Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC MS MS

VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC

ine

an

dP
ha
rm

ac
y,

----------------

M

ed
ic

HÀ ANH TUẤN

of

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP

ho

ol

ĐỊNH LƢỢNG AFLATOXIN

@

Sc

TRONG DƢỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS

Co

py

rig

ht

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Hà Nội – 2019


VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

dP
ha

rm

----------------

ac
y,

KHOA Y DƢỢC

an

HÀ ANH TUẤN

ine

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP

ed
ic

ĐỊNH LƢỢNG AFLATOXIN

of

M

TRONG DƢỢC LIỆU BẰNG LC-MS/MS

ho
ol

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Sc

KHÓA: QH.2014.Y

Ngƣời hƣớng dẫn 2: TS. Nguyễn Hữu Tùng

Co

py

rig

ht

@

Ngƣời hƣớng dẫn 1: TS. Nguyễn Thị Phƣơng

Hà Nội – 2019


LỜI CẢM ƠN

VN
U

Bản luận văn này đƣợc hoàn thành tại Khoa Hóa phân tích – Tiêu

chuẩn, Viện Dƣợc liệu dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Thị Phƣơng và
TS. Nguyễn Hữu Tùng.

ac
y,

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Phƣơng
(Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu) và TS. Nguyễn Hữu

dP
ha
rm

Tùng (Bộ môn Hóa dƣợc và kiểm nghiệm, Khoa Y Dƣợc - ĐHQGHN) là
những ngƣời thầy đã hƣớng dẫn, chỉ bảo, góp ý và đƣa ra những ý kiến
quý báu để em hoàn thiện khóa luận.

an

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Phƣơng Thiện Thƣơng (Trƣởng
khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu) cùng với các anh chị,bạn

ine

bè, cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu đã

ed
ic

giúp đỡ em, đặc biệt là anh Nguyễn Đình Quân - ngƣời đã luôn theo sát,

hƣớng dẫn cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

M

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Khoa Y – Dƣợc đã

of

dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trƣờng.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn ở

ho
ol

bên cạnh, ủng hộ, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và
hoàn thành khóa luận.

Sc

Cuối cùng, em xin chúc các thầy cô mạnh khỏe, hạnh phúc và thành

Hà Nội, ngày 16 tháng 04 năm 2019
Sinh viên

Co

py

rig

ht

@

công trong công việc cũng nhƣ trong cuộc sống.

Hà Anh Tuấn


VN
U

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG

ac
y,

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

dP
ha
rm

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................. 2
1.1. Tổng quan về aflatoxin ......................................................................... 2
1.1.1. Giới thiệu về aflatoxin.................................................................... 2

an

1.1.2. Tính chất hóa lý .............................................................................. 2

ine

1.1.3. Điều kiện sinh aflatoxin ................................................................. 7

ed
ic

1.1.4. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin ....................................................... 8
1.1.5. Độc tính của aflatoxin lên cơ thể ngƣời ......................................... 9

M

1.1.6. Những nghiên cứu về phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong

of

dƣợc liệu.................................................................................................... 10

ho
ol

1.2. Tổng quan về sắc ký ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng – khối phổ (LCMS/MS) ........................................................................................................ 15

Sc

1.2.1. Sắc ký ái lực miễn dịch ................................................................ 15

@

1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ .................................................................... 16
CHƢƠNG2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 21

rig

ht

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ......................................................................... 21

py

2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị ............................................................ 21

Co

2.2.1. Chất chuẩn ...................................................................................... 21
2.2.2. Hóa chất .......................................................................................... 21

1


2.2.3. Thiết bị, dụng cụ ............................................................................. 22

VN
U

2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 22

2.3.1. Thu thập mẫu nghiên cứu ............................................................... 22

ac
y,

2.3.2. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu ....... 22
2.3.3. Áp dụng phƣơng pháp đánh giá hàm lƣợng aflatoxin trong các mẫu

dP
ha
rm

dƣợc liệu giàu tinh bột trên thị trƣờng Hà Nội ......................................... 23
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 23
2.4.1. Phƣơng pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử ............................... 23

an

2.4.2. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc kí ................................................ 23
2.4.3. Quy trình thẩm định phƣơng pháp .................................................. 23

ine

2.4.3.1. Tính đặc hiệu/ chọn lọc................................................................ 23

ed
ic

2.4.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lƣợng (LOQ) ............. 24

M

2.4.3.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn ............................................. 24
2.4.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi................................................................ 25

of

2.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................. 26

ho
ol

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................... 27

Sc

3.1. Khảo sát điều kiện khối phổ.................................................................. 27
3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký...................................................................... 29

