BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) khảo sát tồn dư kháng sinh oxytetracycline trong thịt nhập khẩu bằng phương pháp HPLC

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM
Khoa Chăn Nuôi – Thú Y

BÀI BÁO CÁO DƯỢC PHÂN TÍCH

KHẢO SÁT TỒN DƯ KHÁNG SINH
OXYTETRACYCLINE TRONG THỊT NHẬP KHẨU
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC)
GVHD
Nhóm
SV Thực hiện

1


MỤC LỤC

I.

Đặt vấn đề
Do nhu cầu tiêu dùng về lương thực – thực phẩm ngày một tăng, một số hàng hóa

khơng đảm bảo có thể gây phiền tối cho người tiêu dùng. Như vậy, vấn đề vệ sinh an
toàn thực phẩm hiện nay là mối quan tâm hàng đầu. Chính vì thế, việc kiểm sốt chất
lượng các nguồn thịt, đặc biệt là kiểm tra dư lượng kháng sinh nhằm góp phần bảo vệ
người tiêu dùng trong và ngoài nước, cùng với các nước đẩy lùi bệnh tật do dư lượng các
chất độc hại tồn dư trong thực phẩm gây ra.
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 5% kháng sinh được sử dụng ở Việt
Nam là dùng trong nông nghiệp. Tình trạng tồn dư kháng sinh trong thực phẩm ở mức độ
nghiêm trọng.
Tồn dư kháng sinh trong sản phẩm động vật là nguy cơ tiềm ẩn đe dọa sức khỏe

con người, tồn dư kháng sinh tuy không gây độc hại cấp tính, chết người ngay lập tức
nhưng tích lũy dần trong cơ thể và gây ảnh hưởng bất lợi cho sức khỏe như ung thư, bệnh
về gan, dị ứng, ảnh hưởng đến một số quá trình lên men trong chế biến thực phẩm…
Kháng sinh oxytetracycline là kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, dạng bột, giá
thành rẽ, dễ dàng mua trên thị trường, chính vì thế hay được trộn vào thức ăn chăn nuôi

2


đề phịng, trị bệnh và kích thích tăng trọng. Do đó kháng sinh oxytetracycline thường hay
bị tồn dư trong các sản phẩm động vật.
Vậy làm sao để xác định trong thịt nhập khẩu có tồn dư kháng sinh hay khơng và
tồn dư nhiều hay ít, vì thế bài thuyết trình của nhóm xin được đưa ra phương pháp:
“Khảo sát tồn dư kháng sinh oxytetracycline trong thịt nhập khẩu bằng phương
pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)”
1. Tình hình nhiễm kháng sinh trên thế giới
Theo kết quả nghiên cứu của Hội liên hiệp sức khỏe châu ÂU (FEDESE), năm
2009, châu ÂU đã sử dụng 35% (4700 tấn) tổng lượng kháng sinh đăng ký trong chăn
ni; 65% cịn lại sử dụng cho người (8500 tấn). Trong số kháng sinh dùng trong chăn
nuôi có 3900 tấn (chiếm 29%) được dùng để điều trị bệnh động vật; 786 tấn (6%) trộn
vào thức ăn kích thích tăng trưởng.
Ở Mỹ, hàng năm có 6 triệu pounds (2730 tấn) kháng sinh được dùng trong chăn
nuôi. Theo số liệu của viện thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh được sử dụng trong chăn
nuôi ở Mỹ năm 1999 là khoảng 20,42 triệu pounds (9270 tấn), trong đó Tetracycline
chiếm 15,67%, lượng kháng sinh này dùng để kích thích tăng trưởng.
Ở Anh Tetracyclines là nhóm kháng sinh được sử dụng nhiều nhất để bổ sung vào
thức ăn, chiếm hơn 50% tổng kháng sinh (McEvoy, 2002).Theo số liệu của Ghislain
Follet, trong năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng trong nhân y và chăn ni ở EU là
10500 tấn , trong đó 52% sử dụng trong nhân y, 33% điều trị thú y và 15% như chất bổ
sung trong thức ăn chăn nuôi. Trong đó tỷ lệ các loại kháng sinh được sử dụng trong

chăn nuôi: Penicillin 9%; Tetracycline 66%; Macrolide 12%; Aminoglycoside 4%;
Fluoroquinolone 1%; Trimethomprimsulfamid 2% và các kháng sinh khác 6%.
/>
3


