Tách chiết, tinh sạch và cố định enzyme bromelain từ dứa

MỤC LỤC
TRANG
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ........................................................................................ 1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1
1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI ...................................................................................... 2
1.2.1.

Mục tiêu tổng quát............................................................................. 2

1.2.1.

Mục tiêu cụ thể................................................................................... 2

1.3. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU.............................................................................2
1.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 3
1.4.1.

Nghiên cứu lý thuyết............................................................................3

1.4.2.

Nghiên cứu thực nghiệm......................................................................3

1.5. GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI ............................................................................... 3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.............................. 4
2.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY DỨA.............................................................................. 4
2.1.1.

Lịch sử và sự phát triển của cây dứa .................................................. 4

2.1.2.

Thành phần dinh dưỡng trong dứa.......................................................5

2.1.3.

Các bộ phận trên cây dứa có thể cho enzyme bromelain .................... 6

2.1.3.1. Quả ............................................................................................ 6
2.1.3.2. Thân .......................................................................................... 6
2.1.3.3. Lá ............................................................................................. 6
2.1.3.4. Rễ ............................................................................................. 6
2.2. GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ ENZYME ........................................................ 7
2.3. ENZYME PROTEASE.................................................................................... 8
2.3.1.

Giới thiệu sơ lược các enzyme protease...............................................8
Trang 1


2.3.1.1. Protease vi sinh vật..................................................................... 8
2.3.1.2. Protease động vật....................................................................... 9
2.3.1.3. Protease thực vật...................................................................... 10
2.3.2.

Ứng dụng của enzyme protease..........................................................10

2.4. ENZYME BROMELAIN THU NHẬN TỪ DỨA......................................... 11
2.4.1.

Giới thiệu enzyme bromelain.............................................................11

2.4.2.

Tính chất vật lý của enzyme bromelain............................................. 11

2.4.3.

Tính chất hoá học của enzyme bromelain..........................................12

2.4.3.1. Cấu tạo hoá học........................................................................ 12
2.4.3.2. Cấu trúc không gian của bromelain.......................................... 13
2.4.4.

Hoạt tính của enzyme bromelain....................................................... 13

2.4.4.1. Cơ chế tác động........................................................................ 14
2.4.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain........... 14
2.4.5.

Ứng dụng của enzyme bromelain...................................................... 16

2.4.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm.................................................. 16
2.4.5.2. Trong y dược học..................................................................... 17
2.4.5.3. Một số enzyme bromelain thương mại..................................... 17
2.4.6.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain..... 18

2.4.6.1. Nghiên cứu trong nước............................................................. 18
2.4.6.2. Nghiên cứu ngoài nước............................................................ 18

2.5. KĨ THUẬT CƠ BẢN CHUẨN BỊ DỊCH PROTEIN THÔ............................ 19
2.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN........................................................ 19
2.6.1.

Tủa bằng muối sulfate ở các nồng độ khác nhau............................... 19

2.6.2.

Tủa bằng dung môi hữu cơ................................................................ 20
Trang 2


2.6.3.

Tủa bằng điểm đẳng nhiệt................................................................. 20

2.6.4.

Tủa bằng các loại polymer................................................................ 20

2.6.5.

Tủa bằng các chất đa điện phân......................................................... 21

2.7. SỰ CỐ ĐỊNH ENZYME................................................................................. 21
2.7.1.

Định nghĩa enzyme cố định............................................................... 21

2.7.2. Tính chất ưu và nhược của enzyme cố định...................................... 21

2.7.2.1. Ưu điểm.................................................................................... 21
2.7.2.2. Nhược điểm.............................................................................. 22
2.7.3.

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định........................ 22

2.7.4.

Các phương pháp cố định enzyme..................................................... 23

2.7.4.1. Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định.................. 23
2.7.4.2. Phương pháp hấp thụ vật lí....................................................... 24
2.7.4.3. Phương pháp nhốt..................................................................... 24
2.7.4.4. Phương pháp khâu mạch.......................................................... 25
2.7.5.

Đặc điểm, tính chất của Natrialginate................................................ 25

2.7.6.

Ứng dụng của enzyme cố định.......................................................... 26

2.7.6.1. Trong công nghiệp.................................................................... 26
2.7.6.2. Trong y học.............................................................................. 26
2.7.6.3. Trong nghiên cứu khoa học...................................................... 27
2.7.6.4. Trong bảo vệ môi trường.......................................................... 27
2.7.7.

Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước............................... 27

2.7.7.1. Tình hình nghiên cứu trong nước............................................. 27
2.7.7.2. Tình hình nghiên cứu nước ngoài............................................. 28
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...............................................29
Trang 3


3.1. VẬT LIỆU .................................................................................................... 29
3.1.1.

Chế phẩm enzyme thô....................................................................... 29

3.1.2.

Hóa chất............................................................................................ 30

3.1.3.

Thiết bị.............................................................................................. 30

3.2. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .................................................................. 31
3.2.1.

Chiết thô enzyme từ chế phẩm dứa....................................................31

3.2.2.

Phương pháp xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain từ

dịch chiết enzyme thô.....................................................................................32
3.2.2.1. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford....... 33

3.2.2.2. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano............. 35
3.2.3.

Tách enzyme bằng các phương pháp tủa bằng cồn 960, muối

Ammonium sulfate (NH4)2SO4 và aceton(CH3COCH3)...................................39
3.2.3.1. Nguyên tắc............................................................................... 39
3.2.3.2. Phương pháp thí nghiệm tủa enzyme bằng cồn 960.................. 39
3.2.3.3. Phương pháp thí nghiệm tủa bằng muối Ammonium sulfate.... 40
3.2.3.4. Phương pháp thí nghiệm tủa bằng aceton................................. 41
3.2.4.

Phương pháp xác định tỉ lệ cồn 960, nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỉ lệ

aceton tối ưu để tủa enzyme bromelain...........................................................42
3.2.5.

Phương pháp xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt

động của enzyme bromelain............................................................................42
3.2.5.1. Xác định pH tối ưu cho hoạt động của bromelain.................... 42
3.2.5.2. Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của bromelain............ 42
3.2.5.3. Khảo sát độ bền nhiệt............................................................... 43
3.2.6.

Cố định enzyme bromelain trên cơ chất Natrialginate bằng phương

pháp nhốt........................................................................................................43
Trang 4

3.2.6.1. Tạo dung dịch Natrialginate 3%................................................ 43
3.2.6.2. Tiến hành cố định...................................................................... 43
3.2.6.3. Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố
định hoạt tính của enzyme cố định.........................................................43
3.2.7.

Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố lý hoá đến hoạt tính

của enzyme bromelain được cố định trên Natrialginate..................................44
3.2.7.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH...................................................... 44
3.2.7.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ.............................................. 45
3.2.7.3. Khảo sát độ bền nhiệt............................................................... 45
3.2.8.

Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate..... 45

3.2.9.

Bước đầu tinh sạch enzyme bromelain chồi dứa bằng sắc ký lọc gel 46

3.2.9.1. Nguyên tắc............................................................................... 46
3.2.9.2. Thiết bị và hóa chất.................................................................. 46
3.2.9.3. Các bước tiến hành................................................................... 47
3.2.9.4. Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme protease và độ tinh sạch của
enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel...............................................49
3.2.10. Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp
điện di SDS - PAGE........................................................................................49
3.2.10.1. Nguyên tắc............................................................................. 50
3.2.10.2. Thiết bị và hóa chất................................................................ 50

3.2.10.3. Phương pháp........................................................................... 52
3.2.10.4. Xác định trọng lượng phân tử của protein.............................. 54
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ........................................................ 55
4.1. HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT TÍNH ENZYME BROMELAIN DỊCH
CHIẾT THÔ CÁC BỘ PHẬN TRÊN QUẢ DỨA..................................................55
Trang 5


4.2. KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ CỒN 960..... 56
4.2.1.

Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa

là cồn 960........................................................................................................ 56
4.2.2.

Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain

bộ phận chồi trong dịch tủa cồn với tỉ lệ 1 dứa : 4 cồn................................... 58
4.2.2.1. pH tối ưu.................................................................................. 58
4.2.2.2. Nhiệt độ tối ưu.......................................................................... 59
4.2.2.3. Khảo sát độ bền nhiệt............................................................... 60
4.3. KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ MUỐI
AMMONIUM SULFATE...................................................................................... 61
4.3.1.

Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa

là muối Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)....................................................... 61
4.3.2.

Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain

bộ phận chồi trong dịch tủa muối với nồng độ 60%....................................... 62
4.3.2.1. pH tối ưu.................................................................................. 62
4.3.2.2. Nhiệt độ tối ưu.......................................................................... 63
4.3.2.3. Khảo sát độ bền nhiệt............................................................... 64
4.4. KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ ACETON
(CH3COCH3).......................................................................................................... 66
4.4.1.

Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa

là aceton (CH3COCH3)................................................................................... 66
4.4.2.

Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain

bộ phận chồi trong dịch tủa aceton với tỉ lệ 1 dứa : 5 aceton......................... 67
4.4.2.1. pH tối ưu.................................................................................. 67
4.4.2.2. Nhiệt độ tối ưu.......................................................................... 68
4.4.2.3. Khảo sát độ bền nhiệt............................................................... 69
Trang 6


4.5. SO SÁNH VIỆC TỦA ENZYME BROMELAIN TRONG CỒN 960, MUỐI
AMMONIUM SULFATE VÀ ACETON............................................................... 70
4.6. CỐ ĐỊNH ENZYME BROMELAIN TRÊN NATRIALGINATE................. 71
4.6.1.

Kết quả quá trình cố định enzyme bromelain trên chất mang

Natrialginate................................................................................................... 71
4.6.2.

Hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme

bromelain trên gel Natrialginate..................................................................... 71
4.6.3.

So sánh hàm lượng và hoạt tính enzyme bromelain cố định với hàm

lượng và hoạt tính enzyme trước khi cố định................................................. 72
4.6.4.

Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Natrialginate theo pH,

nhiệt độ và độ bền nhiệt................................................................................. 72
4.6.4.1. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo pH....................... 72
4.6.4.2. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo nhiệt độ............... 74
4.6.4.3. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo độ bền nhiệt........ 75
4.6.5.

Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate..... 76

4.6.6.

So sánh độ bền nhiệt của chế phẩm enzyme ban đầu trước khi cố định

và enzyme cố định trên Natrialginate............................................................. 78

4.7. TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN TRÊN BIOGEL P-100................... 79
4.7.1.

Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain trước khi tinh sạch......... 79

4.7.2.

Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel với các thông số.................... 79

4.7.3.

Tinh sạch enzyme đã tủa với cồn 960................................................ 79

4.7.4.

Tinh sạch enzyme đã tủa với muối Ammonium sulfate.................... 80

4.7.5.

Tinh sạch enzyme đã tủa với aceton.................................................. 82

4.7.6.

So sánh kết quả giữa chế phẩm enzyme thô và dịch enzyme sau khi đã

qua quá trình sắc ký lọc gel............................................................................ 83

Trang 7

4.8. KẾT QUẢ PHÂN TÁCH HỆ ENZYME BROMELAIN BẰNG PHƯƠNG
PHÁP ĐIỆN DI SDS - PAGE................................................................................ 84
4.8.1.

Thành phần mẫu điện di.................................................................... 84

4.8.2.

Kết quả điện di.................................................................................. 84

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 87
5.1. KẾT LUẬN ................................................................................................... 87
5.2. KIẾN NGHỊ ..................................................................................................89
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................I
PHỤ LỤC ............................................................................................................III

Trang 8


CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây người ta dành sự quan tâm rất nhiều đến việc tách
chiết enzyme bromelain để sử dụng làm tác nhân kích thích tiêu hóa, chữa vết thương,
ổn định dịch lên men. Việc nghiên cứu thành công một enzyme là ở việc chiết xuất,
xác định đặt tính, yếu tố ảnh hưởng hoạt động của enzyme. Việc tinh chế enzyme hết
sức cần thiết bởi làm cho enzyme tinh sạch ít còn lẫn tạp chất (các protein không phải
enzyme), nâng cao hoạt tính enzyme so với dạng thô nhiều lần, thuận lợi cho nghiên
cứu, bảo quản, nguyên liệu cho một số ngành công nghệ thực phẩm và trong dược
phẩm dùng làm thuốc trong điều trị và sản xuất.

Bên cạnh đó việc nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme bromelain cũng đang được
nghiên cứu. Phương pháp cố định enzyme là một trong những hướng nghiên cứu nhằm
nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme. Bằng cách cố định enzyme trong chất mang
không tan trong nước enzyme có thể tách ra khỏi cơ chất dễ dàng sau phản ứng. Thêm
vào đó enzyme cố định được tái sử dụng nhiều lần khắc phục tình trạng khan hiếm
enzyme như hiện nay.
Ngày nay, enzyme đã được sản xuất và sử dụng trong nhiều lĩnh vực như công
nghệ thực phẩm, y học, dược phẩm và các ngành công nghiệp khác. Đối với nước ta
nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn vì nguồn nguyên liệu rất phong phú (dứa,
đu đủ,...). Trong quá trình chế biến dứa đóng hộp chỉ khoảng 30% quả dứa được sử
dụng, còn lại 70% phụ phẩm mà chủ yếu là chồi trên quả dứa, thân dứa (Hội thảo quốc
gia năm 2005). Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa có thể giảm thiểu chất thải
hữu cơ gây ô nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm bromelain bởi vì hầu
như trên tất cả các bộ phận của cây dứa đều có enzyme. Bromelain có ba hoạt tính
khác nhau: peptidase, amidase, esterase. Bromelain thân, chồi có thể phân hủy cả cơ
chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp, chúng là enzyme có giá trị kinh tế và hầu hết sản
phẩm bromelain thương mại được ly trích từ thân dứa.
Trang 9


Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành tách chiết, tinh sạch enzyme bromelain ở
quy mô nhỏ. Khảo sát các tác nhân tủa, xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt
cho hoạt động của enzyme trên chồi dứa. Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate
bằng phương pháp tủa muối Ammonium sulfate.
1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
Tách chiết và tinh sạch enzyme bromelain từ chồi dứa.
Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
Thu nhận dịch enzyme bromelain từ các bộ phận quả dứa: chồi dứa, mắt dứa,

thân dứa, cùi dứa.
Xác định tỉ lệ cồn 96o, nồng độ muối Ammonium sulfate và tỉ lệ aceton tối ưu để
tủa enzyme bromelain.
Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho sự hoạt động của enzyme
bromelain.
So sánh các tác nhân tủa của bộ phần chồi dứa sau khi tủa.
Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate.
So sánh hàm lượng và hoạt tính enzyme bromelain cố định với hàm lượng và
hoạt tính enzyme trước khi cố định.
Tinh sạch enzyme bromelain.
Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di.
1.3. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
Làm cơ sở nghiên cứu để sản xuất enzyme bromelain từ lượng phế phẩm lớn là
chồi dứa. Đồng thời cố định enzyme bromelain trên cơ chất Natrialginate để mang lại
hiệu quả kinh tế trong công nghiệp.

Trang 10


1.4.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.4.1. Nghiên cứu lý thuyết
Thu thập tài liệu trong và ngoài nước có liên quan đến nội dung nghiên cứu.
Tổng hợp phân tích, so sánh và đánh giá lựa chọn hướng nghiên cứu phù hợp.
Phân tích đánh giá điều kiện thực tế về kỹ thuật, kinh tế, xã hội để xác định giới
hạn nghiên cứu và phương án thực nghiệm.
1.4.2. Nghiên cứu thực nghiệm
Lập kế hoạch thực hiện thí nghiệm.

Xử lý kết quả bằng Excel và phần mềm Statgraphics.
1.5. GIỚI HẠN ĐỀ TÀI
Vì lý do giới hạn về thời gian và kinh tế, đề tài chỉ thực hiện tủa enzyme với ba
tác nhân tủa (muối, cồn và aceton), tinh sạch enzyme bromelain trên Biogel P-100,
điện di bằng phương pháp SDS-PAGE và chỉ thực hiện cố định enzyme trên cơ chất
Natrialginate ở quy mơ phịng thí nghiệm.

Trang 11


CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY DỨA

Hình 2.1: Dứa trước khi thu hoạch

Hình 2.2: Dứa sau khi thu hoạch

2.1.1. Lịch sử và sự phát triển của cây dứa
Dứa là trái cây của miền nhiệt đới, có nguồn gốc từ các quốc gia Brazil, Paraguay
ở Trung và Nam Mỹ.
Khi Christopher Columbus (1451-1506) thám hiểm châu Mỹ, thấy dứa trồng ở
quần đảo Guadeloup rất ngon, bèn mang về triều cống nữ hoàng Tây Ban Nha Isabella
Đệ Nhất. Từ đó, dứa được đem trồng ở các thuộc địa của Tây Ban Nha, nhất là các
quốc gia thuộc khu vực Thái Bình Dương như Phi Luật Tân.
Tiếng Anh của Dứa là Pinapple. Các nhà thám hiểm Tây Ban Nha thấy trái dứa
nom giống như chốp quả thông, bèn đặt tên là “Pina”. Người Anh thêm chữ “Apple”
để nói rõ hơn về tính ngọt dịu, ăn được của trái này.