@

3.2.1. Lựa chọn pha tĩnh ........................................................................... 29

ht

3.2.2. Khảo sát pha động........................................................................... 30

rig

3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ................................................................ 33

Co

py

3.3.1. Khảo sát dung môi chiết mẫu ......................................................... 33
3.3.2. Khảo sát dung môi làm sạch ........................................................... 34

3.4. Thẩm định phƣơng pháp ....................................................................... 35
2


3.4.1. Độ chọn lọc của phƣơng pháp ........................................................ 35

VN
U

3.4.2. Tính phù hợp hệ thống .................................................................... 36
3.4.3. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính ................................................ 37

ac
y,

3.4.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) ............. 39
3.4.5. Độ lặp lại và độ thu hôi................................................................... 40

dP
ha
rm

3.5. Áp dụng phƣơng pháp đánh giá hàm lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu. 42
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

TÀI LIỆU THAM KHẢO

3


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AF

Aflatoxin

AFB1

Aflatoxin B1

AFB2

Aflatoxin B2

AFG1

Aflatoxin G1

AFG2

Aflatoxin G2

AFM1

Aflatoxin M1

AFM2

Aflatoxin M2

Hiệp hội các nhà phân

Chemists

tích hóa học

Capillary Electrophoresis – Mass

ine

CE/MS

Spectrometry

ed
ic

CTCT
CTPT

Assay

kết với enzyme

Electrospray Ionization

Ion hóa bằng tia điện tử

M

of

@

gan
Sắc ký lỏng hiệu năng

Chromatography

cao

chromatography- Fluorescence

rig

Ung thƣ biểu mô tế bào

High Performance Liquid

HPLC-FLD

py
Co

Hepatocellular carcinoma

High performance liquid

IARC

Công thức phân tử
Kỹ thuật miễn dịch liên

ht

HPLC

Công thức cấu tạo

Enzyme – Linked Immuno Sorbent

Sc

ESI

khối phổ

Hệ số biến thiên

ho
ol

ELISA

Điện di mao quản –

Coefficient of Variation

CV%

HCC

dP
ha
rm

Association of Official Analytical

an

AOAC

Tiếng Việt

VN
U

Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học

ac
y,

Ký hiệu

Detection
International Agency for Research

1

Sắc ký lỏng hiệu năng
cao đầu dò huỳnh quang
Cơ quan nghiên cứ ung


Liquid Chromatography Mass

LC-MS

Spectrometry

Sắc ký lỏng khối phổ

Liquid Chromatography tandem

Sắc ký lỏng khối phổ

Mass Spectrometry

hai lần

ac
y,

LC-MS/MS

VN

U

thƣ quốc tế

on Cancer

Limit of detetion

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantitation

Giới hạn định lƣợng

MeOH

Methanol

PBS

Phosphate-Buffered Saline

R%

Recovery

RSD

Relative Standard Deviation

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

SPE

Solid phase extract

Chiết pha rắn

SPE-IM

Solid phase extract-Immuno

TLC

Thin layer chromatography

ho
ol

of

M

ed

ic

ine

an

dP
ha
rm

LOD

TLPT

phosphat

Độ thu hồi

Độ lệch chuẩn tƣơng
đối

Chiết pha rắn với cột ái
lực miễn dịch
Sắc ký lớp mỏng
Trọng lƣợng phân tử
Tài liệu tham khảo

Co

py

rig

ht

@

Sc

TLTK

Dung dịch đệm

2


DANH MỤC CÁC BẢNG

VN
U

Bảng 1. 1. Tính chất của một vài aflatoxin ....................................................... 4
Bảng 1. 2. Một số nghiên cứu định lượng aflatoxin trong và ngoài nước...... 11
Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu mua........................................................21

ac
y,

Bảng 3.1. Thông số MS tối ưu......................................................................28

Bảng 3. 2. Một số chương trình gradient khảo sát ......................................... 30

dP
ha
rm

Bảng 3. 3. Các thông số sắc ký ứng với chương trình gradient 2 .................. 32
Bảng 3. 4. Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi khác nhau. 34
Bảng 3. 5. Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi làm sạch ... 35
Bảng 3. 6. Ion mẹ và ion con của các aflatoxin .............................................. 35

an

Bảng 3. 7. Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp .......... 37

ine

Bảng 3. 8. Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc của các chất ... 38
Bảng 3. 9. Kết quả xác định LOD và LOQ của phương pháp ........................ 40

