KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (KIỂM NGHIỆM và độc CHẤT) xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC MS MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
----------------

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN
TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
----------------

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN
TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

KHÓA:
NgƯời hƯớng dẫn 1:
NgƯời hƯớng dẫn 2:

Hà Nội – 2019


LỜI CẢM ƠN

Bản luận văn này đƯợc hoàn thành tại Khoa Hóa phân tích – Tiêu
chuẩn, Viện DƯợc liệu dƯới sự hƯớng dẫn của TS. Nguyễn Thị PhƯơng
và TS. Nguyễn Hữu Tùng.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị PhƯơng
(Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện DƯợc liệu) và TS. Nguyễn Hữu
Tùng (Bộ môn Hóa dƯợc và kiểm nghiệm, Khoa Y DƯợc - ĐHQGHN) là
những ngƯời thầy đã hƯớng dẫn, chỉ bảo, góp ý và đƯa ra những ý kiến
quý báu để em hoàn thiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. PhƯơng Thiện ThƯơng
(TrƯởng khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện DƯợc liệu) cùng với các
anh chị,bạn bè, cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện
DƯợc liệu đã giúp đỡ em, đặc biệt là anh Nguyễn Đình Quân - ngƯời đã
luôn theo sát, hƯớng dẫn cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Khoa Y – DƯợc đã
dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trƯờng.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã ln ở
bên cạnh, ủng hộ, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và
hồn thành khóa luận.
Cuối cùng, em xin chúc các thầy cô mạnh khỏe, hạnh phúc và thành
công trong công việc cũng nhƯ trong cuộc sống.

Hà Nội, ngày 16 tháng 04 năm 2019
Sinh viên


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.............................................................................2
1.1.

Tổng quan về aflatoxin......................................................................... 2

1.1.1.

Giới thiệu về aflatoxin.................................................................... 2

1.1.2. Tính chất hóa lý.............................................................................. 2
1.1.3. Điều kiện sinh aflatoxin..................................................................7
1.1.4. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin........................................................8
1.1.5. Độc tính của aflatoxin lên cơ thể ngƯời.........................................9
1.1.6. Những nghiên cứu về phƯơng pháp định lƯợng aflatoxin trong dƯợc
liệu

10

1.2. Tổng quan về sắc ký ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng – khối phổ (LCMS/MS)........................................................................................................15
1.2.1. Sắc ký ái lực miễn dịch................................................................ 15
1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ.................................................................... 16
CHƯƠNG2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................21
2.1. Đối tƯợng nghiên cứu........................................................................ 21
2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị............................................................ 21
2.2.1. Chất chuẩn.......................................................................................................21
2.2.2. Hóa chất 21

4

2.2.3. Thiết bị, dụng cụ............................................................................. 22
2.3. Nội dung nghiên cứu............................................................................. 22
2.3.1. Thu thập mẫu nghiên cứu..........................................................................22
2.3.2. Xây dựng phƯơng pháp định lƯợng aflatoxin trong dƯợc liệu.....22
2.3.3. Áp dụng phƯơng pháp đánh giá hàm lƯợng aflatoxin trong các mẫu
dƯợc liệu giàu tinh bột trên thị trƯờng Hà Nội..............................23
2.4. PhƯơng pháp nghiên cứu......................................................................23
2.4.1. PhƯơng pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử...............................23
2.4.2. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc kí.................................................23
2.4.3. Quy trình thẩm định phƯơng pháp................................................. 23
2.4.3.1. Tính đặc hiệu/ chọn lọc................................................................23
2.4.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lƯợng (LOQ).............24
2.4.3.3. Khoảng tuyến tính và đƯờng chuẩn.............................................24
2.4.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi................................................................25
2.4.4. PhƯơng pháp xử lý số liệu..............................................................26
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................... 27
3.1..............................................................Khảo sát điều kiện khối phổ 27
3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký......................................................................29
3.2.1. Lựa chọn pha tĩnh............................................................................29
3.2.2. Khảo sát pha động...........................................................................30
3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu................................................................33
3.3.1. Khảo sát dung mơi chiết mẫu..........................................................33
3.3.2. Khảo sát dung môi làm sạch........................................................... 34
3.4. Thẩm định phƯơng pháp...................................................................... 35