Trang 12


Tiếng Việt còn gọi Dứa là trái Thơm hay Khóm, có lẽ vì hương thơm dìu dịu
thoát ra từ trái dứa vừa chín tới.
Dứa là trái cây nhiệt đới, thích hợp với môi trường ẩm thấp, nhưng có thể chịu
đựng tới nhiệt độ 280F (-20C), nhưng ở nhiệt độ lạnh, cây chậm lớn và trái chua. Nông
trại trồng dứa quy mô lớn đầu tiên trên thế giới được thiết lập ở Hawaii vào năm 1885.
Sau đó, Phi Luật Tân là nước trồng nhiều và sản xuất cảng nhiều nhất. Các quốc gia
khác ở Đông Nam Á cũng sản xuất một khối lượng dứa khá lớn. Dứa có quanh năm,
nhưng nhiều nhất vào tháng 3 và tháng 7. Trung bình thời gian từ lúc trồng tới lúc thu
hoạch là 18 tháng. Dứa thường được hái khi đã chín, sẵn sàng để ăn. Hái khi dứa cịn
xanh, dứa sẽ khơng chín tiếp vì không có đủ tinh bột để chuyển thành đường.
Ở Việt Nam, dứa được trồng rất nhiều ở Phú Thọ, Ninh Bình, Lâm Đồng, Long
An, Kiên Giang, Cần Thơ. Dứa Bến Lức vẫn nổi tiếng khắp miền Nam. Mỗi trái dứa
có thể nặng khoảng từ 1/2 kg đến 3 kg.
2.1.2. Thành phần dinh dưỡng trong dứa
Dứa có nhiều sinh tố C, chất xơ pectin và chất gum. Thành phần dinh dưỡng
trong 100g dứa:
Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của 100g dứa
Độ ẩm
Tinh chất Ether
Chất xơ
Nitrogen
Tro
Calcium
Phosphorus
Iron
Carotene
Thiamine

Riboflavin
Niacin
Ascorbic Acid
Trang 13

81.3-91.2 g
0.03-0.29 g
0.3-0.6 g
0.038-0.098 g
0.21-0.49 g
6.2-37.2 mg
6.6-11.9 mg
0.27-1.05 mg
0.003-0.055 mg
0.048-0.138 mg
0.011-0.04 mg
0.13-0.267 mg
27.0-165.2 mg


2.1.3. Các bộ phận trên cây dứa có thể cho enzyme bromelain
2.1.3.1. Quả
Quả dứa thuộc loại quả tụ, do 100-200 quả nhỏ hợp lại. Các giống khác nhau thì
hình dạng quả và mắt quả cũng khác nhau. Bộ phận ăn được của quả dứa là do trục của
chùm hoa và lá bắc phát triển nên. Sau khi hòa tàn thì quả bắt đầu phát triển. Đây là bộ
phận cho nhiều enzyme bromelain nhất, chiếm 50% protein của quả dứa.
(Nguồn: ml)
2.1.3.2. Thân
Thân cây dứa chia làm hai phần: một phần trên mặt đất và một phần dưới mặt
đất. Phần ở trên thường bị các lá che kín nên khó nhìn thấy. Khi cây đã phát triển đến

mức độ nhất định, có thể dùng các mầm ngủ trên các đốt để nhân giống. Năm 1957,
Heinicke nhận thấy trong thân cây dứa có một lượng lớn bromelain và người ta bắt đầu
tìm cách tách chiết nó và sản xuất dưới dạng thuốc để chữa bệnh.
(Nguồn: ml)
2.1.3.3. Lá
Lá dứa mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc. Lá thường dày, không có cuốn, hẹp
ngang và dài. Bề mặt và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có tác
dụng làm giảm tốc độ bốc hơi nước ở lá. Các giống dứa thường có gai nhọn và cứng ở
mép lá, nhưng cũng có giống lá không gai. Tuỳ theo giống, một cây dứa trưởng thành
có khoảng 60-70 lá (Nguyễn Văn Kế, 2001). Đây cũng là nguồn có thể thu nhận được
enzyme bromelain.
2.1.3.4. Rễ

Trang 14


Rễ dứa gồm rễ cái và rễ nhánh (mọc ra từ phôi hạt); rễ bất định (mọc ra từ mầm
rễ trên các đốt của các loại chồi dứa trước khi đem trồng). Rễ dứa thuộc loại ăn nông,
phần lớn do nhân giống bằng chồi nên mọc từ thân ra, rễ nhỏ và phân nhiều nhánh. Bộ
rễ dứa thường tập trung ở tầng đất 10-26 cm và phát triển rộng đến 1 m (Nguyễn Văn
Kế, 2001). Đây cũng là nguồn có thể thu nhận được enzyme bromelain.
2.2. GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ ENZYME
Enzyme hay còn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme có
trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa
học nhất định trong cơ thể sinh vật (invivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế
bào (invitro). Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi là chất xúc
tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác.
Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra
trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay
kiềm mạnh…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp

nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng
(370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh…).
Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu là khả năng
xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu
phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất.
Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Do đó muốn thu nhận
enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể sinh vật. Tất cả các tế bào
động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa enzyme nhưng mức độ enzyme thì hoàn toàn
khác nhau.
Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản:
 Động vật (hạn chế)
 Thực vật (hạn chế)
Trang 15