Hình 1. Tình hình sử dụng kháng sinh của các nước trên thế giới
2. Tình hình nhiễm kháng sinh ở Việt Nam
Ở Việt Nam, những năm trước kháng sinh được sử dụng lan tràn để phịng và trị
bệnh nên tình trạng tồn dư kháng sinh trong thịt là phổ biến. Theo Lã Văn Kính và cs.
(2007), tỷ lệ sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi ở nước ta là rất cao, 100% các cơ sở
chăn ni có sử dụng kháng sinh Oxytetracycline, 67% các cơ sở chăn ni có sử dụng
Chloramphenicol (mặc dù thuốc này đã được cấm không dùng để điều trị), 30% sử dụng
Olaquindox và 77% các cơ sở chăn ni có sử dụng Dexamethasol. Bên cạnh đó các cơ
sở chăn nuôi sử dụng kháng sinh trong việc phịng và trị bệnh lại khơng hợp lý, khơng
ngừng sử dụng thuốc theo đúng quy định, thậm chí bán chạy khi điều trị thấy không hiệu
quả.
Kết quả nghiên cứu của Đậu Ngọc Hà và Chử Văn Tuất (2008), ở 30 trang trại chăn
nuôi tập trung lợn thịt và gà thịt trên địa bàn tỉnh Hưng Yên và phân tích kháng sinh
Tetracycline, Oxytetracycline, Chlortetracycline, Tylosin trong 60 mẫu thức ăn chăn nuôi,

4


có 60,3% mẫu thức ăn lợn thịt và 70,3% mẫu thức ăn gà thịt phát hiện thấy kháng sinh, 1
mẫu thức ăn lợn thịt có hàm lượng Tylosin vượt giới hạn cho phép khoảng 2 lần.
/>II.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
1. Đối tượng

Gồm 204 mẫu thịt gia súc và gia cầm các loại được nhập khẩu qua cửa khẩu sân
bay Tân Sơn Nhất và cảng Sài Gòn.
2. Phương pháp
2.1. Kỹ thuật áp dụng
Hệ thống HPLC của hãng Agilent với detector UV có bước sóng 350nm.
2.2. Dấu hiệu nhận biết Oxytetracycline
Oxytetracycline là một loại kháng sinh phổ rộng có nguồn gốc từ việc phân lập
trong môi trường nuôi cấy nấm Streptomyces rimosus, dùng kháng lại nhiều vi khuẩn gây
bệnh (Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2010).
2.2.1

Cơng thức cấu tạo

Hình 2. Cơng thức cấu tạo của Oxytetracycline
CTPT: C22H24N2O9
Tên khoa học: (4S,4aR,5S,5aR,6S,12aS)4-(dimethylamino)-3,5,6,10,12,12ahexahydroxy-6-methyl-1,12-dioxo1,4,4a,5,5a,6,12,12a-octahydrotetracene-2carboxamide.

5


Tính chất hóa lý (Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2010)
Các tetracycline có dạng bột; màu vàng; khơng mùi; vị đắng; kém bền với nóng
ẩm và ánh sáng chiếu trực tiếp dẫn đến phân hủy thuốc tạo thành một số dẫn chất có độc
tính cao trên thận như anhydrotetracycline-4-epitetracycline.
Oxytetracycline dạng bazo ít tan trong nước, tan trong alcohol và dung môi hữu
cơ. Oxytetracycline dạng muối hydrochloride tan trong nước nhiều hơn. Oxytetracycline
kết hợp với K+ tạo các phenolate. Cả hai dạng Oxytetracycline đều mất hoạt tính nhanh
trong mơi trường kiềm và các dung dịch có pH <2.
2.3 Ảnh hưởng của Oxytetracycline đến sức khỏe con người
Oxytetracycline thuộc nhóm Tetracycline (kháng sinh tĩnh khuẩn) có phổ kháng