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

Bảng 3. 10. Độ lặp lại và độ thu hồi của aflatoxin trên nền mẫu dược liệu .. 41

3


DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

VN
U

Hình 1.1. Sơ đồ khối của máy khối phổ..........................................................18
Hình 1.2. Bộ phân tích tử cực chập ba ........................................................... 19

ac
y,

Hình 3.1. Phổ khối của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 quan sát dưới chế độ

ESI-positive ...................................................................................................28

dP
ha
rm

Hình 3. 2. Phổ khối của ion con các aflatoxin...............................................29
Hình 3. 3. Sắc ký đồ chương trình gradient 1 ................................................. 31
Hình 3. 4. Sắc ký đồ chương trình gradient 2 ................................................. 31
Hình 3. 5. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp ........................ 36

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

Hình 3. 6. Đường chuẩn của các độc tố aflatoxin .......................................... 39

4


ĐẶT VẤN ĐỀ

VN
U

Trong những năm gần đây, dƣợc liệu cũng nhƣ các sản phẩm từ dƣợc
liệu đƣợc nhân dân sử dụng ngày càng nhiều. Để đảm bảo ngƣời dân đƣợc sử
dụng những sản phẩm tốt nhất, cũng nhƣ an toàn cho sức khỏe, ngoài việc

ac
y,

đảm bảo các tiêu chí trong Dƣợc điển các sản phầm này cũng nên đƣợc kiểm
tra đánh giá mức độ ô nhiễm các độc tố nấm, trong đó phổ biến nhất là

dP
ha
rm

aflatoxin. Hiện nay trên thế giới nhiều tác giả đã tiến hành xây dựng phƣơng
pháp định lƣợng aflatoxin trong nhiều nền mẫu dƣợc liệu khác nhau. Tuy
nhiên, trong nƣớc hiện tại các nghiên cứu công bố cho thấy quy trình xử lý
mẫu trải qua nhiều công đoạn, tốn nhiều thời gian nên hiệu suất còn chƣa

an

đƣợc cao. Vì vậy, nhằm đƣa ra đƣợc phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong

ine

dƣợc liệu với hiệu suất thu hồi cao và phƣơng pháp đơn giản, cũng nhƣ tiết
kiệm thời gian hơn, chúng tôi đề xuất đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định

ed
ic

lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu bằng LC-MS/MS”, áp dụng để xác định
hàm lƣợng aflatoxin trong một số dƣợc liệu với mục tiêu:

M

- Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời 4 độc tố

of

aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) trong dƣợc liệu bằng phƣơng pháp

ho

ol

LC-MS/MS sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn với cột ái lực miễn dịch (SPE-IM).
- Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng đánh giá mức độc ô nhiễm một số

Co

py

rig

ht

@

Sc

aflatoxin trên các mẫu dƣợc liệu thu mua trên thị trƣờng Hà Nội.

1


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
Tổng quan về aflatoxin

VN
U

1.1.

1.1.1. Giới thiệu về aflatoxin

Aflatoxin đƣợc phát hiện và phân lập lần đầu tiên vào năm 1960 sau sự

ac
y,

kiện Bệnh Gà tây X ở Anh làm chết hơn 100.000 con gà tây. Những con gà
tây này bị hoại tử gan sau khi đƣợc cho ăn lạc mốc và aflatoxin đƣợc xác định

dP
ha
rm

là nguyên nhân gây bệnh [15,25].

Aflatoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp đƣợc sản xuất bởi một vài
loại vi nấm, đặc biệt là nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus.
Nấm mốc có thể phát triển và sinh aflatoxin trƣớc và sau khi thu hoạch, khi

an

bảo quản cũng nhƣ chế biến. Nhiều nông sản có thể bị nhiễm aflatoxin nhƣ

ine

ngũ cốc, lúa gạo; các loại hạt có dầu nhƣ hạt đậu, hạt hƣớng dƣơng, bông; các
loại gia vị nhƣ ớt , hạt tiêu, nghệ, gừng; hạnh nhân, quả óc chó và sữa cùng

ed

ic

các sản phẩm từ sữa (bơ, pho mát...) [10,20].

M

Aflatoxin là một nhóm chất gồm các chất có cấu tạo tƣơng tự nhau và
đều là dẫn chất của difuranocoumarin, đƣợc tổng hợp nhờ con đƣờng

of

polyketide. Ngày nay, ngƣời ta đã xác định đƣợc khoảng 20 loại aflatoxin

ho
ol

trong đó 6 loại aflatoxin quan trọng nhất lần lƣợt là B1, B2, M1, M2, G1 và G2
[27]. Aflatoxin B1là loại aflatoxin độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80%

Sc

tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lƣơng thực, thực phẩm. Thông thƣờng, nếu
không có aflatoxin B1 thì cũng sẽ không có AFB2, AFG1 và AFG2 [10,14].

