Đánh giá hiệu quả việc thực hiện chính sách bồi thường hỗ trợ và tái định cư tại một số dự án trên địa bàn huyện thanh oai thành phố hà nội

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------  -------

PHẠM THỊ BÍCH

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Phạm Thị Bích

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

Hà Nội – 2012


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................3
1.1. TÌM HIỂU VỀ UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG................................................3
1.1.1. Khái quát về ung thƣ .............................................................................3
1.1.2. Ung thƣ đại trực tràng là gì ...................................................................4
1.1.3. Các tác nhân gây ung thƣ đại trực tràng ...............................................4
1.1.4. Các hệ thống phân giai đoạn ung thƣ đại trực tràng .............................6
1.2. CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG.......................8
1.2.1. Chỉ thị sinh học là gì ..........................................................................8
1.2.2. Một số biến đổi về gen liên quan đến ung thƣ đại trực tràng ...............9
1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN LIÊN QUAN ĐẾN
BỆNH UNG THƢ…………………………………………………………………12
1.4.CHEMOKINE CXCL12 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƢ ĐẠI TRỰC

TRÀNG

……………………………………………………………………

16

1.4.1. Chemokine ......................................................................................................16
1.4.2. Chemokine CXCL12 và thụ thể của nó CXCR4 ............................................19
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH VÀ METHYL HĨA GEN CXCL12 Ở
BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG .....................................................21
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................23

2.1. NGUYÊN LIỆU .................................................................................................23
2.1.2. Hóa chất ..............................................................................................23
2.1.3. Thiết bị ................................................................................................24


2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................24
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô ...........................................................24
2.2.2. Tách chiết ADN tổng số từ máu .........................................................25
2.2.3. Khuếch đại gen CXCL12 bằng phƣơng pháp PCR ............................27
2.2.4. Phân tích RFLP ...................................................................................28
2.2.5. Khuếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP .....29
2.2.6. Điện di kiểm tra sản phẩm ..................................................................32
2.2.7. Kỹ thuật nhuộm bạc ............................................................................33
2.2.8. Dự đoán vùng promoter và xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị
trí khởi đầu phiên mã của gen CXCL12 ........................................................34
2.2.9. Phân tích số liệu bằng phƣơng pháp thống kê ....................................34
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................35
3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PCR - RFLP...............................................................35
3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu .................................................35
3.1.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen CXCL12 bằng PCR .............................36
3.1.3. Kết quả phân tích RFLP ......................................................................37
3.1.4. Phân tích số liệu bằng phƣơng pháp thống kê ....................................41
3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÌNH TRẠNG METHYL HĨA GEN CXCL12 .......47
3.2.1. Kết quả tách chiết ADN từ mẫu mô ....................................................47
3.2.2. Kết quả xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên
mã của gen CXCL12......................................................................................48
3.2.3. Khuyếch đại đoạn trình tự nằm trong đảo CpG thuộc vùng promoter
của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP............................................................52

3.2.4. Phân tích tích tình trạng methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12
ở bênh ung thƣ đại trực tràng ........................................................................53
KẾT LUẬN ...............................................................................................................62
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................63
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................64
PHỤ LỤC 1 ..................................................................................................................i
PHỤ LỤC 2 ................................................................................................................ ii
PHỤ LỤC 3 ................................................................................................................iv
PHỤ LỤC 4 ................................................................................................................ix
PHỤ LỤC 5 .................................................................................................................x


BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN

Acid Deoxyribo Nucleic

AJCC

American Joint Committee on Cancer

APC

Adenomatous polyposis coli

APS

Ammonium persulfate

CEA

Carcinoembryonic antigen (kháng nguyên ung thƣ)

CIN

Chromosomal instability (sự bất ổn định nhiễm sắc thể)

CPG-CIMP

CpG island methylator phenotype

CRC

Colorectal cancer (ung thƣ đại trực tràng)

cs

Cộng sự

CXCL12

CXC ligand 12 (phối tử dạng CXC 12)

CXCR4

CXC receptor 4 (thụ thể dạng CXC 4)
Denaturing high performance liquid chromatography

DHPLC

FAP

Familial adenomatous polyposis (hội chứng polyp u tuyến
theo dòng họ)

FOBT

Fecal occult blood test (xét nghiệm máu trong phân)

IUAC

International Union Against Cancer

HNPCC

Hereditary nonpolyposis colon cancer (ung thƣ ruột kết
không polyp di truyền)

LOI

Loss of imprinting (sự mất dấu ấn)

MAPK

Mitogen activated protein kinase

MSI

Microsatellite instability (sự bất ổn định vi vệ tinh)

MSP

Methyl specific polymerase chain reaction (phản ứng
chuỗi trùng hợp đặc hiệu methyl)

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PI3KCA

Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit

PCR- RFLP

Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length
Polymorphism

SNP

Single nucleotide polymorphism (Đa hình nucleotide đơn)

SSCP

Single strand conformation polymorphism

TBE

Tris borate EDTA

TE

Tris - EDTA

TEMED

Tetramethylethylenediamine

TGF β

Transforming growth factor β (yếu tố tăng trƣởng chuyển
hóa β)

TNF

Tumor necrosis factor (Yếu tố gây hoại tử khối u)

TNM

Tumor- lymph node- metastases (khối u-hạch-di căn)

UTĐTT

Ung thƣ đại trực tràng

NST

Nhiễm sắc thể

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1

Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thƣ theo đặc điểm sinh học

Bảng 2

Các chemokine thuộc họ CXC

Bảng 3

Các thành phần của phản ứng PCR

Bảng 4

Các thành phần của phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme
FastDigest MspI