khuẩn rộng nên được dùng rộng rãi trong chăn ni để phịng bệnh cũng như trị bệnh.
Tuy nhiên việc lạm dụng quá mức kháng sinh này để phòng bệnh cho thú bằng cách bổ
sung vào thức ăn hay dùng quá liều điều trị và thời gian ngưng thuốc để đi vào giết mổ
còn sớm sẽ gây nên tồn dư kháng sinh trong thịt. Mặt khác sử dụng tràn lan kháng sinh
lâu ngày gây nên đề kháng kháng sinh không những không làm dịch bệnh dập tắt mà cịn
làm giảm hiệu quả kinh tế. Đó chỉ là trên vật ni, cịn trên người, khi tiêu thụ những súc
sản có tồn dư kháng sinh lâu ngày cũng đề kháng kháng sinh như thú. Quan trọng hơn là
kháng sinh tích tồn dư tích tụ ngày một ít và lâu ngày sẽ ảnh hưởng lên những cơ quan
quan trọng của cơ thể (thần kinh, tuần hoàn,…) làm giảm sức sống, giảm miễn dịch của
cơ thể.
Oxytetracycline khi tồn dư vào cơ thể sẽ tích trữ ở xương và răng. Oxytetracycline
có tính bẫy Ca2+ nên làm giảm sự phát triển của bộ xương. Đối với những em nhỏ dưới 8
tuổi khi có lượng oxytetracycline trong cơ thể sẽ bị vàng răng.

6


Hình 3. Quy định giới hạn tồn dư kháng sinh họ cycline của bộ Y tế 2007
2.3 Dụng cụ thiết bị và hóa chất
2.3.1 Dụng cụ và thiết bị
• Hệ thống HPL gồm: hệ thống bơm mẫu tự động, cột phân tích sắc ký lỏng

pha đảo RP C18 (125mm x 5àm x4,6 mm), detector UV, bung n nhit sc
ã
ã
ã
ã
ã
ã
ã

ã
ã
ã
ã
ã

ký, bỡnh chứa đựng mơi trường, hệ thống máy vi tính và phần mềm sắc ký.
Cân phân tích Mettler toledo (MODEL: AL204) có độ chính xác 0,0001g.
Máy đồng nhất mẫu T25 Basic của hãng IKA
Máy lắc bằng tốc độ cao Orbital Shaker SO3 của hãng Stuart Scientific.
Máy ly tâm Rotina 35R của hãng Hettich Zentrifugen.
Máy khuấy Vortex.
Máy đo pH.
Máy rửa siêu âm Branson 5210
Bình định mức 10, 20,100, 500,… (ml).
Màng lọc whatman
Pipet 100µl.
Phễu lọc.
Bơng thủy tinh,….

2.4.2 Hóa chất
Oxytetracycline chuẩn; methanol; oxalic acid dehydrate; acetone nitrile (ACN);
Na2HPO4 khan; acid citric monohydrate; HCl 0,1M; EDTA; nước cất 2 lần,…

7


2.5 Điều kiện quy trình phân tích
• Bảo quản mẫu thử sao cho không bị giảm chất lượng và thay đổi thành phần
•

•
•
•
•
•
•
•

(Mẫu thử là thịt thi cần tối thiểu 1kg sản phẩm).
Điều kiện tiến hành sắc ký:
Đầu dò UV phát hiện ở bước sóng 350 nm.
Cột RP C18 (125 mm x 5µm x 4,6 mm).
Pha động gồm dung dịch acetone nitrile, dung dịch acid oxalic 0,01M và dung
dịch methanol với tỷ lệ tương ứng: 11%: 82%: 7%.
Thời gian chạy chuẩn: 12 phút.
Tốc độ dịng: 1ml/phút.
Nhiệt độ phịng: 20-25oC.
Thể tích bơm mẫu: 60µl.

2.6 Quy trình thực hiện
 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Oxytetracycline
Pha dung dịch oxytetracycline chuẩn gốc 1000 µg/ml: Cân 0,108g oxytetracycline
cho vào bình định mức 100ml, hịa tan bằng methanol và pha loãng đến vạch, trộn đều.
Bảo quản ở 2- 8oC và sử dụng trong 3 tháng.
Pha dung dịch oxytetracycline chuẩn trung gian 100 µg/ml: Hút 10ml dung dịch
chuẩn gốc vào bình định mức 100ml, pha lỗng đến vạch bằng methanol rồi trộn đều.
Bảo quản ở 2- 8oC và sử dụng trong 1 tháng.
Pha dung dịch oxytetracycline chuẩn làm việc 25 µg/ml: Hút 2,5ml dung dịch
chuẩn trung gian vào bình định mức 10ml, pha lỗng đến vạch bằng methanol rồi trộn
đều. Bảo quản ở 2- 8oC và sử dụng trong 1 tuần.

