Nghiên cứu định lượng đồng thời một số chất nhóm methylxanthines trong chè bằng phổ UV VIS IR và bước đầu nhận dạng chè xanh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN THỊ HUẾ

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ CHẤT
NHÓM METHYLXANTHINES TRONG CHÈ BẰNG PHỔ
UV-VIS, IR VÀ BƯỚC ĐẦU NHẬN DẠNG CHÈ XANH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN THỊ HUẾ

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ CHẤT
NHÓM METHYLXANTHINES TRONG CHÈ BẰNG PHỔ
UV-VIS, IR VÀ BƯỚC ĐẦU NHẬN DẠNG CHÈ XANH
Chun ngành: Hóa phân tích
Mã số: 9440112.03

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Tạ Thị Thảo
2. PGS.TS. Nguyễn Văn Ri

Hà Nội - 2020

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng
dẫn của PGS.TS. Tạ Thị Thảo và PGS. TS. Nguyễn Văn Ri. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình
nào khác.
Tác giả

Trần Thị Huế

i


LỜI CẢM ƠN
Luận án này được hồn thành tại phịng thí nghiệm Hóa phân tích, Khoa Hóa
học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội và phịng thí
nghiệm Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Ngun.
Với lịng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS.
Tạ Thị Thảo và PGS.TS. Nguyễn Văn Ri bộ mơn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều
kiện thuận lợi cho tơi trong q trình học tập và nghiên cứu.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong bộ mơn Hóa phân tích,
Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã
giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong q trình học tập và nghiên cứu.
Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học
Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Tơi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của đề tài mã số ĐH2018-TN04-03
để tơi có thể hồn thành tốt luận án này.

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp
đã ln động viên, giúp đỡ về vật chất và tinh thần để tơi có thể hồn thành tốt
luận án này.
Tác giả

Trần Thị Huế

ii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
MỤC LỤC ..................................................................................................................1
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.......................................................................4
DANH MỤC CÁC HÌNH .........................................................................................9
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................10
Chương 1. TỔNG QUAN .......................................................................................14
1.1. Giới thiệu chung về cây chè và sản phẩm chè Việt Nam ..................................14
1.1.1 Phân loại chè Việt Nam .............................................................................14
1.1.2. Thành phần hóa học trong chè .................................................................17
1.2. Giới thiệu về nhóm chất methylxanthines .........................................................20
1.2.1. Đặc điểm cấu tạo và tính chất ..................................................................20
1.2.2.Tác dụng dược lý .......................................................................................22
1.3. Các phương pháp định lượng methylxanthines trong chè .................................23
1.3.1. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ..................................................23
1.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ..........................................................27
1.3.3. Phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến ....28
1.3.4. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) kết hợp với thuật toán

hồi quy đa biến ...................................................................................................33
1.4. Ứng dụng thống kê đa biến trong phân loại nguồn gốc địa lý chè ....................34
1.4.1. Các phương pháp nhận dạng và phân loại đối tượng phân tích ..............34
1.4.2. Phân loại nguồn gốc địa lý chè dựa trên dữ liệu hàm lượng chất phân tích
trong mẫu ............................................................................................................38
1.4.3. Phân loại nguồn gốc địa lý chè dựa trên phân tích dữ liệu phổ kết hợp
thống kê đa biến ..................................................................................................41
Chương 2. THỰC NGHIỆM ..................................................................................45
2.1. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ..............................................................................45
2.1.1. Hóa chất ...................................................................................................45

1


2.1.2. Dụng cụ và thiết bị....................................................................................46
2.2. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................47
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................48
2.3.1. Phương pháp định lượng đồng thời ba chất TB, TP và CF trong các mẫu chè
............................................................................................................................48
2.3.2. Phương pháp phân loại nguồn gốc địa lý của các mẫu chè dựa trên dữ liệu
phổ UV-Vis, NIR ................................................................................................54
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................56
3.1. Phát triển phương pháp HPLC định lượng đồng thời TB, TP, CF trong chè xanh
...................................................................................................................................56
3.1.1.Khảo sát lựa chọn điều kiện tách TB, TP, CF trên hệ HPLC .........................56
3.1.2. Đường chuẩn xác định TB, TP, CF và giới hạn phát hiện của thiết bị ....62
3.1.3. Khảo sát điều kiện chiết TB, TP, CF ra khỏi nền mẫu .............................64
3.1.4. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích TB, TP, CF bằng
HPLC ..................................................................................................................65
3.1.5. Phân tích mẫu thực tế ...............................................................................72

3.2. Nghiên cứu định lượng đồng thời ba methylxanthines trong chè bằng quang phổ hấp
thụ phân tử (UV-Vis) kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến ......................................74
3.2.1. Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính ....................................................74
3.2.2. Phương pháp thêm chuẩn đa biến sử dụng mô hình SANAS .......................85
3.3. Nghiên cứu định lượng đồng thời TB, TP, CF trong chè bằng phổ hồng ngoại
phản xạ kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến ........................................................87
3.3.1. Phổ hồng ngoại phản xạ của các mẫu chè ..................................................87
3.3.2. Tiền xử lý số liệu ........................................................................................88
3.3.3. Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến tuyến tính...........................89
3.3.4. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế ............................................................102
3.4. Phân loại chè theo nguồn gốc địa lý dựa trên dữ liệu phổ và các phương pháp
thống kê đa biến ......................................................................................................107
3.4.1. Phân loại và nhận dạng chè theo nguồn gốc địa lý bằng phổ hấp thụ phân
tử..............................................................................................................................108

