SEMINAR xác định rhodamine trong thực phẩm (dược PHÂN TÍCH)

XÁC ĐỊNH RHODAMINE TRONG MẪU HẠT DƯA
BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO HPLC SỬ DỤNG DETECTOR UV


NỘI DUNG
1. MỞ ĐẦU
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3. KẾT QUẢ
4. KẾT LUẬN
5. TÀI LIỆU THAM KHẢO


1.MỞ ĐẦU
Vấn đề an toàn thực phẩm và vệ sinh môi trường => ảnh hưởng trực
tiếp đến sức khoẻ con người.
Sự tồn dư của các chất độc hại trong thực phẩm đang là vấn đề đáng lo
ngại. Khoa học kỹ thuật phát triển, nhiều kỹ thuật phân tích mới, hiện
đại đã được áp dụng để kiểm định các chất độc trong thực phẩm.
Trong chế biến, để tạo màu sắc đẹp, bắt mắt, người ta sử dụng phẩm
màu công nghiệp. Phẩm màu cơng nghiệp nói chung, Rhodamine B nói
riêng đều độc hại, bị cấm sử dụng trong thực phẩm vì khó phân huỷ, ảnh
hưởng đến gan, thận hoặc tồn dư lâu ngày gây độc hại đến cơ thể con
người, đặc biệt có thể gây ung thư. Phẩm màu thực phẩm và tự nhiên có
độ bền kém hơn, lại đắt hơn phẩm màu công nghiệp => nhiều người đã
lạm dụng phẩm màu công nghiệp mặc dù chất này đã bị cấm sử
dụng trong thực phẩm. Vì vậy việc nghiên cứu xác định hàm lượng của
các Rhodamine B là vấn đề cần thiết để bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.


TỔNG QUAN

MỘT VÀI NÉT VỀ RHODAMINE B
 Công thức cấu tạo
- Rhodamine B là một hợp chất hóa học, là một thành
phần của phẩm màu công nghiệp.
- Công thức phân tử là C28H31ClN2O3
- Phân tử khối là 479,02g/mol.


TỔNG QUAN
MỘT VÀI NÉT VỀ RHODAMINE B
 Tính chất vật lí
- Rhodamin B là những tinh thể màu tối có ánh xanh hay ở
dạng bột màu nâu đỏ.
- Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 210oC đến 211oC
- Rhodamine B là một thuốc nhuộm lưỡng tính, độc
hại, tan tốt trong methanol, ethanol, nước (khoảng 50 g/l).
- Dung dịch nước và rượu etylic có màu đỏ ánh xanh nhạt
phát huỳnh quang màu đỏ mạnh, đặc biệt rõ trong các dung
dịch loãng. Dung dịch nước hấp thụ cực đại với ánh sáng có
λ = 526 và 517 nm.


TỔNG QUAN
MỘT VÀI NÉT VỀ RHODAMINE B
 Tính chất sinh học
- Rhodamine B gây độc cấp và mãn tính.
- Qua tiếp xúc, nó gây dị ứng hoặc làm mẩn ngứa da,mắt,...
- Qua đường hơ hấp, nó gây ho, ngứa cổ, khó thở, đau ngực.
- Qua đường tiêu hóa, nó gây nơn mửa, có hại cho gan và
thận.

- Nếu tích tụ dần trong cơ thể nó gây nhiều tác hại đối với
gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh cũng như có thể gây
ung thư.


TỔNG QUAN
MỘT VÀI NÉT VỀ RHODAMINE B
Ứng dụng
- Rhodamine B thường được sử dụng trong nước để xác

định tốc độ và hướng của dòng chảy vận chuyển.
- Được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng công nghệ sinh
học như kính hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dịng chảy,
quang phổ huỳnh quang.
- Rhodamine B đang được thử nghiệm để sử dụng trong
vắcxin bệnh dại cho động vật hoang dã.
- Nó cũng được trộn vào thuốc diệt cỏ, được sử dụng để tạo
màu và nhuộm màu trong công nghiệp sợi, nhuộm màu để xét
nghiệm tế bào do tính bền màu.
- Rhodamine B được sử dụng trong sinh học như là một
thuốc nhuộm huỳnh quang.


