SEMINAR xác định dư lượng chloramphenicol (dược PHÂN TÍCH)

XÁC ĐỊNH hÀM LƯỢNG KHÁNG SINH
CHLORAMPHENICOL TRONG THỊT GÀ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ


Danh sách sinh viên


Nội dung

II. Đối tượng và
I. Đặt vấn đề

phương pháp thực
hiện.

III. Tính tốn kết
quả.

IV. Kết luận.


I.

Đặt vấn đề

Biểu đồ: Sản lượng chăn nuôi giai đoạn 2000-2008 (đơn vị: ngàn tấn) * 


I.

Đặt vấn đề

Trị bệnh

Thúc đẩy tăng

Phòng bệnh

trưởng

Kháng
sinh


I.

Đặt vấn đề

Vật nuôi
Người sử

Môi trường

dụng
Tồn dư
kháng
sinh

Đề tài khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và dư lượng kháng sinh trong thịt ở các quầy thịt gà tại Tp. Hồ
Chí Minh của PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải và Khoa CNTY, trường ĐH. Nông Lâm.



II. Đối tượng và
phương pháp thực hiện
1. Đối tượng
Các mẫu thịt gà bán trên quầy thịt ở địa bàn Quận Thủ Đức. Các đối tượng này
sẽ được phân tích những thành phần chính để lựa chọn ra nền mẫu đại diện để chạy
sắc ký.


2. Phương pháp thực hiện
2.1 Dấu hiệu nhận biết chloramphenicol


2.2 Dụng cụ và thiết bị hóa chất

a)

b)

Nguyên vật liệu và hóa chất.





Kháng sinh chuẩn CAP pha trong methanol ở nồng độ 1µg/ml và bảo quản ở tủ lạnh ở

0 - 4°C.
Hóa chất: Etylacetat; aminoacetat; n- hexan; acid acetid, aceton và acetonitril.
Nước cất

Thiết bị




Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS
2 loại cột chiết pha rắn dùng cho khảo sát gồm C18 và Floresil


2.3 Điều kiện qui trình và quá trình thực hiện
2.3.1. Điều kiện qui trình
Bảng 1. Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI
Thế phun điện tử 4,0 kV
Nhiệt độ đầu phun (IS) 130°C
Khí màn (CUR) 30
Khí va chạm (CAD) 7
Nguồn khí ion 1 (GS1) 20
Nguồn khí ion 2 (GS2) 10
Thế phân nhóm (DP) -100
Thế đầu vào (Entrance Potential) (EP) - 10


Bảng 2. Điều kiện bắn phá và phân mảnh các ion con
Thông số khảo sát

Số mảnh quét với mỗi chất

Khoảng khảo sát

Bước quét (step)

5 mảnh cho tín hiệu cao nhất

 

 

Thế phân nhóm (DP)

Từ -150 đến -1 (V)

 

5 (V)
 

Năng lượng va chạm (CE)

Từ 130 đến -5 (V)

 

2 (V)
 

Năng lượng CXP

Từ -55 đến 0 (V)

2 (V)


Bảng 3. Các thông số tối ưu cho chạy khối phổ đối với chloramphenicol

Chất phân tích

Ion mẹ

Mảnh khẳng

Mảnh định lượng

DP (V)

CE (V)

CXP (V)

định

CAP (323,13)

320,972

257,192

152,221

-100

-22

-11

Chú thích: DP: Thế phân nhóm (Declustering Potential), CE: Năng lượng va chạm (Collision Energy) và CXP: Năng lượng CXP (Collision Cell Exit
Potential).