2


3.4.2. Phân loại và nhận dạng chè theo nguồn gốc địa lý bằng phổ hồng ngoại
phản xạ .............................................................................................................114
3.4.3. Phân loại và nhận dạng chè bằng cách ghép nối các dữ liệu phổ NIR và
phổ UV-Vis .......................................................................................................118
KẾT LUẬN ............................................................................................................122
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN .....................................................................................................124
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................125

3

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TT

Viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

1

ANN

Artificial neural network

Mạng nơron nhân tạo

2

ACN

Acetonitrile

Acetonitrile

3

As

Symmetry factor

Hệ số đối xứng

4

CF

Caffeine

Caffeine

5

C

Catechin

Catechin

6

DA

Discriminant analysis

Phân tích phân biệt

7

EC

Epicatechin

Epicatechin

8

ECG

Epicatechin gallate

Epicatechin gallate

9

EGC

Epigallocatechin

Epigallocatechin

10

EGCG

Epigallocatechin gallate

Epigallocatechin gallate

11

EtOH

Ethanol

Ethanol

12

HPLC

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography
13

HPLC-DAD

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography with diode-array

kết nối detector mảng diod

detection
14

HPLC-DAD/

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

MS

chromatography with diode array

kết nối detector mảng diod

detection coupled with mass

và khối phổ

spectrometry
15

HPLC-UV

High-performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography with ultraviolet

kết nối detector quang phổ

detection

tử ngoại
Phổ hồng ngoại

16

IR

Infrared spectroscopy

17

ICP-MS

Inductively coupled plasma mass Quang phổ nguồn plasma
cảm ứng cao tần kết nối khối

spectrometry

phổ
18

ICP-AES

Inductively Coupled Plasma atomic Quang phổ phát xạ plasma
Emission Spectroscopy

19

LC

Liquid chromatography

4

Sắc ký lỏng


20

LC-MS

Liquid chromatography coupled to

Sắc ký lỏng khối phổ

mass spectrometry
21

LDA

Linear discriminant analysis

Phân tích phân biệt tuyến
tính

22

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

23

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lượng

24

MC

Mean centreing

Chuẩn hóa trung bình

25

MeOH

Methanol

Methanol

26

MLR

Multivariate linear regression

Hồi quy đa biến tuyến tính

27

MS

Mass Spectrometry

Phổ khối

28

N

Theoretical plate

Số đĩa lý thuyết

29

NIR

Near infrared spectroscopy

Phổ hồng ngoại gần

30

PC

Principal component

Thành phần chính

31

PCA

Principal component analysis

Phân tích thành phần chính

32

PCR

Principal component regression

Hồi quy thành phần chính

33

PDA

Photo diode array

Mảng diod quang

34

PLS

Partial least squares

Bình phương tối thiểu từng
phần

35

ppm

Parts per million

Phần triệu

36

R

Coeficient regression

Hệ số tương quan

37

RB

Robinson Briston

Hệ đệm Robinson Briston

38

RMSE

Root mean square error

Căn bậc hai sai số tồn
phương trung bình

39

Rs

Resolution

Độ phân giải

40

RSDr

Relative standard deviation for

Độ lệch chuẩn tương đối lặp

repeatability

lại

Relative standard deviation for

Độ lệch chuẩn tương đối tái

reproducibility

lặp

Standad addition net analyte signal

Tín hiệu phân tích tổng

41
42

RSDR
SANAS

thêm chuẩn
43

SIMCA

Soft independent modeling of class
analogy

5

Mơ hình hóa độc lập mềm


44

SNV

Standard normal transformation

Chuyển dạng thành phân bố
chuẩn

45

SVM

Support vector machine

Tính hỗ trợ vector

46

TB

Theobromine

Theobromine

47

TP

Theophylline

Theophylline

48

tR

Retention time

Thời gian lưu

49

UV-Vis

Ultraviolet-visible

Vùng tử ngoại - khả kiến

50

v/v

Volume/volume

Thể tích/thể tích

51

LD

Lam Dong

Lâm Đồng

52

PT

Phu Tho

Phú Thọ

53

TN

Thai Nguyen

Thái Nguyên

54

CTK

Các tỉnh khác

(Chú thích: Tên hóa chất trong luận án được viết theo tên Tiếng Anh)

6


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của lá chè xanh ........................................................17
Bảng 1.2. Các tiêu chuẩn hóa lý của châu Âu về sản phẩm chè xanh ......................20
Bảng 1.3. Công thức cấu tạo, danh pháp IUPAC của các methylxanthines .............21
Bảng 1.4. Tính chất của một số hợp chất hữu cơ nhóm methylxanthines ................22
Bảng 1.5. Một số cơng trình nghiên cứu xác định các methylxanthines và các chất
khác trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC...........................................25
Bảng 1.6. Một số cơng trình nghiên cứu xác định đồng thời các methylxanthines và
các chất khác chè bằng phương pháp NIR ....................................................32
Bảng 1.7. Một số cơng trình nghiên cứu phân loại chè dựa trên dữ liệu phổ NIR.............42
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của dung môi pha động đến thông số pic các chất định phân.........58
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ thành phần pha động đến thông số pic các chất định
phân ................................................................................................................60
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tốc độ dịng đến thơng số pic các chất định phân ...........62
Bảng 3.4. Điều kiện tối ưu cho phép tách TB, TP, CF bằng phương pháp HPLC ..........62
Bảng 3.5. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ TB, TP, CF ...............................63
Bảng 3.6. LOD, LOQ của đường chuẩn TB, TP và CF bằng phương pháp HPLC ........64
Bảng 3.7. Bảng phân tích dữ liệu phổ MS của methylxanthines ...................................68
Bảng 3.8. Tính thích hợp của hệ thống HPLC đối với TB, TP, CF ...............................68
Bảng 3.9. Kết quả phân tích độ lặp lại trong ngày và khác ngày đối với TB, TP, CF bằng
phương pháp HPLC .........................................................................................69

