SEMINAR xác ĐỊNH hàm LƯỢNG CAFEIN (dược PHÂN TÍCH)

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN TRONG CÂY CAFE BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO (HPLC) – PHƯƠNG PHÁP CHUẨN


I.

ĐẶT VẤN ĐỀ.



Café là một thức uống quen thuộc với mọi người, nó phổ biến trên tồn thế giới. Café được sử dụng lần đầu vào
thế kỉ 9.






Café mang lại cảm giác hưng phấn cho người uống
Vậy cảm giác hưng phấn đến từ đâu?
Câu trả lời nằm trong thành phần của hạt café: đó chính là cafein
Cafein là chất kích thích có thể tìm thấy trong một số loại hạt, trái cây,… tuy nhiên nguồn cung cấp cafein chủ yếu
là từ cà phê và các loại trà.



Cung cấp một lượng cafein vừa đủ cho cơ thể sẽ có nhiều tác dụng khá hữu hiệu. Ngồi ra cafein là chất có tác
dụng kích thích hệ thần kinh trung ương làm cho tỉnh táo, kích thích khả năng làm việc, đặc biệt làm việc bằng trí
óc, tăng cường hoạt động cơ.



Vậy cafein được xác định như thế nào, vì vậy bài thuyết trình của nhóm hơm nay xin được đưa ra phương pháp
“XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) – PHƯƠNG
PHÁP CHUẨN”.


II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

Đối tượng nghiên cứu: Caffein được chiết xuất từ café và các sản phẩm của café: cà phê nhân, cà phê, bột có cà phê, cà phê
hòa tan, hỗn hợp hòa tan…

Dấu hiệu nhận biết cafein:

•

Cơng thức: C8 H10 N4 O2

•
•
•
•
•

Caffein ở dạng tinh thể, không màu, không mùi, vị đắng.
Khối lượng mol: 197.19 g/mol
Nhiệt độ nóng chảy 2380C.
Tan nhiều trong nước nóng và chloroform và tan 1Phần trong rượu
Cafein có vị đắng và tạo ra hiệu ứng sinh lý rất dễ nhận biết. Chúng được sử dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất đồ uống.
Cafein có khả năng tồn tại khá lâu trong máu và bị thăng hoa ở 178 oc nên ít tổn thất nhiều trong khi sấy.

Trang thiết bị
Cân phân tích, có khả năng cân chính xác đến ± 0,1 mg.
Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 µm, để lọc pha động và các dịch chiết mẫu pha loãng.
Máy sắc ký lỏng hiệu nâng cao
Cột sắc ký dùng cho HPLC
Máy khuất từ
Bể siêu âm
Xiranh microlit.
Máy xay cà phê
Máy xay với bánh xe có răng
Sàng
Bình định mức một vạch
Pipet


Trang thiết bị

Cột sắc ký


Hóa chất
Thuốc thử: Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước phù hợp với yêu cầu loại 1 của TCVN
4851 (ISO 3696) trừ khi có quy định khác.
Metanol, loại dùng cho HPLC.
Magie oxit (mgo), loại nặng, có chất lượng cao
Cafein (1,3,7-trimetylxantin; 1,3,7-trimetyl-1H-purin-2,6(3H,7H)-dion; metyltheobrom; C8H10N4O2), dạng
khan tinh khiết.
Pha động, 24 % phần thể tích metanol trong nước.
Dung dịch chuẩn cafein.

•
•

Dung dịch gốc, tương ứng với 200 mg/l
Dung dịch chuẩn pha lỗng đối với cà phê thơng thường, tương ứng với khoảng 40 mg/l


Điều kiện quy trình và q trình thực hiện

•

Chuẩn bị mẫu thử

Cà phê nhân: Dùng máy nghiền để nghiền nhân cà phê nhân sao cho 50 % phần khối lượng của mẫu lọt qua
sàng. Sau đó lấy mẫu thử từ toàn bộ cà phê bột đã được trộn kỹ.
Cà phê rang
Dùng máy xay để xay nhân cà phê rang sao cho trên 50 % khối lượng lọt qua sàng.
Dùng luôn cà phê rang xay bao gói bán sẵn mà khơng cần xử lý thêm và đồng hóa mẫu.
Cà phê hịa tan: Đối với cà phê hịa tan thì khơng cần xay.

•

Đồ uống hỗn hợp: Dùng máy xay, đồng hóa bột uống cà phê hỗn hợp ngay trước khi chiết để tránh bị tách
rời.


Cách tiến hành

•

Phép xác định tùy chọn chất khơ của cà phê : Tính hàm lượng chất khơ cà phê từ độ ẩm xác định được trên phần
mẫu thử theo:
- TCVN 6928 (ISO 6673) đối với cà phê nhân,
- TCVN 9721 (ISO 11817) đối với cà phê rang,
- TCVN 5567 (ISO 3726) đối với cà phê hịa tan.

