BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) XÁC ĐỊNH dư LƯỢNG β AGONIST TRONG THỊT HEO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM – KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y
MƠN DƯỢC PHÂN TÍCH

XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG β-AGONIST
TRONG THỊT HEO
GVHD:
DANH SÁCH NHÓM


TỔNG QUAN VỀ β-agonist
Họ β-agonist là một trong những hợp chất được đưa vào chăn nuôi, đặc biệt là
chăn nuôi heo để kích thích heo tăng trưởng và cho thịt siêu nạc. Tuy nhiên loại
dược liệu này là những chất kích thích mạnh gây hại cho gia súc và người nếu
ăn phải thịt vật nuôi được nuôi bằng thức ăn có trộn các loại dược liệu trên.

I.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Clenbuterol là loại chất kích thích tuyến thượng thận, điều tiết sinh trưởng
động vật, thúc đẩy quá trình phát triển cơ bắp, làm tăng lượng thịt nạc và đẩy nhanh
việc phân giải mỡ, giảm tối đa lượng mỡ hình thành trong cơ thể, chỉ để lại một lớp rất
mỏng. Clenbuterol trộn vào thức ăn gia súc nhằm tạo ra vật nuôi siêu nạc, mau lớn.
Đối với gia súc như heo, khi ăn phải chất này chỉ có thể tồn tại được quá nửa tháng là
phải giết mổ.
Tuy nghiên, nếu dùng Clenbuterol quá liều sẽ trở thành chất độc. Việc ăn phải
thịt lợn chứa chất Clenbuterol về lâu dài có thể gây nguy hiểm đối với sức khoẻ con
người, có nguy cơ gây tổn hại cho hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, bị ảnh hưởng xấu lên
tim mạch, làm cho tim đập nhanh, tăng huyết áp, run cơ, gây biến chứng ung thư, ngộ
độc cấp, rối loạn tiêu hóa, choáng váng… và có thể dẫn đến tử vong.

I.1 Tình hình nhiễm clenbuterol trên thế giới

Clenbuterol là chất phổ biến nhất trong nhóm β-agonist, bị cấm sử dụng trong
thức ăn gia súc tại nhiều nước:
. Năm 1988 ở các nước châu Âu và năm 1991 ở Mỹ đã cấm đưa clenbuterol
vào thức ăn chăn nuôi.
. Năm 1990, tại Tây Ban Nha có 135 người bị ngộ độc clenbuterol sau khi ăn
gan bị.
. Ở Hồng Kơng từ năm 1998 đến 2001, mỗi năm trung bình có 15 vụ ngộ độc
thực phẩm được xác nhận có liên quan đến thịt nhiễm độc clenbuterol.
. Ngày 31 tháng 12 năm 2001 clenbuterol bị cấm dùng trong thức ăn gia súc.
I.2 Tình hình nhiễm clenbuterol ở Việt Nam
- Ở Việt Nam, từ năm 2002, Bộ Nông nghiệp đã có Quyết định số 54/QĐ-BNN
cấm sản xuất, nhập khẩu và lưu thông một số kháng sinh, hóa chất sử dụng trong thức
ăn chăn nuôi, trong đó có clenbuterol.
- Năm 2005, Chi cục Thú y TP.HCM đã mở rộng kiểm tra và phát hiện một số
mẫu thịt lợn bày bán trên thị trường có chất Clenbuterol
- Một năm sau, trong một cuộc hội thảo về hormone tăng trưởng do Viện
KHKT Nông nghiệp miền Nam và Hiệp hội thức ăn chăn nuôi tổ chức, Cục Chăn nuôi
(Bộ NN&PTNT) đã công bố kết quả kiểm tra (từ 20/6 - 3/11/2006), cơ quan chức
năng đã phát hiện 47/428 mẫu dương tính với Clenbuterol (chiếm gần 11%).
- Năm 2011, trong số gần 500 mẫu thịt lợn đang bày bán tại các chợ TP.HCM,
có gần 30% mẫu dương tính với Clenbuterol. Đáng lo là khi có kết quả xét nghiệm
này thì tồn bộ số thịt heo trên đã được tiêu thụ hết.
- Hiện nay, tuy tại các tỉnh miền Nam, tình trạng lợn nhiễm độc Clenbuterol
đang lan tràn trên diện rộng, nhưng hiện thị trường miền Bắc chưa phát hiện thịt lợn
nhiễm Clenbuterol.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