Bảng 3.10. Kết quả đánh giá độ lặp lại trong ngày và khác ngày đối với TB, TP, CF bằng
phương pháp HPLC .........................................................................................70
Bảng 3.11. Giá trị MDL và MQL đối với TB, TP và CF bằng phương pháp HPLC ......71
Bảng 3.12. Hiệu suất thu hồi của phương pháp phân tích trong các mẫu chè.................71
Bảng 3.13. Hàm lượng TB, TP và CF trong các mẫu chè xác định bằng phương pháp
HPLC (n=3, RSD<2%) ....................................................................................73
Bảng 3.14. Hàm lượng CF, TB, TP trong các mẫu chè sử dụng làm mẫu chuẩn .........77
Bảng 3.15. Hàm lượng CF, TB, TP trong các mẫu chè sử dụng làm mẫu kiểm tra ..........77
Bảng 3.16. Độ chính xác của mơ hình PCR xác định TB, TP, CF trong mẫu kiểm tra theo
phương pháp UV-Vis .......................................................................................80
Bảng 3.17. Độ chính xác của mơ hình PLS xác định TB, TP, CF trong mẫu kiểm tra
theo phương pháp UV-Vis .............................................................................83

7


Bảng 3.18. So sánh độ chính xác của mơ hình PCR và PLS xác định TB, TP, CF trong
mẫu kiểm tra trước và sau khi loại tannin ......................................................84
Bảng 3.19. Ma trận nồng độ TB, TP, CF được thêm và mẫu chè ................................85
Bảng 3.20. Hàm lượng TB, TP và CF trong các mẫu chè xác định bằng phương pháp UVVis/SANAS .....................................................................................................86
Bảng 3.21. Độ chính xác của mơ hình PCR xác định TB trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm
tra theo phương pháp NIR ...............................................................................90
Bảng 3.22. Độ chính xác của mơ hình PCR xác định TP trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm
tra theo phương pháp NIR ...............................................................................91
Bảng 3.23. Độ chính xác của mơ hình PCR xác định CF trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm
tra theo phương pháp NIR ...............................................................................92
Bảng 3.24. Độ chính xác của mơ hình PLS xác định TB trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm
tra theo phương pháp NIR ...............................................................................97
Bảng 3.25. Độ chính xác của mơ hình PLS xác định TP trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm
tra theo phương pháp NIR ...............................................................................98

Bảng 3.26. Độ chính xác của mơ hình PLS xác định CF trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm
tra theo phương pháp NIR ...............................................................................99
Bảng 3.27. So sánh hàm lượng TB, TP và CF trong các mẫu chè xác định bằng phương
pháp NIR/PLS với phương pháp HPLC ........................................................102
Bảng 3.28. Hàm lượng TB, TP và CF trong 75 mẫu chè xác định bằng phương pháp
NIR/PLS .......................................................................................................103
Bảng 3.29. Kết quả các chỉ số thống kê dữ liệu TB, TP trong các mẫu chè .................106
Bảng 3.30. Kết quả các chỉ số thống kê dữ liệu CF và tổng ba methylxanthines trong các
mẫu chè .........................................................................................................106
Bảng 3.31. Số lượng mẫu thuộc các vùng địa lý trong mơ hình phân loại .............107
Bảng 3.32. Độ chính xác của mơ hình phân loại nguồn gốc địa lý chè theo phương pháp
UV-Vis kết hợp với PCA-DA ........................................................................109
Bảng 3.33. Độ chính xác của mơ hình phân loại nguồn gốc địa lý chè theo phương pháp
UV-Vis kết hợp với PLS-DA ..........................................................................111
Bảng 3.34. Độ chính xác của mơ hình phân loại nguồn gốc địa lý chè theo phương pháp
NIR kết hợp với PCA-DA ..............................................................................115
Bảng 3.35. Độ chính xác của mơ hình phân loại nguồn gốc địa lý chè theo phương pháp
NIR kết hợp với PLS-DA ...............................................................................117

8


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hình ảnh thân cây, lá và hoa chè ..............................................................14
Hình 1.2. Quy trình sản xuất chè...............................................................................16
Hình 1.3. Mơ hình xử lý số liệu của phương pháp ANN ..........................................38
Hình 3.1. Phổ UV-Vis của TB, TP, CF.....................................................................56
Hình 3.2. Ảnh hưởng dung môi pha động trong phép định lượng đồng thời TB, TP,
CF bằng HPLC ...............................................................................................57

