Tách chiết, tinh sạch và cố định enzyme bromelin từ dứa


TRANG
1:  1
1.1.  1
1.2.  2
1.2.1.  2
1.2.1.  2
1.3.  2
1.4.  3
1.4.1.  3
1.4.2.  3
1.5.   3
2 4
2.1.  4
2.1.1.  4
2.1.2.  5
2.1.3. zyme bromelain 6
2.1.3.1.  6
2.1.3.2. Thân 6
2.1.3.3.  6
2.1.3.4.  6
2.2.  7
2.3. ENZYME PROTEASE 8
2.3.1.  enzyme protease 8


 8
 9
 10

2.3.2.  10
2.4.  11
2.4.1. ain 11
2.4.2.  11
2.4.3.  12
 12
 13
2.4.4.  13
 14
 14
2.4.5.  16
 16
 17
 17
2.4.6.  18
 18
 18
2.5.  19
2.6.  19
2.6.1.  19
2.6.2.  20


2.6.3.  20
2.6.4.  20
2.6.5.  phân 21
2.7.  21
2.7.1.  21
2.7.2.  21
 21

 22
2.7.3.  22
2.7.4.  23
2.7.4.1.  23
2.7.4.2.  24
2.7.4.3.  24
2.7.4.4.  25
2.7.5.  25
2.7.6.  26
2.7.6.1.  26
2.7.6.2.  26
2.7.6.3.  27
2.7.6.4.  27
2.7.7.  27
2.7.7.1.  27
2.7.7.2.  28
3:  29


3.1.  29
3.1.1.  29
3.1.2.  30
3.1.3.  30
3.2.  31
3.2.1.  31
3.2.2. 
 32
3.2.2.1.  33
3.2.2.2.  35
3.2.3. 

0
, mu
Ammonium sulfate (NH
4
)
2
SO
4
aceton(CH
3
COCH
3
) 39
3.2.3.1.  39
3.2.3.2. 
0
39
 Ammonium sulfate 40
3.2.3.4. Pht 41
3.2.4. 
0

4
)
2
SO
4

 42
3.2.5. 

 42
3.2.5.1.  42
3.2.5.2.  42
3.2.5.3.  43

 43


3.2.6.1.  43
3.2.6.2.  43

 43
3.2.7. 
. 44
3.2.7.1.   44
3.2.7.2.  45
3.2.7.3.  45
3.2.8.  45
3.2.9.  46
3.2.9.1.  46
3.2.9.2.  46
3.2.9.3.  47
3.2.9.4. 
 49
3.2.10. 
- PAGE 49
3.2.10.1.  50
3.2.10.2.  50
3.2.10.3.  52
3.2.10.4.  54

4N  55
4.1. 
. 55


4.2. 
0
56
4.2.1. 

0
56
4.2.2. 
 58
4.2.2.1.  58
4.2.2.2. N 59
4.2.2.3.  60

AMMONIUM SULFATE 61
4.3.1. H
là ium sulfate ((NH
4
)
2
SO
4
) 61
4.3.2. 
 62
4.3.2.1.  62

4.3.2.2. N 63
4.3.2.3.  64

(CH
3
COCH
3
) 66
4.4.1. H
là aceton (CH
3
COCH
3
) 66
4.4.2. 
aceton5 aceton 67
4.4.2.1.  67
4.4.2.2. N 68
4.4.2.3.  69


4.5. 
0

AMMONIUM SULFATE  70
4.6.  71
4.6.1. 
Natrialginate 71
4.6.2. 
bromelain trên gel Natrialginate 71

4.6.3. 
 72
4.6.4. 
 72
4.6.4.1.  72
4.6.4.2.  theo  74
4.6.4.3.  theo  75
4.6.5.  76
4.6.6. 
 78
4.7. -100 79
4.7.1.  79
4.7.2.  79
4.7.3. 
0
79
4.7.4. ate 80
4.7.5.  82
4.7.6. 
 83