3.4.1. Độ chọn lọc của phƯơng pháp........................................................................ 35
3.4.2. Tính phù hợp hệ thống.................................................................................... 36
3.4.3. ĐƯờng chuẩn và khoảng tuyến tính................................................................37
3.4.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƯợng (LOQ)..............................39

3.4.5. Độ lặp lại và độ thu hôi................................................................................... 40
3.5. Áp dụng phƯơng pháp đánh giá hàm lƯợng aflatoxin trong dƯợc liệu. 42
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học

AF

Aflatoxin

AFB1

Aflatoxin B1

AFB2

Aflatoxin B2

AFG1

Aflatoxin G1

AFG2

Aflatoxin G2

AFM1

Aflatoxin M1

AFM2

Aflatoxin M2

AOAC
CE/MS

Tiếng Việt

Association of Official Analytical

Hiệp hội các nhà phân

Chemists

tích hóa học

Capillary Electrophoresis – Mass

Điện di mao quản –

Spectrometry

khối phổ

CTCT

Công thức cấu tạo

CTPT

Công thức phân tử

CV%

Coefficient of Variation

Hệ số biến thiên

Enzyme – Linked Immuno Sorbent

Kỹ thuật miễn dịch liên

Assay

kết với enzyme

ESI

Electrospray Ionization

Ion hóa bằng tia điện tử

HCC

Hepatocellular carcinoma

ELISA

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng

Chromatography

cao

chromatography- Fluorescence
Detection

IARC

bào gan

High Performance Liquid
High performance liquid

HPLC-FLD

Ung thƯ biểu mô tế

International Agency for Research

7

Sắc ký lỏng hiệu năng
cao đầu dò huỳnh quang
Cơ quan nghiên cứ ung


on Cancer
LC-MS

Liquid Chromatography Mass
Spectrometry

thƯ quốc tế
Sắc ký lỏng khối phổ

Liquid Chromatography tandem

Sắc ký lỏng khối phổ

Mass Spectrometry

hai lần

LOD

Limit of detetion

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantitation

Giới hạn định lƯợng

MeOH

Methanol

PBS

Phosphate-Buffered Saline

R%

Recovery

RSD

Relative Standard Deviation

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

SPE

Solid phase extract

Chiết pha rắn

SPE-IM

Solid phase extract-Immuno

TLC

Thin layer chromatography

LC-MS/MS

Dung dịch đệm
phosphat
Độ thu hồi
Độ lệch chuẩn
tƯơng đối

Chiết pha rắn với cột ái
lực miễn dịch
Sắc ký lớp mỏng

TLPT

Trọng lƯợng phân tử

TLTK

Tài liệu tham khảo

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1. Tính chất của một vài aflatoxin........................................................4
Bảng 1. 2. Một số nghiên cứu định lượng aflatoxin trong và ngoài nước

11

Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu mua........................................................21
Bảng 3.1. Thông số MS tối ưu......................................................................28
Bảng 3. 2. Một số chương trình gradient khảo sát..........................................30
Bảng 3. 3. Các thơng số sắc ký ứng với chương trình gradient 2...................32
Bảng 3. 4. Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi khác nhau. 34
Bảng 3. 5. Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi làm sạch... 35
Bảng 3. 6. Ion mẹ và ion con của các aflatoxin...............................................35
Bảng 3. 7. Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp

37

Bảng 3. 8. Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc của các chất ...
38 Bảng 3. 9. Kết quả xác định LOD và LOQ của phương pháp...................40
Bảng 3. 10. Độ lặp lại và độ thu hồi của aflatoxin trên nền mẫu dược liệu .. 41


DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Sơ đồ khối của máy khối phổ..........................................................18
Hình 1.2. Bộ phân tích tử cực chập ba............................................................19
Hình 3.1. Phổ khối của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 quan sát dưới chế độ
ESI-positive....................................................................................................28
Hình 3. 2. Phổ khối của ion con các aflatoxin...............................................29
Hình 3. 3. Sắc ký đồ chương trình gradient 1..................................................31

Hình 3. 4. Sắc ký đồ chương trình gradient 2..................................................31
Hình 3. 5. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp.........................36
Hình 3. 6. Đường chuẩn của các độc tố aflatoxin...........................................39


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, dƯợc liệu cũng nhƯ các sản phẩm từ dƯợc
liệu đƯợc nhân dân sử dụng ngày càng nhiều. Để đảm bảo ngƯời dân đƯợc
sử dụng những sản phẩm tốt nhất, cũng nhƯ an toàn cho sức khỏe, ngồi
việc đảm bảo các tiêu chí trong DƯợc điển các sản phầm này cũng nên đƯợc
kiểm tra đánh giá mức độ ô nhiễm các độc tố nấm, trong đó phổ biến
nhất là aflatoxin. Hiện nay trên thế giới nhiều tác giả đã tiến hành xây dựng
phƯơng pháp định lƯợng aflatoxin trong nhiều nền mẫu dƯợc liệu khác
nhau. Tuy nhiên, trong nƯớc hiện tại các nghiên cứu công bố cho thấy quy
trình xử lý mẫu trải qua nhiều cơng đoạn, tốn nhiều thời gian nên hiệu
suất cịn chƯa đƯợc cao. Vì vậy, nhằm đƯa ra đƯợc phƯơng pháp định
lƯợng aflatoxin trong dƯợc liệu với hiệu suất thu hồi cao và phƯơng pháp
đơn giản, cũng nhƯ tiết kiệm thời gian hơn, chúng tôi đề xuất đề tài “Xây
dựng phƯơng pháp định lƯợng aflatoxin trong dƯợc liệu bằng LCMS/MS”, áp dụng để xác định hàm lƯợng aflatoxin trong một số dƯợc liệu
với mục tiêu:
- Xây dựng và thẩm định phƯơng pháp định lƯợng đồng thời 4 độc tố
aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) trong dƯợc liệu bằng phƯơng pháp
LC-MS/MS sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn với cột ái lực miễn dịch (SPE-IM).
- Áp dụng phƯơng pháp đã xây dựng đánh giá mức độc ô nhiễm một số
aflatoxin trên các mẫu dƯợc liệu thu mua trên thị trƯờng Hà Nội.

1
1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về aflatoxin

1.1.1. Giới thiệu về aflatoxin
Aflatoxin đƯợc phát hiện và phân lập lần đầu tiên vào năm 1960 sau sự
kiện Bệnh Gà tây X ở Anh làm chết hơn 100.000 con gà tây. Những con gà
tây này bị hoại tử gan sau khi đƯợc cho ăn lạc mốc và aflatoxin đƯợc xác
định là nguyên nhân gây bệnh [15,25].
Aflatoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp đƯợc sản xuất bởi một vài
loại vi nấm, đặc biệt là nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus.
Nấm mốc có thể phát triển và sinh aflatoxin trƯớc và sau khi thu hoạch, khi
bảo quản cũng nhƯ chế biến. Nhiều nông sản có thể bị nhiễm aflatoxin nhƯ
ngũ cốc, lúa gạo; các loại hạt có dầu nhƯ hạt đậu, hạt hƯớng dƯơng, bông;
các loại gia vị nhƯ ớt , hạt tiêu, nghệ, gừng; hạnh nhân, quả óc chó và sữa
cùng các sản phẩm từ sữa (bơ, pho mát...) [10,20].
Aflatoxin là một nhóm chất gồm các chất có cấu tạo tƯơng tự nhau và
đều là dẫn chất của difuranocoumarin, đƯợc tổng hợp nhờ con đƯờng
polyketide. Ngày nay, ngƯời ta đã xác định đƯợc khoảng 20 loại aflatoxin
trong đó 6 loại aflatoxin quan trọng nhất lần lƯợt là B1, B2, M1, M2, G1 và G2
[27]. Aflatoxin B1là loại aflatoxin độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80%
tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lƯơng thực, thực phẩm. Thơng thƯờng, nếu
khơng có aflatoxin B1 thì cũng sẽ khơng có AFB2, AFG1 và AFG2 [10,14].
1.1.2. Tính chất hóa lý
Aflatoxin hịa tan trong dung mơi phân cực nhẹ nhƯ cloroform,
methanol, dimethyl sulfoxid. Độ tan của aflatoxin trong nƯớc vào khoảng 10–
20 mg/l. Dung dịch aflatoxin trong dung môi cloroform hay benzen có thể
đƯuọc trong nhiều năm nếu bảo quản ở điều kiện lạnh và tối [3].