Hình 3.3. Ảnh hưởng tỉ lệ pha động trong phép định lượng đồng thời TB, TP, CF
bằng HPLC .....................................................................................................59
Hình 3.4. Ảnh hưởng tốc độ dòng pha động trong phép định lượng đồng thời TB, TP,
CF bằng HPLC ...............................................................................................61
Hình 3.5. Đường chuẩn xác định TB, TP, CF bằng phương pháp HPLC ................63
Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian chiết mẫu đến hàm lượng TB, TP, CF ...................64
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết mẫu đến hàm lượng TB, TP, CF.....................65
Hình 3.8. Sắc ký đồ HPLC-UV đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp......................66
Hình 3.9. So sánh phổ UV của mẫu thử chè xanh và mẫu chuẩn trên thiết bị HPLC .....66
Hình 3.10. Sắc ký đồ trên hệ HPLC detector PDA và hệ HPLC detector DAD ghép nối
MS ..................................................................................................................67
Hình 3. 11. Sắc ký đồ mẫu chè (a) - LD5, (b) - TN9, (c) - CTK10 ................................72
Hình 3.12. Phổ UV-Vis của 125 mẫu trong vùng phổ 190-700nm (a), và vùng 240310 nm (b) ......................................................................................................74
Hình 3.13. Phổ UV-Vis của dung dịch chuẩn, mẫu chè và mẫu chè thêm chuẩn ....75
Hình 3.14. Sơ đồ tìm ma trận trị số a) và ma trận trọng số b) .................................78
Hình 3.15. Phương sai tích lũy của mơ hình biểu diễn theo số PC trong phương pháp
UV-Vis/PCR ..................................................................................................79
Hình 3.16. Biểu diễn cách tìm ma trận trực giao trong PLS .....................................81
Hình 3.17: Phương sai tích lũy của mơ hình biểu diễn theo số PC trong phương pháp
UV-Vis/PLS ...................................................................................................82
Hình 3.18. Đường thêm chuẩn xác định nồng độ CF(a), TB(b), TP(c) trong mẫu chè
xanh Thái Nguyên ..........................................................................................86
Hình 3.19. Đường thêm chuẩn xác định nồng độ CF(a), TB(b), TP(c) trong mẫu chè
xanh Hà Giang ...............................................................................................86
Hình 3.20. Phổ hồng ngoại phản xạ của các mẫu chè..................................................87

9


Hình 3.21. Phổ hồng ngoại phản xạ của các mẫu chè sau tiền xử lý bằng MC (c) và SNV

(b) ...................................................................................................................88
Hình 3.22. Phương sai tích lũy của mơ hình biểu diễn theo số PC trong phương pháp
IR/PCR ...........................................................................................................89
Hình 3.23. Độ chính xác của mơ hình PCR xác định TB (a), TP (b), CF (c) trong mẫu
kiểm tra bằng phương pháp NIR .....................................................................92
Hình 3.24. Tương quan hàm lượng TB, TP, CF tìm được từ mơ hình PCR với hàm lượng
xác định bằng HPLC trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra ..................................94
Hình 3.25. Phương sai tích lũy của mơ hình biểu diễn theo số PC trong phương pháp
IR/PLS ............................................................................................................96
Hình 3.26. Độ chính xác của mơ hình PLS xác định TB, TP, CF trong mẫu kiểm tra bằng
phương pháp NIR ............................................................................................99
Hình 3.27. Tương quan hàm lượng TB, TP và CF tìm được từ mơ hình PLS với hàm
lượng xác định bằng HPLC trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra ......................101
Hình 3.28. Biểu đồ biểu diễn độ tập trung và phân tán hàm lượng TB, TP, CF trong các
mẫu chè theo khu vực địa lý khác nhau ..........................................................106
Hình 3.29. Phương sai tích lũy của mơ hình biểu diễn theo số PC trong phương pháp UVVis/PCA-DA .................................................................................................108
Hình 3.30. Kết quả kiểm tra mơ hình PCA-DA/UV-Vis với 25 mẫu kiểm tra .............110
Hình 3.31. Mơ hình ANN trên cơ sở dữ liệu phổ UV-Vis ......................................112
Hình 3.32. Số mẫu nhận dạng và độ chính của mơ hình phân loại theo ANN trên cơ
sở dữ liệu phổ UV-Vis của mẫu chuẩn ........................................................113
Hình 3.33. Số mẫu nhận dạng và độ chính xác của mơ hình phân loại theo ANN trên
cơ sở dữ liệu phổ UV-Vis của mẫu kiểm tra ...............................................114
Hình 3.34. Phương sai tích lũy của mơ hình biểu diễn theo số PC trong phương pháp
NIR/ PCA-DA ..............................................................................................115
Hình 3.35. Kết quả kiểm tra mơ hình PCA-DA/NIR với 25 mẫu kiểm tra ............116
Hình 3.36. Kết quả kiểm tra mơ hình PLS-DA/NIR với 25 mẫu kiểm tra .............118
Hình 3.37. Độ chính xác của mơ hình PLS-DA trên cơ sở dữ liệu ghép phổ UV-Vis
và NIR ..........................................................................................................119
Hình 3.38. Độ chính xác của mơ hình phân loại theo PCA-ANN trên cơ sở dữ liệu
ghép phổ của mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b) ................................................120