II.1 Đối tượng
- Thí nghiệm được thực hiện trên mẫu thịt heo và gan heo được lấy trực tiếp từ
các lò giết mổ.
II.2 Phương pháp
- Sử dụng phương pháp phân tích sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Đây là phương
pháp tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao, mẫu chất thu lại dễ dàng.
2.1 Dấu hiệu nhận biết:
-Tính chất lý hóa của Clenbuterol:
▪ Dạng tinh thể không màu, mịn.
▪ Phân tử gam: 277,19
▪ Nhiệt độ nóng chảy: 174-175,5 oC
▪ Nhiệt độ sôi: 404,9oC
▪ Clenbuterol tan nhiều trong nước, aceton, methanon, ethanon, ít tan trong
chloroform, khơng tan trong benzen.
-Thịt lợn có chứa clenbuterol thường có màu đỏ tươi khác thường, lớp mỡ
mỏng, lỏng lẽo, thịt chạm vào có cảm giác như bị ứ nước, da xuất hiện đốm đỏ.
2.2 Dụng cụ và thiết bị hóa chất
2.2.1 Máy sắc ký lỏng cao áp HPLC
Máy sắc ký lỏng cao áp gồm các bộ phận chính: bơm chịu áp suất (pump),
van tiêm mẫu (injector), cột sắc ký lỏng (column), đầu dò (detector) và phần điều
khiển và xử lý số liệu (data processor).


2.2.2 Thiết bị
và hóa chất
-

Thiết bị:

Hệ

thống

máy

LC-MS/MS
Thermo
Finnigan
gồm:
• Hệ thống máy
sắc ký lỏng: Bơm và

hệ thống tiêm mẫu tự động

• Đầu dị khối phổ ba tứ cực TSQ Quantum Access với hai loại nguồn ion
hóa ESI và APCI.
• Cột sắc ký lỏng pha đảo Purospher Star C18, 150 mm x 4,6 mm, kích cỡ
hạt 5 µm, cột bảo vệ pha đão C18 (hãng Merck)
• Phần mềm Xcalibur, điều khiển thiết bị và xử lý dữ liệu sắc ký
- Hóa chất và dung dịch thử
• Nước cất 2 lần khử ion, CH3OH loại HPLC; H3PO4, p.a (pure analysis);
HCOOH loại HPLC và K2HPO4, p.a (pure analysis); Dung dịch thử K2HPO4 0,1M
• Dung dịch pha động: MeOH (0,1% HCOOH) và H 2O (0,1% HCOOH)
(v/v) .

2.2.3. Chất chuẩn và nội chuẩn
• Clenbuterol hydrochloride, Dr. Ehrenstorfer, 95% (C12H18Cl2ON2, HCl)
• Clenbuterol–d9 (100 mg/L), Dr. Ehrenstorfer (C12H9D9Cl2ON2).

2.3 Điều kiện và quy trình thực hiện
2.3.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký
a.Khảo sát chọn bước sóng thích hợp: khảo sát để lựa chọn bước sóng thích
hợp cho việc phát hiện Clenbuterol.
b.Lựa chọn cột:
c.Lựa chọn đệm: lựa chọn đệm có pH để peak clenbuterol tách tốt, cân xứng
và không làm giảm tuổi thọ cột.
d.Lựa chọn pha động: khảo sát lựa chọn pha động sao cho peak gọn, cân
xứng và hệ số bất đối thấp nhất.
e.Lựa chọn tốc độ dòng: sao cho peak cân đối, thời gian chạy sắc ký phù
hợp.
2.3.2. Quy trình thực hiện

2.4
Tiến hành
phân

tích

trên máy

III. TÍNH TOÁN VÀ KẾT QUẢ:
Bảng 1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong q trình phân tích:

Nhận xét: Kết quả từ bảng 1 cho thấy các diện tích peak của mỗi ion lần lượt trong dd
chuẩn và dung dịch chuẩn thêm vào nền mẫu sau xử lý tương tự nhau, điều này chứng
tỏ không có hiệu ứng nền trong giai đoạn tạo ion ở đầu dò khối phổ.