4.8. 
- PAGE 84
4.8.1.  84
4.8.2.  84
5 87
5.1.  87
5.2. K 89
 I

 III

Chương 1: Mở đầu
Trang 1


M U
1.1. T V
Trong nh i ta dành s quan tâm rt nhin vic tách
chi s dng làm tác nhân kích thích tiêu hóa, cha v
nh dch lên men. Vic nghiên cu thành công mt enzyme là  vic chit xut,
t tính, yu t ng hong ca enzyme. Vic tinh ch enzyme ht
sc cn thit bi làm cho enzyme tinh sch ít còn ln tp cht (các protein không phi
enzyme), nâng cao hot tính enzyme so vi dng thô nhiu ln, thun li cho nghiên
cu, bo qun, nguyên liu cho mt s ngành công ngh thc ph  c
phm dùng làm thuu tr và sn xut.
Bên cc nâng cao hiu sut s dc
nghiên c nh enzyme là mt trong nhng nghiên cu nhm
nâng cao hiu sut s dng enzyme. Bng cách c nh enzyme trong cht mang
c enzyme có th tách ra kht d dàng sau phn ng. Thêm
 c tái s dng nhiu ln khc phc tình trng khan him
n nay.
c sn xut và s dng trong nhi
ngh thc phm, y hc phm và các ngành công nghii vc ta
ngun enzyme t thc vt có trin vng ln vì ngun nguyên liu rt phong phú (da,
, ). Trong quá trình ch bin dp ch khong 30% qu dc s
dng, còn li 70% ph phm mà ch yu là chi trên qu da, thân da (Hi tho quc
u tn dc ngun ph phm thì va có th gim thiu cht thi
hng va có th sn xut sn phm bromelain bi vì hu
t c các b phn ca cây du có enzyme. Bromelain có ba hot tính

khác nhau: peptidase, amidase, esterase. Bromelain thân, chi có th phân hy c 
cht t nhiên lt tng hp, chúng là enzyme có giá tr kinh t và hu ht sn
phc ly trích t thân da.

Chương 1: Mở đầu
Trang 2

 n hành tách chit, tinh sch enzyme bromelain 
quy mô nh. Kho sát các tác nhân tnh pH, nhi t bn nhit
cho hong ca enzyme trên chi da. C nh enzyme bromelain trên Natrialginate
ba Ammonium sulfate.
1.2. M TÀI
1.2.1. Mc tiêu tng quát
Tách chit và tinh sch enzyme bromelain t chi da.
C nh enzyme bromelain trên Natrialginate.
1.2.2. Mc tiêu c th
Thu nhn dch enzyme bromelain t các b phn qu da: chi da, mt da,
thân da, cùi da.
nh t l cn 96
o
, n mui Ammonium sulfate
ta enzyme bromelain.
 nh pH, nhi  t    bn nhit cho s ho ng ca enzyme
bromelain.
So sánh các tác nhân ta ca b phn chi da sau khi ta.
C nh enzyme bromelain trên Natrialginate.
     

Tinh sch enzyme bromelain.
nh trng phân t enzyme bromelain bn di.

1.3. M
 nghiên c sn xut enzyme bromelain t ng ph phm ln là
chi dng thi c  mang li
hiu qu kinh t trong công nghip.

Chương 1: Mở đầu
Trang 3

1.4. U
1.4.1. 
 



1.4
 .
 Statgraphics.
1.5. GII H TÀI
Vì lý do gii hn v thi gian và kinh t tài ch thc hin ta enzyme vi ba
tác nhân ta (mui, c  n Biogel P-100
-PAGE thc hin c t
Natrialginate  quy mô phòng thí nghim.



ng quan v v nghiên cu
Trang 4




2.1. 









2.1.1. 
               

-

N






 2.1:  
 2.2: 

ng quan v v nghiên cu
Trang 5




0
F (-2
0



. 






2.1.2. 
Da có nhiu sinh t C, ch    t gum. Thành phn  
trong 100g da:










81.3-91.2 g

0.03-0.29 g


0.3-0.6 g
Nitrogen
0.038-0.098 g
Tro
0.21-0.49 g
Calcium
6.2-37.2 mg
Phosphorus
6.6-11.9 mg
Iron
0.27-1.05 mg
Carotene
0.003-0.055 mg
Thiamine
0.048-0.138 mg
Riboflavin
0.011-0.04 mg
Niacin
0.13-0.267 mg
Ascorbic Acid
27.0-165.2 mg
: din

ng quan v v nghiên cu
Trang 6

2.1.3. 
2.1.3.1. 
-




 ml)
2.1.3.2. Thân





 ml)
2.1.3.3. 