@

1.1.2. Tính chất hóa lý

ht

Aflatoxin hòa tan trong dung môi phân cực nhẹ nhƣ cloroform,

rig

methanol, dimethyl sulfoxid. Độ tan của aflatoxin trong nƣớc vào khoảng 10–

py

20 mg/l. Dung dịch aflatoxin trong dung môi cloroform hay benzen có thể

Co

đƣuọc trong nhiều năm nếu bảo quản ở điều kiện lạnh và tối [3].

2


Ở nhiệt độ đun nấu thông thƣờng không thể phân hủy đƣợc aflatoxin,

VN
U

nhƣng dƣới ánh sáng tử ngoại các aflatoxin bị phân hủy. Trong công thức cấu
tạo có vòng lacton nội phân tử, nên các aflatoxin dễ bị phân hủy bởi base
mạnh và nếu tiếp tục acid hóa nhẹ thì aflatoxin ban đầu đƣợc tái tạo [3].

ac
y,

Các aflatoxin phát huỳnh quang rất mạnh, dựa vào tính chất này ta có

thể phát hiện chúng ở nồng độ rất thấp (trên sắc ký đồ lớp mỏng có thể phát

dP
ha
rm

hiện với lƣợng chất khoảng 0,5ng hay nhỏ hơn). Đây chính là cơ sở hóa lý

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

cho việc phát hiện và định lƣợng các hợp chất này [3].

3


U
N
,V

Bảng 1. 1. Tính chất của một vài aflatoxin

STT

1

Loại
aflatoxin

CTPT

AFB1

C17H12O6

TLPT

Tính chất

(đvC)
-

Nhiệt độ nóng chảy 268-269 oC

-

Huỳnh quang màu xanh da trời.
-

312

[α]D: -480o (0,1M/dimethyl

n
i
ic

formamid)
-

n
a
e

h
P
d

m
r
a

y
c
a

CTCT

TLTK

[22]

ed

Hấp thụ UV cực đại trong môi
trƣờng ethanol: 223; 265; 362 nm.

2

AFB2

C17H14O6

@
t
h

Sc

ho

ol

314

-

M
f
o

Nhiệt độ nóng chảy 286-289 oC

Huỳnh quang màu xanh da trời.

-

[α]D: -492o (0,1M/cloroform)

-

Hấp thụ UV cực đại trong môi
trƣờng ethanol: 265; 363 nm.

p
o
C

g
i
r
y

4

[22]


3

AFG1

C17H12O7

328

U
N
,V

o

-

Nhiệt độ nóng chảy 244-246 C

-

Huỳnh quang màu xanh lá cây.
-

[α]D: -556o (0,1M/cloroform)

-

Hấp thụ UV cực đại trong môi

y
c
a

h
P
d

trƣờng ethanol: 243; 257; 264;
362nm.

4

AFG2

C17H14O7

330

n

a
e

-

Nhiệt độ nóng chảy 237-240 oC

-

Huỳnh quang màu xanh lá cây.

-

[α]D: -430o (0,084M/cloroform)

-

Hấp thụ UV cực đại trong môi

M
f
o

m
r
a

[22]

n

i
ic

ed

[22]

trƣờng ethanol: 265; 363 nm.

5

AFM1

@
t
h

g
i
r
y

p
o
C

C17H12O8

Sc

ho

ol

-

344

Nhiệt độ nóng chảy 299 oC

-

Huỳnh quang màu xanh tím.

-

[α]D: -280o (0,1M/dimethyl
formamid)

-

Hấp thụ UV cực đại trong môi
trƣờng ethanol: 266; 265; 357 nm.

5

[22]


AFM2

C17H14O8

-

346

-

y
c
a

Nhiệt độ nóng chảy 293 oC

6

U
N
,V

Huỳnh quang màu tím.

Hấp thụ UV cực đại trong môi
trƣờng ethanol: 221; 264; 357 nm.

h
P
d

n
a
e

l
o
o

@
t
h

M
f
o

n
i
ic

ed

h
c
S

p
o
C

g
i
r
y

6

m
r
a

[22]


1.1.3. Điều kiện sinh aflatoxin

VN
U

 Chủng giống:

Các loài nấm mốc có thể sinh aflatoxin gồm các loài thuộc chi

ac
y,

Aspergillus, thuộc họ nấm cúc: A. flavus, A. arachidicola, A. bombycis, A.
minisclerotigenes, A. nomius, A. ochraceoroseus, A. parasiticus, A.
pseudotamarii, A. rambellii, trong đó A. flavus và A. parasiticus là hai chủng

dP
ha
rm

nấm chủ yếu thƣờng gặp sinh aflatoxin B1 [12]. Hầu hết các chủng nấm
Aspergillus sinh trƣởng tốt trong điều kiện nhiệt độ 30-35oC và độ ẩm không
khí trên 55% trong khoảng pH rộng từ 3-10 trên những cơ chất giàu năng
lƣợng dạng tinh bột [6]. Tuy nhiên, sự có mặt của chủng nấm mốc sinh

an

aflatoxin không đồng nghĩa với nhiễm aflatoxin do sự tổng hợp aflatoxin còn

ine

phụ thuộc vào nhiều yếu tố vật lý, hóa học và sinh học.

ed
ic

 Điều kiện môi trƣờng và cơ chất:

Các chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm

M

mốc và sự hình thành aflatoxin bao gồm: năng lƣợng (thƣờng dƣới dạng tinh
bột), vitamin, acid béo, amino acid và chất khoáng, đặc biệt cần có mặt Kẽm

of

(Zn). Vì thế, nhiễm độc aflatoxin thƣờng có trong những sản phẩm nhiều tinh

ho
ol

bột, các hạt có dầu nhƣ hạt bông, đậu nành tỷ lệ nhiễm ít hơn [14].
Nhiệt độ và độ ẩm cũng ảnh hƣởng đến sự tạo thành aflatoxin. Nhiệt độ

Sc

tối thiểu và tối đa cho tổng hợp aflatoxin theo nghiên cứu lần lƣợt là 12oC và

@

42oC. Nhiệt độ tối ƣu để hình thành aflatoxin là 25-35oC, nhiệt độ tối ƣu để
tổng hợp aflatoxin B1 là 24-28oC. Độ ẩm cần thiết cho tổng hợp aflatoxin của

ht

nấm mốc là trên 62%, hàm ẩm nông sản cho tổng hợp aflatoxin tối đa ở nông

py

rig

sản nhiều tinh bột là 18% và trong quả, hạt có dầu là 9-10% [10,14,21].
Nhƣ vậy, khí hậu và điều kiện bảo quản ảnh hƣởng rất lớn đến sự

Co

nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm. Các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới
trong đó có Việt nam có khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cao, mƣa nhiều phần lớn

7


thời gian trong năm, thƣờng có sản phẩm bị nhiễm aflatoxin nhiều hơn so với

VN
U

các nƣớc ôn đới. Các nƣớc đang phát triển nhƣ ở khu vực Đông Nam Á, Châu
Phi...chƣa có nền nông nghiệp hiện đại hóa với những điều kiện trồng trọt và
sản phẩm nông nghiệp nói chung và dƣợc liệu nói riêng.
1.1.4. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin

ac
y,

bảo quản chƣa đạt tiêu chuẩn làm tăng nguy cơ xuất hiện aflatoxin trong các

dP
ha
rm

Trong số các loại aflatoxin thì AFB1 là loại độc nhất và phổ biến nhất,
chiếm 60-80% tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lƣơng thực, thực phẩm.
AFB1 đƣợc chuyển hóa chủ yếu tại gan thành dạng có hoạt tính aflatoxin exo8,9-epoxide hoặc hydroxyl hóa thành AFM1 ít độc tính hơn bởi cytochrome

an

P450, một họ enzyme trong tế bào gan. Sự epoxide hóa AFB1 là một bƣớc

ine

nguy hiểm gây nguy cơ đột biến gen và ung thƣ. Aflatoxin exo-8,9-epoxide là
một chất rất ái điện tử, không bền vững, nó liên kết ái lực cao với guanine

ed
ic

base trong DNA tạo thành aflatoxin-N7-guanine. Aflatoxin-N7-guanine
đến ung thƣ [13,19].

M

methyl hóa biến G thành T, gây đột biến gen và có thể là nguyên nhân dẫn

of

Aflatoxin exo-8,9-epoxide và sản phẩm hydrat hóa của nó là

ho
ol

dihydrodiol, gắn kết cộng hóa trị với DNA, RNA làm thay đổi cấu trúc và ảnh
hƣởng chức năng của acid nucleic và protein. Aflatoxin exo-8,9-epoxide còn

Sc

ức chế enzyme RNA polymerase và ribosomal translocase, ảnh hƣởng đến
quá trình phiên mã và dịch mã [12].

@

AFB1 ức chế enzyme glycogen synthetase và transglycosylase làm

ht

giảm glycogen ở gan và tăng glucose trong máu. AFB1 ức chế

rig

phosphoglucomutase – một enzyme xúc tác thuận nghịch phản ứng chuyển
G6P Glucose-6-phosphate thành Glucose-1-phosphate, dẫn đến tích lũy G6P

Co

py

Glucose-6-phosphate và giảm tổng hợp glycogen [12].