Bảng 5

Thành phần phản ứng PCR (với thể tích 12,5 µl)

Bảng 6

Thành phần bản gel polyacrylamide 10% (bản 7cm)

Bảng 7

Phân bố genotype giữa mẫu bệnh và mẫu đối chứng theo vị trí khối u

Bảng 8

Phân bố genotype theo giới tính của bệnh nhân

Bảng 9

So sánh phân bố genotype giữa nhóm ngƣời bệnh trên 70 tuổi và dƣới
70 tuổi

Bảng 10

Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu đối chứng và mẫu bệnh theo vị
trí khối u

Bảng 11

Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo giới tính

Bảng 12

Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo độ tuổi

Bảng 13

Tỷ lệ methyl hóa và khơng methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12
trên mơ u và mơ lân cận u

Bảng 14

Thống kê tỷ lệ methyl hóa trong vùng promoter của gen CXCL12 theo
các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1

Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi

Hình 2

Các giai đoạn phát triển của ung thƣ đại trực tràng

Hình 3

Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ máu

Hình 4

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12

Hình 5

Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng
302bp, 202bp và 100bp

Hình 6

Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 2 băng 202bp

và 100bp

Hình 7

Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng
302bp, 202bp và 100bp (genotype dị hợp tử)

Hình 8

Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 1 băng 302bp

Hình 9

Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ mơ

Hình 10 Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm MethPrimer
Hình 11 Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm cpgplot
Hình 12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12
Hình 13 Tỷ lệ methyl và unmethyl khảo sát trên 2 loại mơ u và lân cận u
Hình 14 Hình ảnh điện di sản phẩm MSP củ a gen CXCL12 của bệnh nhân ung thƣ
đại trực tràng


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

MỞ ĐẦU
Ung thƣ trực tràng là bệnh lý hay gặp trong ung thƣ đƣờng tiêu hóa, đứng
hàng thứ hai sau ung thƣ dạ dày và chiếm 1,4 % trong tổng số ung thƣ. Bệnh tiến

triển tƣơng đối chậm, di căn muộn, nếu phát hiện sớm, điều trị kịp thời và triệt để
thì tỷ lệ sống trên 5 năm đạt 60-80% [26]. Tuy nhiên bệnh thƣờng đƣợc phát hiện ở
giai đoạn muộn khi đã di căn hay biến chứng, do đó hiệu quả điều trị rất hạn chế.
Hàng năm, trên thế giới có khoảng 650.000 ngƣời đƣợc chẩn đốn mắc bệnh
ung thƣ đại trực tràng và có khoảng 150.000 ngƣời chết vì căn bệnh này, đây là loại
ung thƣ nguy hiểm đứng hàng thứ ba gây tử vong trên thế giới và đứng hàng thứ hai
gây ra tử vong tại Mỹ. Tại Việt Nam, bệnh này chiếm khoảng 15% trong số các loại
ung thƣ và đang gia tăng một cách rõ rệt. Gần đây, do sự thay đổi trong thói quen ăn
uống giàu chất đạm, ít chất xơ, lạm dụng thức ăn nhanh khiến ung thƣ đại trực tràng
ngày càng phổ biến. Tuổi mắc căn bệnh chết ngƣời này ngày càng trẻ hóa, nhiều
trƣờng hợp mới 18 - 20 tuổi, thậm chí có trẻ mới 12 đã mắc ung thƣ đại trực tràng
[30].
Trên thế giới ung thƣ đại trực tràng luôn đƣợc các nhà sinh y học quan tâm,
có nhiều nghiên cứu genomics, transcriptomics, proteomics đã đƣợc tiến hành. Mục
tiêu của những nghiên cứu này nhằm tìm ra những chỉ thị sinh học cho việc chẩn
đoán bệnh sớm hơn để điều trị kịp thời. Tuy nhiên, đến nay, mới chỉ có
carcinoembryonic antigen (CEA) là chỉ thị sinh học thƣờng dùng cho chẩn đoán
bệnh cho các bệnh nhân trong giai đoạn III, IV, nhƣng chi phí cho xét nghiệm cịn
rất tốn kém[38].Vì vậy, việc tìm ra những chỉ thị mới dễ nhận biết và có thể phát
hiện chính xác giai đoạn ung thƣ là cần thiết. Genomics và proteomics là những lĩnh
vực nghiên cứu cho phép xác định các chỉ thị đặc trƣng cho bệnh, phục vụ cho cơng
tác chẩn đốn, điều trị và tìm ngun nhân bệnh.
Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích biến đổi của gen
CXCL12 ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng”, nhằm mục tiêu:

1


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

1. Nghiên cứu đa hình gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng:
- Xác định đƣợc tính đa hình của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thƣ đại trực
tràng, so sánh với các mẫu đối chứng.
- Đánh giá mức độ liên quan giữa tính đa hình của gen CXCL12 với các đặc
điểm lâm sàng của bệnh ung thƣ đại trực tràng ở Việt Nam.
2. Phân tích tình trạng methyl hóa promoter của gen CXCL12 ở bệnh
nhân ung thư đại trực tràng:
- Xác định đƣợc sự phân bố của đảo CpG và mật độ nucleotide CpG trong
các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12.
- Xác định đƣợc tình trạng methyl hóa của 1 đảo CpG thuộc vùng promoter
của gen CXCL12.
- Đánh giá mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa gen CXCL12 với các đặc
điểm bệnh học lâm sàng của ung thƣ đại trực tràng ở ngƣời Việt Nam.
Đề tài đƣợc thực hiện tại phịng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc
thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại
học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TÌM HIỂU VỀ UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.1.1. Khái quát về ung thƣ

