Đề tài: Phân lập, tách chiết, tinh sạch enzyme CDH từ nấm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzyme cellobiose dehydrogenase từ
chủng nấm phân lập Coprinellus aureogranulatus
NGUYỄN MỸ LINH


Chuyên ngành Kỹ thuật sinh học
Giảng viên hướng dẫn:
GVHD 1

TS. Nguyễn Trường Giang

GVHD 2

TS. Đỗ Hữu Nghị

Bộ môn

Công nghệ sinh học

Viện:

Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm

HÀ NỘI, 7/2020


ĐỀ TÀI TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: Nguyễn Mỹ Linh
Khóa: 59

Số hiệu sinh viên: 20142581

Viện: Cơng nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm

Ngành: Kỹ thuật Sinh học
1. Đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzyme cellobiose
dehydrogenase từ chủng nấm phân lập Coprinellus aureogranulatus”
2. Nội dung chính của đề tài:
• Phân lập, tuyển chọn chủng nấm tự nhiên có khả năng sinh enzyme
cellobiose dehydrogenase (CDH)
• Nuôi cấy thu enzyme và tinh sạch thu enzyme CDH.
3. Giảng viên hướng dẫn:
Giảng viên hướng dẫn tại Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm
KHCNVN: TS. Đỗ Hữu Nghị.
Giảng viên hướng dẫn tại Viện CNSH-CNTP: TS. Nguyễn Trường Giang
4. Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 02 tháng 01 năm 2020.
5. Ngày hoàn thành đồ án: 10 tháng 7 năm 2020.
Ngày 10 tháng 7 năm 2020
Trưởng bộ môn

Cán bộ hướng dẫn 1

Cán bộ hướng dẫn 2

(Ký, ghi rõ họ, tên)

(Ký, ghi rõ họ, tên)

(Ký, ghi rõ họ, tên)

Sinh viên đã hoàn thành và nộp đồ án tốt nghiệp ngày 10 tháng 7 năm 2020
Người duyệt

Sinh viên

(Ký, ghi rõ họ, tên)

(Ký, ghi rõ họ, tên)


LỜI CẢM ƠN
Để đồ án này đạt kết quả tốt đẹp, em đã nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ của
nhiều cơ quan, tổ chức, cá nhân. Em xin phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
tất cả các cá nhân và cơ quan đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình học tập và
nghiên cứu đề tài.
Thời gian thực tập và làm đồ án vừa qua là quá trình em tham gia học hỏi,
so sánh, nghiên cứu và ứng dụng các kiến thức đã học vào công việc thực tế ở cơ
quan.
Trước hết em xin gửi tới các cán bộ phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hoá
học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam lời
cảm ơn sâu sắc. Với sự quan tâm, dạy dỗ, chỉ bảo tận tình chu đáo của các anh chị
cô chú, đến nay em đã có thể hồn thành đồ án, đề tài: "Nghiên cứu thu nhận và
tinh sạch enzyme Cellobiose dehydrogenase từ chủng nấm phân lập
Coprinellus aureogranulatus".
Đồ án được thực hiện theo nội dung của Đề tài Nghị định thư Việt Nam –
CHLB Đức “Nghiên cứu phát hiện và khai thác một số enzyme chuyển hoá hiệu
quả lignocellulose từ đa dạng nấm Việt Nam trên cơ sở ứng dụng genomic và

secretomic” (NĐT.45.GER/18) do TS. Đỗ Hữu Nghị (Viện Hàn lâm KHCNVN)
làm chủ nhiệm.
Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới TS. Đỗ Hữu Nghị đã
quan tâm giúp đỡ, hướng dẫn em hoàn thành tốt đồ án này trong thời gian qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến thày Nguyễn Trường Giang, cũng như viện
Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã giúp đỡ em trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu đề tài.
Với điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế của một sinh
viên, đồ án này không thể tránh được những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự
chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cơ để em có điều kiện bổ sung, nâng cao
kiến thức của mình, phục vụ tốt hơn công tác thực tế sau này.

Em xin chân thành cảm ơn!


TÓM TẮT
Xử lý vật liệu giàu lignocellulose bằng các phương pháp hữu cơ không gây
hại cho môi trường và con người đang là xu hướng phát triển hiện nay. Trong đó,
nấm phân giải lignocellulose là một nguồn sản sinh enzyme dồi dào, góp phần xử
lý an tồn các phụ phẩm nông - lâm nghiệp. Trong các loại enzyme được sinh tổng
hợp bởi các loại nấm này, cellobiose dehydrogenase là một loại enzyme phụ trợ
có vai trị vơ cùng quan trọng. Hơn nữa, loại enzyme này cịn có rất nhiều ứng
dụng thiết thực khác. Do đó, em thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận và tinh
sạch enzyme Cellobiose dehydrogenase từ chủng nấm phân lập Coprinellus
aureogranulatus”, nhằm thu được một sản phẩm enzyme tinh sạch.
Sử dụng các phương pháp vi sinh, hoá sinh và sinh học phân tử cũng như
các thiết bị hỗ trợ nghiên cứu, các kết quả đạt được đều phù hợp với mục tiêu đặt
ra: Chủng nấm được phân lập và định danh, enzyme cellobiose dehydrogenase đã
được tinh sạch sau quy trình tinh sạch nhiều bước (lọc màng MWCO 10 – 20 kDa
cut-off và sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel). Các nghiên cứu về enzyme này sẽ

được tiếp tục, nhằm hoàn thiện hơn nữa quy trình thu nhận cũng như tinh sạch.

Hà Nội, ngày 10 tháng 7 năm 2020
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Mỹ Linh


MỤC LỤC
DANH MỤC VIẾT TẮT ..................................................................................... 3
DANH MỤC HÌNH MINH HOẠ ....................................................................... 4
DANH MỤC BẢNG............................................................................................. 5
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 6
I.

Lý do chọn đề tài. ...................................................................................... 6

II. Lịch sử nghiên cứu. ................................................................................... 7
Chương 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 10
I.

Phụ phẩm nông - lâm nghiệp giàu lignocellulose ở Việt Nam ............ 10

1.

