Tác dụng chống oxy hóa trên thực nghiệm của cao chiết thạch hộc nuôi cấy mô (dendrobium nobile lindl orchidaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
--------------------

LÂM CẨM TIÊN

TÁC DỤNG CHỐNG OXY HĨA TRÊN THỰC NGHIỆM
CỦA CAO CHIẾT THẠCH HỘC NI CẤY MÔ
(Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC CỔ TRUYỀN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
--------------------

LÂM CẨM TIÊN

TÁC DỤNG CHỐNG OXY HĨA TRÊN THỰC NGHIỆM
CỦA CAO CHIẾT THẠCH HỘC NI CẤY MÔ
(Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae)

Chuyên nghành: Y HỌC CỔ TRUYỀN
Mã số: 60 72 02 01

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC CỔ TRUYỀN

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN CÔNG LUẬN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu trong
luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một cơng trình
nào khác.
Tác giả luận văn

Lâm Cẩm Tiên


i

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Trang

DANH MỤC HÌNH VẼ
DANH MỤC BẢNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4
1.1. Gốc tự do và chất chống oxy hóa theo YHHĐ .................................................4

1.2. Gốc tự do và chống oxy hóa theo quan niệm YHCT .....................................16
1.3. Dược liệu được nghiên cứu ............................................................................19
1.4. Các cơng trình nghiên cứu về Thạch hộc .......................................................23
1.5. Một số phương pháp xác định tác dụng chống oxy hóa .................................26
1.6. Một số mơ hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vivo ....28
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 32
2.1. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................32
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................34
2.3. Thử nghiệm độc tính cấp bằng đường uống ...................................................46
2.4. Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm malonyl
dialdehyd (MDA test) ............................................................................................47
2.5. Khảo sát hoạt tính chống oxy hố in vivo trên mơ hình suy giảm miễn dịch
bằng cyclophophamid (CY) ...................................................................................49
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ ......................................................................................... 52
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 80
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN ....................................................................................... 88
CHƢƠNG 6. KIẾN NGHỊ...................................................................................... 89


ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACE

Acetylcholine esterase

APH

1-acetyl-2-phenylhydrazin

CY

Cyclophosphamid

DĐVN IV

Dược Điển Việt Nam IV

GSH

Glutathion

GSH –Px

Enzym glutathion peroxydase

IC50

The half maximal inhibitory concentration

MDA

Malonyl dialdehyd

MeOH

Methanol

TBA

Acid thiobarbituric

TCA

Acid tricloacetic

YHCT

Y học cổ truyền

YHHĐ

Y học hiện đại


iii

DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 3-1. Phản ứng hóa học định tính alkaloid trong ngun liệu ...........................55
Hình 3-2.Phản ứng hóa học định tính saponin trong ngun liệu.............................55
Hình 3-3. Sắc ký lớp mỏng định tính hợp chất saponin trong ngun liệu ..............56
Hình 3-4. Sắc ký lớp mỏng định tính hợp chất alkaloid trong ngun liệu ..............57
Hình 3-5. Phản ứng hóa học định tính alkaloid trong cao ........................................61
Hình 3-6. Phản ứng hóa học định tính saponin trong cao .........................................62
Hình 3-7. Sắc ký lớp mỏng định tính alkaloid trong cao ..........................................63
Hình 3-8. Sắc ký lớp mỏng định tính saponin trong cao ..........................................64
Hình 3-9. Hoạt tính chống oxy hóa in vitro của thuốc đối chiếu trong thử nghiệm
MDA..........................................................................................................................67
Hình 3-10. Hoạt tính chống oxy hóa in vitro của cao Thạch hộc nuôi cấy mô trong

thử nghiệm MDA. .....................................................................................................68
Hình 3-11. Hoạt tính chống oxy hóa in vitro của cao Thạch hộc tự nhiên trong thử
nghiệm MDA. ...........................................................................................................69
Hình 3-12. Hàm lượng MDA trong gan ở lô cho uống cao Thạch hộc ni cấy mơ.
...................................................................................................................................72
Hình 3-13. Hàm lượng MDA trong gan ở lô cho uống cao Thạch hộc tự nhiên. .....74
Hình 3-14. Hàm lượng GSH trong gan ở lơ cho uống cao Thạch hộc ni cấy mơ. 76
Hình 3-15. Hàm lượng GSH trong gan ở lô cho uống cao Thạch hộc tự nhiên. ......78


iv

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2-1. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa in vivo ...........................................49
Bảng 3-1. Kết quả định tính phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của ngun
liệu Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộc tự nhiên. ................................................52
Bảng 3-2. Độ ẩm của nguyên liệu Thạch hộc nuôi cấy mô ......................................53
Bảng 3-3. Độ ẩm của nguyên liệu Thạch hộc tự nhiên .............................................53
Bảng 3-4. Độ tro toàn phần của nguyên liệu Thạch hộc nuôi cấy mô ......................53
Bảng 3-5. Độ tro toàn phần của nguyên liệu Thạch hộc tự nhiên.............................54
Bảng 3-6. Độ tro không tan trong acid hydrochloric của nguyên liệu Thạch hộc nuôi
cấy mô .......................................................................................................................54
Bảng 3-7. Độ tro không tan trong acid hydrochloric của nguyên liệu Thạch hộc tự
nhiên ..........................................................................................................................54
Bảng 3-8. Định lượng alkaloid trong nguyên liệu Thạch hộc tự nhiên ....................58
Bảng 3-9. Định lượng alkaloid trong nguyên liệu Thạch hộc nuôi cấy mô ..............58
Bảng 3-10. Định lượng saponin trong nguyên liệu Thạch hộc tự nhiên ...................58
Bảng 3-11. Định lượng saponin trong nguyên liệu Thạch hộc nuôi cấy mô ............59
Bảng 3-12. Hiệu suất cao Thạch hộc nuôi cấy mô và cao Thạch hộc tự nhiên ........59
Bảng 3-13. Độ tan trong nước của cao Thạch hộc ....................................................60