-
enzyme bromelain.
2.1.3.4. 



ng quan v v nghiên cu
Trang 7


-

2.2. 
Enzyme hay còn gi là cht xúc tác sinh hc có bn cht là protein. Enzyme có

trong m sinh vt, nó không nhng làm nhim v xúc tác cho các phn ng hóa
hc nh sinh vt (invivo) mà còn xúc tác cho các phn ng ngoài t
bào (invitro). Vì có ngun gc t sinh vc gi là cht xúc
tác sinh hc (biocatalisateur) nhm phân bit vi các cht xúc tác hóa hc khác.
Chính nh s có mt ca enzyme mà nhiu phn ng hóa hc rt khó xy ra
u king   (do cn nhi, áp sut cao, acid mnh hay
kim m nó xy ra ht sc nhanh chóng, liên tc và nhp
nhàng vi nhiu phn ng liên hu kin ht sc êm du, nh nhàng
(37
0
C, áp sung, không kim mnh hay acid m
c tính quan trng nht cc hic hiu là kh 
xúc tác chn lc, xúc tác s chuyn hóa mt hay mt s cht nhnh theo mt kiu
phn ng nhc hiu cm c hit.
Enzyme không th tng hp b  ng hóa h   n thu nhn
enzyme ch ng duy nht là thu nhn t  sinh vt. Tt c các t bào
ng vt, thc vt, vi sinh vu ch enzyme thì hoàn toàn
khác nhau.
Hii ta khai thác enzyme t ba ngun:
 ng vt (hn ch)
 Thc vt (hn ch)
 Vi sinh vt (ph bin)

ng quan v v nghiên cu
Trang 8

Vic khai thác enzyme t ng vt và thc vt rt phc tp vì ngun nguyên liu
thu nhu sut thp dn giá thành cao nên hn ch.
Vic sn xut enzyme t vi sinh vt có nh
 Vi sinh vt có chu k ng và phát trin rt ngn.

 H enzyme ca vi sinh vt vô cùng phong phú.
 Vic ci to ging vi sinh v to ra nhng chng vi sinh vt có kh 
tng hp ra các loi enzyme theo ý muc thc hin mt cách d dàng
trong mt thi gian ngn vì kh ng ca vi sinh vt là
rt cao.
 Vi sinh vt có t sinh sn cc nhanh
 Vi sinh vi nghiêm ngt v ng nên có th tn
dng nhng ph ph liu công nông nghi sn xut enzyme và có th d
u khin các yu t n quá trình nuôi c có th thu
c hiu sut cao trong sn xut.
 Sn xut enzyme t vi sinh vt hoàn toàn có th thc hin theo quy mô công
nghip.
2.3. ENZYME PROTEASE
Enzyme protease là enzyme thuc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thy
phân liên kt peptide (-CO-NH-) ca phân t protein và peptide thành các acid amin t
do, mt peptide ngn,pepton.
2.3.1. Gii thic các Enzyme protease
2.3.1.1. Protease vi sinh vt
 Protease t vi khun
ng protease sn xut t vi khuc tính vào khong 500 tn, chim

ng quan v v nghiên cu
Trang 9

k
Trong các chng vi khun có kh  ng hp mnh protease là Bacillus
subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và mt s ging thuc chi
Clostridium.  ng hp protease mnh nht (Nguyn
Trng Cn và cs, 1998). Các vi khung tng hng thích
hp  vùng pH trung tính và kim yu.

 Protease t nm
Nhiu loi nm mc có kh  ng hp m ng l  c ng
dng trong công nghip thc phm là các chng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A.
fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum
 
V n tng hp protease, x khuc nghiên cn và
nm mc mt s chng có kh ng hp

ng vt
- Ty t ây là ngun enzyme sm nht, lâu dài nht và có cha nhiu
enzymenht.
- D    ca d dày bê có tn ti enzyme thuc nhóm
 c s dng ph bin trong công ngh
phomat. Renin làm bi i casein thành paracasein có kh  t ta trong môi
ng s n Ca
2+.
ng t sa rc nghiên
cu và ng d nht. Trong thc t nhiu ch phm renin b nhipepsin thì
kh
Gu sn xut protease t vi sinh v
các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus.