Nguồn gốc ............................................................................................. 10

2.

Thành phần ............................................................................................ 11

III.

Chuyển hóa vật liệu giàu Lignocellulose. .......................................... 12

IV.

Nấm phân giải lignocellulose .............................................................. 16

V.

Chủng nấm Coprinellus aureogranulatus .......................................... 17

VI.

Giới thiệu enzyme Cellobiose dehydrogenase .................................. 18

1.

Khái niệm, nguồn gốc và phân loại....................................................... 19

2.

Cấu trúc ................................................................................................. 21

3.

Cơ chế xúc tác ....................................................................................... 22

4.

Điều kiện tối ưu ..................................................................................... 25

5.

Đặc tính và đặc hiệu cơ chất ................................................................. 25

6.

Ứng dụng............................................................................................... 26

7.

Các phương pháp tinh sạch enzyme CDH ............................................ 28

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 33
I.

Đối tượng nghiên cứu, hoá chất và thiết bị........................................... 33

1.

Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 33

2.

Vật liệu .................................................................................................. 33

1

3.

Hoá chất ................................................................................................ 33

4.

Thiết bị sử dụng .................................................................................... 34

II.

Phương pháp nghiên cứu.................................................................... 34

1.

Phân lập nấm ......................................................................................... 34

2.

Định danh nấm ...................................................................................... 35

3.

Nuôi cấy và bảo quản nấm .................................................................... 36

4.

Tinh sạch enzyme.................................................................................. 36

5.

Xác định hàm lượng protein enzyme .................................................... 38

6.

Xác định hoạt độ enzyme ...................................................................... 38

7.

Xác định độ tinh sạch ............................................................................ 39

Chương 3. Kết quả và thảo luận ....................................................................... 40
1.

Phân lập và sàng lọc nấm ...................................................................... 40

2.

Định danh và quan sát hình thái nấm .................................................... 42

3.

Dựng đường chuẩn protein tổng ........................................................... 45

4.

Kết quả lên men thu nhận enzyme ........................................................ 47

5.

Kết quả tinh sạch protein ...................................................................... 47

6.

Xác định độ tinh sạch ............................................................................ 51

7.

Khảo sát điều kiện hoạt động tối thích .................................................. 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 55

2


DANH MỤC VIẾT TẮT
Tên
viết tắt

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

CBQR

Cellobiose:quinone oxidoreductase

CDH

Cellobiose dehydrogenase

CYT

Cytochrome domain of CDH

Vùng cytochrome của CDH

DET

Direct electron transfer

Vận chuyển điện tử trực tiếp

DCIP

2,6-Dichlorophenolindophenol

DH

DH domain of CDH

FAD

Flavin adenine dinucleotide

FPLC

Fast protein liquid chromatography

GDH

Glucose dehydrogenase

GMC

Glucose-methanol choline

IET

Interdomain electron transfer

LPMO

Lytic polysaccharide monooxygenase

MET

Mediated electron transfer

Miền DH của CDH

Nicotinamide
phosphate

adenine

Vận chuyển điện tử nội phân tử

Vận chuyển điện tử qua trung

gian

MWCO Molecular weight cut off
NADP

Sắc ký lỏng protein nhanh

Siêu lọc theo khối lượng phân tử
dinucleotide

TLTK

Tài liệu tham khảo

3


DANH MỤC HÌNH MINH HOẠ
Hình 1.1: Cấu tạo của lignocellulose. ....................................................................... 11
Hình 1.2: Mặt cắt vi sợi lignocellulose. .................................................................... 11
Hình 1.3: Cơ chế phân giải cellulose bằng enzyme xúc tác ..................................... 15
Hình 1.4: Cấu trúc in vivo của CDH. ........................................................................ 15
Hình 1.5: Các dạng hình thái của chủng nấm Coprinellus aureogranulatus ........... 18
Hình 1.6: Sự phân bố và xuất hiện của gene lpmo và cdh trong bộ genome của nấm
.................................................................................................................................. 20
Hình 1.7: Phân loại CDH. ......................................................................................... 21
Hình 1.8: Cấu trúc của TcCDH. ................................................................................ 22
Hình 1.9: Cơ chế xúc tác của CDH và mối liên hệ với LPMO. ............................... 23
Hình 1.10: Dịch chuyển điện tử trong CDH ............................................................. 24
Hình 1.11: Dịch chuyển điện tử trực tiếp (DET) hoặc gián tiếp (MET).. ................ 24

Hình 1.12: So sánh pH tối ưu cho CDH loại I (bên trái) và loại II ........................... 25
Hình 1.14: Cơ chế hoạt động của cột trao đổi ion .................................................... 30
Hình 1.15: Nhựa nhồi cột DEAE-cellulose .............................................................. 31
Hình 3.1: Hoạt tính CDH của các chủng khác nhau, xác định trên phiến 96 giếng. 42
Hình 3.2: Chủng nấm ký hiệu MPG14 trên đĩa thạch .............................................. 43
Hình 3.3: Khuẩn ty của chủng ký hiệu MPG14. ....................................................... 43
Hình 3.4: Điện di DNA tổng số.................................................................................44
Hình 3.5. Mối quan hệ họ hàng của chủng nấm MPG14 với các loài/thứ trong cùng
chi lấy trên Genbank ................................................................................................ 45
Hình 3.6: Trình tự ITS của chủng nấm ký hiệu MPG14 .......................................... 45
Hình 3.7: Đường chuẩn nồng độ protein trong dung dịch. ....................................... 46
Hình 3.8 : Đồ thị chạy cột DEAE –sepharose .......................................................... 47
Hình 3.9: Đồ thị chạy cột Q-sepharose ..................................................................... 48
Hình 3.10: Kết quả điện di SDS-PAGE và điện di pI (native isoelectric focusing) . 51
Hình 3.11. So sánh hoạt tính CDH ở các nhiệt độ khác nhau. .................................. 54
Hình 3.12. So sánh hoạt tính CDH ở các dung dịch đệm có giá trị pH khác nhau ... 55

4


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Sinh khối lignocellulose từ phế phẩm nông - lâm nghiệp tại Việt Nam
............................................................................................................................. 10
Bảng 1.2: Một số thơng số của cột Q-sepharose.................................................. 31
Bảng 2.1: Các hố chất sử dụng........................................................................... 33
Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng ............................................................................. 34
Bảng 3.1: Hoạt tính CDH và phương pháp định danh của các chủng nấm nghiên
cứu........................................................................................................................ 40
Bảng 3.2: Kết quả đo OD tương ứng với nồng độ protein .................................. 46
Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả tinh sạch enzyme CDH........................................... 49

5


MỞ ĐẦU
I.