Bảng 3-14. Độ ẩm của cao Thạch hộc nuôi cấy mô .................................................60
Bảng 3-15. Độ ẩm của cao Thạch hộc tự nhiên ........................................................60
Bảng 3-16. Độ tro tồn phần của cao Thạch hộc ni cấy mơ .................................60
Bảng 3-17. Độ tro toàn phần của cao Thạch hộc tự nhiên ........................................61
Bảng 3-18. Định lượng hợp chất alkaloid của cao Thạch hộc tự nhiên ....................64
Bảng 3-19. Định lượng hợp chất alkaloid của cao Thạch hộc nuôi cấy mô .............65


v

Bảng 3-20. Định lượng hợp chất saponin của cao Thạch hộc tự nhiên ....................65
Bảng 3-21. Định lượng hợp chất saponin của cao Thạch hộc nuôi cấy mô .............66
Bảng 3-22. Kết quả thuốc đối chiếu Trolox. ............................................................66
Bảng 3-23. Kết quả thử trên test MDA của mẫu Thạch hộc nuôi cấy mô ................67
Bảng 3-24. Kết quả thử trên test MDA của mẫu Thạch hộc tự nhiên ......................68
Bảng 3-25. Kết quả khảo sát hàm lượng MDA trong gan ở lô cho uống cao Thạch
hộc nuôi cấy mô. .......................................................................................................71
Bảng 3-26. Kết quả khảo sát hàm lượng MDA trong gan ở lô cho uống cao Thạch
hộc tự nhiên ...............................................................................................................73
Bảng 3-27. Kết quả khảo sát hàm lượng GSH trong gan ở lô cho uống cao Thạch
hộc nuôi cấy mô. .......................................................................................................75
Bảng 3-28. Kết quả khảo sát hàm lượng GSH trong gan ở lô cho uống cao Thạch
hộc tự nhiên. ..............................................................................................................77


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ở cơ thể bình thường, oxy qua chuyển hóa của cơ thể tạo ra các gốc tự do để thực
hiện chức năng sinh lý, chúng chỉ tồn tại với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại

bỏ và không độc hại cho cơ thể. Tuy nhiên ngày nay y học ngày càng phát triển,
tuổi thọ ngày càng gia tăng, bên cạnh đó sự gia tăng kinh tế, cơng nghiệp phát triển,
lối sống thay đổi thì vấn đề ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái đang ngày
trở nên trầm trọng, hậu quả các gốc tự do được tạo ra ngày càng nhiều. Ở tuổi trẻ
hay thanh niên, cơ thể mạnh, trấn áp được chúng, nhưng tới tuổi cao, sức yếu, gốc
tự do lấn át, gây thiệt hại gấp nhiều lần ở người trẻ, các gốc tự do được sinh ngày
càng nhiều và liên tục tấn công vào mọi thành phần của tế bào (màng tế bào, protein,
acid nucleic, cấu trúc của ADN,…) còn được gọi là “stress oxy hóa”, là một trong
những nguyên nhân gây nên sự lão hóa mà cịn là đồng phạm gây ra các bệnh
thường gặp như bệnh tim mạch, ung thư, Alzheimer, bệnh Parkinson, xơ gan, viêm
khớp dạng thấp, xơ vữa động mạch,…[27], [30], [52]. Các chất có tác dụng chống
oxy hóa có thể bảo vệ các cơ quan (não, tim, mạch máu, gan, thận) khỏi các tác
động xấu của stress oxy hóa. Trong việc điều trị bệnh ung thư, hầu hết các thuốc,
hóa chất cũng như tia xạ đều gây tổn thương các cơ quan bằng cách tạo ra các gốc
oxy tự do hoặc ảnh hưởng đến hệ thống enzym chống oxy hóa nội sinh của cơ thể,
một trong những thuốc đó là cyclophosphamid. Do q trình chuyển hóa ở gan,
cyclophosphamid hình thành các tác nhân gây độc tế bào, gián tiếp làm gia tăng q
trình peroxy hóa lipid trong tế bào gan [10], [23]. Từ thực tế đó mà hiện nay, trên
thế giới có xu hướng sử dụng thuốc nguồn gốc thảo dược bởi chúng ít tác dụng phụ,
có hiệu quả điều trị, và giảm chi phí điều trị là rất cần thiết.
Đã từ rất lâu, Thạch hộc là một trong những dược liệu quý, đã được Trung Quốc sử
dụng như thuốc giảm đau, hạ sốt, kích thích dạ dày, để cải thiện cảm giác ngon
miệng, kích thích tiết nước bọt, điều trị các bệnh khác nhau, như viêm dạ dày, đái
tháo đường, lão hóa da, và bệnh tim mạch, mà phần lớn được cho là liên quan chặt
chẽ với sự trao đổi chất, chống lại sự rối loạn trong việc tạo ra gốc tự do [31], [37],
[39]. Một số nghiên cứu nước ngoài đã chứng minh Thạch hộc (Dendrobium nobile


2

Lindl.) có tác dụng kháng viêm, chống tế bào ung thư, chống đột biến gen điều hòa
miễn dịch,…gần đây còn cho thấy tác dụng chống oxy hóa trên in vitro [36], [40],
[44], [49], [53], [54].
Hiện nay Thạch hộc là thực vật quý hiếm,được đưa vào sách đỏ, cần được bảo tồn
[2], [8], nên xu hướng mới là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn
dược liệu với lượng lớn và chất lượng cao.
Vì thế để góp phần làm rõ hơn tác dụng dược lý của Thạch hộc nuôi cấy mô so với
Thạch hộc trồng tự nhiên, chúng tơi tiếp tục khảo sát tác dụng chống oxy hóa theo
hướng tăng cường bảo vệ gan của Thạch hộc nuôi cấy mô in vitro, in vivo trên thực
nghiệm.