TỔNG QUAN
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
- Phương pháp tối ưu nhất để xác định Rhodamine B là sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC). Đây là một phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong những
năm gần đây. Nó được áp dụng để tách nhận dạng và xác định hàng loạt các hợp chất
mà một số phương pháp khác gặp nhiều khó khăn như các hợp chất khơng bền với
nhiệt, các hợp chất có tính chất hố học tương tự nhau,…Phương pháp HPLC cũng có

nhiều ưu điểm mà các phương pháp khác khơng có như: xác định đồng thời được
nhiều chất, tốn ít mẫu, thao tác đơn giản,…
- Có 2 loại cột tách được sử dụng: cột trao đổi ion và cột tách pha đảo
- Detectơ ghép nối HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau rửa giải. Ngày
nay có rất nhiều loại detectơ được sử dụng đã mở rộng khả năng phát hiện nhiều loại
chất bằng phương pháp HPLC. Đối với phân tích dư lượng thì người ta hay sử dụng
detector khối phổ (MSD), nhất là tách và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp.
Cịn thơng dụng người ta dùng detectơ UV-Vis hay detectơ huỳnh quang. Dùng
detectơ UV-Vis thì xác định được nhiều loại chất, nhưng detectơ huỳnh quang
thường nhạy hơn, chọn lọc hơn và ít hơn các tương tác do các hợp chất có trong
nền mẫu. Ngồi ra cịn dùng một số detectơ khác như detectơ điot array
(DAD), detectơ điện hoá ,… các detectơ này cũng thường được ứng dụng để phân
tích các chất có trong phẩm nhuộm.


TỔNG QUAN
 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
- Nguyên tắc chung và trang bị của Phương pháp HPLC
HPLC là một kĩ thuật tách chất trong đó xảy ra quá trình các chất
tan chuyển dịch trong cộ t tách có chứa các chất nhồi kích thước
nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ
số phân bố của nó. Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp
ứng hiệu quả tách sắc ký tốt. Thành phần pha động có thể thay đổi
để đạt được lực rửa giải phù hợp nhất. Sau khi chất tan chuyển tới
cuối cột tách được chuyển tới detectơ để phát hiện. Tuỳ thuộc vào
bản chất của chất tan mà dùng các loại detectơ khác nhau
 Phương pháp UV- Vis xác định Rhodamine B
- Để xác định Rhodamine B, người ta còn sử dụng phương pháp
UV- Vis. Lấy mẫu chất đem hồ tan trong dung mơi thích hợp, lắc,
rung siêu âm và chiết lấy dung dịch. Đem dung dịch chiết được đo

bằng máy UV- Vis, dựa vào cực đại hấp thụ ta có thể định tính và
định lượng Rhodamine B


2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu|
- Phân tích Rhodamine B có trong thực phẩm, cụ thể là hạt dưa
- Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector hấp thụ
phân tử UV-Vis được lựa chọn. Từ đó xây dựng một quy trình
phân tích để áp dụng xác định Rhodamine B trong thực phẩm.


2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương
pháp
nghiên
cứu
- Đối tượng phân tích là các mẫu hạt dưa và chất phân tích là phẩm
màu. Thơng thường, trong các mẫu thực phẩm có rất nhiều thành phần,
nền rất phức tạp. Vì vậy chọn phương pháp HPLC (High Performance
Liquid Chromatography- Sắc ký lỏng hiệu năng cao) để khảo sát điều
kiện tách và định lượng Rhodamine B.
- Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm
tắt như sau:


2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Detector UV-Vis

Loại detector này thực chất là các máy đo hấp thụ phân tử vùng tử

ngoại (UV) và vùng khả kiến (Vis). Nhưng ở đây buồng đặt cuvet đo
được thay thế bằng các cuvet đo dòng chảy (flowcell). Việc đo để phá
hiện các chất phân tích hay hợp chất của nó vẫn dựa trên cơ sở tính
chất hấp thụ quang phân tử của chất ở trong dung dịch tại một độ
dài sóng nào đó, nhưng dung dịch ở đây là pha động của quá trình
sắc ký, nó chứa chất phân tích và chảy liên tục qua buồng đo
(flowcell). Các chất phân tích tan trong pha động có thể cho phổ hấp
thụ trực tiếp của chính nó. Như vậy nói chung tất cả các chât phân tích
hay hợp chất của nó đối với một thuốc thử mà có khả năng hấp thụ
quang nhạy tại một bước sóng nào đó trong vùng phổ UV-Vis đều có
thể được phát hiện và xác định bằng loại detector này. Nguyên tắc của
việc phát hiện định lượng ở đây là dựa theo định luật hấp thụ ánh sán g


2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Detector UV-Vis
Ta có cơng thức:

Trong đó:
- Aλ là độ hấp thụ quang của chất phân tích hay hợp chất
phức của nó với thuốc thử phân tích ở bước sóng λ.
- ε là hệ số độ hấp thụ quang phân tử (độ tắt phân tử)
- l là bề dầy của lớp hấp thụ (chiều dài của flowcell).