Lý do chọn đề tài.

Sự đẩy mạnh sản xuất nông - lâm nghiệp đã thải ra môi trường một lượng lớn
sản phẩm phụ sau thu hoạch như phế thải từ rừng (cành, lá), phế thải nông nghiệp
(cỏ, bèo dâu, rơm rạ, bã mía, thân mì, các loại vỏ,….) và các chất thải hằng ngày
như giấy, bàn, ghế,… Hàng năm, thảm thực vật sinh ra một lượng sinh khối khổng
lồ, ước tính khoảng 4x1010 tấn. Các chất thải này được gọi là vật liệu lignocellulose
thải với thành phần chủ yếu là cellulose 35 - 50 %, hemicellulose 15 – 30 % và
lignin 10 - 25 %.
Các chất thải này chỉ một phần lượng được tái sử dụng làm thức ăn gia súc,
chất độn,…phần còn lại thường được đốt hay thải bỏ để phân hủy tự nhiên. Cách
xử lý này sẽ thải ra CO, CO2 hay CH4,…Đây là các nguồn góp phần gây ơ nhiễm
mơi trường và hiệu ứng nhà kính. Hiện nay, quá trình thủy phân lignocellulose
thường được thực hiện bằng các phương pháp hóa học như sử dụng acid và kiềm
hoặc được thủy phân bằng enzyme từ vi sinh vật. Q trình thủy phân bằng phương
pháp hóa học thường xảy ra ở nhiệt độ và áp suất cao dẫn đến sự tạo thành các chất
độc hại có thể ảnh hưởng không tốt đến môi trường và sức khoẻ con người. Vì vậy,
ngày nay các nghiên cứu theo hướng sử dụng vi sinh vật để sản sinh enzyme thúc
đẩy phân giải lignocellulose đang rất được ưa chuộng và được đầu tư nghiên cứu.
Phương pháp này vừa đạt hiệu quả cao, vừa thân thiện hơn với mơi trường và an
tồn khi tiếp xúc.
Trong nhóm các vi sinh vật sản sinh enzyme phân giải lignocellulose, nấm là
nhóm được nghiên cứu nhiều nhất. Các loại nấm khác nhau cũng có khả năng sinh

ra các enzyme phân giải lignocellulose khác nhau. Trong đó các loại nấm mục như
nấm mục nâu và nấm mục trắng phổ biến ở Việt Nam. Nấm mục có vai trị rất quan
trọng trong việc phân giải cellulose, nhờ có khả năng sinh các loại enzyme ngoại
bào như cellobiose dehydrogenase, lignin peroxidase, mangan peroxidase,
laccase,…Đặc biệt enzyme cellobiose dehydrogenase do nấm mục sinh ra là rất
lớn so với những loại nấm khác. Phụ phẩm nông nghiệp ở Việt Nam sẽ là nơi sinh
sống tốt nhất và là nguồn thức ăn dồi dào nhất cho các chủng nấm mục có khả
năng sinh enzyme này.
Enzyme cellobiose dehydrogenase (CDH, EC 1.1.99.18) thuộc họ
oxidoreductase, là enzyme xúc tác cho sự chuyển điện tử từ một phân tử (chất
khử), được gọi là chất cho điện tử, đến chất khác (chất oxy hóa), được gọi là chất
nhận điện tử. CDH có khả năng chuyển điện tử tới enzyme phân giải
6


polysaccharide monooxygenases (LPMO) để phân giải cellulose. LPMO kích hoạt
oxy phân tử, được chèn vào nguyên tử C1 hoặc C4 của cellulose liền kề với liên
kết glycosid để tạo ra một chất trung gian không ổn định cuối cùng dẫn đến đứt
sợi, là chuỗi glucan dễ bị tấn công bởi cellulase [1]. Gần đây enzyme cellobiose
dehydrogenase được nghiên cứu ứng dụng ở nhiều lĩnh vực khác nhau như cảm
biến sinh học, nhiên liệu sinh học, xử lý sinh học, hoặc ứng dụng trong việc sản
xuất lactobionic axit, xử lý dệt may và đặc biệt cho một số ứng dụng y sinh [2-4].
Mặc dù cellobiose dehydrogenase được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh
học và các ngành công nghiệp khác. Tuy nhiên, ở trong nước hiện nay rất ít các
cơng trình khoa học nghiên cứu về đặc tính cellobiose dehydrogenase, đặc biệt là
khả năng sinh enzyme cellobiose dehydrogenase từ nấm lớn ở Việt Nam.
Từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên làm động lực cho em chọn đề tài: “Nghiên
cứu thu nhận và tinh sạch enzyme cellobiose dehydrogenase từ chủng nấm
phân lập Coprinellus aureogranulatus”.
II.

Lịch sử nghiên cứu.

Cellobiose dehydrogenase (CDH) hiện đã được nghiên cứu trong hơn bốn thập
kỷ kể từ báo cáo đầu tiên vào năm 1974 bởi Westermark và Eriksson, nhưng loại
enzyme này vẫn cịn những khía cạnh mới. CDH lần đầu tiên được tìm thấy trong
hai loại nấm mục trắng Trametes versicolor và Phanerochaete chrysosporium và
việc nghiên cứu các đặc tính xúc tác và phân tử của enzyme ngoại bào này gặp rất
nhiều khó khăn. Tổng quan những khám phá quan trọng về CDH được đưa ra trong
Bảng 1 dưới đây.
Năm

Sự kiện

TLTK

1974

Lần đầu phát hiện CDH trong nấm mục trắng (T. versicolor & P. 11
chrysosporium)

1980

Lần đầu phát hiện CDH trong nấm mục nâu (Monilia sp.)