Ở nhiệt độ đun nấu thông thƯờng không thể phân hủy đƯợc aflatoxin,
nhƯng dƯới ánh sáng tử ngoại các aflatoxin bị phân hủy. Trong cơng thức cấu
tạo có vịng lacton nội phân tử, nên các aflatoxin dễ bị phân hủy bởi base
mạnh và nếu tiếp tục acid hóa nhẹ thì aflatoxin ban đầu đƯợc tái tạo [3].
Các aflatoxin phát huỳnh quang rất mạnh, dựa vào tính chất này ta có
thể phát hiện chúng ở nồng độ rất thấp (trên sắc ký đồ lớp mỏng có thể phát
hiện với lƯợng chất khoảng 0,5ng hay nhỏ hơn). Đây chính là cơ sở hóa lý
cho việc phát hiện và định lƯợng các hợp chất này [3].


Bảng 1. 1. Tính chất của một vài aflatoxin

STT

Loại
aflatoxin

CTPT

TLPT
(đvC)

Tính chất

CTCT

TLTK

Nhiệt độ nóng chảy 268-269 oC

Huỳnh quang màu xanh da trời.

1

AFB1

C17H12O6

-[α]D: -480o (0,1M/dimethyl
312
formamid)
Hấp thụ UV cực đại trong môi trƣờng ethanol: 223; 265; 362 nm.

[22]

-

- Nhiệt độ nóng chảy 286-289 oC
Huỳnh quang màu xanh da- trời. [α]D: -492o (0,1M/cloroform) Hấp thụ UV cực đại trong môi
trƣờng ethanol: 265; 363 nm.
2

AFB2

C17H14O6

314

-

[22]

1
4



3

4

5

AFG1

AFG2

AFM1

C17H12O7

C17H14O7

C17H12O8

Nhiệt độ nóng chảy 244-246 oC
Huỳnh quang màu xanh lá cây.
-[α]D: -556o (0,1M/cloroform)
328
Hấp thụ UV cực đại trong môi trƣờng ethanol: 243; 257; 264;

362nm.

Nhiệt độ nóng chảy 237-240 oC
Huỳnh quang màu xanh lá cây.
-[α]D: -430o (0,084M/cloroform)
330
Hấp thụ UV cực đại trong mơi trƣờng ethanol: 265; 363 nm.

-Nhiệt độ nóng chảy 299 oC
-Huỳnh quang màu xanh tím.
-[α]D: -280o (0,1M/dimethyl
344
formamid)
-Hấp thụ UV cực đại trong môi trƣờng ethanol: 266; 265; 357 nm.

[22]

[22]

[22]


o

6

AFM2

C17H14O8

346

Nhiệt độ nóng chảy 293 C
-

-

Huỳnh quang màu tím.