ng quan v v nghiên cu
Trang 10


2.3.1.3. Protease thc vt
Protease thc vt tp trung ch yu  mt s cây vùng nhi, da,
  t c protease thc vu cùng thuc mt nhóm

enzyme cha gc  SH trong tâm hong.
Thí d: papain t m , bromelain t da, ficin t qu sung.
2.3.2. ng dng ca enzyme protease
Trong các loi enzyme thì enzyme protease có vai trò quan tr vì nó
thy phân protein. t yi vi si,
nó là thành phn ci và vt nuôi, là ngun cung câp vt li
lôc v cho sn xut nhm nâng cao chi gian
bo qun.
Protease
pH
Cht hot hóa
Pepsin
Chymosin
Trypsin
Chymotrypsin
Carboxypeptidase
Aminopeptidase
1,5  4,0
5  6
6,5  9,0
7,0  8,5
6,0  8,5
6,5  8,0
H
+
, protease
Ca
2+
Enserkinase, Ca
2+

Ca
2+
Trypsin
-
Sn phm
ng dng
Bia
Phomat
m tht
nh bia.
Ta protein s
Ct mt phn mô liên kt.
Bng 2.3: ng dng protease trong Công nghip

Bng vt


ng quan v v nghiên cu
Trang 11



Hin nay ch ph   i mt phn có ngun g ng v 
c v yu là t vi sinh vt ( Nguyn Tin Thng, 2004).
2.4. 
2.4.1. 
Bromelain là enzyme có nhiu trong qu dc phát hin t gia th k 19
c nghiên cu t gia th k 20.  c ta nghiên cu v Bromelain
c bu t nh-1970.
Bromelain là nhóm protease thc vc thu nhn t h c bit

là t thân (EC-3.4.22.32) và trái da (EC-3.4.22.33).  mi b phn khác nhau thì
Bromelain có pH t cu t khác nhau.
Bromelain có trong toàn b cây du nht là trong qu. Bromelain là
nhóm endoprotease có kh t các liên kt peptid ni phân t 
chuyn phân t    n nh gi là các peptide (D  
Giang, 2005).
Thành phn ch yu ca Bromelain có cha nhóm sulfurhydryl thy gii protein.
Khi chit tách và tinh sn có cha nhóm sulfhydryl ca Bromelain thì thu
c mt enzyme thy phân protein hiu qu in vitro (Nguyc ng, 2004).
2.4.2. Tính cht vt lí ca enzyme bromelain
Bánh mì
Bánh ko
Da
Cht ty ra
 do ca gluten.
 giòn.
Loi b lông, sc t, làm mm da.
Ty ra vt protein.

ng quan v v nghiên cu
Trang 12


 Murachi và cng s     u v tính cht vt lý ca enzyme
Bromelain trích t thân cây da và thau:

*
: .
**
: .

***
.
2.4.3. 
2.4.3.1. 
Bromelain thân là mi các protease thc vt khác
 ch nó là mt glycoprotein, mi phân t có glycan gm 3 manose,
2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose (Nguyng, 2004).
Tùy tn acid amin
 bromelain thân và qu i khác nhau. Bromelain thân có thành phn acid amin
i trong khong 321-144 acid amin và 283-i vi bromelain qu.




S
2.73 S

D
7.77 x 10
-7
cm
2
/s

V
0.743 mL/g

[l]
0.039 dl/g


f/f
0

1.26

Pi
9.55

A
1%
cm

20.1


Da
33 200
*
32 100
**

35 500
***



(Nguyng, 2004)

ng quan v v nghiên cu
Trang 13

Các nghiên cu ghi nhn, polypeptide cu 
NH
2
i vi Bromelin quu 
NH
2
là alanine (Nguyng, 2004).
2.4.3.2.


Ser  Val  Lys  Asn  Gln  Asn  Pro  Cys  Gly  Ala  Cys  Tryp 

- Gly  Cys  Lys -
             
i S-S- (disulfur).