25

1991

Quan sát được sự phân tách protein trong 2 miền của CDH

26

1992

Sự tạo thành Fe2+ và H2O2

20

1992

Ứng dụng CDH trong cảm biến sinh học MET cellobiose dựa trên 27
một polymer oxy hoá khử

1996

Ứng dụng hiện tượng dịch chuyển điện tử trực tiếp của CDH làm 28
điện cực than chì.

2000

Giải mã cấu trúc của miền CYT
7

22


2002

Giải mã cấu trúc miền DH

23

2002

Tiềm năng oxy hoá khử của cofactor DH và CYT và tỷ lệ IET được 30
xác định.

2006

CDH được sử dụng làm nguyên tố sinh học cho biosensor lactose 31
thế hệ 3.

2004

Phân loại CDH theo gene thành 3 loại I, II, III.

2008

Sử dụng CDH làm anode trong pin nhiên liệu sinh học glucose/O2 33

2011

Sử dụng CDH làm nguyên tố sinh học trong biosensor glucose thế 34
hệ 3.

2011

Phát hiện ra LPMO là chất nhận điện tử tự nhiên của CDH

37

2016

Ứng dụng của CDH trong biosensor

36

2016

Khảo sát cơ chế tương tác giữa CDH và LPMO

18

2018

Sử dụng CDH làm anode trong biosupercapacitor (siêu tụ điện)

37

2019

Thêm nhóm IV vào trong các nhóm phân loại CDH.

38

32

Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu về phân
lập, tinh sạch và đặc tính của enzyme cellobiose dehydrogenase, nhưng chủ yếu

được nghiên cứu ở nấm mục trắng, và rất ít ở nấm mục nâu, trong đó có
Schmidhalter và Canevascini đã báo cáo hoạt tính của CDH vào năm 1993 [6]. Ở
Việt Nam hiện nay cũng chưa có cơng trình nào nghiên cứu tính chất của enzyme
cellobiose dehydrogenase từ nấm được cơng bố ngồi nhóm tác giả Đỗ Hữu Nghị,
Vũ Đình Giáp (Viện Hàn lâm KHCNVN) [2].
3 Mục đích nghiên cứu
Thu nhận, tinh sạch và khảo sát đặc tính của enzyme cellobiose dehydrogenase
từ các chủng nấm mục được phân lập.
4. Đối tượng nghiên cứu
Enzyme cellobiose dehydrogenase sinh ra từ nấm mục.
5. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Phân lập chủng nấm mục có khả năng sinh enzyme cellobiose
dehydrogenase.
- Tinh sạch enzyme cellobiose dehydrogenase.

8


-

Khảo sát những điều kiện ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme cellobiose
dehydrogenase.
6. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp vi sinh
- Phương pháp hóa sinh
- Phương pháp sinh học phân tử
- Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme
7. Dự kiến cấu trúc đồ án
Đồ án bao gồm phần mở đầu, 3 chương và phần kết luận được kiến nghị được
trình bày như sau:

Mở đầu
Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Kết luận và kiến nghị.

9


Chương 1. TỔNG QUAN
I.

Phụ phẩm nông - lâm nghiệp giàu lignocellulose ở Việt Nam

1. Nguồn gốc
Phụ phẩm nông-lâm nghiệp là một dạng sinh khối có thành phẩn chính chủ yếu là
lignocellulose. Hiện nay mỗi năm mỗi năm nguồn sinh khối này sản sinh ra hàng
trăm triệu tấn từ quá trình sản xuất nông-lâm nghiệp như: bèo dâu, rơm rạ, bã cà
phê, mùn gỗ, thân cây ngô, vỏ trấu và hàng chục triệu tấn bã mía, cơ chất để trồng
nấm…Phần lớn được đốt bỏ thu tro làm phân bón. Cách xử lý này sẽ thải ra CO,
CO2 hay CH4…, là nguyên nhân gây nên một số bệnh về mắt, phổi. Nguy hiểm
hơn, chúng gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng tới môi trường sống ở cả thành
thị và nông thôn. Đặc biệt, gây lãng phí lượng lớn chất hữu cơ có giá trị, trong khi
đó nếu khai thác sử dụng hợp lý thì nguồn sinh khối này đem lại lợi ích vơ cùng
lớn. Xét về nguồn gốc, thành phần, có thể phân biệt các loại lignocellulose như: từ
cây gỗ cứng, gỗ mềm cũng như từ cây trồng hàng năm (đặc biệt là cây lúa, ngũ
cốc, các loại cỏ, cây mía...) và thân cây thảo.
Bảng 1.1: Sinh khối lignocellulose từ phế phẩm nông - lâm nghiệp tại Việt Nam.

Lignocellulose là một phức hợp polyme thành tế bào ở thực vật, chiếm 60% tổng

sinh khối thực vật trên trái đất, bao gồm các thành phần chính là các polymer

10


carbohydrate (cellulose, hemicellulose) và một polymer thơm (lignin), trong đó
cellulose và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao. Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ
40% - 50%, còn hai hợp chất hemicellulose và lignin lần lượt chiếm khoảng 20 40% và 20 - 35% khối lượng khô của cơ thể thực vật (Bảng 1.1). Ngồi các thành
phần này, Lilholt cịn cho rằng pectin cũng là thành phần chính của lignocellulose
thành tế bào, đặc biệt là ở các cấu trúc sợi thực vật không phải thành phần gỗ.
2. Thành phần
Lignocellulose là thành phần chính của thực vật thân gỗ và các thực vật khác như
cỏ, lúa, ngơ… gồm 3 hợp phần chính là cellulose, hemicellulose và lignin. Chúng
cùng nhau tạo thành cấu trúc phức tạp có độ bền cao cho thành tế bào thực vật.
Lignocellulose là một cơ chất phức hợp bao gồm các polysaccharide, các polyme
có gốc phenol, và protein. Các thành phần của lignocellulose tạo thành một dạng
cấu trúc gọi là vi sợi (microfibril).