10


MỞ ĐẦU
Chè (Camellia sinensis) từ lâu đã là một đồ uống quen thuộc của con người và
được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt Trung Quốc, Nhật Bản,
Việt Nam. Nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy lá chè chứa khoảng 2000 hợp
chất hóa học, trong đó các polyphenols chiếm khoảng 25-30%, caffeine chiếm khoảng
2-5%; theobromine và theophylline chiếm khoảng 0,2-0,5% lượng chất khô [4, 99].
Trong lá chè, caffeine, theobromine và theophyline thuộc nhóm methylxanthines
được quan tâm đặc biệt vì có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như: caffeine có tác
dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, tim và hơ hấp; theobromine và theophyline
là các chất có tác dụng làm giãn cơ trơn. Thành phần hóa học đặc biệt là hàm lượng
của các methylxanthines, polyphenol sẽ quyết định đến chất lượng và giá trị kinh tế
của chè thành phẩm. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, bên cạnh yếu tố giống, chế độ
canh tác, kĩ thuật chế biến ...thì điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng có ảnh hưởng rất lớn
đến các thành phần hóa học của chè [15, 61, 97]. Do vậy, chè thành phẩm ở các vùng
địa lý khác nhau sẽ có giá trị kinh tế khác nhau. Trong những năm gần đây, một số
loại chè đã được đăng ký nhãn hiệu chứng nhận, chỉ dẫn địa lý như: chè Shan tuyết
Mộc Châu, chè Tân Cương Thái Nguyên, chè Lâm Đồng, chè Suối Giàng Yên Bái.
Tuy nhiên, hiện nay vẫn tồn tại nhiều điểm bán chè với thương hiệu nổi tiếng nhưng
khơng có nhãn mác đúng quy chuẩn. Trước thách thức trên, việc kiểm soát chất lượng
và truy xuất nguồn gốc sản phẩm dần trở thành nhu cầu tất yếu mang lại những lợi
ích thiết thực cho nhà sản xuất và người tiêu dùng.
Phương pháp điển hình để định lượng các methylxanthines trong chè là
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detector UV, khối phổ [48,
65, 84]. Tuy nhiên, phương pháp HPLC có nhược điểm q trình xử lí mẫu phức tạp,
chi phí dung mơi lớn do đó khơng phù hợp với thực tế sản xuất hướng đến các phương
pháp phân tích nhanh, đồng thời. Gần đây, hướng nghiên cứu nhóm các phương pháp

phổ như quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) và quang phổ hồng ngoại (IR) kết hợp
với các thuật toán thống kê đa biến nhằm mục đích định lượng đồng thời các chất
đang phát triển mạnh mẽ [60, 75, 83, 104]. So với các phương pháp phân tích hóa
học, thì định lượng các chất trong thực phẩm bằng phổ UV-Vis và phổ IR có ưu điểm
nổi trội, khơng phải xử lý mẫu, phân tích nhanh, giá thành rẻ.
10


Ở Việt Nam đã có một số cơng trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp IR
vùng gần và trung bình để định lượng đồng thời một số hoạt chất trong thuốc viên
nén [2, 3]. Trong các nghiên cứu trên, việc xây dựng mơ hình hồi quy tuyến tính được
thực hiện trên các mẫu chuẩn đã biết trước hàm lượng bằng cách trộn các chất chuẩn
và tá dược theo công thức đã biết. Tuy nhiên, khơng thể tự tạo chính xác mẫu chuẩn
theo cách này với nền mẫu tự nhiên như mẫu chè. Hiện nay, ở Việt Nam chưa có
cơng trình nghiên cứu nào định lượng đồng thời các chất nói chung và nhóm
methylxanthines nói riêng trong nền mẫu phức tạp như thực phẩm dựa trên dữ liệu
phổ UV-Vis, IR.
Để truy xuất nguồn gốc sản phẩm thì hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng các
phương pháp thống kê đa biến dựa trên tập số liệu về kết quả phân tích các thành
phần hóa học trong mẫu bằng phương pháp HPLC, ICP- OES [13, 64, 71, 107]. Tuy
nhiên, để phân loại sản phẩm theo cách này đòi hỏi cần rất nhiều dữ liệu phân tích
dẫn đến chi phí và thời gian phân tích lớn . So với phương pháp trên, phương pháp
thống kê đa biến dựa trên dữ liệu quang phổ tồn phần cho lượng thơng tin về thành
phần hóa học trong mẫu đa dạng hơn nên kết quả phân loại và nhận dạng hiệu quả
hơn. Mặt khác, trên cùng một tập số liệu phổ IR, UV-Vis có thế đạt được cả mục đích
phân loại và định lượng các hoạt chất.
Xuất phát từ các lý do nêu trên, đề tài luận án Tiến sĩ: “Nghiên cứu định
lượng đồng thời một số chất nhóm methylxanthines trong chè bằng phổ UV-Vis,
IR và bước đầu nhận dạng chè xanh” hướng đến mục tiêu:
Xây dựng phương pháp định lượng nhanh một số chất nhóm methylxanthines

trong chè và nhận dạng nguồn gốc địa lý các mẫu chè xanh Việt Nam dựa trên cùng
dữ liệu phổ UV-Vis và IR (sử dụng kĩ thuật đo phổ IR phản xạ khuếch tán) kết hợp
với phân tích đa biến.
Để đạt được mục tiêu trên, luận án cần giải quyết các nội dung sau:
1. Phát triển phương pháp HPLC để định lượng đồng thời các chất nhóm
methylxanthines trong các mẫu chè và sử dụng các mẫu này làm mẫu chuẩn để xây
dựng mơ hình hồi quy đa biến khi phân tích phổ UV-Vis và NIR.
2. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đồng thời các chất
methylxanthines trong chè bằng phổ UV-Vis và NIR kết hợp với hồi quy đa biến.