 Chuẩn bị dung dịch rửa giải (dung dịch methanolic oxalic acid)

Cân 0,126g oxalic acid dihydrate, sau đó hịa tan trong 100ml methanol, trộn đều.
Pha sử dụng trong ngày.
 Chuẩn bị dãy chuẩn Oxytetracycline

8


Pha dãy chuẩn có nồng độ lần lượt là: 0,025 – 0,05 – 0,1 – 0,25 – 0,5 ppm bằng
cách lần lượt hút 10 – 20 – 40 – 100 và 200 µl dung dịch chuẩn oxytetracycline làm việc
(25 µg/ml) vào 5 bình định mức 10ml riêng biệt. Thêm 6ml dung dịch rửa giải cho mỗi
bình và pha lỗng đến vạch bằng nước cất lọc (là nước cất 2 lần được lọc qua giấy lọc)
sau đó trộn đều. Dùng ống tiêm hút khoảng 1ml dung dịch ở các bình định mức 10ml
riêng biệt này bơm qua màng lọc whatman 0,45µm cho vào các lọ nhỏ đựng chuẩn để
chuẩn bị chạy sắc ký.
 Chuẩn bị dung dịch đệm Mcllvaine- EDTA
 Dung dịch đệm Mcllvaine pH 4,0 ± 0,05

Cân 28,4g disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) khan cho vào bình định mức 1 lít
và hịa tan bằng một ít nước cất, pha lỗng đến vạch bằng nước cất rồi trộn đều. Cân
21,0g citric acid monohydrate vào bình định mức 1 lít khác, pha lỗng đến vạch bằng
nước cất rồi trộn đều. Trộn 1 lít dung dịch citric acid monohydrate với 625 ml dung dịch
Na2HPO4 vào bình 2 lít, chỉnh pH tới 4,0 ± 0,05 bằng cách thêm từng giọt dung dịch HCl
hay NaOH 0,1M, pha loãng sử dụng trong 1 tuần.
 Dung dịch đệm Mcllvaine- EDTA 0,1M

Cân 60,5g ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA), thêm
1,625 lít dung dịch đệm Mcllvaine pH 4,0 ± 0,05, khuấy tới khi tan hoàn toàn. Pha sử
dụng trong 1 tuần.

 Xử lý mẫu thịt bằng cột chiết SPE (Nguồn: AOAC 2000 (995.09))

Nguyên tắc: Oxytetracycline được chiết từ mẫu thịt bằng dung dịch đệm McllvaineEDTA. Dịch chiết được lọc rồi loại tạp trên cột chiết pha rắn SPE C 18 . Kháng sinh
oxytetracycline được phân tích bằng máy sắc ký lỏng với cột C 18 và phát hiện bằng đầu
dò UV tại bước sóng 350nm. Kết quả được hiệu chỉnh với hiệu suất thu hồi cho mỗi lần
chạy phân tích mẫu.

9


Cách tiến hành: Sau khi tiếp nhận mẫu thịt cần xét nghiệm tồn dư kháng sinh
oxytetracycline, chúng tôi sẽ lấy mẫu đồng đều tại các vị trí trong lơ rồi cắt nhỏ cho vào
túi nylon Sau đó, tiếp tục dùng kéo cắt nhỏ từng mẫu thịt trong mỗi túi nylon, tách bỏ
phần mỡ và da, chỉ lấy phần thịt nạc.
Chiết lần 1: Cân 10 ± 0,05g mẫu thịt cho vào trong ống nhữa 50ml. Thêm 20ml dung
dịch đệm McIlvaine- EDTA cho mỗi ống. Nghiền (đồng nhất) mẫu thịt trong 30 giây, rửa
đầu nghiền bằng 2ml dung dịch đệm McIlvaine- EDTA cho vào ống. Đậy nắp lắc 10 phút
trên máy lắc bằng với tốc độ cao. Ly tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần nước
nổi ở trên lọc qua bông thủy tinh cho vào ống nhựa 50ml khác đã được hứng sẵn bên
dưới, phần tủa thịt còn lại đem chiết lần 2.
Chiết lần 2: Rửa tủa thịt sau khi chiết lần 1 bằng 20ml dung dịch đệm McIlvaineEDTA. Đậy nắp lắc 10 phút trên máy lắc bằng với tốc độ cao. Ly tâm 2500 vịng/phút
trong 10 phút. Sau đó ly tâm nước nổi dồn chung vào ống nhựa chứa dịch chiết lần 1,
phần tủa thịt để lại tiếp tục chiết lần 3.
Chiết lần 3: Rửa tủa thịt bằng 10ml dung dịch đệm McIlvaine- EDTA và lặp lại các
bước trên. Sau khi ly tâm lấy nước nổi dồn chung vào ống nhựa chứa dịch chiết lần 1,
còn phần tủa thịt bỏ đi.
Dịch lọc sau khi thu được ở cả 3 lần chiết được dồn chung vào ống nhựa 50ml, sau đó
đem ly tân 6000 vòng/phút trong 10 phút. Lọc lại lần cuối dung dịch sau khi ly tâm bằng
giấy lọc ta thu được 40ml dịch lọc.