Hình 1.1 [7]: cấu tạo của lignocellulose.

Hình 1.2 [8]: mặt cắt vi sợi lignocellulose.
Cellulose, thành phần chính của thành tế bào thực vật bao gồm các đơn vị
D-glucose liên kết ß-1,4 tạo thành chuỗi polyme tuyến tính gồm khoảng 8000 - 12
000 đơn vị glucose. Ở dạng tinh thể của nó, cellulose bao gồm các chuỗi dính lấy

11


nhau bằng liên kết hydro để tạo thành các cấu trúc khó tan, được gọi là microfibrils.
Ngồi cấu trúc tinh thể, cellulose chứa các vùng vơ định hình (amorphous regions)

trong các vi sợi (cấu trúc không tinh thể) [3].
Hemicellulose là các polysaccharide không đồng nhất bao gồm các đơn vị
đường khác nhau, là polysaccharide phổ biến thứ hai trong thành tế bào thực vật.
Hemicellulose thường được phân loại theo thành phần chính của đường có trong
mạch polymer. Xylan, loại polymer hemicellulose dồi dào nhất trong ngũ cốc và
gỗ cứng, được cấu tạo bởi các đơn vị D-xylose liên kết ß-1,4 trong mạch chính và
có thể được thay thế bởi D-galactose, L-arabinose, glucuronic acid, acetyl, feruloyl
và p-coumaroyl [3]. Hai hemicellulose chính khác trong thành tế bào thực vật là
galacto(gluco)mannan, bao gồm một mạch chính của D-mannose có liên kết ß-1,4
(mannans) và D-glucose (glucomannans) với chuỗi bên D-galactose và
xyloglucans bao gồm một mạch chính D-glucose liên kết ß-1,4 được thay thế bằng
D-xylose [3]. Hơn nữa, trong polyme xyloglucan, L-arabinose và D-galactose có
thể được gắn vào xyloza và L-fucose có thể được gắn vào galactose. Do có nhiều
nhóm có khả năng gắn vào mạch chính như vậy, nên polymer này có độ phức tạp
và biến đổi cấu trúc cao.
Pectin là một họ khác của heteropolysaccharide thành tế bào thực vật, chứa
một mạch chính gồm các acid D-galacturonic liên kết với nhau. Pectin thường
chứa hai vùng khác nhau. Vùng mạch thẳng của pectin chứa acid D-galacturonic
có thể bị methyl hóa hoặc acetyl hóa. Ở vùng cịn lại, mạch chính của acid Dgalacturonic bị gián đoạn bởi L-rhamnose liên kết với α-1,2. Mạch nhánh có thể
có L-arabinose và D-galactose gắn vào rhamnose [5].
Lignin là một polymer phenolic tạo nên độ bền chắc của thành tế bào thực
vật. Lignin là một polymer phân nhánh phức tạp rất khó tan gồm các đơn vị
phenylpropane, được liên kết với nhau bằng liên kết ether và carbon-carbon, tạo
thành một mạng lưới liên kết chéo rộng rãi trong thành tế bào. Liên kết chéo giữa
các polyme khác nhau tạo nên sự phức tạp và độ cứng của thành tế bào thực vật,
chịu trách nhiệm bảo vệ toàn bộ tế bào thực vật. Ngoài việc bảo vệ chống lại lực
cơ học và ly giải thẩm thấu, thành tế bào thực vật là một hàng rào hiệu quả chống
lại mầm bệnh, bao gồm vi sinh vật.
III.

Chuyển hóa vật liệu giàu Lignocellulose.

Q trình thủy phân lignocellulose được thực hiện bởi acid, kiềm hoặc hỗn hợp
enzyme thủy phân. Vào cuối thế kỉ 19 và đầu thế kỉ 20, quá trình thủy phân được
thực hiện bởi phản ứng giữa cellulose với acid. Acid loãng được sử dụng dưới điều
12


kiện nhiệt độ và áp suất cao, còn acid đậm đặc được sử dụng ở nhiệt độ thấp và áp
suất khí quyển. Q trình thủy phân bằng acid lỗng xảy ra ở nhiệt độ và áp suất
cao dẫn đến sự tạo thành các chất độc hại có thể ảnh hưởng khơng tốt đến q trình
lên men như các acid hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất furan và các
hợp chất vơ cơ. Các mắt xích của cellulose có thể bị phân cắt thành các phân tử
đường glucose riêng lẻ bằng hệ cellulase. Xét về bản chất quá trình thủy phân được
thực hiện theo phương trình phản ứng:
(C6H10O5)n + nH2O à nC6H12O6
Ngày nay, người ta quan tâm nhiều theo hướng nghiên cứu ứng dụng kết
hợp xử lý hóa học và xúc tác sinh học bằng enzyme thủy phân để thủy phân nguồn
vật liệu giàu lignocellulose thay cho các phương pháp hóa lý truyền thống. Sự kết
hợp này giúp cho quá trình thủy phân đạt hiệu quả cao hơn. Khi có sự tham gia
xúc tác sinh học của enzyme thì cơ chất sẽ được hoạt hóa mạnh trong thời gian
ngắn và không gây ảnh hưởng tới môi trường. Cơ chất tương tác với enzyme do
sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron, sự biến dạng các liên kết. Từ đó làm
thay đổi động năng, thế năng dẫn tới cơ chất trở nên dễ dàng tham gia vào các phản
ứng hơn. Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra qua ba giai đoạn
E +Sà ESà E + P
Trong đó: E - enzyme; S – substrate - cơ chất; P – product - sản phẩm
Giai đoạn thứ nhất: Enzyme kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ
đó sẽ tạo ra phức hợp E-S, phức này không bền. Giai đoạn thường này xảy ra rất
nhanh và đòi hỏi ít năng lượng.