Ung thƣ (u ác tính) là một loại bệnh của các tế bào, biểu hiện là sự phát triển
khơng bình thƣờng của các tế bào, tăng sinh nhanh chóng về số lƣợng một cách
khơng kiểm sốt đƣợc và tế bào khơng tn theo các cơ chế kiểm soát và phát triển
của cơ thể [33]. Trong một số trƣờng hợp, chúng di căn (lan tràn tới các cơ quan ở
xa) (bảng 1).
Bảng 1. Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thƣ theo đặc điểm sinh bệnh học
U lành tính
- Tế bào biệt hóa cao
- Phân bào ít và chậm
- Khơng xâm lấn xung quanh
- Có vỏ bọc
- Khơng hoại tử
- Rất ít tái phát và ít ảnh hƣởng tới cơ thể

U ác tính (ung thƣ)
- Tế bào ít biệt hóa
- Phân bào nhanh, khơng tn theo sự kiểm
sốt của chu trình tế bào
- Xâm lấn xung quanh
- Khơng có vỏ bọc
- Thƣờng hoại tử
- Ảnh hƣởng lớn tới cơ thể

Ung thƣ không phải là một bệnh. Bệnh này là một nhóm của hơn 100 bệnh
khác nhau.
Ung thƣ có thể có nguồn gốc từ bất cứ tế bào nào của cơ thể và có rất nhiều
loại khác nhau trong mỗi vùng của cơ thể. Hầu hết các bệnh ung thƣ đƣợc đặt tên
theo loại tế bào hoặc cơ quan nơi chúng phát sinh. Nếu một khối ung thƣ lan rộng ra
(di căn), thì khối u mới mang tên giống với tên của khối u nguồn gốc đầu tiên [33].

3


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

1.1.2. Ung thƣ đại trực tràng là gì
Ung thƣ đại trực tràng (UTĐTT) là căn bệnh phổ biến, đứng hàng đầu trong
ung thƣ đƣờng tiêu hóa tại các nƣớc Âu Mỹ. Tại Việt Nam và các nƣớc châu Á,
UTĐTT đứng thứ hai trong ung thƣ đƣờng tiêu hóa sau ung thƣ dạ dày. Ở nƣớc ta,
mỗi năm có khoảng hơn 7.300 ngƣời mới mắc và hơn 4.100 ngƣời tử vong do ung
thƣ đại trực tràng [34]. Ung thƣ đại trực tràng là ung thƣ biểu mô phổ biến hiện nay,
bao gồm ung thƣ đại tràng và ung thƣ trực tràng. Đại tràng là phần ruột lớn hình
chữ N gồm đoạn lên, đoạn ngang và đoạn xuống. Trực tràng là phần ruột thẳng nối
giữa đại tràng và hậu môn. Ung thƣ thƣờng xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng và trực
tràng (hình 1). Ung thƣ đại tràng và ung thƣ trực tràng thƣờng có liên hệ với nhau
và khó có thể xác định ung thƣ nào xảy ra trƣớc, ung thƣ nào xảy ra sau, vì thế
chúng đƣợc gọi chung là ung thƣ đại trực tràng [35].

Hình 1. Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi [35]

1.1.3. Các tác nhân gây ung thƣ đại trực tràng
Các loại ung thƣ khác nhau có tác nhân gây bệnh khác nhau. Trong ung thƣ
đại trực tràng thì có rất nhiều tác nhân và các nghiên cứu cho thấy các tác nhân sau
đây có thể gây nguy cơ bị bệnh ung thƣ đại trực tràng:

4

Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

 Polyp đại trực tràng là bệnh khá thƣờng gặp, đây là những khối u lồi vào
trong lòng đại trực tràng, chúng đƣợc hình thành do sự tăng sinh quá mức của niêm
mạc đại trực tràng. Triệu chứng của bệnh thƣờng nghèo nàn và không đặc hiệu.
Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời, đặc biệt nếu xác định rõ và loại bỏ những
polyp bằng thủ thuật cắt polyp qua nội soi sẽ làm giảm thiểu đáng kể nguy cơ polyp
trở thành ung thƣ.
 Tác nhân lối sống: Những ngƣời có thói quen hút thuốc, hoặc có chế độ
ăn uống giàu chất mỡ và ít trái cây, rau quả sẽ có nguy cơ mắc bệnh ung thƣ đại
trực tràng cao hơn vì nó có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực
tràng, gây viêm loét đại tràng và từ đó có thể dẫn tới ung thƣ đại trực tràng.
 Bệnh Crohn hoặc chứng lở ruột già: Ngƣời bị chứng bệnh gây viêm đại
tràng (nhƣ chứng lở ruột già hoặc bệnh Crohn) trong nhiều năm sẽ có nguy cơ mắc
bệnh cao.
 Bệnh sử ung thư cá nhân: Ngƣời từng bị ung thƣ đại trực tràng có thể sẽ
lại bị ung thƣ đại trực tràng lần thứ hai. Đồng thời, phụ nữ có tiền sử ung thƣ buồng
trứng, dạ con, hoặc ung thƣ vú, sẽ có nguy cơ mắc bệnh ung thƣ đại trực tràng cao
hơn.
 Bệnh sử ung thư trong gia đình: Trong khi phần lớn các trƣờng hợp ung
thƣ đại trực tràng là các khối u rời rạc thì có rất ít các trƣờng hợp xảy ra do đột biến
gen di truyền. Phổ biến nhất là hội chứng polyp u tuyến theo dòng họ (familial
adenomatous polyposis - FAP) và hội chứng ung thƣ ruột kết không polyp di truyền
(hereditary nonpolyposis colon cancer - HNPCC). Dạng ung thƣ này thƣờng biểu
hiện từ rất sớm (trung bình dƣới 45 tuổi) [20].
Khối u FAP chủ yếu nằm ở vùng ngoại biên (bên trái) trong khi HNPCC chủ
yếu nằm ở vùng đầu gần (bên phải) của đại tràng. Khi có thành viên trong gia đình
đƣợc chẩn đốn là mắc ung thƣ đại trực tràng thì nguy cơ các thành viên khác mắc