Chiết lần 1

Chiết lần 2

Chiết lần 3

Cân 10g mẫu

Rửa tủa thịt lần 1
bằng 20ml dd
đệm

Rửa thịt lần 2
bằng 20ml dd
đệm

+ 20ml dd đệm
Ly tâm 4000
Đồng
nhất mẫu
vòng/phút
(10
Lắc 10 phút với
(30s)
phút)
tốc độ cao

10

Lắc 10 phút với
tốc độ cao

Ly tâm 2500
vòng/phút (10
phút)

Lắc 10 phút với
tốc độ cao

Ly tâm 2500
vòng/phút (10
phút)

Thu dịch lọc

Ly tâm 6000
40ml dịch lọc
vịng /phút (10
phút)
Sơ đồ cơng đoạn chiết lỏng – lỏng trong quy trình phân tích tồn dư kháng sinh
oxytetracycline bằng HPLC
Chuẩn bị cột SPE: Cho 20ml methanol qua cột và tiếp theo là 20ml nước cất lọc. Cho
40ml dịch lọc thu được của 3 lần chiết qua cột chiết SPE C 18 (lưu ý: cho dịch lọc qua cột
một cách từ từ- khoảng 2ml/phút nhằm giữ lại được kháng sinh tồn dư (nếu có)). Sau khi
dịch lọc đã qua cột hết, tiến hành rửa cột bằng cột 20ml nước cất. Làm khơ cột SPE bằng
khí (bằng cách bật máy hút chân không).
Rửa giải bằng 6ml dung dịch methanolic oxalic acid cho vào bình định mức 10ml (lưu
ý: rửa giải một cách từ từ- khoảng 1ml/phút nhằm mục đích lơi cuốn hết kháng sinh tồn
dư (nếu có) trong cột), sau đó thêm nước cất lọc cho đến vạch 10ml.

Dùng ống tiêm hút khoảng 1ml dung dịch sau khi rửa giải này bơm qua màng lọc
Whatman 0,45µm cho vào lọ nhỏ đựng mẫu để chuẩn bị chạy trên máy sắc ký.

11


Cơng đoạn chiết pha rắn trong quy trình phân tích tồn dư kháng sinh bằng kỹ thuật
HPLC








 Chuẩn bị pha động

Pha dung dịch oxalic acid 0,01M: Hòa tan 1,26g oxalic acid dihydrate với
nước trong bình định mức 1 lít. Sau đó, lấy 820ml dung dịch oxalic acid đã pha
đem trộn với 110ml acetone nitrile và 70ml methanol (dùng cho cột 5µm).
 Chuẩn bị trên máy HPLC

Gắn cột sắc ký pha đảo RPI8e vào hệ thống HPLC. Cho các lọ nhỏ đựng
chuẩn vào khay đựng của bộ bơm mẫu tự động. Bật máy sắc ký và máy vi tính.
Chờ vài phút cho hệ thống ổn định. Kết nối máy vi tính và máy HPLC qua
phần mềm chạy sắc ký. Bật bơm đuổi khí trong các dây dẫn dung mơi. Chạy máy để rửa
cột bằng nước, sau đó chạy với pha động ( dung dịch oxalic, acetone nitrile và methanol).
Kiểm tra tính ổn định của đường nền, đặt các lọ chuẩn oxytetracycline vào khay đựng
mẫu, sau đó tiến hành đo hàm lượng của chuẩn oxytetracycline với các điều kiện sắc ký:

•
•
•

Đầu dị UV phát hiện ở bước sóng 350 nm.
Cột RP C18 (125 mm x 5µm x 4,6 mm).
Pha động gồm dung dịch acetone nitrile, dung dịch acid oxalic 0,01M và dung

•
•
•
•

dịch methanol với tỷ lệ tương ứng: 11%: 82%: 7%.
Thời gian chạy chuẩn: 12 phút.
Tốc độ dòng: 1ml/phút.
Nhiệt độ phòng: 20-25oC.
Thể tích bơm mẫu: 60µl.
12


Hình 4. Hệ thống máy HPLC
Thời gian lưu của peak đối với kháng sinh oxytetracycline khoảng 7,88 phút. Sau
khi phân tích xong, rửa cột bằng methanol rồi đến acetone nitrile.
2.7 Tiến hành phân tích trên máy
 Xây dựng đường chuẩn Oxytetracycline
Sau khi bơm lần lượt 5 chuẩn oxytetracycline vào máy HPLC ứng với các nồng độ
0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 ppm. Bộ phận ghi nhận kết quả sẽ hiển thị trên màn hình một
sắc ký đồ có peak của kháng sinh chuẩn Oxytetracycline tại thời gian lưa T R. Với phương
pháp đã xây dựng để chạy chuẩn oxytetracycline thì peak của chuẩn oxytetracycline sẽ

xuất hiện tại TR= 7,882 phút (±0,1).
 Xác định sự tồn dư kháng sinh oxytetracycline trong mẫu thịt

Sau khi bơm mẫu vào máy HPLC, bộ phận ghi nhận kết quả sẽ hiển thị trên màn hình
một sắc ký đồ với peak của mẫu kháng sinh oxytetracycline cần xác định (nếu có) tại thời
gian lưu TR = 7,882 phút. Từ đó tính diện tích trung bình từng mẫu peak (nếu có), sau đó
thế vào phương trình đường chuẩn để xác định nồng độ kháng sinh tồn dư trong 10g mẫu
thịt.
13


III. Tính tốn kết quả.
1. Lập đường chuẩn.
Đường chuẩn Oxytetracycline được xây dựng dựa vào các điểm chuẩn với các nồng
độ: 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 ppm. Kết quả về diện tích peak trung bình (S) của chuẩn
Oxytetracycline ở các mức nồng độ được trình bày trong Bảng 4.1
Nồng độ chuẩn
Oxytetracycline (ppm)
0,025
0,05
0,1
0,25
0,5

Diện tích peak trung bình
của chuẩn Oxytetracycline (S)
2,3
5,5
10,8
27,9

56,9

Bảng 4.1 Diện tích peak theo nồng độ của Oxytetracycline
Từ diện tích peak các chuẩn có được ở Bảng 4.1, ta dựng được đường thẳng diện tích
peak theo nồng độ, sau đó xây dựng phương trình đường chuẩn Oxytetracycline như Đồ
thị 4.
Hình 5. Đường chuẩn Oxytetracycline
Qua
khảo sát
quan

mối

hệ

tuyến

tính

ta

thấy

rằng

ở

nồng

độ

từ 0,025

đến

0,5 ppm

thì

hệ

số

tương quan rất chặt chẽ theo hàm bậc nhất: y = 114,62x - 0,5244 với hệ số tương quan R 2
= 0,9999.

14


Phương trình đường chuẩn y = 114,62x – 0,5244 được áp dụng cho việc xác định
hàm lượng Oxytetracycline có trong mẫu. Kết quả thu được từ sắc ký đồ phân tích về
diện tích peak Oxytetracycline (Speak mẫu) được thế vào phương trình (tương đương với y),
từ đó suy ra x là nồng độ Oxytetracycline theo đường chuẩn (Cđc) theo Công thức sau
Cđc

=

(µg/ml)

Trong đó:

Cđc :Nồng độ Oxytetracycline có trong mẫu tính theo đường chuẩn (là biến số x)
Speak mẫu : Biến số y trong phương trình đường chuẩn
A : Hệ số góc của đường chuẩn
B : là tung độ góc của đường chuẩn
Sau đó suy ra nồng độ (hàm lượng) kháng sinh Oxytetracycline có trong 10g mẫu
theo cơng thức
Cks = Cđc × ×
Trong đó :
Cks : Nồng độ kháng sinh Oxytetra tồn dư trong 10g mẫu thịt (µg/kg hay ppb)
Cđc : Nồng độ mẫu tính theo đường chuẩn (µg/ml)
Vđm : Thể tích định mức (hay pha lỗng) mẫu (10ml)
mbđ : Khối lượng ban đầu ( m=10g)
H :Hiệu suất thu hồi (%)