Giai đoạn thứ hai: Cơ chất bị biến đổi, dẫn tới phá vỡ các liên kết đồng hóa trị.
Giai đoạn thứ ba: Sản phẩm được tạo thành, tách ra khỏi enzyme, sau đó enzyme
được
giải phóng và trở lại trạng thái tự do ban đầu. Các loại liên kết chủ yếu được tạo
thành giữa E và S trong phức hợp ES là: tương tác tĩnh điện, liên kết hydro, tương
tác Van der Waals. Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu
ảnh hưởng khác nhau khi có nước.
Trong tự nhiên, lignocellulose bị phân giải bởi các loại enzyme thủy phân
và oxy hóa được sinh tổng hợp bởi nhiều loại nấm và vi khuẩn có khả năng phá vỡ
cellulose, hemicellulose và lignin [68]. Các chất phân giải cellulose hiếu khí, cả vi
khuẩn và nấm, sử dụng cellulose thông qua việc sản xuất một lượng đáng kể các

13


enzyme cellulase ngoại bào [69]. Vi khuẩn kỵ khí phân giải cellulose chủ yếu
thông qua các hệ thống cellulase phức tạp bao gồm nhiều tiểu đơn vị tương tác với
nhau và phá vỡ cơ chất cellulose [70]. Cellulose khơng hịa tan và thành phần hóa
học của nó đồng nhất nhưng có nhiều vùng, vùng có cấu trúc vơ định hình và tinh
thể. Ở các vùng này, nước gần như bị loại trừ hoàn toàn. Mạng lưới cellulose và
pectin phần lớn độc lập với nhau hoặc chỉ tương tác yếu thông qua liên kết hydro.
Hemicellulose, một loại polymer không đồng nhất được tạo ra bởi các
đường 5C (D-xylose, D-arabinose), đường 6C (D-mannose, D-glucose, Dgalactose) và các loại đường khác, tương tác mạnh hơn với cellulose và làm cho
cấu trúc thành tế bào trở nên vững chắc hơn [71]. Lignin liên kết cộng hóa trị với
polysaccharide, do đó làm giảm diện tích bề mặt có thể tiếp cận của cellulose.
Mặc dù một số quan điểm trái ngược đã được đưa ra liên quan đến ảnh
hưởng của độ kết tinh của cellulose với hiệu suất thủy phân enzyme, nhưng người
ta chấp nhận rằng cellulose vơ định hình dễ bị tấn cơng cellulase hơn so với
cellulose kết tinh. Khi bắt đầu quá trình thuỷ phân, cellulose vơ định hình bị thuỷ
phân trước, dẫn đến sự giãn cách của các vùng tinh thể và do đó, sự phá vỡ cơ chất

diễn ra [80].
Trong bất kỳ quy trình nào để thu được ethanol từ sinh khối lignocellulose,
một bước tiền xử lý là cần thiết để ngăn sự chống thuỷ phân của cellulose. Tiền xử
lý làm tăng khả năng phá vỡ độ cứng tổng thể, thuỷ phân hemicellulose thành
monosacharride và oligosaccharide [87], phá vỡ lignin hoặc phá vỡ cấu trúc tinh
thể của cellulose. Cơ chất sau khi tiền xử lý thường chứa hemicellulose và lignin
cịn sót lại, cản trở việc tiếp cận và liên kết với các cellulase. Do đó, phải thêm vào
các enzyme đặc hiệu hơn, có nhiều hoạt tính hơn để thủy phân cellulose hồn
chỉnh. Các chế phẩm cellulase thương mại thường chứa các hoạt chất enzyme khác
bên cạnh cellulase cải thiện quá trình thủy phân cellulose [82].

14


Hình 1.3 [10]: cơ chế phân giải cellulose bằng enzyme xúc tác

Hình 1.4 [9]: Cấu trúc in vivo của CDH. CDH lấy electron của cellobiose chuyển
sang trung tâm đồng của LPMO để kích hoạt phân tử oxi, phân cắt cellulose.

15


IV.

Nấm phân giải lignocellulose

Nấm sợi phân giải thành tế bào thực vật có vai trị quan trọng trong việc xoay
vịng chất dinh dưỡng trong hệ sinh thái rừng. Chúng được biết đến như các loại
nấm sản xuất nhiều loại enzyme ngoại bào với các hoạt động xúc tác đa dạng để
thủy phân các nguyên liệu thô chứa nhiều lignocellulose. Chúng phân hủy và đồng

hóa các polymer hữu cơ khó phân hủy nhất do lối sống dễ thích nghi của chúng.
Các loại nấm này sử dụng các enzyme ngoại bào tiết ra mơi trường trong q trình
sinh trưởng. Hơn nữa, hệ thống enzyme ngoại bào bao gồm hai loại enzyme:
enzyme thủy phân sử dụng cho polysaccharide; và enzyme oxy hóa, oxy hố lignin
và mở vịng phenyl. Ba nhóm nấm mục bao gồm nấm mục mềm, mục trắng và
mục nâu, với các tác động và cơ chế phân hủy khác nhau lên lignocellulose, đã
được nghiên cứu. [1]
Các nấm mục nâu chuyển hoá cellulose khá nhanh trong giai đoạn đầu của quá
trình phân huỷ gỗ. Trong khi nấm mục trắng depolymer hoá cellulose chậm, đồng
thời sử dụng các sản phẩm của quá trình phân giải. Trong số các loại nấm mục có
khả năng phân giải lignocellulose, nấm mục trắng là loại nấm duy nhất có thể tấn
cơng tất cả các cấu tử của thành tế bào gỗ. Nấm mục trắng có khả năng phân giải
lignin hiệu quả nhờ có khả năng tiết ra các enzyme ngoại bào thuộc nhóm ligninase
(lignin peroxidase, mangan peroxidase, laccase,…) [7]
Một số nấm mục trắng như Phanerochaete chrysosporium và Trametes
versicolor không phân giải chọn lọc mà đồng thời tác động lên tất cả các cấu tử
của gỗ như hemicellulose, cellulose và lignin. Trong đó một vài nấm khác như
Phlebia tremellosa, Ceriporiopsis subvermispora và Phellinus pini chủ yếu phân
giải lignin [83]. Enzyme phân giải lignocellulose của nấm mục trắng có khả năng
hoạt động mạnh trên rất nhiều loại cơ chất khác nhau, do đó nó có tiềm năng sử
dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau [78]. Các vi sinh vật sẽ sử dụng
enzyme ngoại bào để phân cắt cellulose, hemicellulose và lignin. Các enzyme thuỷ
phân như cellulase, xylanase và mannanase góp phần phân giải các nhóm chức
carbohydrate, cịn các enzyme oxi hoá như laccase, lignin peroxidase và
manganese peroxidase (kết hợp với các phân tử trung gian khối lượng nhỏ) tham
gia phân giải lignin.
Một nghiên cứu của Kerem và cộng sự [51] so sánh khả năng phân hủy
lignocellulose của hai loại nấm: Pleurotus ostreatus và Phanerochaete
chrysosporium, trong quá trình lên men ở trạng thái rắn trên cơ chất là thân cây
bông. Sự tăng trưởng của P. chrysosporium dẫn đến 55% chất hữu cơ khô ban đầu