2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Detector UV-Vis
Về nguyên tắc cấu tạo, loại detector này bao gồm các phần chính như sau:

- Nguồn sáng điểm S: là đèn D2 (cho vùng phổ UV), hay đèn W- Halid

(cho vùng phổ Vis).
- Buồng mẫu và môi trường hấp thụ (flowcell).
- Bộ đơn sắc để thu chùm sáng, phân ly và chọn tia sáng cần đo. Trong các
detector đơn giản thì đây là một kính lọc cho các vùng phổ nhất định.
- Bộ phận điện tử thu nhận và khuếch đại tín hiện đo.
- Bộ phận chỉ thị kết quả.
Trong thực tế, rất nhiều chất hữu cơ và hợp chất phức của kim loại với một
thuốc thử phân tích đều có thể được phát hiện và xác định bằng loại detectơ
này. Detectơ UV- Vis đang được dùng phổ biến nhất trong kỹ thuật HPLC v
nó có độ nhạy tương đối cao, đơn giản, dễ dùng và không quá đắt.


2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phân tích định lượng bằng HPLC
- Trong điều kiện phân tích đã chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất là thời gian lưu t Ri

của chất đó trên cột tách. Chúng ta có thể dựa vào thời gian lưu này để định tính (thơng
qua mẫu chuẩn). Sau đó dựa vào các tín hiệu phân tích thu được (chiều cao peak hoặc diệ
tích peak) để định lượng các chất.
- Để biết tỷ số khối lượng của chất tan phân bố vào mỗi pha là bao nhiêu, ta dựa vào hệ
số lưu ki
k’I là hệ số lưu
m(SP) là khối lượng chất tan phân bố vào pha tĩnh.
m(MP) là khối lượng chất tan phân bố vào pha động.
TRi là thời gian lưu của chất thứ i
TR0 là thời gian chết của cột tách.


2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phân tích định lượng bằng HPLC
Thường trong phương pháp HPLC biểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc
vào chiều cao peak hoặc diện tích.
H= k.Cb
S= k. Cb
H là chiều cao peak sắc ký của chất
S là diện tích peak sắc ký của chất
k là hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký
b- là hằng số bản chất, nó nhận giá trị trong vùng: 0 < b ≤ 1
Ở vùng nồng độ nhỏ thì b= 1, mối quan hệ giữa H(S) với C là tuyến tính:
H= k1.C = f(C)
S= k2.C =f(C)


2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hóa chất và dụng cụ trong nghiên cứu
Hoá chất: Các loại hoá chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh
khiết phân tích và HPLC
Dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn gốc 50 ppm: cân một lượng chính xác chất
chuẩn Rhodamine B vào cốc 50 ml, hồ tan và chuyển vào bình định
mức 50 ml, định mức bằng methanol ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ, bảo
quản tránh ánh sáng ở 4oC.
Dung dịch chuẩn 2 ppm: lấy 2 ml dung dịch chuẩn gốc 50 ppm
cho vào bình định mức 50 ml, định mức tới vạch bằng methanol
và lắc kỹ, bảo quản ở 4oC, tránh ánh sáng.
Các dung dịch chuẩn nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn làm
việc, sử dụng trong ngày.

2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hóa chất và dụng cụ trong nghiên cứu
Các loại hoá chất khác
Methanol loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Acetonitril loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Axit fomic loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Trietyl amin loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Natri 1-heptansunfonat của Merk
Ethanol loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Axeton loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Dụng cụ
Ống đong
Các bình định mức: 5, 10, 20, 50 ml
Lọc chân không
Pipet: 1, 2, 5, 10 ml
Cattrige lọc cỡ 0,45m, 0,2m, cột chiết pha rắn
Pipet man,...


2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Máy móc và thiết bị
 Máy quang phổ UV-Vis 8453 của hãng Agilent- Mỹ với dải phổ từ 190-1100 nm,
điều khiển bằng phần mềm Chemstation.
 Máy đo pH TIM 800 của hãng Radiometer- Đan Mạch với điện cực thủy tinh RedRod cho phép đo pH và bổ chính nhiệt độ tự động.
 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của hãng Shimadzu, Nhật Bản gồm:
 Bộ loại khí cho dung mơi, Degasser- DGU- 14AM
 Bộ trộn dung môi FCV- 10ALVP.
 Bơm dung môi bốn kênh LC- 10ATVP