Kết quả xây dựng đường chuẩn Clen trên nền thịt

70

Y = 0,663x-0084

60

2
R =1

Clen (Nền thịt)

50
40
30
20

Co (μg/L)

10
0
20

40

60

80

100

Đường chuẩn Clen nền thịt

Kết quả xác định hiệu suất thu hồi
Đường chuẩn để xác định hiệu suất thu hồi được xây dựng trên dung dịch
và trên các nền mẫu thịt, gan.
Hiệu suất thu hồi của Clen trên thịt heo được xác định dựa trên đường
chuẩn của tỉ lệ diện tích ion chuẩn và nội chuẩn theo nồng độ của Clen trên các nền
mẫu. Hiệu suất thu hồi của phương pháp (H pp ), với việc sử dụng nội chuẩn đồng vị
phải đạt khoảng 100%. Có thể ước tính hiệu suất thu hồi thực (H t ) trong tách chiết
bằng cách dựa trên đường chuẩn xây dựng từ các dung dịch chuẩn. Kết quả được trình
bày trong bảng 2:
Bảng 2: Hiệu suất thu hồi của Clen trên nền thịt:


Nhận xét: Hiệu suất thu hồi của p.pháp đạt khoảng 100% như đã dự đoán và hiệu suất
tu hồi thực trên nền các mẫu khảo sát đạt các kết quả như sau: mẫu có nồng độ 0,0550μg/Kg, hiệu suất thu hồi đạt 68,5-86,78%
Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
Bảng 3: Giá trị LOD và LOQ của Clen:
LOD (RSD%)
Nền mẫu

Cmẫu

Co

(μg/Kg)

(μg/Kg)

(μg/Kg)

LOQ (μg/Kg)
(RSD%)

n=6
Thịt (2g)

0,0991

0,0495

0,017 (14,14)

0,051 (14,14)


Nhận xét: Kết quả cho thấy giá trị LOD,LOQ của Clen rất nhỏ đáp ứng được tiêu
chuẩn của Châu Âu, Codex và phù hợp với quy định của VN.

Bảng 4: Kết quả điều tra hàm lượng Clenbuterol trong thịt heo:
Loại mẫu

Tổng số mẫu

Nhiễm Clenbuterol

Thịt

28

5 (1,36-6,12)

IV. KẾT LUẬN
Các kết quả trên đã đề xuất được phương pháp phân tích hiện đại để định lượng
Clenbuterol bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực có sử dụng nội
chuẩn đồng vị (Clenbuterol-d9) cho kết quả chính xác, độ tin cậy cao.
Quy trình đạt tiêu chuẩn phân tích theo u cầu của châu Âu, với các giá trị đạt
được như sau:
- Hiệu suất thu hồi của phương pháp (HPP %) khoảng 100% và quy trình
được sử dụng để định lượng chính xác nồng độ của clenbuterol trong thịt và gan heo.
- Hiệu suất thu hồi thực (HT %) từ tách chiết:
Mẫu có nồng độ 0,05 – 50 (μg/Kg), HT%: 68,5 – 86,78%


- Giới hạn phát hiện (LOD) khá thấp cho clenbuterol:
LODClen = 0,017 ( μg/Kg)
Các trị số LODClen cho thịt (LOD 1/5 MRL) phù hợp với giá trị tối đa cho phép
MRL theo cả tiêu chuẩn châu Âu và Codex

V. TÀI LIỆU THAM KHẢO:
Luận án Đánh giá hàm lượng các chất β-agonist (clenbuterol và salbutamol)
trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép
khối phổ của Nguyễn Thị Thu Thủy.
[ />
Đồ án tốt nghiệp Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng
phương pháp HPLC.
[ />