8


Aflatoxin còn ảnh hƣởng đến DNA và cấu trúc ty thể. Aflatoxin-8,9-

VN
U

epoxide ƣu tiên gắn vào DNA của ty thể hơn là DNA nhân tế bào cản trở sản
xuất ATP làm mất chức năng tổng hợp năng lƣợng dƣới dạng ATP của ty thể
1.1.5. Độc tính của aflatoxin lên cơ thể ngƣời

ac
y,

và gây tăng chết tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) [12,13].

Aflatoxicosis là tình trạng bệnh lý do nhiễm độc aflatoxin, ở ngƣời

dP
ha
rm

phơi nhiễm với aflatoxin có thể xảy ra aflatoxicosis cấp hoặc mạn tính [9,13].
Độc tính cấp bao gồm: sốt cao, xuất huyết, tổn thƣơng gan cấp với biểu
hiện nhiễm độc gan nặng (tỷ lệ tử vong 25%), phù, rối loạn tiêu hóa, rối loạn
hấp thu và/hoặc chuyển hóa chất dinh dƣỡng, thậm chí có thể gây tử vong.

an

Aflatoxicosis nguyên phát cấp tính xuất hiện khi phơi nhiễm với lƣợng trung

ine

bình đến lƣợng lớn aflatoxin [12,14].

Độc tính mạn của aflatoxin B1 do tiêu thụ lƣợng thấp đến trung bình

ed
ic

aflatoxin, thƣờng không có biểu hiện lâm sàng và khó nhận ra. Sau thời gian
phơi nhiễm kéo dài, AFB1 có thể gây quái thai và tật nguyền bẩm sinh; đột

M

biến gen làm thay đổi mã gen và DNA, phá vỡ nhiễm sắc thể, tái sắp xếp các

of

mảnh nhiễm sắc thể, tăng thêm hoặc mất hoàn toàn nhiễm sắc thể; gây ung

AFB1 [12,14].

ho
ol

thƣ trong đó HCC (ung thƣ biểu mô tế bào gan) là loại ung thƣ thƣờng gặp do
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng những thức ăn nhiễm độc AFB1 là

Sc

yeus tố nguy cơ chính dẫn đến ung thƣ gan. IARC phân loại AFB1 là tác nhân

@

gây HCC nhóm I [23]. Cơ chế HCC do AFB1 đƣợc chứng minh là do đột biến

gen p53 – gen ức chế khối u. Một số nghiên cứu tại Trung Quốc và Nam Phi

ht

cho thấy có đột biến ở codon 249 (guanine (G) thành thymine (T), kết quả là

rig

argenine (R) chuyển thành serine (S)), exon 7 trên gen p53 ở những bệnh

py

nhân HCC [14]. Nguy cơ mắc HCC tăng lên khi đồng phơi nhiễm với AFB1

Co

và virus HBV hoặc HCV [27]. Ở những cá thể có HbsAg dƣơng tính,
aflatoxin có tiềm năng gây độc gấp 30 lần ở những ngƣời không nhiễm virus.

9


Nhiễm HBV tăng nguy cơ ung thƣ gan lên 5 lần trong khi đồng phơi nhiễm

VN
U

virus HBV và aflatoxin tăng nguy cơ ung thƣ gan lên 60 lần [17]. Ngoài ra
ung thƣ phổi do AFB1 cũng đƣợc báo cáo ở những ngƣời phơi nhiễm kéo dài
với sản phẩm đã nhiễm độc aflatoxin qua đƣờng hô hấp [19].

ac
y,

AFB1 còn đƣợc báo cáo có liên quan đến hội chứng giống nhƣ hội
chứng Reye ở trẻ em với những triệu chứng nhƣ ho, sốt, thay đổi trƣơng lực

dP
ha
rm

cơ, nôn. Giải phẫu cho thấy hình ảnh gan to nhiễm mỡ, phù não, thoái hóa mỡ
nội tạng, thoái hóa thần kinh. Khi gan bị tổn thƣơng do AFB1 dẫn đến
amoniac – sản phẩm chuyển hóa protein và acid amin – không đƣợc giải độc
khỏi cơ thể, đạt nồng độ cao trong cơ thể, đi qua hàng rào máu não và gây hội

an

chứng não gan [12].