 Bộ ổn nhiệt cho cột tách CTO- 10ASVP
 Van bơm mẫu 6 chiều VS- 7725i của Rheodyne, Mỹ với thể tích vịng mẫu
(sample loop) 20 µl.
 Detector UV-Vis SPD- 10AVVP
 Hệ điều khiển SCL- 10AVP
 Phần mềm điều khiển và xử lý LC solution Version 1.11SP1.
 Cân phân tích độ chính xác 0,1mg, bể siêu âm, tủ lạnh, máy điều nhiệt, tủ sấy


3. KẾT QUẢ
Các điều kiện sắc ký
Pha tĩnh: RP- C8 (4,6 x 150 mm, 5µm)
Pha động: 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- 7mM natri 1heptansunfonat), pH=3
Tốc độ pha động: 0,8 ml/phút
Nhiệt độ cột tách: 30oC
Thể tích vịng mẫu: 20µl
Detector: UV-Vis 550 nm


3. KẾT QUẢ
Giới hạn phát hiện (limit of detection- LOD) Xác định theo 2 phương
pháp:

Phương pháp tính tốn theo đường chuẩn
Dựa vào đường chuẩn ta có: LOD = 3 x SB/b
MRLRhodamine B = 10μg/kg
Trong đó:
b là hệ số góc của phương trình hồi quy
SB là độ lệch chuẩn của mẫu trắng, cũng được xác định theo phương trình hồi quy.

Như vậy theo phương trình hồi quy ta có:
LOD= 0,015 µg/ml = 15ppb
Phương pháp trực tiếp
Dùng chính chất phân tích tiến hành pha lỗng liên tục chất phân
tích trong pha động, rồi cho chạy sắc ký tới khi nào chiều cao peak thu
được vẫn còn khả năng phân biệt được với tín hiệu nền thì nồng độ đó được
coi là giới hạn phát hiện.


3. Kết quả
Tiến hành pha loãng dung dịch gốc 50 ppm thành các dung dịch
thử 1ppm, 0,5ppm, 0,1ppm, 0,01ppm, 0,001ppm.

Tại nồng độ 0,001ppm chiều cao peak thu
được vẫn còn khả năng phân biệt được với
tín hiệu nền, có chiều cao gấp hơn ba lần
so với tín hiệu nền.

Vì vậy giới hạn phát hiện là
0,001ppm (hay 1ppb).


3. KẾT QUẢ
Giới hạn định lượng (limit of quanlity- LOQ)
Giới hạn định lượng là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ
thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích (y Q) ) khác có ý
nghĩa định lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền (blank or
background).
LOQ = 10 x SB/b
Trong đó:

b là hệ số góc của phương trình hồi quy
SB là độ lệch chuẩn của mẫu trắng, cũng được xác định theo phương trình
hồi quy.
Như vậy theo phương trình hồi quy ta có:
LOQ= 0,0502 µg/ml
Hay LOQ= 50,2 ppb
Theo phương pháp trực tiếp, giới hạn phát hiện là 3,33 ppb.


3. KẾT QUẢ
Độ chính xác của phép đo
Độ chính xác của phép đo được đánh giá thông qua phần trăm sai số.
Chọn các mẫu phân tích có nồng độ tại điểm đầu, cuối và giữa khoảng tuyến tính
đã khảo sát. Chúng tơi tiến hành chuẩn bị 3 mẫu chuẩn có nồng độ lần lượt là
0,1ppm; 0,5ppm; 1,0ppm rồi tiến hành chạy sắc ký, mỗi mẫu chạy lặp 8
lần.
Phần trăm sai số được tính theo cơng thức sau:

Trong đó: Si là diện tích tính từ đường chuẩn
St là diện tích theo sắc đồ


3. KẾT QUẢ

Phân tích mẫu thực phẩm, quy trình xử lý và kết quả phân tích
Khảo sát dung mơi chiết lấy Rhodamine B
Xử lý sơ bộ mẫu phân tích
Áp dụng các điều kiện tối ưu được để phân tích bốn đối tượng mẫu l
hạt dưa
Tổng số mẫu phân tích là 3 mẫu/đối tượng. Cứ ba đơn vị mẫu của

một đối tượng thu thập được trộn với nhau thành mẫu phức hợp để phân
tích.
Phương pháp chọn mẫu: Mẫu được chọn theo phương pháp chủ địn
có định hướng tại 3 chợ, mỗi chợ mua một đơn vị mẫu trên một đối tượng
mẫu. Mẫu thực phẩm được mua tại một số chợ ở Hà Nội: chợ Đồng Xuân,
chợ Mơ, Chợ Ngã Tư Sở.
Mẫu thực phẩm mua về được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC
mẫu đem phân tích được sấy khơ ở nhiệt độ 40oC, nghiền nhỏ, cân
với lượng cân chính xác và được chiết trong dung mơi chiết thích hợp.