.


3

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
MỤC TIÊU TỔNG QUÁT
Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của cao chiết Thạch hộc ni cấy mơ.
MỤC TIÊU CỤ THỂ
1. So sánh thành phần hóa học của cao chiết Thạch hộc nuôi cấy mô và cao chiết
Thạch hộc tự nhiên.
2. Khảo sát độc tính cấp của cao chiết Thạch hộc nuôi cấy mô và cao chiết Thạch
hộc tự nhiên.
3. So sánh hoạt tính chống oxy hóa in vitro của cao chiết Thạch hộc nuôi cấy mô và
cao chiết Thạch hộc tự nhiên bằng thử nghiệm MDA trên chuột nhắt trắng.
4. So sánh hoạt tính chống oxy hóa in vivo của cao chiết Thạch hộc ni cấy mô và
cao chiết Thạch hộc tự nhiên bằng phương pháp khảo sát hàm lượng MDA và GSH
ở gan chuột trên mơ hình suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid trên chuột
nhắt trắng.

4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Gốc tự do và chất chống oxy hóa theo YHHĐ

1.1.1. Gốc tự do và các tổn thƣơng liên quan
1.1.1.1. Gốc tự do
Khái niệm:
Oxy hóa khơng thể thiếu với vi sinh vật hiếu khí. Khoảng vài thập niên gần đây, các
thành tựu khoa học đã chứng tỏ rằng oxy tham gia vào nhiều quá trình sinh hóa học.
Trong các q trình đó, oxy tạo ra nhiều phân tử trung gian gọi là các gốc tự do.
Từ đầu những năm 70, I.W.Fridovich đã nhận thấy rằng khi nhận một điện tử đầu
tiên, oxy tạo ra gốc superoxyd. Đây là gốc tự do quan trọng nhất của tế bào. Từ
gốc superoxyd (O2•−) nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng
phản ứng cao được tạo ra như: HO•─ (gốc hydroxyl), H2O2, 1O2 (oxy đơn bội),
LO• (gốc lipoxyd), LOO• (gốc lipoperoxyd), RO• (gốc alkoxyd), LOOH. Tên chung
của các gốc là oxy dạng đang hoạt động.
Các nhà khoa học cũng phát hiện rằng sự sinh sản ra nhiều dạng oxy hoạt động
cũng có thể được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa (antioxidant) tự nhiên trong
cơ thể. Tiêu biểu là enzym superoxyd dismutase (SOD), glutathion (GSH), enzym
glutathion peroxydase (GSH-Px), enzym catalase và các phân tử nhỏ: tocopherol,
ascorbat.
Trong cơ thể luôn tồn tại sự cân bằng các dạng oxy hoạt động và dạng chống oxy
hóa. Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội môi (homeostasis). Do ảnh hưởng
của nhiều yếu tố tác động từ bên ngoài hay bên trong cơ thể, làm cho cân bằng này
di chuyển theo hướng gia tăng các dạng oxy hoạt động. Trạng thái sinh lý này được
gọi là stress oxy hóa. Hay nói một cách khác stress oxy hóa là sự rối loạn cân bằng
giữa chất chống oxy hóa và oxy hóa theo hướng tạo ra nhiều các oxy hóa.

Bản chất hóa học của gốc tự do:


5

- Các gốc có khả năng phản ứng cao:
Ví dụ:
R1+ R2H  R2+ R1H
R1+ R2 R1 – R2
- Thời gian tồn tại ngắn: do khả năng phản ứng cao nên các gốc có thời gian tồn tại
ngắn. Thời gian tồn tại này phụ thuộc bản chất các gốc và điều kiện của hệ mà nó
tồn tại.
- Trong cơ thể, những gốc của oxy rất khơng bền. Đó là các gốc O2- (gốc
superoxyd); HO (gốc hydroxyl), LO (gốc lipoxyd), LOO (gốc lipoperoxyd), RO
(gốc alkoxyd). Các gốc bền là các gốc có cấu trúc semiquinon như gốc của vitamin
E (tocopheryl), vitamin C (ascorbyl).
Sự hình thành gốc tự do:
Trong tế bào, gốc tự do được sinh ra do các phản ứng chuyển nhường điện tử.
Những phản ứng này có thể được thực hiện bởi enzym hoặc khơng enzym, thơng
qua sự oxy hóa khử của các ion kim loại chuyển tiếp.
- Sự hình thành gốc tự do trong trao đổi bình thường:
Trong sinh học, nguồn quan trọng sinh ra gốc tự do là sự cung cấp điện tử ở chuỗi
hô hấp tế bào trong ty lạp thể cho oxy. Trong ty lạp thể có một hệ thống enzym và
các chất trung gian làm nhiệm vụ vận chuyển hydro và điện tử từ cơ chất tới oxy.
Những hợp chất này tạo ra một loại các phản ứng dây chuyền nối tiếp nhau gọi là
chuỗi hô hấp tế bào.
Qúa trình oxy nhận điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào thực tế phải xảy ra qua nhiều giai
đoạn. Mỗi giai đoạn oxy chỉ nhận được một điện tử. Oxy nhận điện tử đầu tiên tạo
ra gốc superoxyd (O2-). Oxy nhận điện tử chủ yếu ở màng ty lạp thể. Khoảng 80%
lượng O2- hình thành chuyển vào trong ty lạp thể, cịn 20% thốt ra bào tương. O2có các chức năng như sau: là nguồn sinh ra H2O2; cùng với NO2 và các chất phóng

6

thải từ tế bào thành trong tham gia chi phối trạng thái tĩnh hay hoạt động của tiểu
cầu, quyết định sự bám dính hay kết tụ của tiểu cầu vào thành mạch.
Các gốc O2- hình thành nhanh chóng được enzym SOD chuyển thành H2O2theo cơ
chế tự oxy hóa khử:
SOD
-