15


Hình 4.1 Sắc kí đồ của một chuẩn kháng sinh Oxytetracycline

2 Kết quả khảo sát trên mẫu thịt
Tiến hành khảo sát để định danh Oxytetracycline dựa trên thời gian lưu ( T R ) và tương
ứng theo nồng độ khác nhau có nồng độ từ 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 ppm trên cột C 18 và
phát hiện bằng đầu dò UV tại bước sóng 350 nm. Kết quả được hiệu chỉnh hiệu suất thu
hồi sau mỗi lần phân tích mẫu thể hiện như sau:

16


Hình 7. Sắc ký đồ của mẫu thịt khơng phát hiện kháng sinh Oxytetracycline

Hình 8. Sắc kí đồ của một mẫu thịt phát hiện kháng sinh Oxytetracycline

17


Nhận xét: Tín hiệu về Oxytetracycline xuất hiện dưới dạng peak vào thời gian lưu T R
=7,882 phút.
Loại
mẫu

Số lượng
mẫu

Thịt gà

146
31
1
14
12

Thịt bò
Thịt trâu
Thịt cừu

Khối lượng mẫu
ban đầu
(g)
10,0000 ± 0,05
10,0000 ± 0,05

10,0000 ± 0,05
10,0000 ± 0,05
10,0000 ±0,05

Nồng độ
Oxytetracycline
phát hiện (ppb)
Không phát hiện
Không phát hiện
100
Không phát hiện
Không phát hiện

Kết quả cho thấy trong 204 mẫu thịt, chỉ phát hiện được 1 mẫu duy nhất một mẫu có
tồn dư kháng sinh Oxytetracycline ở nồng độ 100ppb.
LOD và LOQ
•

Bằng cách chuẩn bị một dung dịch chất chuẩn trong một dung môi tinh khiết
( mẫu trắng) và bơm vào máy với một thể tích xác định V(àl). Ly sc ký v o
S/N

ã

LOD c chp nhn ở nồng độ mà tại đó tín hiệu lơn gấp 3 lần nhiễu đường
nền(S/N =3). LOD của phương pháp là 60 ppb. Điều này chứng tỏ khả năng phát

hiện của quy trình là khá cao.
• LOQ được chấp nhận ở nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đường nền
(S/N =10). LOQ của phương pháp là 200ppb.

Hiệu suất thu hồi
Sử dụng mẫu trắng
18


R% = (Ctt / Cc) × 100
Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)
Ctt : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

IV. Kết luận
Phương trình đường chuẩn Oxytetracycline y = 1114,62x – 0,5244 và hệ số tương
quan tuyến tính khá tốt (R2 = 0,999), có thể dùng để tính tốn hàm lượng Oxytetracycline
cho một đối tượng cụ thể.
Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là 60ppb rất có ý nghĩa.
Điều kiện sắc kí có thể áp dụng là: Đầu dị UV 350nm; Cột sắc kí pha đảo RP C 18; Pha
động (ACN: A.oxalic 0,01M : MeOH) : (11%: 82%: 7%); Tốc độ dịng: 1ml/phút. Thể
tích bơm mẫu: 60µl. Thời gian lưu T R = 7,882 phút. Thời gian chạy một mẫu là 12 phút.
Nhiệt độ phòng (20 – 250 C).
Tỷ lệ mẫu thịt nhập khẩu tồn dư kháng sinh Oxytetracycline rất thấp (chỉ chiếm
0,49%) và không có mẫu thịt tồn dư Oxytetracycline vượt mức cho phép.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

19


 Sách, báo
1. Phùng Võ Cẩm Hồng. Bài giảng Dược phân tích. Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí

Minh.
2. Phan Thị Diệu Hương, 2011. Khảo sát tồn dư kháng sinh Oxytetracycline trong
thịt nhập khẩu bằng phương pháp sắc ký lỏng (HPLC). Khóa luận tốt nghiệp Khoa
chăn ni thú y đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh.
 Internet
1. />2. />
20