2.3.2. Quá trình thực hiện

a
b
c
d


Cân 10g mẫu
Thêm chuẩn hỗn hợp KS CAP và 20ml dung dịch Etylacetat

a. Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu
Đồng nhất

Chiết lặp với 10ml

Lắc vortex 5 phút

Etylacetat
Ly tâm 6.000v/phút trong 5 phút

Gạn lớp trên bình cơ quay 100ml, cơ quay tới cạn ở 40°C

Phần rắn

Hòa phần rắn bằng 12ml NH44COO-CH3 4%

Loại chất béo bằng 5ml n –hexan, chiết lặp lại 2 lần

Qua cột chiết pha rắn C18

•
•
•
•

Hoạt hóa bằng 3ml H22O và 3ml Methanol
Nạp mẫu
Rửa tạp chất bằng 2ml H22O
Rửa giải bằng 3ml Methanol

LC-MS/MS


b. Tối ưu hóa điều kiện phân tích CAP
trên máy LC-MS/MS

Kháng sinh nhóm phenicol có khối lượng phân tử và độ phân cực trung bình.

Để tối ưu hóa điều kiện khối phổ, dùng pipet 500µl bơm chuẩn CAP 10ng/ml vào
detector để khảo sát. Tối ưu hóa từng ion mẹ và chỉnh tối ưu điều kiện chạy ESI như
bảng 2.


Phổ khối của CAP trên hệ LC/MS nghiên cứu


c. Tối ưu các điều kiện sắc ký


Lựa chọn cột phân tách.
CAP có độ phân cực trung bình, nên lựa chọn an toàn cho hệ pha động của máy khối phổ là các dung môi phân

cực vừa như methanol, acetonitril, nước, acid formic (< 1%), amoniacetat (< 1%). Lựa chọn dung mơi thường tn
theo tính kinh tế và tính phù hợp với phịng thí nghiệm.



Hệ pha động và phương pháp gradient
Pha động ảnh hưởng lớn đến quá trình tách các chất và q trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích. Q

trình ion hóa sẽ tối ưu hơn khi hệ pha động có thêm các chất như acid acetid, acid formic…

 Hệ pha động kênh A lần lượt là acid acetid 0,1%, CH COONH4 0,1% trong nước, nước; kênh B lần lượt là
3

methanol và acetonitril.

 Tỉ lệ pha động khảo sát theo 2 chế độ: cố định tỉ lệ hai kênh pha động và chế độ gradient quét từ 10% tới

100% kênh A về thể tích theo thời gian.


Hệ pha động khảo sát methanol – CH3COOH 0,1%


d. Thẩm định phương pháp phân tích thơng qua việc phân tích mẫu trắng và thử nghiệm phân tích mẫu
thực tế.
d.1. Phân tích mẫu trắng.
Mẫu trắng: gà được ni bằng thức ăn tự nhiên và không sử dụng kháng sinh trong thời gian ni).
Tiến hành phân tích lặp lại 3 lần và thu được độ thu hồi đều cao hơn 80% ở 3 mức nồng độ 0,5; 1 và 5
ng/g.
d.2. Thử nghiệm phân tích mẫu thực tế.
Mẫu thực tế: lấy ở các quầy thịt gà tại các chợ tại địa bàn quận Thủ Đức.


2.4. Q trình phân tích trên máy
Nạp mẫu

Hóa khí mẫu

Ion hóa
Phân tích ion theo số
khối

Bơm hút

Xử lý số liệu

Detector

III. Tính tốn kết quả
1.

Lập đường chuẩn

Phương pháp LC-MS/MS có khoảng tuyến tính rõ rệt (tất cả hệ số hồi qui tuyến tính đều dao động trong
khoảng từ 0,99 đến dưới 1). Cụ thể CAP có khoảng tuyến tính từ 0,5 đến 3 ng/g với hệ số hồi qui tuyến tính là
0,9994.

Khoảng tuyến tính khảo sát

Phương trình đường chuẩn

R²

LOD (ng/g)

LOQ (ng/g)

Y= 6x10¯⁵x – 0,0256

0,9994

0,009

0,03

(ng/g)

0,5 – 3


đường chuẩn của CAP
y (ng/g)

3
2.5

2.5

2
1.5
1
0.5
0
0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

x (cm²)


2. Độ chính xác
 Giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD) đối với CAP = 0,009ng/g
 Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) đối với CAP = 0,03ng/g
 Kết quả phân tích cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao để phân tích dư
lượng kháng sinh CAP trong thịt gà.