-

O2 + O2 + 2H

+

H2 O2 + O 2

H2O2 là tác nhân oxy hóa và dễ dàng bị phân hủy theo phản ứng:
H2O2 + 2GSH

GSSG + 2H
GSH – Px

GSH: Glutathion, GSH-Px : enzyme glutathion peroxydas
Như vậy, ở cơ thể bình thường, oxy qua các chuyển hóa trong cơ thể tạo ra O2-,
H2O2 để thực hiện các chức năng sinh lý. Chúng chỉ tồn tại với một nồng độ vô
cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại cho cơ thể.
- Sự hình thành gốc tự do ngẫu nhiên:

Rất có thể do chuyển động nhiệt hoàn toàn ngẫu nhiên mà các gốc O2- và H2O2 va
đập với nhau, khơng có men đặc hiệu xúc tác, tạo ra một số phản ứng phụ sau:
Sự hình thành gốc tự do khơng có enzym SOD xúc tác:
Các gốc O2- có khả năng phản ứng với nhau trong điều kiện khơng có enzym SOD
xúc tác theo phản ứng sau:
O2-+ O2- + 2H+  H2O2 +

1

O2

Oxy đơn bội (1 O2) có tính oxy hóa rất mạnh. Nó có thể phản ứng với bất kỳ một
chất hữu cơ nào khi nó gặp tạo ra các peroxyd.
Phản ứng Harber - Weiss:
Các gốc O2- va đập với H2O2 :
O2-+ H2O2  1 O2 + OH +OH-


7

Phản ứng này xảy ra chậm nhưng có mặt Fe2+, Cu2+ thì tốc độ phản ứng xảy ra rất
nhanh (phản ứng fenton). Hai tiểu phân H2O2 và O2- không độc, có thể tạo ra 1 O2,
OH là những phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với
các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế
bào.
Sự hình thành gốc tự do từ các ion kim loại chuyển tiếp
Ion kim loại chuyển tiếp (Fe2+, Cu2+) dễ dàng phân tách H2O2 thành gốc OH :
Fe2+ + H2O2  Fe3+ + OH + OHBình thường phản ứng này trong sinh học ít xảy ra vì H2O2 ở nồng độ thấp cịn Fe2+,
Cu2+ thường bị khóa ở dạng phức, ít ở trạng thái tự do.
Các ion kim loại chuyển tiếp có thể phản ứng với oxy tạo ra gốc O2- . Phản ứng này

đặc biệt quan trọng vì nó khơi mào cho các phản ứng gốc tự do sinh ra.
Fe2+ + O2  Fe3+ + O2Cu1+ + O2  Cu2+ + O2Như vậy từ 4 tiểu phân O2-, H2O2, O2 và kim loại chuyển tiếp cùng hợp biến sinh ra
gốc OH và 1 O2 những tác nhân có khả năng phản ứng mạnh. Gốc OH phản ứng
mạnh với hầu hết các phân tử sinh học ở tốc độ khuếch tán, có khả năng gây tổn
thương lớn trong phạm vi bán kính nhỏ mà nó sinh ra.
Các gốc tự do là sản phẩm của quá trình sinh học bình thường trong cơ thể nhưng
cũng có thể là sản phẩm tạo ra từ sự ô nhiễm môi trường, hút thuốc lá, tia xạ, dùng
rượu bia, quá trình viêm, dùng một số thuốc hoặc kim loại nặng chẳng hạn như sắt,
đồng… Các yếu tố ngoại sinh ảnh hưởng đến sự hình thành gốc tự do có thể là các
chất hóa học cơ thể không tổng hợp sẵn được như các thuốc trừ sâu, diệt cỏ, các
chất nitrơ hữu cơ, các phẩm nhuộm. Khi xâm nhập vào cơ thể, các hóa chất này có
giai đoạn trung gian tạo ra các gốc tự do. Hoặc do ảnh hưởng của các tác nhân
viêm và hoại tử gan. Các hợp chất halogen hữu cơ có thể gây viêm hoại tử gan, điển
hình là CCl4. Khi vào gan được chuyển hóa như sau:


8

CCl4   CCl3  Cl2COO  … COCl2 (Phosgen)
Chính các dạng gốc trung gian này làm tăng quá trình peroxy hóa lipid. Qúa trình
peroxy hóa lipid mãnh liệt sẽ gây vỡ màng tế bào, gây viêm và có khả năng gây
hoại tử gan.
Ngoài ra, các tác nhân tiêu máu và bầm huyết, điển hình là các diazonaphtol,
diphenylhydrazin…cũng tạo ra gốc superoxyd (O2-).
Cơ thể hoạt động một cách bình thường là do cân bằng nội môi đã được thiết lập.
Nếu có một yếu tố nào phá vỡ cân bằng nội mơi thì được gọi là tác động của stress.
Khi cơ thể bị các stress như sự thay đổi môi trường sống, ô nhiễm môi trường, áp
lực và sự lo lắng – căng thẳng…thì hàm lượng các gốc tự do của oxy thường tăng
cao. Thông qua các dây thần kinh hướng tâm và vùng dưới đồi, cơ thể có những đáp
ứng với stress. Sự giải phóng ra adrenalin và noradrenalin, khi cơ thể bị stress tác

động sẽ dẫn tới khả năng chuyển hóa tương tác với oxy tạo ra các gốc O2-. Đồng
thời nhiều acid béo chưa no được giải phóng ra từ các lipid. Những yếu tố đó (gốc
O2 tăng, acid béo chưa no tăng…) thúc đẩy quá trình peroxy hóa tăng khi bị stress
[4], [19], [29].