 Vi sinh vật (phổ biến)
Việc khai thác enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp vì nguồn nguyên liệu
thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hạn chế.
Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật có những ưu điểm như sau:
 Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn.
 Hệ enzyme của vi sinh vật vô cùng phong phú.
 Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng
tổng hợp ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện một cách dễ dàng
trong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng môi trường của vi sinh vật là
rất cao.
 Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh
 Vi sinh vật khơng địi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng nên có thể
tận dụng những phụ phế liệu công nông nghiệp để sản xuất enzyme và có thể
dễ dàng điều khiển các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để có thể thu
được hiệu suất cao trong sản xuất.

 Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo quy mô công
nghiệp.
2.3. ENZYME PROTEASE
Enzyme protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy
phân liên kết peptide (-CO-NH-) của phân tử protein và peptide thành các acid amin tự
do, một peptide ngắn,pepton.
2.3.1. Giới thiệu sơ lược các Enzyme protease
2.3.1.1. Protease vi sinh vật
 Protease từ vi khuẩn
Trang 16


Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm
khoảng 59% lượng enzyme được sử dụng.
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus
subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn
Trọng Cẩn và cs, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích
hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
 Protease từ nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A.
fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum…
 Protease từ xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và
nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp
protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. Trerimosus...
2.3.1.2. Protease động vật
- Tụy tạng: Đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều
enzymenhất.

- Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm
Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ
phomat. Renin làm biến đổi casein thành paracasein có khả năng kết tủa trong môi
trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên
cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiễm pepsin thì
khả năng đông tụ sữa kém đi.
Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở
các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus.

Trang 17


Protease

pHđộng vật
Bảng 2.2: Protease

Chất hoạt hóa

Pepsin

1,5 – 4,0

H+, protease

Chymosin

5–6

Ca2+

Trypsin

6,5 – 9,0

Enserkinase, Ca2+

Chymotrypsin

7,0 – 8,5

Ca2+

Carboxypeptidase

6,0 – 8,5

Trypsin

Aminopeptidase

6,5 – 8,0

-

2.3.1.3. Protease thực vật
Protease thực vật tập trung chủ yếu ở một số cây vùng nhiệt đới như đu đủ, dứa,
cây sung, articho và đậu tương. Tất cả protease thực vật đều cùng thuộc một nhóm
enzyme chứa gốc – SH trong tâm hoạt động.
Thí dụ: papain từ mủ đu đủ, bromelain từ dứa, ficin từ quả sung.

2.3.2. Ứng dụng của enzyme protease
Trong các loại enzyme thì enzyme protease có vai trò quan trọng hơn cả vì nó
thủy phân protein. Protein đóng vai trò vô cùng thiết yếu đối với đời sống con người,
nó là thành phần cơ bản của người và vật nuôi, là nguồn cung câp vật liệu như da,
lông, tơ phục vụ cho sản xuất nhằm nâng cao chất lượng cũng như gia tăng thời gian
bảo quản.
Bảng 2.3: Ứng dụng protease trong Công nghiệp
Sản phẩm

Ứng dụng

Bia

Làm tan protein hạt, làm ổn định bia.

Phomat

Tủa protein sữa và làm chín phomat.

Làm mềm thịt

Cắt mợt phần mơ liên kết.

Bánh mì

Tăng đợ dẻo của gluten.

Bánh kẹo
Da

Tăng đợ giịn.
Trang 18
Loại bỏ lơng, sắc tớ, làm mềm da.

Chất tẩy rửa

Tẩy rửa vết protein.


Hiện nay chế phẩm protease thương mại một phần có nguồn gốc động vật và
thực vật, nhưng chủ yếu là từ vi sinh vật ( Nguyễn Tiến Thắng, 2004).
2.4. ENZYME BROMELAIN THU NHẬN TỪ DỨA
2.4.1. Giới thiệu enzyme bromelain
Bromelain là enzyme có nhiều trong quả dứa, được phát hiện từ giữa thế kỉ 19
nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế kỉ 20. Ở nước ta nghiên cứu về Bromelain
được bắt đầu từ những năm 1968-1970.
Bromelain là nhóm protease thực vật được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt
là từ thân (EC-3.4.22.32) và trái dứa (EC-3.4.22.33). Ở mỗi bộ phận khác nhau thì
Bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau.
Bromelain có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả. Bromelain là
nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptid nội phân tử protein để
chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide (Dương Thị Hương
Giang, 2005).
Thành phần chủ yếu của Bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải protein.
Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfhydryl của Bromelain thì thu
được một enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.4.2. Tính chất vật lí của enzyme bromelain
Bromelain tan nhẹ trong nước và glycerine nhưng không tan trong dung môi hữu
cơ. Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzyme
Bromelain trích từ thân cây dứa và thấy như sau:

Bảng 2.4: Tính chất vật lí của bromelain thân

Trang 19


Tính chất vật lí

Kí hiệu

Giá trị

Hằng sớ sa lắng

S

2.73 S

Hằng số khuếch tán

D

7.77 x 10-7 cm2/s

Thể tích riêng phần

V

0.743 mL/g

Độ nhớt bên trong

[l]

0.039 dl/g

Tỉ số ma sát

f/f0

1.26

Điểm đẳng điện

Pi

9.55

A1%cm ở 280 nm

20.1

Sự hấp thu

33 200*

Trọng lượng phân tử

Da

32 100**

35 500***

*

(Nguyễn
: Tính từ phương pháp sa lắng – khuếch
tán. Đức Lượng, 2004)

**

: Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong.

***

: Tính bằng phương pháp Archibald.

2.4.3. Tính chất hố học của enzyme bromelain
2.4.3.1. Cấu tạo hoá học
Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác
như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose,
2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Tùy từng phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích, thành phần acid amin
ở bromelain thân và quả thay đổi khác nhau. Bromelain thân có thành phần acid amin
thay đổi trong khoảng 321-144 acid amin và 283-161 acid amin đối với bromelain quả.
Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của Bromelain thân có acid amin đầu –
NH2 là valine và đầu carboxyl là glycine; cịn đới với Bromelin quả, acid amin đầu –
NH2 là alanine (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.4.3.2. Cấu trúc không gian của bromelain
Trang 20

Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách sắp
xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau:
Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –

- Gly – Cys – Lys Bromelain là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi
polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S- (disulfur).
Tâm hoạt động –Cys đặt cách nhóm imidazole của histidine là 5Å.
Chuỗi phân tử gấp nếp phức tạp thành dạng hình cầu.
Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu trong
hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra, trong
phân tử bromelain thân còn có sự hiện diện của các ion Zn 2+ với hàm lượng 2 mg/g
enzyme có vai trò duy trì cấu trúc khơng gian của enzyme.
2.4.4. Hoạt tính của enzyme bromelain
Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính Bromelain kể từ 3 tháng trước khi chín. Trong đó
hoạt tính cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín. Khi trái chín, hoạt tính bromelain
giảm xuống nhưng không mất hẳn.
Một số nghiên cứu cho thấy Bromelain có hoạt tính khác nhau trên những cơ chất
khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của Bromelain mạnh hơn
papain gấp 4 lần, còn cơ chất là casein thì khả năng phân giải của hai enzyme này
tương đương nhau. Đối với các cơ chất tổng hợp thì khả năng phân giải của Bromelain
yếu hơn papain.
Bromelain có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính
esterase ở bromelain hơn papain và ficin (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.4.4.1. Cơ chế tác động
Trang 21


Hầu hết các tác giả đều thừa nhận vai trò của nhóm –SH của cystein, nhóm
imidazole của histidine và nhóm disulfur trong hoạt động thủy phân của bromelain.

Nhóm –SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ chất
(nơi các liên kết peptide bị cắt).
Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion
của chất nhận khác.
Cầu nới S-S có vai trị duy trì cấu trúc không gian của bromelain. Casein và
hemoglobin là 2 cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất.
Đầu tiên, bromelain kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide và
acid amin. Protein kết hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi nhóm
imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, acid amin và peptide.
Ở giai đoạn đầu, Zn2+ rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của tâm hoạt
động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết phối trí
bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein như amin, carboxyl…)
Enzyme –SH +Zn2+ => enzyme-S-Zn + H+
Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc
không gian được bảo vệ ổn định.
2.4.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain
Giớng như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu
tố như nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm
chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch.
 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác
động càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của
enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme.

Trang 22


Bromelain ở dạng tinh khiết thì nhạy với nhiệt: ở 5o C, pH = 4-10, Bromelain có
hoạt tính tối đa trên Casein trong 24h; ở 55oC, pH=6 trong 20 phút, hoạt tính giảm
50%.