Hấp thụ UV cực đại trong môi
trƯờng ethanol: 221; 264; 357
nm.

[22]


1.1.3. Điều kiện sinh aflatoxin
 Chủng giống:
Các loài nấm mốc có thể sinh aflatoxin gồm các lồi thuộc chi
Aspergillus, thuộc họ nấm cúc: A. flavus, A. arachidicola, A. bombycis, A.
minisclerotigenes, A. nomius, A. ochraceoroseus, A. parasiticus, A.
pseudotamarii, A. rambellii, trong đó A. flavus và A. parasiticus là hai chủng
nấm chủ yếu thƯờng gặp sinh aflatoxin B1 [12]. Hầu hết các chủng nấm
o

Aspergillus sinh trƯởng tốt trong điều kiện nhiệt độ 30-35 C và độ ẩm khơng
khí trên 55% trong khoảng pH rộng từ 3-10 trên những cơ chất giàu năng
lƯợng dạng tinh bột [6]. Tuy nhiên, sự có mặt của chủng nấm mốc sinh
aflatoxin không đồng nghĩa với nhiễm aflatoxin do sự tổng hợp aflatoxin còn
phụ thuộc vào nhiều yếu tố vật lý, hóa học và sinh học.

 Điều kiện môi trƯờng và cơ chất:
Các chất dinh dƯỡng cần thiết cho sự sinh trƯởng và phát triển của
nấm mốc và sự hình thành aflatoxin bao gồm: năng lƯợng (thƯờng dƯới
dạng tinh bột), vitamin, acid béo, amino acid và chất khoáng, đặc biệt cần có
mặt Kẽm (Zn). Vì thế, nhiễm độc aflatoxin thƯờng có trong những sản phẩm
nhiều tinh bột, các hạt có dầu nhƯ hạt bơng, đậu nành tỷ lệ nhiễm ít hơn [14].
Nhiệt độ và độ ẩm cũng ảnh hƯởng đến sự tạo thành aflatoxin. Nhiệt độ
o

tối thiểu và tối đa cho tổng hợp aflatoxin theo nghiên cứu lần lƯợt là 12 C và
o

o

42 C. Nhiệt độ tối Ưu để hình thành aflatoxin là 25-35 C, nhiệt độ tối Ưu
o

để tổng hợp aflatoxin B1 là 24-28 C. Độ ẩm cần thiết cho tổng hợp aflatoxin
của nấm mốc là trên 62%, hàm ẩm nông sản cho tổng hợp aflatoxin tối đa ở
nông
sản nhiều tinh bột là 18% và trong quả, hạt có dầu là 9-10% [10,14,21].
NhƯ vậy, khí hậu và điều kiện bảo quản ảnh hƯởng rất lớn đến sự
nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm. Các nƯớc nhiệt đới và cận nhiệt đới
trong đó có Việt nam có khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cao, mƯa nhiều phần lớn
18


thời gian trong năm, thƯờng có sản phẩm bị nhiễm aflatoxin nhiều hơn so với
các nƯớc ôn đới. Các nƯớc đang phát triển nhƯ ở khu vực Đông Nam Á,
Châu Phi...chƯa có nền nơng nghiệp hiện đại hóa với những điều kiện trồng