1.1.1.2. Các bệnh lý hay tổn thương liên quan đến gốc tự do
Gốc tự do có tác dụng khơng tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới
sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày. Ở tuổi
trung niên, cơ thể mạnh, trấn áp được chúng, nhưng tới tuổi cao, sức yếu, gốc tự do
lấn át, gây thiệt hại nhiều gấp mười lần ở người trẻ. Nếu khơng bị kiểm sốt, kiềm
chế, gốc tự do gây ra các bệnh thối hóa, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị
nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ người cao niên.
Theo các nhà khoa học, gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh,
đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục
thuỷ tinh thể, bệnh đái tháo đường, cao huyết áp vô căn, xơ gan,…[19], [29].
Các bệnh lý này thường xảy ra do quá trình tổn thương trong cơ thể:


9

Sự tổn thương do q trình peroxy hóa lipid
Tất cả các phân tử sinh học đều có thể bị các gốc tự do tấn cơng. Nhưng trong cơ
thể, ngồi nước ra thì các tổ chức màng là phần lớn và quan trọng. Thành phần của
màng chủ yếu là các acid béo chưa no, phospholipid,…Vì vậy xác suất các gốc tự
do tấn cơng vào thành phần lipid gây ra q trình peroxy hóa lipid phải kể ở vị trí
đầu tiên. Q trình peroxy hóa là sự tương tác của các dạng oxy hoạt động với các
acid béo chưa no, tạo ra nhiều sản phẩm độc hại và các phản ứng gốc tự do lan
truyền trong cơ thể. Q trình peroxy hóa là một phản ứng gốc tự do điển hình với
ba giai đoạn: khơi mào, phát triển và dập tắt mạch.
• Giai đoạn khai mào:

Tác nhân khơi mào quan trọng là gốc OH xuất hiện. Gốc này cướp ngay lấy
nguyên tử H của các acid béo chưa no theo phản ứng:
LH + OH → H2O + L
O2
L

L1 H
LOO

L1 + LOOH

Từ một phân tử acid béo thơng thường nhanh chóng bị các gốc OH chuyển thành
phân tử peroxyd. Gốc L1 mới lại phản ứng với oxy và tương tự lại tạo ra L2OOH…
có nghĩa là có thể tạo ra nhiều hợp chất peroxyd tại vị trí xung quanh gốc OH xuất
hiện.
• Giai đoạn phát triển mạch:
Đó là giai đoạn chuyển tâm gốc tự do từ phân tử này sang phân tử khác theo cơ chế:
Gốc + phân tử → gốc mới + phân tử mới
Q trình này tăng nhanh khi có Fe2+, Cu2+ xúc tác.
• Giai đoạn dập tắt mạch:
Phản ứng gốc tự do chỉ bị ngừng khi sản phẩm của phản ứng khơng cịn ở trạng thái
gốc.


10

R + R → R-R
Các LOOH hình thành được GSH, GSH-Px… chuyển về các acid béo. Nghĩa là các
chất chống oxy hóa cịn đủ lớn, thì khả năng phục hồi các peroxyd về dạng acid béo
chưa no vẫn có thể thực hiện được. Nếu ngược lại, các chất chống oxy hóa thấp q

trình peroxy hóa lipid tăng, dẫn tới sự tích tụ nhiều đám peroxy lipid ở màng và
nhiều polymer sinh học khơng có hoạt tính. Tất cả dấu hiệu đó gọi là hội chứng
peroxy hóa.
Sự tổn thương do quá trình oxy hóa protein
Sự oxy hóa protein tế bào liên quan đến các gốc OH và O2•−, trong đó các
thành phần như: các aminoacid, các peptid đơn giản và protein bị phơi nhiễm trong
những điều kiện có các gốc tự do trên hoạt động. Những chuỗi bên của của các
aminoacid của protein đặc biệt là cystein và methionin thì nhạy cảm với sự oxy hóa
của các dạng oxy hoạt động. Sự oxy hóa cystein làm hư hại cầu nối disulfur giữa
các nhóm thiol protein (- SH) với những thiol có trọng lượng phân tử thấp, làm mất
tác dụng sinh lý của các chất sinh học, đặc biệt là hệ thống GSH và các enzym.
Sự tấn công của các gốc tự do vào các phân tử protein ít nhạy cảm hơn so với tấn
công vào các acid béo chưa no. Các dạng oxy hoạt động có thể gây ra các biến đổi
về cấu trúc và chức năng cho các phân tử protein. Nhiều protein có các gốc amino
acid nhạy cảm cao với các tác nhân oxy hóa, bị thay đổi về cấu trúc nhưng vẫn có
khả năng phục hồi được như sự oxy hóa của nhóm SH trong các phân tử protein.
Tổn thương do q trình oxy hóa DNA
Gốc tự do có tính oxy hóa rất mạnh như gốc hydroxyl (OH) có thể phản ứng với
acid nucleic, tấn cơng vào các thành phần của acid nucleic như: phần đường, phần
purin, và pyrimidin base. Từ đó, làm hư hỏng purin, pyrimidin base cũng như các
deoxyribose chính, tạo ra các dạng DNA bị tổn thương như dạng 8-oxo-2deoxyguanosin, ảnh hưởng đến chất liệu di truyền [27].
Malonyl dialdehyd (MDA) – sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid


11

Khi cơ thể bị stress oxy hóa, các gốc tự do được sản sinh ra ngày càng nhiều và liên
tục tấn công vào mọi thành phần của tế bào, đặc biệt là lipid. Việc đo trực tiếp
lượng gốc tự do trong tế bào hay cơ thể là cực kỳ khó khăn và phức tạp, do đó để
đánh giá mức độ tổn thương do gốc tự do gây ra, người ta có thể định lượng các

thành phần tế bào mà có thể phản ứng với các gốc tự do, ví dụ như protein, DNA và
chủ yếu là lipid. Các peroxyd này là những hợp chất khơng ổn định, chúng có xu
hướng suy giảm hàm lượng nhanh chóng thơng qua một loạt các biến đổi thành hợp
chất thứ cấp. Malonyl dialdehyd (MDA) là một trong những sản phẩm của q trình
peroxy hóa lipid, có tính chất khá ổn định và có thể được sử dụng như là một dấu
hiệu của sự tổn thương màng tế bào hay nói rộng ra là dấu hiệu của sự tổn thương tế
bào hay mô [34].
Một số bệnh lý điển hình liên quan đến gốc tự do [27], [52]
- Bệnh ung thƣ
Gốc tự do là nguyên nhân gây lão hoá và thức đẩy sự phát triển của bệnh ung
thư. Chúng tấn công đến rất nhiều các thành phần của tế bào như: màng tế bào,
protein, acid nucleic và gây nguy hiểm đến cấu chúc của ADN. Cấu trúc ADN bị
thay đổi rõ nhất như các điểm đột biến và đột biến nhiễm sắc thể trong các gen liên
quan đến ung thư, làm hoạt hoá gen ung thư telomerase; một protein bảo vệ mã hoá
cuối cùng của nhiễm sắc thể. Các loại chất chống ơxy hố có thể ngăn ngừa các
chất oxy hoá nguy hiểm đến ADN và giảm được nguy cơ mắc bệnh ung thư.
- Các bệnh tim mạch
Một kết quả nghiên cứu y học lớn về bệnh tim mạch đã được khám phá làm
sáng tỏ đó là cơ chế hoạt động của các gốc tự do gây ra bệnh tim mạch. Các kết quả
nghiên cứu đã chỉ ra rằng các bệnh tim liên quan tới hiện tượng giảm, thiếu các
vitamin chống oxy hoá trong huyết thanh. Ngồi ra các gốc tự do oxy hố phản ứng
làm giảm khối lượng của lipoprotein (LDL). Các phân tử LDL sau khi bị các gốc tự
do tác động sẽ trở nên nhỏ nhẹ hơn và dễ dàng kết hợp với các tế bào bạch cầu gọi


12

là đại tế bào thành một khối các tế bào xốp và tạo thành các mảng bám trên thành
mạch, chính các mảng trên bám vào thành mạch dẫn đến xơ cứng và hẹp thành
mạch, dẫn đến giảm sự lưu thông của máu, dẫn đến trong tim thiếu oxy và các chất

dinh dưỡng. Ngồi ra, lưu thơng máu kém dẫn đến quá trình tiếp nhận và cung cấp
các chất chống oxy hố càng thiếu, q trình oxy hố sẽ ngày càng nhiều. Tiếp tục
như vậy một thời gian sẽ dẫn đến các tế bào bị tổn thương và thiếu máu cục bộ.
Ngồi ra, stress oxy hóa cũng làm tăng nồng độ Ca++ nội bào, làm tăng co mạch dẫn
đến tăng huyết áp.Vì vậy các chất chống ơxy hố để khử các gốc tự do, sẽ phòng
tránh và giảm các nguy cơ bệnh tim mạch.
- Các bệnh thuộc thần kinh trung ƣơng
+Bệnh đột qụy
Các gốc tự do gây nguy hiểm tới hệ thống thành mạch trong não bộ, dẫn đến
thiếu máu cục bộ trong não, đó là ngun nhân chính dẫn đến bệnh đột qụy. Sử
dụng các chất chống oxy hố có tác dụng tích cực trong việc ngăn ngừa và giảm
nguy cơ mắc bệnh đột qụy.
+ Bệnh Alzheimer
Bệnh Alzheimer (AD) là một bệnh não mất trí nhớ của tuổi già. Biểu hiện
bằng việc mất trí nhớ và các vấn đề liên quan tới chức năng nhận thức. Bệnh lý chủ
yếu là sự hỗn loạn của các sợi thần kinh, màng não suy yếu và tổn hại các tế bào
não. Chính quá trình oxy hố gây ra bệnh AD, do não có nhu cầu tiêu thụ oxy nhiều
nhất trong cơ thể, gốc tự do làm tăng các q trình peroxy hóa lipid trong não, dẫn
đến tăng số lượng các sản phẩm oxy hóa như: MDA, 4-hydroxy-2-nonenal,
isopoprostan,… và thiếu hụt các enzym chống oxy hố, từ đó tăng sự thối hóa thần
kinh, đặc biệt ở những vùng liên quan trí nhớ, nhận thức. Ngoài ra, sắt cũng là một
tác nhân nguy hiểm trong việc tạo ra các gốc tự do, nó đã được tìm thấy một hàm


13

lượng lớn trong não của các bệnh nhân Alzheimer. Vì vậy, bổ sung các chất chống
oxy hoá thường xuyên cho người già sẽ giúp họ cải thiện trí nhớ tốt hơn [30].
- Bệnh viêm đƣờng tiêu hoá
Các bệnh viêm đường tiêu hoá như bệnh viêm ruột, viêm dạ dày và bệnh Crohn’s,