•

Phần mẫu thử

Cà phê rang và cà phê nhân: Dùng cân ,cân khoảng 1 g mẫu thử (cà phê nhân, cà phê rang) chính xác đến miligam và
chuyển vào bình định mức 250 ml
Cà phê hòa tan: Dùng cân,cân khoảng 0,5 g mẫu thử (cà phê hịa tan) chính xác đến miligam và chuyển vào bình định
mức 250 ml.
Đồ uống hỗn hợp: Dùng cân ,cân khoảng 1 g mẫu thử (đồ uống hỗn hợp) chính xác đến miligam và chuyển vào bình
định mức 250 ml.


Chiết cafein

o

Thêm 5 g magie oxit và khoảng 200 ml nước vào phần mẫu thử (cà phê: rang, nhân, hỗn hợp,hịa tan) đựng
trong bình định mức. Đặt bình vào nồi cách thủy được duy trì ở điểm sơi và chờ cho đến khi dung dịch đạt
đến ít nhất 90 oc. Tiếp tục gia nhiệt bình trong nồi cách thủy trong 20 min, thỉnh thoảng trộn lượng chứa
trong bình bằng cách khuấy hoặc lắc bình. Lấy bình ra khỏi nồi cách thủy, làm nguội đến nhiệt độ phòng
dưới vòi nước và thêm nước đến vạch. Chờ cho đến khi chất rắn lắng xuống.

o

Lấy phần dịch lỏng nổi phía trên và lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,45 µm, loại bỏ vài mililit đầu tiên. Dịch lọc này
được dùng để tách bằng HPLC.


Tiến hành phân tích trên máy
Chỉnh thiết bị: Cài đặt máy sắc ký theo chỉ dẫn của nhà sản xuất và chỉnh như sau:

•
•

tốc độ dịng của pha động : 1,0 ml/min;
detector UV cài đặt ở 272 nm (hoặc 254 nm trong trường hợp detector có bộ lọc). Đảm bảo rằng phạm vi nhạy của detector phù
hợp với pic của dung dịch chuẩn (trong trường hợp nhiều hơn một chất chuẩn, thì theo pic cao nhất).

Phân tích HPLC
Khi tốc độ dòng của pha động và áp suất tương ứng ổn định, để cho hệ thống cân bằng trong ít nhất 10 min. Sau đó bơm 10 µl dung
dịch chuẩn lên cột, dùng xyranh microlit, trong lần chạy sau đó, bơm tiếp một thể tích tương tự của dịch chiết mẫu. Khi sử dụng dung
dịch chuẩn đơn lẻ, thì bơm với các khoảng cách đều đặn (thông thường cứ sau sáu lần bơm dịch chiết mẫu thì bơm một lần). Sau mỗi
mẻ phân tích, rửa kỹ hệ thống sắc ký cùng với cột bằng metanol 50 % thể tích và nước, đậy nút cột để bảo quản nếu không tiếp tục
dùng.


Tiến hành phân tích trên máy

Đo quang phổ


III.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN:

Kết quả

•.

Độ chụm

Bảng 1 – Giá trị trung bình, giới hạn lặp lại và giới hạn tái lập

Giá trị trung bình

Giới hạn lặp lại R

Giới hạn tái lậpR

% phần khối lượng

% phần khối lượng

% phần khối lượng

0,057

0,004

0,009

0,075

0,003

0,006

1,14

0,05

0,15

2,18

0,096

0,37

Mẫu/sản phẩm

Cà phê nhân
Cà phê đã tách cafein (decaf)
Cà phê đã tách cafein
Cà phê chè (arabica) thông thường

Cà phê vối (robusta) thông thường


Cà phê rang
Cà phê đã tách cafein

0,055

0,007

0,026

0,642

0,054

0,091

1,22

0,053

0,176

0,024

0,068

0,072

0,004

0,024

0,109

0,008

0,030

2,51

0,050

0,23

3,19

0,085

0,372

0,066

0,216

Hỗn hợp cà phê thông thường/ cà phê đã tách cafein

Cà phê thông thường

Bột uống có thành phần cà phê
Cà phê kiểu cappuccino

0,403
Cà phê hòa tan

Cà phê đã tách cafein

Cà phê đã tách cafein
Cà phê đông khô thông thường

Cà phê kết tụ thông thường

Hỗn hợp cà phê hòa tan
Cà phê/chicory

2,45


•

Độ lặp lại
Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử nghiệm độc lập, đơn lẻ thu được khi sử dụng cùng
phương pháp, trên cùng vật liệu thử, trong một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết
bị, trong cùng một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % (nghĩa là độ lặp lại ở xác suất 95 %) các
trường hợp vượt quá giá trị giới hạn lặp lại, r, nêu trong Bảng 1.

•

Độ tái lập
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành
thử trên vật liệu giống thử hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực
hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % (nghĩa là độ tái lập ở xác suất 95 %) các trường hợp
vượt quá giá trị giới hạn tái lập, R, nêu trong Bảng 1.


Bàn luận: Báo cáo thử nghiệm phải ít nhất bao gồm các thơng tin sau:

•
•
•
•
•

Mọi thơng tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu;
Phương pháp sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
Kết quả thử nghiệm thu được;
Nếu kiểm tra về độ lặp lại, thì nêu kết quả cuối cùng thu được;
Mọi chi tiết thao tác khác với quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể
ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.