trọt và bảo quản chƯa đạt tiêu chuẩn làm tăng nguy cơ xuất hiện aflatoxin
trong các sản phẩm nơng nghiệp nói chung và dƯợc liệu nói riêng.
1.1.4. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin
Trong số các loại aflatoxin thì AFB1 là loại độc nhất và phổ biến nhất,
chiếm 60-80% tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lƯơng thực, thực phẩm.
AFB1 đƯợc chuyển hóa chủ yếu tại gan thành dạng có hoạt tính aflatoxin exo8,9-epoxide hoặc hydroxyl hóa thành AFM1 ít độc tính hơn bởi cytochrome
P450, một họ enzyme trong tế bào gan. Sự epoxide hóa AFB1 là một bƯớc
nguy hiểm gây nguy cơ đột biến gen và ung thƯ. Aflatoxin exo-8,9-epoxide là
một chất rất ái điện tử, không bền vững, nó liên kết ái lực cao với guanine
base trong DNA tạo thành aflatoxin-N7-guanine. Aflatoxin-N7-guanine
methyl hóa biến G thành T, gây đột biến gen và có thể là nguyên nhân dẫn
đến ung thƯ [13,19].
Aflatoxin exo-8,9-epoxide và sản phẩm hydrat hóa của nó là
dihydrodiol, gắn kết cộng hóa trị với DNA, RNA làm thay đổi cấu trúc và ảnh
hƯởng chức năng của acid nucleic và protein. Aflatoxin exo-8,9-epoxide còn
ức chế enzyme RNA polymerase và ribosomal translocase, ảnh hƯởng đến
quá trình phiên mã và dịch mã [12].
AFB1 ức chế enzyme glycogen synthetase và transglycosylase làm
giảm glycogen ở gan và tăng glucose trong máu. AFB1 ức chế
phosphoglucomutase – một enzyme xúc tác thuận nghịch phản ứng chuyển
G6P Glucose-6-phosphate thành Glucose-1-phosphate, dẫn đến tích lũy G6P
Glucose-6-phosphate và giảm tổng hợp glycogen [12].


Aflatoxin còn ảnh hƯởng đến DNA và cấu trúc ty thể. Aflatoxin-8,9epoxide Ưu tiên gắn vào DNA của ty thể hơn là DNA nhân tế bào cản trở sản
xuất ATP làm mất chức năng tổng hợp năng lƯợng dƯới dạng ATP của ty thể
và gây tăng chết tế bào theo chƯơng trình (apoptosis) [12,13].
1.1.5. Độc tính của aflatoxin lên cơ thể ngƯời
Aflatoxicosis là tình trạng bệnh lý do nhiễm độc aflatoxin, ở ngƯời
phơi nhiễm với aflatoxin có thể xảy ra aflatoxicosis cấp hoặc mạn tính [9,13].

Độc tính cấp bao gồm: sốt cao, xuất huyết, tổn thƯơng gan cấp với biểu
hiện nhiễm độc gan nặng (tỷ lệ tử vong 25%), phù, rối loạn tiêu hóa, rối loạn
hấp thu và/hoặc chuyển hóa chất dinh dƯỡng, thậm chí có thể gây tử vong.
Aflatoxicosis nguyên phát cấp tính xuất hiện khi phơi nhiễm với lƯợng trung
bình đến lƯợng lớn aflatoxin [12,14].
Độc tính mạn của aflatoxin B1 do tiêu thụ lƯợng thấp đến trung bình
aflatoxin, thƯờng khơng có biểu hiện lâm sàng và khó nhận ra. Sau thời gian
phơi nhiễm kéo dài, AFB1 có thể gây quái thai và tật nguyền bẩm sinh; đột
biến gen làm thay đổi mã gen và DNA, phá vỡ nhiễm sắc thể, tái sắp xếp các
mảnh nhiễm sắc thể, tăng thêm hoặc mất hoàn toàn nhiễm sắc thể; gây ung
thƯ trong đó HCC (ung thƯ biểu mơ tế bào gan) là loại ung thƯ thƯờng gặp
do AFB1 [12,14].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng những thức ăn nhiễm độc AFB1 là
yeus tố nguy cơ chính dẫn đến ung thƯ gan. IARC phân loại AFB1 là tác nhân
gây HCC nhóm I [23]. Cơ chế HCC do AFB1 đƯợc chứng minh là do đột biến
gen p53 – gen ức chế khối u. Một số nghiên cứu tại Trung Quốc và Nam Phi
cho thấy có đột biến ở codon 249 (guanine (G) thành thymine (T), kết quả là
argenine (R) chuyển thành serine (S)), exon 7 trên gen p53 ở những bệnh
nhân HCC [14]. Nguy cơ mắc HCC tăng lên khi đồng phơi nhiễm với AFB1
và virus HBV hoặc HCV [27]. Ở những cá thể có HbsAg dƯơng tính,
aflatoxin có tiềm năng gây độc gấp 30 lần ở những ngƯời không nhiễm virus.