ine

Do có độc tính cao, nhiều quốc gia đã đƣa ra các quy định để kiểm soát
hàm lƣợng aflatoxin trong thực phẩm và các sản phẩm nông nghiệp có nguy

ed
ic

cơ lây nhiễm cao. Trong Dƣợc điển Trung Quốc 2015 và Dƣợc điển Hồng
Kông, quy định giới hạn tổng hàm lƣợng aflatoxin (AFG1, AFG2, AFB1,

M

AFB2) trong dƣợc liệu không đƣợc quá 10 µg/kg và hàm lƣợng AFB1 không

of

đƣợc quá 5 µg/kg. Liên minh châu Âu (EU) quy định tổng hàm lƣợng

ho
ol

aflatoxin không đƣợc quá 4 µg/kg và hàm lƣợng AFB1 không quá 2 µg/kg
[18].

Thep FDA, nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm nông nghiệp và dƣợc

Sc

liệu là khó tránh khỏi, hàng năm có rất nhiều ngƣời có nguy cơ phơi nhiễm

@

với aflatoxin. Tuy nhiên, nguy cơ nhiễm độc và độc tính aflatoxin có thể đƣợc

ht

giảm tới mức tối thiểu nhờ các phƣơng pháp kiểm soát và phát hiện aflatoxin

rig

trong sản phẩm và dƣợc liệu.

dƣợc liệu

Co

py

1.1.6. Những nghiên cứu về phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong

10


Bảng 1. 2. Một số nghiên cứu định lượng aflatoxin trong và ngoài nước

TT

Phƣơng pháp

Phƣơng

phân tích

pháp chiết

LC-MS/MS

n
a

e

(30mm × 4 mm, 3ϻm)

(80:20, v/v)

+ Tốc độ dòng: 1mL/phút

giàu

LC-FLD

Sc

p
o
C

yr

h
g
i

lạnh +

t@

chiết pha

rắn để làm
giàu

fM

lo

o
o
h

methanol :

2

ed

(30:70)

rắn để làm

pháp chiết

n
i
ic

methanol : nƣớc + Pha động: methanol – nƣớc

chiết pha

Phƣơng

lƣợng

TLTK

+ Pha tĩnh: LiChrocart C18 short column

pháp chiết
lạnh +

m
r
a

h
P
d

Các nghiên cứu trên Thế giới
Phƣơng

1

y
c
a

Hoạt chất định

Dung môi chiết Điều kiện sắc ký

I

U
N
,V

nƣớc (70:30,

v/v), methanol:
nƣớc (80:20,
v/v) và
methanol :
nitric acid1%

aflatoxin B1, B2,
G1, G2 trên nến mẫu

[26]

Rhammus purshiana

+ Detector phát hiện: ESI (+) - SIM
+ Pha tĩnh: Scharlau Chemie C18

aflatoxin B1, B2,

column (250 × 4.6 mm i.d.)

G1, G2 trên các nền

+ Pha động: methanol:nƣớc (52:48, v/v)

mẫu nhƣ Valeriana

với 119 mg/L Kali bromide và 100µL/L

officinalis,

acid nitric 65%.

Hypericum

+ Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút
+ Detector phát hiện: máy dò huỳnh
quang FP-1520, bƣớc sóng kích thích và
11

perforatum, Cassia
angustifolia, Mentha
pulegium và

[16]


(70:30, v/v)

U

N
,V

phát xạ tƣơng ứng là 365 và 435nm.

Chrysanthemum

y
c
a

parthenium

+ Pha tĩnh: Shim-Pack CLC – ODS
Column (5µm, 4.6 x 250 mm)

3

LC-FLD

lạnh +
chiết pha
rắn để làm

Sc

Các nghiên cứu trong nƣớc

@
t

h

methanol :
nƣớc (85:15,

g
i
r
y

LC-MS

p
o
C

n
i
ic

120 mg KBr.

ed

AFB1 trong thuốc
từ thảo dƣợc và

[24]

dƣợc liệu

+ Detector phát hiện: máy dò huỳnh

ol

ho

M
f
o

quang Shimadzu LC-10 AD Model,
bƣớc sóng kích thích và phát xạ tƣơng
ứng là 360 và 435nm.
+ Pha tĩnh: Betabasic 18 (2,0mm x

pháp chiết

methanol :

lạnh +

nƣớc (85:15,

chiết pha

v/v)

rắn để làm

v/v/v) bổ sung 350 µL HNO3 4M and
+ Tốc độ dòng: 1 mL/phút

v/v)

Phƣơng

4

n
a
e

nƣớc-acetonitrile-methanol (60:20:20,

giàu

II

h
P
d

+ Pha động: dung dịch khử ion hon hợp

Phƣơng
pháp chiết

m
r

a

50mm, 5ϻm)
+ Pha động: kênh A: nƣớc; kênh B:
methanol; chạy chế độ Gradient.
+ Tốc độ dòng: 0,2ml/phút.
12