chúng cũng được liệt vào những bệnh gây ra bởi các chất ơxy hố nguy hiểm. Các
gốc tự do là nguyên nhân chính gây ra bệnh viêm đường tiêu hoá. Chất oxy hoá đã
gián tiếp gây tổn thương đến một chuỗi q trình oxy hố protein, tạo ra các sản
phẩm carbonnila protein. Bệnh viêm ruột được xem là nguyên nhân từ q trình oxy
hố protein trong các tế bào màng nhầy ruột bằng cách phá huỷ hệ thống enzym giữ
vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sự nguyên vẹn của lớp màng nhày đường tiêu
hoá, hoặc sự hấp thụ các ion và cả làm hư hại đến hệ thống đường tiêu hoá. Cơ thể
được cung cấp đủ các chất chống oxy hoá sẽ giúp cải thiện và tránh được các bệnh
đường tiêu hoá.
- Bệnh đái tháo đƣờng
Trong bệnh đái tháo đường typ 2, Chính q trình oxy hố đã làm bệnh ngày càng
trở nên trầm trọng hơn cũng như phát sinh nhiều biến chứng của bệnh. Nguyên
nhân do sự giảm những enzym bắt giữ gốc tự do như: catalase, glutathion
peroxidase, và superoxid dismutase làm tế bào β tuyến tụy tăng nhạy cảm với các
dạng oxy hoạt động và dễ bị các gốc tự do tấn công làm hư hỏng chức năng, dẫn
đến giảm hoặc mất khả năng tiết insulin, từ đó gây ra bệnh đái tháo đường.
- Bệnh viêm khớp dạng thấp
Gốc tự do làm tăng nồng độ prostaglandin trong máu và màng hoạt dịch, đồng thời
hoạt hóa tế bào lympho T và đại thực bào, làm chúng di chuyển vào trong màng
hoạt dịch ở khớp viêm ngày càng nhiều, gây ra tình trạng viêm khớp mạn tính.
Bệnh đặc trưng bởi hàm lượng cao các dẫn chất, lypoperoxyd trong hoạt dịch: dịch


14

này có độ nhớt thấp do các gốc tự do sinh ra từ bạch cầu trung tính được kích thích
ở khớp bị tổn thương, đã cắt ngắn các polyme của acid hyaluronic.

1.1.2. Chất chống oxy hóa và sự phịng vệ của cơ thể chống lại gốc tự do
1.1.2.1. Khái niệm về chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là những chất có khả năng nhường điện tử, chúng ngăn cản
hoạt động cướp điện tử gốc tự do bằng cách nhường điện tử cho những gốc này.
Nhờ vậy chúng có thể vơ hiệu hóa các gốc tự do và biến chúng thành những phân tử
vơ hại, đồng thời có khả năng duy trí cấu trúc và chức năng của tế bào, phục hồi các
tế bào bị tổn thương, giúp tăng cường hệ thống miễn dịch, ngăn ngừa bệnh tật và
hạn chế sự tổn thương do các gốc tự do gây ra.
Chất chống oxy hóa có nhiều trong rau, trái cây và cũng được tìm thấy trong các
loại hạt, ngũ cốc, trà, rau đậu,…và đặc biệt là các thảo dược có từ thiên nhiên.
Ngồi các chất chống oxy hóa phổ biến như Vitamin E, Vitamin C, β-caroten, selen,
còn kể đến anthocyanins, catechin, flavonoid, acid Lipoic, lutein và lycopen…Cơ
thể có thể sản xuất chất chống oxy hóa riêng của mình và cũng có thể có được
chúng từ thực phẩm. Sự phối hợp của các chất chống oxy hóa nội và ngoại sinh tạo
ra một mạng lưới chống oxy hóa trong cơ thể, làm tăng hiệu lực của nhau nhằm bảo
vệ cơ thể chống lại tác động xấu gây ra bởi gốc tự do [4], [28].
1.1.2.2. Sự phòng vệ của cơ thể chống lại gốc tự do
Do việc sinh ra các gốc tự do trong tế bào là không thể tránh khỏi, nên việc bảo vệ
chống lại những tác hại của gốc tự do là tất yếu. Đó là sự phịng vệ của các chất
chống oxy hóa nội sinh trong cơ thể với hai cách tác động sau đây, một là phòng
ngừa sinh ra các gốc bao gồm hiệu lực vận chuyển điện tử của oxy hóa và sự khóa
các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, đặc biệt với các protein như transferin,
lactoferin, feritin. Hai là loại bỏ các gốc đã sinh ra trước khi chúng đủ mức gây ra
những biến đổi chuyển hóa và định hướng đến sự sống của tế bào. Ở trong tế bào


15

quan trọng nhất là enzym SOD và hệ thống glutathion. Ở tổ chức màng thì quan
trọng nhất là các chất kiểu Vitamin E, ubiquinon, β-caroten. Ở pha nước có vai trò
của Vitamin C và một số chất như acid uric.
Gan là cơ quan có nhiều enzym trong đó những enzym đóng vai trị quan trọng

trong nhiều việc chống oxy hóa là: các chất chống peroxyd, enzym SOD, phân hủy
các gốc tự do khác, những protein khóa kim loại chuyển tiếp như transferin,
lactoferin, feritin,…Các chất chống peroxyd chiếm thành phần chủ yếu trong gan,
đó là các chất glutathion (GSH), enzym glutathion peroxydase (GSH-Px). Khẩu
phần ăn đủ protein và hàm lượng selen liên quan chặt chẽ với GSH và hoạt tính
enzym GSH-Px, nếu hàm lượng selen khơng đủ thì GSH giảm, hoạt độ enzym
GSH-Px thấp. Enzym SOD có khả năng phân hủy đặc hiệu các gốc O2 _ . Vitamin
E, ubiquinon, Vitamin C và acid uric huyết tương có khả năng loại bỏ các gốc tự do.
Phân tử β-caroten cũng có tính chất chống oxy hóa theo cơ chế nhận năng lượng
kích thích của oxy đơn bội, biến oxy đơn bội thành oxy thường và bản thân βcaroten trở thành dạng kích thích, sau đó có thể trở về trạng thái bình thường hoàn
toàn bằng hiện tượng vật lý là năng lượng kích thích truyền cho các liên kết nội tạng
dưới dạng nhiệt [4].
Glutathion (GSH)
Glutathion là thành phần quan trọng của hệ thống phịng vệ chống oxy hóa, hàm
lượng glutathione nội bào được xem là một chỉ tiêu đánh giá khả năng chống oxy
hóa của tế bào. GSH đóng vai trị quan trọng trong vô số chức năng của tế bào, bao
gồm tổng hợp DNA, điều hòa sự hằng định của Ca2+ nội bào tương và khử các oxy
phản ứng. Sự suy giảm của GSH trong tế bào làm tăng sản xuất các chất tiền-oxy
hóa, thúc đẩy tế bào chết theo chương trình. GSH góp mặt trong nhiều enzym chống
oxy hóa như Se-glutathion peroxidase, glutathion S-transferase, và glutathion
reductase, có vai trị tiêu diệt các oxy phản ứng. Vì thế duy trì sự ổn định glutathion
trong tế bào có vai trị sống cịn đối với các tế bào trong cơ thể.