11


3. Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân loại có chỉ dẫn (supervised
classification) mẫu chè xanh Việt Nam dựa trên cùng dữ liệu phổ UV-Vis và NIR kết
hợp với phân tích đa biến.
4. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để phân tích định lượng các
methylxanthines trong chè và nhận dạng nguồn gốc địa lý các mẫu chè xanh Việt Nam
đang lưu hành trên thị trường dựa trên dữ liệu phổ UV-Vis và NIR.
* Điểm mới về mặt khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
* Điểm mới của luận án
Xây dựng được quy trình xác định đồng thời ba chất nhóm methylxanthines
gồm theobromine, theophylline, caffeine trong mẫu chè bằng phổ UV-Vis và NIR kết
hợp với hồi quy đa biến (mơ hình bình phương tối thiểu từng phần (Partial Least
Square-PLS), hồi qui thành phần chính (Partial Component Regression - PCR). Các
mơ hình trên được xây dựng từ dữ liệu hàm lượng ba chất phân tích trong mẫu chè
đã được xác định bằng phương pháp HPLC. Quy trình này cho phép phân tích nhanh,
đồng thời các chất trong nền mẫu thực mà không cần xử lý mẫu (với phương pháp
NIR) và không cần tách chúng ra khỏi nhau (với phương pháp UV-Vis) .
Xây dựng được mơ hình phân loại nguồn gốc địa lý các mẫu chè xanh đã biết

trước trên cơ sở dữ liệu đã dùng định lượng các methylxanthines trong mẫu chè, bằng
các thuật tốn phân loại có chỉ dẫn (gồm phân tích thành phần chính phân biệt (Principal
Component Analysis - Disciminant Analysis – PCA – DA), bình phương tối thiểu từng
phần phân biệt (Partial Least Square - Disciminant Analysis – PLS - DA), mạng nơron
nhân tạo (Artificial Neural Networks - ANN)). Từ mơ hình xây dựng được cho phép
nhận dạng được các mẫu chè xanh Việt Nam.
* Ý nghĩa thực tiễn của luận án
Nghiên cứu đã xây dựng và phát triển một số phương pháp định lượng các
methylxanthines trong mẫu chè xanh Việt Nam gồm: HPLC, UV-Vis và NIR. Các
phương pháp UV-Vis và NIR có ưu điểm phân tích nhanh, kỹ thuật đơn giản. Đề tài
cũng mở ra hướng nghiên cứu sử dụng một cơ sở dữ liệu phổ xác định nhiều hợp chất
nếu có bộ số liệu chuẩn từ phương pháp HPLC thay vì phải phân tích rất nhiều mẫu
và nhiều chỉ tiêu.

12


Kết quả định lượng hàm lượng caffeine, theobromine, theophylline trong 50
mẫu chè cho thấy hàm lượng của ba methylxanthines trong các mẫu chè trên là khác
nhau giữa tỉnh Thái Nguyên so với tỉnh Phú Thọ và Lâm Đồng.
Từ dữ liệu phổ UV-Vis, IR của 125 mẫu chè thuộc các tỉnh Thái Nguyên, Phú
Thọ, Lâm Đồng (trong đó có 50 mẫu đã dùng định lượng các methylxanthines) xây
dựng mơ hình nhận dạng nguồn gốc địa lý các mẫu chè xanh.

13


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về cây chè và sản phẩm chè Việt Nam
1.1.1 Phân loại chè Việt Nam

Chè hay trà có tên khoa học Camellia sinensis, là lồi cây từ Đơng Á, Nam
Á và Đơng Nam Á, nhưng ngày nay chè được trồng phổ biến ở các khu vực nhiệt
đới và cận nhiệt đới trên thế giới. Chè là loại cây xanh lưu niên mọc thành bụi hoặc các
cây nhỏ, thông thường được cắt tỉa để thấp hơn 2 mét khi được trồng để lấy lá. Do đặc
điểm sinh trưởng, chiều cao, thân cây chè có ba dạng chính là thân gỗ (1), thân bán gỗ
(2) và thân bụi (3) (hình 1.1).

Hình 1.1. Hình ảnh thân cây, lá và hoa chè [4]
Cây chè thường được trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nơi có lượng
mưa tối thiểu là 127 cm mỗi năm. Cây chè sinh trưởng và phát triển tốt trong điều
kiện nhiệt độ 15-230C, độ cao so với mực nước biển trên 1000 mét. Tùy theo giống
chè, điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng, kĩ thuật chăm bón, canh tác, chế biến ...thì thành
phần hóa học và giá trị kinh tế của chè sẽ khác nhau do đó có thể có các cách thức
phân loại chè khác nhau [4].
1.1.1.1. Phân loại theo nguồn gốc thực vật

14


Theo phân loại của nhà phân loại thực vật Hà Lan Cohen Stuart (1918) và nhà
nông học Pháp Du Pasquier (1923), giống chè có ở Việt Nam chia thành 4 loại:
a. Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var. Macrophylla)
b. Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var. Bohea)
c. Chè Shan (Camellia sinensis var. Shan)
d. Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var. Assamica)
Bốn loại chè trên được trồng ở Việt Nam nhưng phổ biến nhất là 2 loại chè:
Camellia sinesis var. Macrophylla và Camellia sinesis var. Shan.
- Camellia sinensis var. Macrophylla được trồng nhiều nhất ở các tỉnh trung
du với các tên gọi của địa phương (theo màu sắc lá) như: trung du lá xanh, trung du
lá vàng, v.v...