căn bệnh này cao gấp nhiều lần so với bình thƣờng, phụ thuộc nhiều vào số thành

5


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

viên mắc bệnh và độ tuổi mắc bệnh. Thực tế, các nghiên cứu cho thấy phải có tới 20
đến 25% các bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng có tiền sử gia đình mắc căn bệnh này.
1.1.4. Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thƣ đại trực tràng [39]
Phân loại Duke cho ung thƣ trực tràng
Năm 1932, Cuthbert E. Dukes, một bác sĩ giải phẫu bệnh ở bệnh viện
St.Mark, đã đƣa ra một hệ thống phân loại giai đoạn cho ung thƣ trực tràng.
Phân loại đƣợc chia làm 3 giai đoạn:
- Dukes A: khối u giới hạn ở thành trực tràng.
- Dukes B: những khối u đã vƣợt thành trực tràng đến những cơ quan cạnh
trực tràng.
- Dukes C: những khối u đã di căn đến hạch lympho vùng.
Phân loại TNM (Tumor, Node, Metastasis)
Phân loại này đƣợc đƣa ra vào năm 1954 bởi AJCC (American Joint
Committee on Cancer) và IUAC (International Union Against Cancer) dựa trên
những dữ kiện lâm sàng và bệnh học. Phân loại TNM thƣờng dùng để dự báo tỉ lệ
sống sót 5 năm của bệnh nhân ung thƣ trực tràng.
Phân loại TNM cho ung thƣ đại trực tràng
U nguyên phát (T):
Tx – không xác định đƣợc u.
T0 – khơng có bằng chứng của khối u.
Tis – u tại chỗ (niêm mạc).

T1 – u xâm lấn lớp dƣới niêm mạc.
T2 – u xâm lấn thanh mạc.
T3 – u xuyên qua thanh mạc vào lớp dƣới thanh mạc hoặc vào các mô xung quanh
đại tràng hay trực tràng.
T4 – U xâm lấn trực tiếp các cơ quan khác hoặc xuyên vào lớp phúc mạc tạng.

6


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Hạch lympho vùng (N):
Nx – không xác định đƣợc hạch.
N0 – khơng có hạch di căn.
N1 – di căn 1-3 hạch xung quanh đại tràng hoặc trực tràng.
N2 – di căn từ 4 hạch trở lên.
N3 – di căn đến bất kì một hạch nào dọc theo mạch máu chính.
Di căn xa (M):
Mx – không xác định đƣợc di căn xa.
M0 – khơng di căn xa.
M1 – di căn xa.
Nói chung, ung thƣ đại trực tràng đƣợc chia làm các giai đoạn (hình 2):
 Giai đoạn 0: Trong giai đoạn 0, các tế bào bất thƣờng đƣợc tìm thấy trong
các lớp trong cùng của đại trực tràng. Những tế bào bất thƣờng có thể trở thành ung
thƣ và lây lan vào các mơ bình thƣờng gần đó. Giai đoạn 0 cũng đƣợc gọi là ung thƣ
biểu mơ tại chỗ.

Hình 2. Các giai đoạn phát triển của ung thƣ đại trực tràng [28].

 Giai đoạn I: Ung thƣ đã bắt đầu lây lan, nhƣng vẫn cịn trong lớp lót bên
trong.

7


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

 Giai đoạn II: Ung thƣ đã lan đến các cơ quan khác ở gần đại trực tràng hoặc
trực tràng nhƣng chƣa lây lan đến các hạch bạch huyết.
 Giai đoạn III: Ung thƣ đã lan đến hạch bạch huyết nhƣng chƣa lan đến
những phần xa của cơ thể.
 Giai đoạn IV: Ung thƣ đã lan đến các phần xa của cơ thể thông qua hệ
thống bạch huyết, đƣợc gọi là di căn. Các cơ quan mà ung thƣ đại trực tràng
thƣờng di căn đến là phổi và gan.
Tỉ lệ sống sót sau 5 năm của ung thƣ đại trực tràng: Giai đoạn I: 72%. Giai
đoạn II: 54% . Giai đoạn III: 39% . Giai đoạn IV: 7%.[39]
1.2. CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.2.1. Chỉ thị sinh học là gì
Chỉ thị sinh học (biomarker) là những phân tử chất đƣợc sử dụng nhƣ một
chỉ báo của một trạng thái sinh học. Đó là một đặc tính khách quan đƣợc đặc trƣng
bởi các thông số nhƣ các chỉ số hóa sinh, miễn dịch… Do đó, nó đƣợc dùng để đánh
giá những quá trình sinh học bình thƣờng, quá trình gây bệnh hoặc các phản ứng
dƣợc của quá trình điều trị [18].
Trong ung thƣ, chỉ thị sinh học đóng một vai trị quan trọng, nó là cơng cụ
hữu hiệu, chỉ thị sinh học mới có độ nhạy và tính đặc hiệu cao sẽ giúp cho việc

kiểm soát ung thƣ tốt hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định nhanh chóng
các đáp ứng của khối u đối với liệu pháp điều trị mới. Ví dụ nhƣ đột biến dịng phơi
gen APC là một chỉ thị để chẩn đốn nguy cơ mắc polyp và sự phát triển tiếp theo
của ung thƣ biểu mô trực tràng, biểu hiện của β-catenin trong tế bào chất và nhân là
một chỉ thị để tiên lƣợng ung thƣ biểu mô thực quản. Tuy nhiên, rất ít các chỉ thị
phân tử hiện nay đƣợc ứng dụng thực tiễn trong lâm sàng vì sự hạn chế về độ nhạy
và tính đặc hiệu, do đó, cần phải phát triển nhiều hơn nữa các chỉ thị đáng tin cậy có
liên quan tới phần lớn các khối u để có thể sử dụng rộng rãi trong chẩn đốn và điều
trị ung thƣ.