Quá trình sấy thăng hoa (đông khô) mất hoạt tính 27% (Nguyễn Đức Lượng,
2004).
 Ảnh hưởng của pH
pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. pH
thích hợp nhất đối với bromelain không ổn định mà phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian
phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất của dung
dịch đệm, sự có mặt của chất tăng hoạt.
Biên độ pH khá rộng từ 3-10 nhưng pH tối ưu thường nằm trong khoảng 5-8 tùy
cơ chất: gelatin:5-6, casein: 7-8 (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
 Ảnh hưởng bởi các ion kim loại
Các ion kim loại thường gắn với phân tử protein tại các trung tâm hoạt động, do
đó ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Vì bromelain thuộc nhóm protease
cystein, trung tâm hoạt động có nhóm –SH đều là hoạt chất hoạt hóa cho bromelain. Ví
dụ: KCN, Thioglycolic Acid, Cystein, Sulfid, Sisulfid, Cianit…
Bromelain bị ức chế bởi những ion hoặc hợp chất có ái lực mạnh hơn nhóm –SH,
các tác nhân oxi hóa, halogen hóa, ankyl hóa như: Iodoacetate, bromoacetate, clo
acetophenol, H2O2, methyl bromur.
Các ion kim loại như: Fe, Cu, Ag, Sb, Zn có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân tử
bromelain (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
 Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản

Trang 23


Bảng 2.5: Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản lên hoạt tính enzyme
bromelain

Hoạt tính (UI/mg protein)

Điều kiện bảo quản

Dịch chiết

Đông khô

Nguyên liệu tươi

1600

1150

Bảo quản ở 4oC trong 5 ngày

830

630

Sấy khô ở 4oC

1880

1360

2.4.5. Ứng dụng của enzyme bromelain
2.4.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm
Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thường
thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất
nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên hiện nay quy trình sản
xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme
bromelain để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm (Salem và

ctv,1995).
Chỉ cần một phần enzyme bromelain là có khả năng thuỷ phân 1000 phần thịt.
Enzyme bromelain được rãi lên thịt dưới dạng bột hoặc được ngâm trong dung dịch
enzyme hoặc tiêm dung dịch enzyme vào thịt để làm mềm thịt.
Sử dụng trong quá trình đông tụ sữa: Thông thường để chế biến các sản phẩm từ
sữa người ta dùng renin. Renin là loại enzyme được sử dụng làm đông tụ sữa truyền
thống. Tuy nhiên lượng renin sản xuất chưa đáp ứng đủ yêu cầu thực tế. Gần đây sử
dụng enzyme thực vật trong chế biến sữa đang được phát triển, trong đó bromelain
chồi dứa đang được quan tâm vào mục đích này.
2.4.5.2. Trong y dược học

Trang 24


Bromelain còn có tác dụng làm giảm di căn của bệnh ung thư, liều dùng 200 –
300 mg/kg thể trọng kết hợp với hoá trị hay xạ trị. Trong công nghiệp dược phẩm,
nhiều hãng dược phẩm ở Châu Âu đã đưa bromelain vào thành phần thuốc. Ở Mỹ và
Anh có thuốc Aranas do hãng W.H Roser điều chế.
Điều trị các bệnh nhiễm trùng (Jayaran và ctv, 1991).
Ngăn ngừa bệnh tiêu chảy ở heo con (Chandler và Mynott, 1998).
Nhờ tác dụng làm dễ tiêu hoá protein, bromelain được điều chế với vài chất khác
để bổ sung hay điều trị sự thiếu protease tiêu hoá tự nhiên (Nielsel và ctv, 2001).
Thực phẩm chức năng mang tên tinh nghệ - dứa điều trị bệnh loét dạ dày, hành tá
tràng, đại tràng, viêm da, bảo vệ gan, mật...Đó là thành quả nghiên cứu của các nhà
khoa học tại Dự án hoạt chất sinh học Việt - Bỉ (Viện Hóa học, Viện Khoa học - cơng
nghệ VN) năm 2006.
Ngoài ra bromelain cịn dùng để thuỷ phân gan bị làm cao gan, th́c bở.
2.4.5.3. Mợt số chế phẩm enzyme bromelain thương mại

Hình 2.3: Bột bromelain bổ sung

vào thức ăn cho gia súc do Thái
Lan sản xuất.

Hình 2.4: Chất chiết từ lá và
thân dứa được sản xuất dưới
dạng viên nén, mỗi viên chứa
200mg bromelain.
2.4.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain
2.4.6.1. Nghiên cứu trong nước

Trang 25