Nhiễm HBV tăng nguy cơ ung thƯ gan lên 5 lần trong khi đồng phơi nhiễm
virus HBV và aflatoxin tăng nguy cơ ung thƯ gan lên 60 lần [17]. Ngoài ra
ung thƯ phổi do AFB1 cũng đƯợc báo cáo ở những ngƯời phơi nhiễm kéo
dài với sản phẩm đã nhiễm độc aflatoxin qua đƯờng hơ hấp [19].
AFB1 cịn đƯợc báo cáo có liên quan đến hội chứng giống nhƯ hội
chứng Reye ở trẻ em với những triệu chứng nhƯ ho, sốt, thay đổi trƯơng
lực cơ, nôn. Giải phẫu cho thấy hình ảnh gan to nhiễm mỡ, phù não, thối hóa

mỡ nội tạng, thối hóa thần kinh. Khi gan bị tổn thƯơng do AFB1 dẫn
đến amoniac – sản phẩm chuyển hóa protein và acid amin – không đƯợc giải
độc khỏi cơ thể, đạt nồng độ cao trong cơ thể, đi qua hàng rào máu não và
gây hội chứng não gan [12].
Do có độc tính cao, nhiều quốc gia đã đƯa ra các quy định để kiểm soát
hàm lƯợng aflatoxin trong thực phẩm và các sản phẩm nơng nghiệp có nguy
cơ lây nhiễm cao. Trong DƯợc điển Trung Quốc 2015 và DƯợc điển Hồng
Kông, quy định giới hạn tổng hàm lƯợng aflatoxin (AFG1, AFG2, AFB1,
AFB2) trong dƯợc liệu không đƯợc quá 10 µg/kg và hàm lƯợng AFB1
không đƯợc quá 5 µg/kg. Liên minh châu Âu (EU) quy định tổng hàm
lƯợng aflatoxin không đƯợc q 4 µg/kg và hàm lƯợng AFB1 khơng q
2 µg/kg [18].
Thep FDA, nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm nông nghiệp và dƯợc
liệu là khó tránh khỏi, hàng năm có rất nhiều ngƯời có nguy cơ phơi nhiễm
với aflatoxin. Tuy nhiên, nguy cơ nhiễm độc và độc tính aflatoxin có thể đƯợc
giảm tới mức tối thiểu nhờ các phƯơng pháp kiểm soát và phát hiện aflatoxin
trong sản phẩm và dƯợc liệu.
1.1.6. Những nghiên cứu về phƯơng pháp định lƯợng aflatoxin trong
dƯợc liệu


Bảng 1. 2. Một số nghiên cứu định lượng aflatoxin trong và ngồi nước

TT

PhƯơng pháp

PhƯơng

phân tích

pháp chiết

Dung mơi chiết Điều kiện sắc ký

I

TLTK

+ Pha tĩnh: LiChrocart C18 short column

pháp chiết
LC-MS/MS

lạnh +
chiết pha
rắn để làm

(30mm × 4 mm, 3ϻm)
methanol :

nƯớc (30:70)

v/v)

+ Tốc độ dòng: 1mL/phút

pháp chiết
LC-FLD

lạnh +
chiết pha
rắn để làm
giàu

aflatoxin B1, B2,
G1, G2 trên nến mẫu

[26]

Rhammus purshiana

+ Detector phát hiện: ESI (+) - SIM

methanol :
PhƯơng

+ Pha động: methanol –

nƯớc (80:20,

giàu

2

lƯợng

Các nghiên cứu trên Thế giới
PhƯơng

1

Hoạt chất định

nƯớc (70:30,
v/v), methanol:
nƯớc (80:20,
v/v) và
methanol :
nitric acid1%

+ Pha tĩnh: Scharlau Chemie C18

aflatoxin B1, B2,

column (250 × 4.6 mm i.d.)