8


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

1.2.2. Một số biến đổi về gen liên quan đến ung thƣ đại trực tràng
Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tìm ra các chỉ thị phân
tử trong chẩn đốn ung thƣ. Trong đó, nhiều nghiên cứu tập trung vào việc xem xét
mức biến đổi của ADN, các đột biến, đa hình của gen, ... Các nghiên cứu đã cho
thấy trong ung thƣ đại trực tràng, một số biến đổi về gen đóng vai trị quan trọng
trong sự phát sinh ung thƣ.
Đột biến gen APC (Adenomatous polyposis coli). APC là gen ức chế khối u
có vai trị điều hịa sự tăng sinh và bám dính tế bào. Sự biến đổi của gen này đóng
vai trị quan trọng, đánh dấu sự hình thành và phát triển của ung thƣ.
Đột biến gen APC là dạng đột biến phổ biến nhất trong ung thƣ đại trực tràng
đƣợc tìm thấy ở 60 - 80% ung thƣ đại trực tràng. Đột biến chủ yếu xảy ra trong khu
vực exon 15. Các cá thể sinh ra với một alen đột biến của gen này sẽ phát sinh hàng
trăm, thậm chí hàng nghìn polyp u tuyến ở đại tràng trong lứa tuổi 13 đến 20. Hội

chứng này gọi là hội chứng FAP. Protein APC khu trú trong bào tƣơng, ở đây chúng
tƣơng tác với nhiều protein nội bào khác, trong đó có β-catenin - một protein có thể
đi vào nhân tế bào, hoạt hố việc phiên mã các gen. Chức năng quan trọng của
protein APC là duy trì mức độ thấp của β-catenin trong bào tƣơng nhờ sự hình
thành phức hệ APC/β-catenin, phức này kích thích sự phân hủy của β-catenin. Sự
bất hoạt gen APC gây hậu quả mất protein APC, dẫn đến làm tăng β-catenin của tế
bào, chất này sẽ xâm nhập vào nhân tế bào và điều hòa tăng sinh tế bào. Hậu quả là
các khối u hình thành trong lớp biểu mơ ruột và có thể tiến triển thành ung thƣ. Vì
vậy, APC là yếu tố điều hịa âm tính của việc truyền tín hiệu β-catenin.
Ngồi ra, những đột biến làm mất chức năng của APC cũng dẫn đến sự bất
ổn định nhiễm sắc thể do APC liên kết với các vi ống làm chúng bị sai lệch [21].
TP53 là một gen ức chế khối u cực kì quan trọng với một số chức năng chủ
yếu nhƣ khởi động quá trình apoptosis, sửa chữa ADN bị lỗi và điều khiển chu trình
tế bào. Đột biến gen này dẫn đến sự biểu hiện bất thƣờng của protein p53. Do đó,
khi p53 mất chức năng thì các tế bào sẽ tiếp tục phân chia mang theo các sai hỏng

9


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

ADN, tích lũy qua mỗi chu trình tế bào và đến một lúc nào đó tế bào khơng kiểm
sốt đƣợc hoạt động phân bào nữa và chuyển sang trạng thái ung thƣ.
Một số gen gây ung thƣ nhƣ RAS và BRAF cũng đóng vai trị quan trọng
trong việc phát triển căn bệnh ung thƣ trong đó có: Đột biến RAS xảy ra ở 37% các
trƣờng hợp mắc ung thƣ đại trực tràng và 13% đối với BRAF. Các đột biến RAS mà
phần lớn là ở KRAS đã làm hoạt hóa GTPase, vốn có vai trị dẫn tín hiệu trực tiếp
đến RAF. Các đột biến BRAF ảnh hƣởng tới enzyme MAPK (mitogen activated

protein kinase) vốn có vai trị điều hịa một số hoạt động của tế bào (nhƣ phân bào,
tăng sinh, biệt hóa tế bào, chết theo chu trình) và sau đó điều khiển các lớp tín hiệu
dẫn tới con đƣờng tín hiệu này bị hạn chế từ đó ảnh hƣởng tới hoạt động của tế bào.
Các đột biến BRAF có thể phát hiện đƣợc ngay cả ở các polyp nhỏ và so với các đột
biến RAS thì chúng phổ biến hơn ở các polyp tăng sản, các u tuyến dạng khía và các
ung thƣ đại trực tràng phần đầu gần, và đặc biệt là ở các trƣờng hợp ung thƣ có kiểu
hình methyl hóa đảo CpG - CIMP (CpG island methylator phenotype) [16]. Năm
2003, Shield và cộng sự khi nghiên cứu về gen KRAS (gen gây ung thƣ) cho thấy
đột biến này có vai trị chuyển ung thƣ đa u tuyến từ giai đoạn trung gian.
Sự methyl hóa ADN
Nhƣ đã biết, những biến đổi di truyền bao gồm các đột biến trong gen gây
ung thƣ, các gen gây ức chế khối u gây ung thƣ, tuy nhiên chỉ khoảng 10% bệnh
nhân thuộc kiểu genotype kiểu cổ điển này. Ngoài ra, sự phát sinh ung thƣ cịn có
thể do cơ chế biến đổi ngoại di truyền gây ra.
Di truyền ngoại sinh (Epigenetics) là sự biến đổi trong biểu hiện gen mà sự
biến đổi này khơng phải do những biến đổi trình tự base trên ADN, bao gồm sự
methyl hóa ADN, biến đổi histone,…Trong đó, di truyền ngoại sinh đƣợc nghiên
cứu nhiều nhất là sự methyl hóa ADN.
Methyl hóa là sự gắn nhóm methyl vào vị trí C thứ 5 ở cytosine của vịng
pyrymidine nhờ enzyme methyl transferase. Có 3 dạng methyl hóa ADN khác nhau
đƣợc biết đến liên quan tới ung thƣ, đó là: sự giảm methyl hóa (hypomethylation),