- Camellisa sinensis var. Shan được trồng ở miền núi các tỉnh miền bắc và ở
miền nam Tây Nguyên (Lâm Đồng). Ở mỗi địa phương có các giống khác nhau như:
Shan Mộc Châu, Shan Tham Vè [4].
Ngoài các giống chè trên, ở Việt Nam hiện nay có các giống chè cho năng suất
cao như A1, LDP, Kim Tuyên, TRI777…
1.1.1.2. Phân loại theo cách thức chế biến
Dựa vào mức độ lên men, chè được chia thành ba loại chính là chè xanh, chè Oolong
và chè đen. Mỗi loại chè có những tính chất cảm quan đặc trưng riêng về màu sắc, mùi
vị. Quy trình sản xuất chè được mơ tả theo sơ đồ hình 1.2 [14].

15


Chè tươi ngun liệu

Diệt men

Vị

Vị

Vị

Lên men hạn chế

Lên men hồn tồn

Sấy khơ

Diệt men

Sấy khơ

Phân loại, đóng gói

Sấy khơ

Phân loại, đóng gói

Chè xanh

Phân loại
đóng gói

Chè đen

Chè Oolong

Hình 1.2. Quy trình sản xuất chè
Q trình chế biến chè xanh khơng có q trình lên men và các enzyme bị tiêu
diệt ngay từ giai đoạn đầu tiên bằng cách sấy nên hàm lượng tannin trong chè xanh
biến đổi không đáng kể so với chè tươi.
Trong q trình chế biến chè đen có sử dụng hoạt tính của enzyme để oxi hóa
các hợp chất catechine. Vì thế trong chè đen thành phẩm hàm lượng của các hợp chất
catechine rất thấp, khoảng 2 - 3 % hàm lượng khô. Màu đỏ đặc trưng của nước chè
đen là do các sản phẩm oxy hóa như theaflavin và thearubigin gây ra.
Chè Oolong là một sản phẩm trung gian giữa chè xanh và chè đen, hàm lượng
catechine chiếm khoảng 10 - 20 % chất khô, tức khoảng 50 % so với chè nguyên liệu
ban đầu. Trong quá trình chế biến chè Oolong, quá trình lên men được kiểm sốt theo
mục đích tạo sản phẩm của người sản xuất, khi q trình chuyển hóa catechine trong

chè ngun liệu đạt mức độ mong muốn, enzyme sẽ bị làm Chè
mất đen
hoạtthành
tính, q
trình
phẩm
oxy hóa dừng lại [14].
1.1.1.3. Phân loại chè theo nguồnChè
gốcOolong
địa lý thành phẩm

16


Cây chè thường được trồng ở các vùng có khí hậu ở nền nhiệt trung bình (20230C). Việt Nam có 2 vùng trồng chè chiếm sản lượng lớn nhất là vùng Trung du miền
núi phía bắc (bao gồm các tỉnh như Thái Ngun, Hịa Bình, Phú Thọ, Hà Giang,…)
chiếm 73% sản lượng chè của cả nước và vùng Lâm Đồng chiếm hơn 20 % tổng sản
lượng, phần còn lại thuộc các tỉnh khác nằm ở Tây Bắc Bộ và Nam Trung Bộ (như Sơn
La, Lai Châu, Nghệ An,…). Do ảnh hưởng của điều kiện khí hậu, kĩ thuật canh tác nên
chè ở hai vùng trung du miền núi phía bắc và Lâm Đồng có những hương vị khác biệt rõ
rệt.
Ở vùng trung du miền núi phía bắc, cây chè được trồng trên nền đất feralit đá
vôi cách đây khoảng 500 năm. Mặt khác, các tỉnh trung du miền núi phía bắc nằm
trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa. Mùa nóng từ tháng 5 đến tháng 10, nhiệt độ
trung bình khoảng 23-280C và lượng mưa chiếm 90% lượng mưa cả năm. Mùa đông
kéo dài từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau. Với nền nhiệt thấp trong mùa đông, cây chè
phát triển tương đối chậm nên chè ở vùng trung du miền núi phía bắc ln có vị đậm
đà.
So với cây chè ở trung du miền núi phía bắc, cây chè ở Lâm Đồng có lịch sử
phát triển muộn hơn rất nhiều, nó bắt đầu được trồng ở vùng này cách đây khoảng

150 năm, và được trồng rộng rãi từ những năm 40 của thế kỉ trước. Cây chè Lâm
Đồng được trồng trên đất bazan màu mỡ và khí hậu nhiệt đới núi cao (nền nhiệt trung
bình khoảng 18-25oC) nên cây chè Lâm Đồng phát triển nhanh hơn cây chè phía Bắc.
1.1.2. Thành phần hóa học trong chè
Chất lượng chè thành phẩm được quyết định bởi những thành phần hóa học
của nguyên liệu và kỹ thuật chế biến. Thành phần hóa học của chè biến đổi phức tạp
phụ thuộc vào giống, tuổi chè, điều kiện thổ nhưỡng, kỹ thuật canh tác, kĩ thuật chế
biến [7,15]. Trong thành phần lá chè xanh chứa khoảng 25% tannin (hỗn hợp các
catechine và dẫn xuất của chúng), 3-4% caffeine, và hàm lượng các chất khác (bảng
1.1) [99].
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của lá chè xanh
Thành phần

% khối lượng
(tính theo chất khơ)

17


Polyphenols tổng
(-) Epigallocatechin gallate
(-) Epicatechin gallate
(-) Epigallocatechine
(-) Epicatechine
(+) Catechine
(+) Gallocatechine
Flavonols và flavonol glycosides
Leuco-anthocyanins
Chlorophyll và các chất màu khác
Khoáng và vitamin