16


bị giảm trong vòng 15 ngày kể từ khi lên men, trong khi lượng lignin mất đi tương
đương 35% hàm lượng lignin ban đầu trong cơ chất. Sự tăng trưởng của
P.ostreatus thì chỉ làm hao hụt 20% chất hữu cơ khô ban đầu, trong khi lignin giảm
đi 45% so với hàm lượng lignin ban đầu trong cơ chất.
Li và cộng sự [52] đã phân tích những thay đổi thành phần của cơ chất vỏ cây
bơng trong q trình sinh trưởng của P. Ostreatus. Sau 45 ngày ủ, hàm lượng lignin
giảm từ 17% ban đầu xuống cịn 11% chất khơ. Hơn nữa, họ đã thực hiện thuỷ
phân rơm bằng Fusarium concolor có khả năng sản xuất enzyme laccase, LiP và
MnP khi phát triển trên môi trường lignocellulose. Sau 5 ngày ủ, họ đã quan sát
thấy sự hao hụt 13,07% lignin và 7,62% polysaccharide tổng số [53].
Herpöel và cộng sự [54] khảo sát sự thuỷ phân rơm lúa mì kết hợp xylanase
thương mại và laccase từ Pycnoporus cinnabarinus, sau đó là xử lý bằng kiềm. Xử
lý qua hai giai đoạn này có thể loại bỏ 60% lignin trong bột rơm lúa mì. Ngoài ra,
xylanase và laccase, thường được sử dụng kèm vào q trình, góp phần cải thiện
hiệu suất trong bước phân loại hóa học sau đó. Loại nấm tương tự đã được sử dụng
trong việc thuỷ phân nguyên liệu chứa lignocellulose thô (Prosopis juliflora /
Lantana camara) được báo cáo bởi Gupta và cộng sự [63]. Kết quả cho thấy sự
loại bỏ lignin giúp cải thiện q trình đường hóa của cellulose.
Giles và cộng sự đã nghiên cứu ra một phương pháp sinh học sử dụng nấm gồm
hai giai đoạn [56], cải thiện quá trình dùng enzyme thủy phân gỗ để sản xuất
ethanol. Trong phương pháp này, huyền phù nuôi cấy lỏng bao gồm nấm mục trắng
C. subvermispora và nấm mục nâu Postia placenta, đã được sử dụng. Các phương
pháp xử lý dẫn đến sự giảm khối lượng 6 ± 0,5% và tăng năng suất thủy phân bằng
enzyme lên 67-119%.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tính hiệu quả của việc sử dụng từ nấm để
phân giải nguyên liệu chứa lignocellulose. Các kết quả thu được đều rất tích trong

việc sử dụng enzyme ligninolytic trong các quy trình thuỷ phân và tẩy trắng [10].
V.

Chủng nấm Coprinellus aureogranulatus

Coprinellus aureogranulatus là một loài nấm trong họ Psathyrellaceae, được
công bố lần đầu bởi nhà nấm học C.B. Uljé và A. Aptroot năm 1998 [65], sau đó
được xếp vào chi Coprinellus năm 2001 [66]. Các loài nấm trong
họ Psathyrellaceae thường sinh trưởng và phát triển trong những môi trường
giàu nitơ như đất mùn, phân, thân cây mục rữa...

17


Đặc điểm hình thái: Đầu chóp rộng 8 - 10 mm, hình nón hoặc hình quả chng
khi cịn non, sau đó lên đến 30 mm, màu nâu vàng nhạt đến màu nâu cam, tối hơn
ở giữa, nhạt dần thành màu xám ở rìa. Lamellae dày, màu trắng, khi già chuyển
thành màu vàng nâu đến xám đen. Cuống nấm dài 20 - 40 mm, đường kính 1 - 4
mm, bằng nhau, mỏng manh, màu trắng. Khuẩn ty phát triển dày đặc, màu vàng
đồng. Mùi và vị khơng rõ ràng.

Hình 1.5 [65]: các dạng hình thái của lồi nấm Coprinellus aureogranulatus
VI.

Giới thiệu enzyme Cellobiose dehydrogenase

Cellobiose dehydrogenase (CDH) hiện đã được nghiên cứu trong hơn bốn thập
kỷ kể từ báo cáo đầu tiên vào năm 1974 bởi Westermark và Eriksson, nhưng loại
enzyme này vẫn cịn những khía cạnh mới. CDH lần đầu tiên được tìm thấy trong
hai loại nấm mục trắng Trametes versicolor và Phanerochaete chrysosporium và

việc nghiên cứu các đặc tính xúc tác và phân tử của enzyme ngoại bào này gặp rất
nhiều khó khăn.
Một số các chức năng in vivo khác nhau đã được phát hiện bao gồm: phân giải
cellulose, ngăn ngừa tái cấu trúc cellulose, giảm ức chế sản phẩm cellulase, lignin
depolyme hóa, hỗ trợ mangan peroxidase bằng cách tăng sự có mặt của mangan,
sinh tổng hợp các gốc hydroxyl, khử quinone như cơ chế giải độc trong quá trình
tấn công cây của nấm, chức năng kháng khuẩn và là thành phần của chuỗi hô hấp.
Giả thuyết gốc hydroxyl [20], trong đó có khả năng sinh tổng hợp phức hợp hydro
peroxide và ion sắt của CDH, sau đó được sử dụng trong phản ứng Fenton, đã được
ưa chuộng trong một thời gian cho đến khi người ta phát hiện ra CDH cung cấp
điện tử cho LPMO thông qua miền cytochrome di động (CYT), cần thiết để kích
18