10


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

tăng cƣờng methyl hóa (hypermethylation) và sự mất đi dấu ấn gen (loss of

imprinting – LOI).
Bình thƣờng có 3-6% cytosine bị methyl hóa trong tế bào bình thƣờng ở
ngƣời. Cặp nucleotide CpG là vị trí trong vùng giàu CpG, cịn đƣợc gọi là đảo CpG.
LOI là hiện tƣợng có sự mất biểu hiện hay hoạt hóa biểu hiện của các alen
bố mẹ trong các khối u. Sự giảm methyl hóa ADN xảy ra ở giai đoạn tiến triển của
bệnh, liên quan tới sự tăng cƣờng phiên mã của gen (nhƣ các gen gây ung thƣ).
Trong khi đó thì sự tăng cƣờng methyl hóa ADN lại xảy ra tại các vị trí điều hòa
đặc hiệu ở các vùng promoter, dẫn tới sự ngăn cản phiên mã từ đó gây bất hoạt gen
(nhƣ ở các gen ức chế khối u). Chính sự tăng cƣờng methyl hóa ADN này đã trở
thành một lĩnh vực đƣợc quan tâm lớn trong nghiên cứu ung thƣ hiện nay [12].
Ngồi ra, sự methyl hóa ADN cịn đóng vai trò trung tâm trong sự đánh dấu của
gen, sự phát triển của phôi, sự im lăng NST X và sự điều khiển chu trình tế bào.
Đã có những bằng chứng chứng tỏ rằng sự methyl hóa bất thƣờng là một
hiện tƣợng phổ biến trong ung thƣ và đó có thể là sự thay đổi sớm nhất trong sự
phát sinh ung thƣ .
Năm 2010, Kim và cs thuộc trƣờng đại học y John Hopkins, Hoa Kỳ qua
việc tổng hợp từ hơn 40 bài báo khác nhau đã đƣa ra một bản tổng hợp về tình trạng
methyl hóa của 59 gen khác nhau trên mô đại trực tràng, 19 gen đƣợc phân tích từ
mẫu huyết tƣơng, huyết thanh hoặc mẫu phân. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ
methyl hóa là: 76,2% ở CXCL12, 32% ở E-Cadherin, 100% nhƣ ở Cyclin
A1,…Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy có sự tăng cƣờng methyl hóa cao ở
các gen của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng, trong khi đó tỷ lệ này rất thấp và gần
nhƣ là 0% ở ngƣời bình thƣờng, điều đó cho thấy tình trạng tăng cƣờng methyl hóa
ADN có thể là yếu tố quan trọng góp phần vào sự phát sinh ung thƣ đại trực tràng
[12]. Sự methyl hóa ADN có thể đƣợc phát hiện trong các ADN bắt nguồn từ mẫu
mô, mẫu phân hoặc dịch cơ thể.

11

Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Vì vậy, nếu các phƣơng pháp nghiên cứu sự methyl hóa ADN khi đƣợc tối
ƣu hóa về độ nhạy và độ đặc hiệu của nó sẽ giúp xác định chính xác những khác
biệt trong tình trạng methyl hóa ADN giữa bệnh nhân ung thƣ và ngƣời bình
thƣờng, cho thấy rằng đây có thể là một cơng cụ hữu hiệu cho việc phát hiện sớm
bệnh và là một chỉ thị tầm soát mới cho ung thƣ đại trực tràng.
1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN LIÊN
QUAN ĐẾN BỆNH UNG THƢ
PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length
Polymorphism)
Đây là kĩ thuật truyền thống, đƣợc sử dụng để lập bản đồ gen, xác định đột
biến điểm. Kĩ thuật này đƣợc áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu ung thƣ ở cấp độ
đột biến gen.
Nguyên lí cơ bản của phƣơng pháp này là dựa vào tính chất của enzyme giới
hạn, có thể nhận biết một trình tự ADN đặc hiệu để cắt đoạn ADN thành các mảnh
nhỏ có chiều dài khác nhau. Các mảnh giới hạn này sau đó đƣợc phân tách theo
chiều dài của chúng bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose/polyacrylamide và
đƣợc chuyển qua màng bằng phƣơng pháp lai Southern blot. Trên màng có những
đầu dị ADN để xác định những đoạn ADN giới hạn có thể bắt cặp bổ sung với. đầu
dò RFLP xảy ra khi chiều dài của các đoạn giới hạn khác nhau ở những mẫu khác
nhau. Mỗi đoạn giới hạn đó đƣợc gọi là một alen và có thể dùng để phân tích di
truyền. Phân tích RFLP thƣờng đƣợc hỗ trợ bằng kĩ thuật PCR để khuếch đại đoạn
gen cần phân tích. Chính vì thế, kĩ thuật này thƣờng đƣợc gọi là PCR-RFLP. Tùy
theo mục đích và dựa vào đặc điểm của gen cần nghiên cứu, ngƣời ta có thể thực
hiện phƣơng pháp PCR-RFLP theo các cách khác nhau, có thể đơn giản hóa hoặc
tiến hành cùng một số phƣơng pháp khác.
SSCP (Single strand conformation polymorphism)