2+


2.4.4. Hot tính ca enzyme bromelain
Tht qu da ch có hot tính Bromelain k t 
hot tính cao nht là khoc khi chín. Khi trái chín, hot tính bromelain
gim xut hn.
Mt s nghiên cu cho thy Bromelain có hot tính khác nhau trên nht
khác nhau. Nt là hemoglobin thì kh i ca Bromelain m

papain gp 4 lt là casein thì kh  i ca hai enzyme này

ng quan v v nghiên cu
Trang 14

i vt tng hp thì kh i ca Bromelain
y
Bromelain có 3 hot tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase, hot tính
esterase  ng, 2004).
2.4.4.1 . 
Hu ht các tác gi u tha nhn vai trò ca nhóm SH ca cystein, nhóm
imidazole ca histidine và nhóm disulfur trong hong thy phân ca bromelain.
Nhóm SH tham gia to thành acyl-thioester trung gian vi nhóm carboxyl ct
t peptide b ct).
Nhóm imidazole làm cht trung gian nhn gc acid và chuyn cho nhóm anion
ca cht nhn khác.
Cu ni S-S có vai trò duy trì cu trúc không gian ca bromelain. Casein và
t t c dùng nhiu nht.
u tiên, bromelain kt hp vi protein và thy  cho ra polypeptide và
acid amin. Protein kt hp vi nhóm SH ca enzyme khin nó b ester hóa ri nhóm
imidazole s kh  gii phóng enzyme, acid amin và peptide.
 u, Zn2+ rt quan trng, chúng kt hp vi nhóm SH ca tâm hot
ng hình thành mercaptid phân ly yn còn kh o liên kt phi trí
b sung vi các nhóm cha phân t 
Enzyme SH +Zn
2+
=> enzyme-S-Zn + H
+

Do vy nhóm SH trong tâm ho    ester hóa b t, cu trúc

c bo v nh.
2.4.4.2. Các yu t n hot tính bromelain
Gii cht sinh h ng bi các yu
t  t, n enzyme, nhi, pH, ion kim loi, mt s nhóm
chch.

ng quan v v nghiên cu
Trang 15

 ng ca nhi
Nhi ca phn ng xúc tác chu ng bi nhiu yu t: thi gian tác
ng càng dài thì nhi  s có nh  i làm   n hot tính ca
enzyme, nn enzyme, n t, dng tn ti ca enzyme.
Bromelain  dng tinh khit thì nhy vi nhit:  5
o
C, pH = 4-10, Bromelain có
hot tính t 55
o
C, pH=6 trong 20 phút, hot tính gim
50%.
Quá trình s    ) mt hot tính 27% (Nguy  ng,
2004).
 ng ca pH
pH là yu t quan trng nht n hot tính xúc tác ca enzyme. pH
thích hp nhi vi bromelain không nh mà ph thuc vào nhi, thi gian
phn ng, bn cht và nng   tinh sch ca enzyme, bn cht ca dung
dm, s có mt ca cht.
 pH khá rng t 3-ng nm trong khong 5-8 tùy
t: gelatin:5-6, casein: 7-8 (Nguyng, 2004).
 ng bi các ion kim loi

Các ion kim long gn vi phân t protein ti các trung tâm hong, do
n hot tính xúc tác ca enzyme. Vì bromelain thuc nhóm protease
cystein, trung tâm hong có nhóm u là hot cht hot hóa cho bromelain. Ví
d
Bromelain b c ch bi nhng ion hoc hp cht có ái lc mSH,
            
acetophenol, H
2
O
2
, methyl bromur.

ng quan v v nghiên cu
Trang 16

Các ion kim lonh cu trúc phân t
bromelain (Nguyng, 2004).
  
 2.5
enzyme bromelain





1600
1150

o


830
630

o
C
1880
1360

2.4.5. 
2.4.5.1. Trong công ngh
Trong ch bin thu sn: Khi sn xuc mm (và mt s loài mng
thi gian ch bing là dài nht, hiu sut thu  m) li ph thuc rt
nhiu cá. Nên hin nay quy trình sn
xuc mm ngc hoàn thi dng ch phm enzyme
 rút ngn thi gian làm và ci thi cc mm 
ctv,1995).


.




ng quan v v nghiên cu
Trang 17

     

2.4.5.2. 


300 mg/kg






Thc phm ch - da u tr bnh loét d dày, hành tá
i tràng, viêm da, bo v gan, m nghiên cu ca các nhà
khoa hc ti D án hot cht sinh hc Vit - B (Vin Hóa hc, Vin Khoa hc - công
ngh 

2.4.5.3. 







 2.3    
       

 2.4
 

200mg bromelain.