hoạt phần trung tâm chứa đồng của LPMO để bắt đầu chu trình xúc tác [17, 18,
21].
Tính linh động của miền CYT trong CDH là cần thiết cho sự chuyển điện tử
giữa cả hai enzyme và cũng là lý do tại sao kết tinh hồn tồn CDH là vơ cùng khó
khăn. Do đó, các cấu trúc đầu tiên của CDH được quan sát từ các miền riêng lẻ.
Năm 2000, Hallberg và cộng sự đã phân tích thành cơng cấu trúc của miền CYT
từ P.chrysosporium [22] và vào năm 2002 là miền DH [23].
1. Khái niệm, nguồn gốc và phân loại
CDH là một enzyme oxy hoá khử, xúc tác phản ứng:
cellobiose + chất nhận điện tử ➔ cellobiono-1,5-lactone + chất nhận điện tử đã bị
khử
Do đó, enzyme này được đặt tên là cellobiose dehydrogenase (chất nhận
điện tử) với số EC là 1.1.99.18. CDH cũng được liệt kê trong cơ sở dữ liệu enzyme
carbohydrate (CAZy), là một trong bốn phân nhóm đầu tiên của họ hoạt động phụ
trợ CAZy (AA3_1) dựa trên chức năng của nó là hỗ trợ q trình depolymer hoá
polysaccharide bằng LPMO.

CDH phân bố rộng rãi trong Basidiomycota và Ascomycota và có hàm
lượng đáng kể cùng với LPMO-chất nhận điện tử tự nhiên của nó trong các nhóm
cùng loại (Hình 1) [18]. Trong khi hầu hết tất cả các loại nấm mục trắng, nhiều
nấm bệnh và mục mềm đều có CDH nấm mục nâu, thực vật cộng sinh và nhiều
mầm bệnh khác có ít CDH. Điều này cho thấy chức năng hỗ trợ phá vỡ
polysaccharide của nó khi kết hợp với LPMO.
Trong khoảng 60% trường hợp, hai gen cdh và lpmo xuất hiện cùng nhau,
điều này nhấn mạnh vai trò enzyme phụ trợ quan trọng của CDH đối với LPMO.
Tuy nhiên, 40% cịn lại là nấm khơng có CDH.
Các loại nấm đã phân lập và xác định đặc tính CDH bao gồm Basidiomycota
P.chrysosporium, P. sordida, Trametes spp., Sclerotium rolfsii, và Gelatoporia
subvermispora (syn. Cereporiopsis subvermispora , C. thermophilus (syn. Coryn
Damascus thermophilus), Humicola insolens và Thielavia terrestris. Tuy nhiên,
nhiều sinh vật khác đã được chứng minh chúng mang một hoặc nhiều gen cdh [61].

19


Hình 1.6 [3]: Sự phân bố và xuất hiện của gene lpmo và cdh trong bộ genome
của nấm. Tổng cộng 96 genome của các loại nấm phân giải lignocellulose được
nghiên cứu. Các gen mang một hay nhiều đoạn lpmo (màu xanh) và đoạn cdh
(màu đỏ)
Các trình tự cdh được chia thành bốn loại (Hình ) [38]: Trình tự CDH loại
I chỉ được tìm thấy trong Basidiomycota trong khi các chuỗi CDH loại II, III và
IV chỉ được tìm thấy trong Ascomycota. CDH loại I có ái lực mạnh với cellulose
và liên kết thơng qua vị trí gắn kết cellulose trên bề mặt của miền DH [23], khác
với vị trí hoạt động. Vị trí gắn kết cellulose này khơng có ở các loại CDH còn lại.
Sự liên kết với cellulose của CDH loại II phụ thuộc vào sự có mặt của module liên
kết carbohydrate 1 C-terminal (Carbohydrate-binding module - CBM1). Một số
CDH loại II có C-terminal và được phân loại là CDH loại IIA, trong khi CDH loại

IIB khơng có CBM1 và không liên kết với cellulose. Một số điểm khác biệt khác
giữa CDH loại I và loại II nằm ở độ đặc hiệu cơ chất và độ pH tối ưu của IET.
CDH loại III và loại IV vẫn chưa được xác định rõ đặc tính.

20


Hình 1.7 [35]: Phân loại CDH.
Người ta đã làm các phép thử bằng các enzyme CDH bị cắt miền DH, kết quả cho
thấy sự quan trọng của miền DH chứa FAD [49, 61].
CDH loại IV là loại CDH cấp tiến hoá cao nhất liên quan đến các lớp CDH
khác và khơng có miền CYT chuyển điện tử, điều này cho thấy một vai trò lý sinh
khác và CDH loại IV khơng cịn khả năng vận chuyển điện tử trực tiếp..
2. Cấu trúc
Việc kết tinh và xác định cấu trúc của CDH đã bị tính linh động của miền
CYT cản trở trong một thời gian dài. Tuy nhiên, cấu trúc tinh thể của từng miền
CYT [22] và miền DH [23] đã cho thấy sự bổ sung lẫn nhau và vị trí vùng giao
thoa của hai miền này, cung cấp cơ sở cấu trúc cho sự chuyển điện tử giữa các
miền được quan sát trong các nghiên cứu sinh hóa và điện hóa học [39].
Cấu trúc tinh thể của miền DH của P.chrysosporium được xác định bởi
Hallberg và cộng sự là có hình hạt đậu với kích thước khoảng 72x57x45 Å.
Tuỳ vào nguồn gốc và phân loại, CDH có khối lượng phổ biến trong khoảng từ
91kDa đến 102kDa, dải pI dao động từ 3.0 đến 4.2 và có thể hơn nữa.
Cấu trúc CDH bao gồm miền CYT đầu N, một sợi liên kết, miền DH và
CBM1 đầu C.

21