Một phƣơng pháp đơn giản khác đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đột biến
điểm là phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) của phân tử ADN. Cấu trúc

12


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

khơng gian 3 chiều của phân tử ADN sợi đơn đƣợc xác định bởi trình tự và mơi
trƣờng chứa chúng. Do đó, trong trƣờng hợp điều kiện mơi trƣờng khơng thay đổi,
cấu trúc của chúng chỉ phụ thuộc vào trình tự nucleotide và bất cứ thay đổi nào
trong đó cũng làm thay đổi cấu hình sợi đơn. Khi điện di trên gel polyacrylamide
khơng biến tính, các cấu hình khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và phân
tách ra. Những yếu tố khác ảnh hƣởng đến cấu hình sợi đơn nhƣ nhiệt độ, pH, đệm
chạy có thể đƣợc sử dụng để tăng khả năng phân tách. Nhìn chung, nhiệt độ và pH
thấp giúp duy trì cấu hình và dễ dàng phân biệt đƣợc các phân tử ADN có trình tự
khác nhau.
DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography)
Đây là phƣơng pháp phân tích ADN dị sợi kép. Thay vì sử dụng gel và phân
tách ADN bằng điện di, ADN đƣợc phân tách bằng sắc ký HPLC. Các mạch ADN
đƣợc phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau
và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đơi khơng chính xác. Các phân tử
dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thƣờng. DHPLC
là một kĩ thuật mạnh, đơn giản và mẫu đƣợc đƣa vào tự động. Với những tiến bộ
gần đây trong việc phát triển phần mềm dự đốn đƣờng cong biến tính, phƣơng
pháp này có độ nhạy cao và khả năng tái sử dụng tốt.
Real Time PCR
Trong sinh học phân tử, đây là kĩ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN

đƣợc hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Kĩ thuật này cho phép phát
hiện và định lƣợng tuyệt đối số lƣợng bản sao của một hay nhiều trình tự cụ thể của
một mẫu ADN. Hai phƣơng pháp để định lƣợng là nhuộm huỳnh quang khơng đặc
hiệu với trình tự ADN kép và lai sản phẩm với một đầu dị ADN đặc hiệu có gắn
huỳnh quang. Qua mỗi chu kì của phản ứng, lƣợng sản phẩm tăng lên dẫn đến sự
gia tăng tỉ lệ phát huỳnh quang. Qua đó có thể dựa vào số đo huỳnh quang để định
lƣợng chính xác lƣợng sản phẩm. Đây đƣợc coi là hƣớng tiếp cận mới so với PCR
chuẩn, đƣợc sử dụng nhiều trong cả khoa học cơ bản và trong chẩn đoán.

13


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Giải trình tự
Phần lớn các phƣơng pháp nói trên đƣợc sử dụng để sàng lọc bƣớc đầu đột
biến điểm/SNPs. Để khẳng định chính xác đột biến hay biển đổi ngƣời ta phải giải
trình tự trực tiếp. Nguyên tắc của hầu hết các phƣơng pháp giải trình tự hiện nay
đều dựa trên phƣơng pháp đƣợc Sanger và cộng sự công bố năm 1977, đƣợc gọi là
phƣơng pháp dideoxyribonuleotide (gọi tắt là phƣơng pháp dideoxy) [3].
Theo phƣơng pháp này, một trình tự Sanger giới hạn đƣợc bắt đầu tại một vị
trí cụ thể trên chuỗi ADN bằng cách sử dụng một oligonucleotide ngắn, có trình tự
bổ sung với trình tự của mẫu tại vị trí đó. Các mồi oligonucleotide đƣợc kéo dài nhờ
tác dụng của enzyme ADN polymerase. Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại
deoxynucleotide A, T, G, C trong đó có một loại là di-deoxynucleotide để ngắt phản
ứng kéo dài chuỗi.
Các đoạn ngắn ADN mới đƣợc tổng hợp sau đó đƣợc điện di trên gel
polyacrylamide, hình ảnh thu đƣợc sẽ đƣợc dùng để phân tích trình tự ADN. Ngày

nay, phƣơng pháp giải trình tự tự động đƣợc áp dụng rộng rãi ở các phịng thí
nghiệm trên thế giới nhƣng cơ bản vẫn áp dụng nguyên lý nhƣ trên. Với sự phát
triển của các enzyme ADN polymerase và các hợp chất hóa học, phƣơng pháp này
cho phép sàng lọc SNPs hiệu quả rất cao khi so sánh với các kỹ thuật đã miêu tả
trên. Cho đến nay, nó đã đƣợc cải tiến thành giải trình tự tự động và sử dụng chất
huỳnh quang, cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với
độ nhạy rất cao. Ƣu điểm lớn nhất của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về
điểm đột biến nhƣ: loại đột biến, vị trí, hậu quả. Tuy nhiên nó có hạn chế là địi hỏi
sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt
tiền.
Kỹ thuật phân tích ADN microarray
Đây là một trong những kỹ thuật đƣợc ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu
genomics tìm các chỉ thị về gen. Phân tích ADN microarray có thể đo mức độ biểu
hiện ARN của hàng nghìn gen cùng một lúc , sự biểu hiện gen có thể đƣợc sử dụng