Các loại aflatoxin
trong dƣợc liệu

[2]


giàu

+ Detector phát hiện: ESI (+) - SIM
+ Pha tĩnh: cột C18 Acquity UPLC BEH

Phƣơng

(2,1x100 mm, 1,7ϻm)

pháp chiết
5

LC-MS

lạnh +

methanol :

chiết pha

nƣớc (6:4, v/v)

rắn để làm

n
i
ic

ed

+ Detector phát hiện: ESI (+) - SIM

l
o
o

M
f
o

h
c
S

g
i

r
y

p
o
C

n
a
e

10mM; kênh B: methanol; chạy chế độ
Gradient.

13

y
c
a

m
r
a

h
P
d

+ Pha động: kênh A: amoni acetat

+ Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút

giàu

@
t
h

U
N
,V

aflatoxin B1 trong
dƣợc liệu

[7]


 Nhận xét:

VN
U

Từ những nghiên cứu trên, ta có thể thấy hiện nay trong nƣớc và trên
thế giới nhiều tác giả đã tiến hành xây dựng phƣơng pháp định lƣợng
aflatoxin trong nhiều nền mẫu dƣợc liệu khác nhau. Tuy nhiên, trong nƣớc

ac
y,

hiện tại các nghiên cứu công bố cho thấy quy trình xử lý mẫu trải qua nhiều
công đoạn, tốn nhiều thời gian nên hiệu suất còn chƣa đƣợc cao. Vì vậy,

dP
ha
rm

nhằm đƣa ra đƣợc phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu với hiệu
suất thu hồi cao và phƣơng pháp đơn giản, cũng nhƣ tiết kiệm thời gian hơn,
chúng tôi đề xuất đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin
trong dƣợc liệu bằng LC-MS/MS”, áp dụng để xác định hàm lƣợng

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

aflatoxin trong một số dƣợc liệu.

14


1.2.

Tổng quan về sắc ký ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng – khối phổ

VN
U

(LC-MS/MS)
1.2.1. Sắc ký ái lực miễn dịch
a) Sắc ký ái lực

ac
y,

Sắc ký ái lực là một kỹ thuật sắc ký lỏng sử dụng một thuốc thử liên kết
đặc biệt để làm sạch hoặc phân tích các thành phần trong hỗn hợp. Lƣu giữ

dP
ha
rm

chất phân tích là do tƣơng tác thuận nghịch và chọn lọc của các cặp có trong
cơ thể sống nhƣ: kháng nguyên – kháng thể, enzyme – cơ chất, hormone –
receptor...[1].

Để thực hiện sắc ký ái lực ngƣời ta cố định một thành phần của cặp

an

(phối tử - ái lực) trên một chất mang rắn làm pha tĩnh đƣa vào cột. Mẫu phân

ine

tích có thành phần thứ hai đƣợc đƣa vào cột nhờ một pha động có pH xác
định, lực ion và thành phần dung môi phù hợp gọi là dung dịch đệm rửa giải.

ed
ic

Khi mẫu phân tích qua cột, các thành phần khác khuếch tán dễ dàng, chỉ có
hai thành phần của cặp tƣơng tác đặc hiệu và liên kết với nhau. Nhờ một dung

M

dịch đệm rửa giải, liên kết trên bị phá vỡ và thành phần chọn lọc với phối tử

of

ái lực đi ra khỏi cột. Phát hiện và định lƣợng bằng một detector thích hợp [1].

ho
ol

- Phối tử ái lực: là những chất có tính đặc hiệu cao với chất phân tích,
quyết định thành công của kỹ thuật tách ái lực. Phối tử ái lực có thể có nguồn

Sc

gốc sinh học (kháng thể, protein...) hoặc nguồn gốc hóa học (boronat, phức
càng cua kim loại...).

@

- Chất mang: là những chất rắn đƣợc dùng để cố định phối lực ái tử

ht

trong cột sắc ký. Một số chất mang thƣờng dùng trong sắc ký ái lực là agarose

rig

và agarose liên kết, cellulose, silica...

py

b) Sắc ký ái lực miễn dịch
Sắc ký ái lực miễn dịch là một loại hình sắc ký ái lực sử dụng phối tử ái

Co

lực là kháng thể hoặc kháng nguyên. Do tính đặc hiệu cao của tƣơng tác
kháng thể - kháng nguyên và khả năng tạo kháng thể của nhiều loại chất, kỹ
15