Caffeine
Theobromine
Theophylline
Amino acids
Organic acids
Monosaccharides
Polysaccharides
Cellulose, Hemicellulose
Pectin
Lignin
a. Polyphenols

25-30
8-12
3-6
3-6
1-3
1-2
3-4
3-4
2-3
0,5-0,6
5-6
3-4
0,2
0,5
4-5
2
4-5
14-22

4-7
5-6
5-6

Nhóm các hợp chất polyphenols là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong
lá chè. Các hợp chất polyphenols chiếm đa số là các catechine (C, EC, EGCG, EGC,
ECG…) trong đó EGCG và EGC chiếm hơn 70% tổng lượng catechine. Ngoài ra, trong
thành phần polyphenols của chè cịn có một số chất khác tỉ lệ thấp như các flavonol
(quercetin, kaempferol, rutin...), các dẫn xuất glucoside như myricetin - 3 - glucoside,
kaempferol-3 rhamnodiglucoside..., các leucoanthocyanin, các hợp chất poliflavonoid
như theaflavin, thearubigin. Các dạng hợp chất như theaflavin, thearubigin chiếm tỉ lệ
rất thấp trong búp chè và lá chè non nhưng tăng dần tỉ lệ trong các lá chè già hơn [99].
b. Methylxanthines
Methylxanthines là nhóm hợp chất vịng hữu cơ có chứa nitrogen trong phân
tử. Phần lớn các methylxanthines là những chất khơng màu, có vị đắng. Trong lá chè,
người ta tìm thấy các methylxanthines chủ yếu là caffeine, theobromine và
theophylline. Trong đó, caffeine chiếm khoảng 3 - 4% lượng chất khô; theobromine
18


và theophylline với hàm lượng nhỏ hơn rất nhiều so với hàm lượng của caffeine,
chiếm khoảng 0,2-0,5% khối lượng chất khơ. Tuy vậy, vai trị của theobromine và
theophylline trong cây chè quan trọng hơn so với caffeine [99, 63].
c. Acid hữu cơ và vitamin
Trong lá chè chứa các oxalic acid và malic acid, citric acid, isocitric acid và
succinic acid. Ngoài ra, chè cũng chứa shikimic là một trong những chất có vai trị
quan trọng đối với q trình sinh tổng hợp các polyphenols. Vitamin C (ascorbic acid)
cũng đã được phát hiện trong chè xanh và đen [99].
d. Đường và chất xơ
Trong lá chè các polysaccharides (saccarose, glucose, fructose, raffinose, stachyose)

chiếm 14 - 22 % lượng chất khô, chất xơ (cellulose, hemicellulose, lignin) chiếm 4 -7 % lượng
chất khô. Chất xơ trong chè xanh giúp chống táo bón, kích thích nhu động ruột, thúc đẩy hệ
tiêu hóa làm việc hiệu quả và khỏe mạnh hơn.
Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng chè xanh dựa trên tổng hàm lượng các
methylxanthines, catechine, chất xơ …trong chè được trình bày trong bảng 1.2
[113].

19


Bảng 1.2. Các tiêu chuẩn hóa lý của châu Âu về sản phẩm chè xanh
Tiêu chuẩn
Tên các tiêu chí

STT

(% khối
lượng)

Tiêu chuẩn
kiểm tra

1

Tổng hàm lượng tro trong chè

4-8

ISO1575

2

Hàm lượng tro có thể bị hòa tan trong nước

≥45

ISO1576

1-3

ISO1578

3

Độ kiềm khi tro tan vào trong nước, (được quy
đổi bằng khối lượng KOH/100g đất)

4

Hàm lượng tro khơng tan trong acid

≤1

ISO1577

5

Hàm lượng chất xơ có trong chè

≤15

ISO5498

6

Tổng hàm lượng Methylxanthines

3-7

ISO14500

7

Tổng hàm lượng Catechine

≥7

ISO14502-2

8

Tổng hàm lượng polyphenols

≥11

ISO14502-1

9

Tỷ lệ hàm lượng Catechine/Polyphenols

0.5

Đối với chè xanh Việt Nam, tiêu chuẩn chất lượng cũng áp dụng theo tiêu
chuẩn châu Âu và công bố ở TCVN 9740:2013.
1.2. Giới thiệu về nhóm chất methylxanthines
1.2.1. Đặc điểm cấu tạo và tính chất
1.2.1.1. Đặc điểm cấu tạo
Xanthine là một purine cơ sở được tìm thấy trong hầu hết các mơ và chất của
con người và các sinh vật khác. Methylxanthines là dẫn xuất methyl hóa của xanthine,
chúng là các hợp chất hữu cơ dị vòng được xây dựng từ các vòng pyrimidinedione và
imidazole. Methylxanthines bao gồm caffeine, theobromine, theophylline,
aminophylline, paraxanthine, pentoxifylline, IBMX. Các methylxanthines thường
được dùng là chất kích thích nhẹ, giãn phế quản và điều trị các triệu chứng hen suyễn.
Trong chè, cà phê, ca cao thường chỉ tìm thấy ba methylxanthines là caffeine (1,3,7trimethylxanthine), theophylline (1,3-dimethylxanthine) và theobromine (3,7dimethylxanthine). Công thức cấu tạo của các methylxanthines được thể hiện trong
bảng 1.3 [63].

20