14


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

để phân biệt các dạng khối u cũng nhƣ có ý nghĩa trong

chẩn đoán bệnh. Điều này

đã đƣợc chứng minh với ung thƣ vú và trong ung thƣ bạch cầu ác tính. Các mảnh
ADN trên các tấm kính mỏng đƣợc lai với các mẫu cADN, chúng có thể đƣợc
nhuộm huỳnh quang đỏ và xanh. Phụ thuộc vào mối tƣơng tác của mẫu phân tích,
mỗi điểm trên kính có thể phát ra tín hiệu màu đỏ hoặc xanh. Các gen có thể đƣợc

tập hợp lại thành nhóm và có thể so sánh giữa các mẫu.
Một số phƣơng pháp trong nghiên cứu sự methyl hóa ADN
Sự methyl hóa ADN trong vùng promoter của các gen khác nhau có thể đóng
vai trị làm chỉ thị sinh học trong việc phát hiện sớm ung thƣ từ ADN có trong mẫu
phân và mẫu máu của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng, giúp cho việc theo dõi và
điều trị bệnh hiệu quả hơn. Các nghiên cứu tình trạng methyl hóa ADN chủ yếu sử
dụng kỹ thuật PCR làm cơ sở do độ nhạy và khả năng ứng dụng cao của kỹ thuật
này. Sau đây là một số phƣơng pháp phổ biến dùng để khảo sát tình trạng methyl
hóa ADN:
MSP (Methyl Specific PCR)
Hiện nay, kỹ thuật MSP đƣợc sử dụng phổ biến nhất do tính đơn giản, nhạy
và chi phí hợp lý của nó, chủ yếu để phát hiện sự tăng cƣờng methyl hóa tại một
vùng promoter quan tâm của một số gen có chức năng quan trọng, liên quan tới sự
bất hoạt gen đó trong các bệnh ung thƣ ở ngƣời [9]. Đây là kỹ thuật nhanh chóng
phát hiện đƣợc sự methyl hóa của bất kỳ vị trí CpG nào trong một đảo CpG. Đầu
tiên, ADN đƣợc biến đổi với sodium bisulfite để chuyển hóa tất cả các cytosine
khơng bị methyl hóa thành uracil, sau đó, ADN này đƣợc khuếch đại lên qua phản
ứng PCR bằng cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho đoạn trình tự bị methyl hóa và khơng
bị methyl hóa. Kỹ thuật MSP địi hỏi lƣợng ADN rất ít, phát hiện nhạy tới 0,1% các
alen bị methyl hóa trên locus đảo CpG quan tâm và cũng có thể thực hiện đƣợc với
ADN tách chiết từ các mẫu đúc paraffin. Kỹ thuật MSP hạn chế đƣợc các kết quả
dƣơng tính giả từ các nghiên cứu trƣớc đó dựa trên PCR và sự phân cắt của enzyme
giới hạn để phân biệt giữa ADN bị methyl hóa và khơng bị methyl hóa.

15


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

MethyLight
Đây là kỹ thuật định lƣợng, phát triển dựa trên kỹ thuật MSP. Kỹ thuật này
cho phép phân biệt đƣợc các vị trí methyl hóa và khơng methyl hóa trên cùng một
mẫu. Để phát hiện ra các vị trí methyl, đầu dò đánh dấu FAM đƣợc sử dụng trong
khi đầu dò đánh dấu VIC phát hiện ra các vị trí khơng methyl. Kỹ thuật này có độ
nhạy và độ đặc hiệu cao, chỉ cần một lƣợng ADN rất nhỏ là có thể phát hiện ra các
alen bị methyl hóa trong sự có mặt của 10.000 các alen khơng bị methyl hóa khác,
tuy nhiên chi phí cho phƣơng pháp này là khá cao [6].
Pyrosequencing
Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để phân tích ADN đã đƣợc xử lý với
bisulfite mà không cần sử dụng kỹ thuật MSP. Sau khi dùng PCR khuếch đại vùng
gen quan tâm thì pyrosequencing đƣợc sử dụng để xác định trình tự đã biến đổi với
bisulfite của các vị trí CpG đặc hiệu trong vùng. Tỷ lệ C chuyển thành T tại các vị
trí riêng biệt có thể đƣợc định lƣợng dựa trên tỷ lệ kết hợp của C và T trong suốt
quá trình kéo dài chuỗi. Hạn chế duy nhất của phƣơng pháp này chính là giá thành
cao, tuy nhiên giải trình tự ln là phƣơng pháp chính xác nhất để xác định trình tự
ADN, nên kỹ thuật này thƣờng đƣợc sử dụng trong việc khẳng định kết quả nghiên
cứu cuối cùng từ các phƣơng pháp khác.
1.4. CHEMOKINE CXCL12 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƢ ĐẠI TRỰC
TRÀNG

1.4.1. Chemokine
Chemokine là những cytokine có bản chất là protein, có kích thƣớc 8-14
kDa, có khả năng di chuyển trực tiếp hoặc hóa hƣớng động, có khả năng hịa tan.
Nó liên kết và hoạt hóa với một họ các thụ thể chemokine.
Chemokine đƣợc sản xuất trong những giai đoạn sớm nhất của nhiễm trùng.
Các phân tử này đƣợc phát hiện cách đây khơng lâu. Chúng phát huy tác dụng hóa
hƣớng động đến các tế bào có khả năng đáp ứng gần đó. Interleukine-8 là

16