G1, G2 trên các nền

+ Pha động: methanol:nƯớc (52:48, v/v)

mẫu nhƯ Valeriana

với 119 mg/L Kali bromide và 100µL/L

officinalis,

acid nitric 65%.

Hypericum

+ Tốc độ dịng: 1,2 mL/phút

perforatum, Cassia

+ Detector phát hiện: máy dị huỳnh

angustifolia,

quang FP-1520, bƯớc sóng kích thích

Mentha pulegium và

và

22

[16]


(70:30, v/v)

phát xạ tƯơng ứng là 365 và 435nm.

Chrysanthemum
parthenium

+ Pha tĩnh: Shim-Pack CLC – ODS
Column (5µm, 4.6 x 250 mm)
+ Pha động: dung dịch khử ion hon hợp

PhƯơng
pháp chiết
3

LC-FLD

lạnh +
chiết pha
rắn để làm

nƯớc-acetonitrile-methanol (60:20:20,

methanol :
nƯớc
(85:15, v/v)

v/v/v) bổ sung 350 µL HNO3 4M and
120 mg KBr.
+ Tốc độ dòng: 1 mL/phút

AFB1 trong thuốc
từ thảo dƯợc và

[24]

dƯợc liệu

+ Detector phát hiện: máy dị huỳnh

giàu

quang Shimadzu LC-10 AD Model,
bƯớc sóng kích thích và phát xạ
tƯơng ứng là 360 và 435nm.

II

Các nghiên cứu trong nƯớc
PhƯơng

4

LC-MS

+ Pha tĩnh: Betabasic 18 (2,0mm x

pháp chiết

methanol :

lạnh +

nƯớc

chiết pha

(85:15, v/v)

rắn để làm

50mm, 5ϻm)
+ Pha động: kênh A: nƯớc; kênh
B: methanol; chạy chế độ
Gradient.

Các loại aflatoxin
trong dƯợc liệu

[2]


giàu

+ Detector phát hiện: ESI (+) - SIM
+ Pha tĩnh: cột C18 Acquity UPLC BEH

PhƯơng

(2,1x100 mm, 1,7ϻm)

pháp chiết
5

LC-MS

lạnh +
chiết pha
rắn để làm
giàu

methanol :
nƯớc (6:4,
v/v)

+ Pha động: kênh A: amoni acetat
10mM; kênh B: methanol; chạy chế độ
Gradient.
+ Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút
+ Detector phát hiện: ESI (+) - SIM

aflatoxin B1 trong
dƯợc liệu

[7]


 Nhận xét:
Từ những nghiên cứu trên, ta có thể thấy hiện nay trong nƯớc và trên
thế giới nhiều tác giả đã tiến hành xây dựng phƯơng pháp định lƯợng
aflatoxin trong nhiều nền mẫu dƯợc liệu khác nhau. Tuy nhiên, trong nƯớc
hiện tại các nghiên cứu công bố cho thấy quy trình xử lý mẫu trải qua nhiều
cơng đoạn, tốn nhiều thời gian nên hiệu suất còn chƯa đƯợc cao. Vì vậy,
nhằm đƯa ra đƯợc phƯơng pháp định lƯợng aflatoxin trong dƯợc liệu với
hiệu suất thu hồi cao và phƯơng pháp đơn giản, cũng nhƯ tiết kiệm thời
gian hơn, chúng tôi đề xuất đề tài “Xây dựng phƯơng pháp định lƯợng
aflatoxin trong dƯợc liệu bằng LC-MS/MS”, áp dụng để xác định hàm
lƯợng aflatoxin trong một số dƯợc liệu.

25