16

Glutathion được hình thành từ ba amino acid: cystein chứa nhóm hoạt hóa là thiol (SH), acid glutamic và glycin với cơng thức hóa học là C10H17N3O6S (M=307,33).
Đây là một chất chống oxy hóa, một chất kháng độc và là một coenzym thiết yếu
cho các enzym chống oxy hóa.
Phân tử GSH có khả năng hịa tan tức thời trong nước, chúng được tìm thấy chủ yếu

trong tế bào chất và trong pha nước của hệ thống sống. GSH thường đạt tới mức
hàng triệu phân tử bên trong những tế bào, tạo nên một nồng độ chống chất oxy hóa
tối đa trong nội bào.
Trong cơ thể, GSH có thể ở trạng thái tự do hay kết hợp với protein, đồng thời GSH
chuyển hóa qua lại giữa 2 dạng:
Dạng khử là GSH có nhóm sulfhydryl (-SH) tạo cho phân tử GSH có đặc tính
nhường điện tử (electron-donating).
Dạng oxy hóa là một hợp chất có cầu nối sulfur (S-S), được biết như là một
glutathion disulfur hay GSSG.
Ở trạng thái bình thường, glutathion tự do hiện diện chủ yếu ở dạng khử (GSH)
(chiếm trên 90% tổng số phân tử glutathion) và có thể được chuyển thành dạng oxy
hóa (GSSG) trong q trình stress oxy hóa. Ngược lại, GSSG cũng có thể chuyển
hóa trở lại thành GSH nhờ có enzym glutathion reductase.
Ở tế bào bình thường, dạng oxy hóa (GSSG) thường khơng chiếm đến 10% tổng số
phân tử glutathion, nếu tỉ lệ này thay đổi theo hướng gia tăng dạng oxy hóa (GSSG)
thì hiện tượng stress oxy hóa đã xuất hiện [38].
1.2. Gốc tự do và chống oxy hóa theo quan niệm YHCT
Trong YHCT khơng có danh từ gốc tự do và chống oxy hóa, do việc sinh ra
các gốc tự do trong tế bào là không thể tránh khỏi, nên việc bảo vệ cơ thể chống
lại những tác hại của gốc tự do là tất yếu. Đó là sự phịng vệ của các chất chống
oxy hóa nội sinh trong cơ thể mà theo YHCT tương ứng với chính khí của cơ thể
(bao gồm khí, huyết, tinh, tân dịch). Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể


17

liên tục ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả
chục ngàn gốc tự do mỗi ngày. Ở tuổi trẻ, cơ thể mạnh, trấn áp được chúng, nhưng
tới tuổi cao, sức yếu, gốc tự do lấn át, gây thiệt hại nhiều gấp nhiều lần ở người
trẻ, thêm vào đó vấn đề ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái và lối sống

thay đổi,… làm các gốc tự do tạo được sản sản sinh ngày càng nhiều và liên tục
tấn công vào mọi thành phần của tế bào (màng tế bào, protein, acid nucleic, cấu
trúc của AND,…), tức là theo YHCT tương ứng với chính khí bị suy gây ra chứng
hư lao do khí, huyết, tinh, tân dịch hao tổn.
Hư lao là biểu hiện do hậu quả của các loại bệnh mạn tính diễn tiến lâu ngày
tích lại mà thành. Bệnh lâu ngày thường là bệnh của các tạng phủ đã bị hư tổn.
Hư lao còn gọi là hư tổn, hư là bệnh lâu ngày làm suy giảm khí, huyết, tinh,
tân dịch. Tổn là tình trạng hư tích lại, làm tổn thương thêm tạng phủ khó phục hồi
[7], [24].
Theo Hải Thượng Lãn Ơng ( Hải thương y tơng tâm lĩnh) các bệnh hư lao đã lâu
ngày thì âm hỏa hun đốt cần phải cứu chân âm cho hỏa tự rút để giải thốt cho tình
trạng tinh huyết khơ kiệt nguy cấp.
Âm hư là tên gọi chung cho trường hợp tinh huyết bất túc hoặc tân dịch hao tổn mà
trên lâm sàng thường có các chứng hậu âm hư tân dịch thiếu hoặc âm không chế
được dương. Bệnh đa số do tiên thiên suy tổn, ốm lâu lao tổn hoặc giai đoạn cuối
của bệnh nhiệt âm dịch hao thương gây ra. Trích y văn kinh điển: “Hoàng đế hỏi:
thế nào là âm hư sinh nội nhiệt? Kỳ Bá đáp: cơ thể có phần nhọc mệt, hình khí giảm
sút, khơng ăn được, thượng tiêu không lưu thông, vùng hạ quản cũng không thông,
vị khí nóng, nhiệt khí hun đốt trong ngực cho nên nội nhiệt” (Điều kinh luận-Tố
Vấn). Theo Y học tâm ngộ thì “nếu như mạch sác vơ lực, hư hỏa có lúc bốc lên,
miệng ráo, lưỡi khơ nóng ở trong, táo bón, khí nghịch xơng lên, đó là chân âm kém”.
Biểu hiện lâm sàng chủ yếu của chứng âm hư: thể tạng gầy cịm, miệng ráo, họng
khơ, ù tai, chóng mặt, mất ngủ, triều nhiệt, đạo hãn, đau lưng, ngũ tâm phiền nhiệt,
gị má đỏ, tiểu ít sắc vàng, đại tiện táo kết, lưỡi đỏ ít rêu, mạch tế sác [11].