Xác định đồng thời một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng sắc ký lỏng khối phổ LC MS MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

=======

NGUYỄN THỊ NHUNG

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ
TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC-MS/MS
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Bản khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm
An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia với sự hướng dẫn của PGS.TS. Lê Thị
Hồng Hảo.
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.
TS Lê Thị Hồng Hảo đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và góp ý giúp
em hồn thành khóa luận này. Tơi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Thị
Hà Bình đã hướng dẫn và giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận này.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An
toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS. Trần Cao Sơn và các cán bộ khoa Độc
học dị nguyên, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo
điều kiện giúp tơi hồn thành đề tài.

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới các thầy cơ giáo giảng dạy tại khoa Hố,
đặc biệt là các thầy cơ trong bộ mơn Hố Phân tích, đã cho tơi những kiến
thức q giá trong q trình học tập và thực hiện đề tài này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học
hoá K24, đặc biệt là những người bạn trong nhóm hố phân tích K24 đã giúp đỡ,
chia sẻ những khó khăn trong suốt q trình tơi học tập và thực hiện đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã ln
bên tơi, chia sẻ khó khăn, động viên và giúp đỡ tôi trong học tập và trong
cuộc sống.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên khơng tránh những thiếu sót.
Tơi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cơ và các bạn sinh viên.
Hà Nội, ngày 07 tháng 11 năm 2016
Nguyễn Thị Nhung

Nguyễn Thị Nhung

Trường ĐHKH Tự Nhiên


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .........................................................................................................1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .................................................................................2
1.1. Giới thiệu về độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ ..................................................2
1.1.1 Giới thiệu về STX ....................................................................................4
1.1.2 Giới thiệu về NEO ...................................................................................4
1.1.3 Giới thiệu về GTX-1 ................................................................................ 5
1.1.4 Giới hạn tối đa cho phép (ML) ...............................................................6
1.1.5 Những tác hại của độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ ....................................7
1.2. Các phương pháp xác định độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh
vỏ ..........................................................................................................................9

1.2.1. Các phương pháp thử sinh học ..............................................................9
1.2.2. Phương pháp xét nghiệm miễn dịch ELISA .........................................10
1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ...............................10
1.2.4 Kỹ thuật điện di .....................................................................................12
1.2.5 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), (LC-MS/MS) .................13
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............16
2.1. Đối tượng và nội dung nghiên cứu ..............................................................16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................16
2.1.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................16
2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................16
2.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu ..................................................................16
2.2.2 Phương phápsắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) ..................................17
2.2.3. Thẩm định phương pháp ......................................................................23
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................26
2.3. Phương tiện nghiên cứu ..............................................................................26
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ ...................................................................................26
2.3.2. Dung mơi, hóa chất ..............................................................................27

Nguyễn Thị Nhung

Trường ĐHKH Tự Nhiên


CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................29
3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy thiết bị LC-MS/MS ....................................29
3.1.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy của thiết bị khối phổ MS/MS ................29
3.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ......33
3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu .......................................................................35
3.2.1 Chọn qui trình xử lí mẫu .......................................................................35
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết mẫu ..................40

3.2.3 Khảo sát quá trình pha lỗng dịch chiết ...............................................42
3.2.4. Khảo sát thể tích dung mơi chiết ..........................................................43
3.3 Thẩm định phương pháp phân tích ..............................................................46
3.3.1 Tính đặc hiệu / chọn lọc ........................................................................46
3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) .......................49
3.3.3 Xác định khoảng tuyến tính ...................................................................50
3.3.4 Độ chính xác (accuracy) của phương pháp phân tích (độ đúng và độ
chụm) ..............................................................................................................52
3.4 Áp dụng phân tích mẫu thực tế ...................................................................54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................58
PHỤ LỤC ..................................................................................................................

Nguyễn Thị Nhung

Trường ĐHKH Tự Nhiên


DANH SÁCH BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học và độc tính của một vài độc tố PSP .................................. 3
Bảng 1.2: Một số nước đã đưa ra qui định giới hạn tối đa cho phép (ML) của các
PSP ............................................................................................................................... 6
Bảng 1.3: Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC-FLD để xác định PSP ... 11
Bảng 2.1: Bảng pha dung dịch chuẩn làm việc ........................................................... 28
Bảng 3.1: Ion mẹ của từng chất .................................................................................. 29
Bảng 3.2: Điều kiện tối ưu cho ESI-MS/MS .............................................................. 30
Bảng 3.3: Các thông số tối ưu MS/MS. ...................................................................... 32
Bảng 3.4: Chương trình gradient................................................................................. 34
Bảng 3.5: Lựa chọn quy trình chiết mẫu ..................................................................... 39
Bảng 3.6: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết mẫu ......................... 40

Bảng 3.7: Khảo sát q trình pha lỗng dịch chiết ..................................................... 42
Bảng 3.8: Khảo sát thể tích dung mơi chiết ................................................................ 43
Bảng 3.9: Ion mẹ và ion con của STX, GTX-1, NEO ................................................ 46
Bảng 3.10: LOD và LOQ của STX, GTX-1, NEO ..................................................... 50
Bảng 3.11: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của các PSP ........................ 51
Bảng 3.12: Độ lặp lại và độ thu hồi của STX, GTX-1, NEO trên nền mẫu Ngao ...... 53
Bảng 3.13: Độ lặp lại và độ thu hồi của STX, GTX-1, NEO trên nền mẫu Hàu ........ 53
Bảng 3.14: Kết quả phân tích mẫu thực tế trên địa bàn Hà Nội ................................. 54

Nguyễn Thị Nhung

Trường ĐHKH Tự Nhiên


DANH SÁCH H NH
Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo tổng qt của các độc tố PSP .......................................... 2
Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo của STX .......................................................................... 4
Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo của Neo ........................................................................... 5
Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo của GTX-1 ...................................................................... 5
Hình 2.1: Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng.................................................... 18
Hình 2.2: Bộ kết nối phun điện tử ............................................................................... 20
Hình 2.3: Bộ phân tích tứ cực ..................................................................................... 22
Hình 2.4: Bộ phân tích khối ba tứ cực ........................................................................ 22
Hình 3.1: Sắc kí đồ mix PSP chuẩn 100 ng/mL chạy chương trình gradient 4 .......... 35
Hình 3.2: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 1Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình 2 theo
tác giả Van De Riet ..................................................................................................... 36
Hình 3.3: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 2........................................................................ 37
Hình 3.4: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 3........................................................................ 38
Hình 3.5:Sắc kí đồ các PSP 100 ng/mL trong quy trình 3 .......................................... 39
Hình 3.6: Sắc kí đồ quy trình khơng gia nhiệt khi thêm chuẩn mix PSP 100

ng/mL .......................................................................................................................... 41
Hình 3.7: Sắc kí đồ quy trình gia nhiệt khi thêm chuẩn mix PSP 100 ng/mL ............ 41
Hình 3.8: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của q trình pha lỗng đến hiệu suất thu hồi .... 42
Hình 3.9: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của thể tích chiết đến hiệu suất thu hồi ....... 44
Hình 3.10: Quy trình xử lí mẫu tối ưu ........................................................................ 45
Hình 3.11: Phổ khối của các PSP ................................................................................ 47
Hình 3.12: Sắc đồ mẫu trắng khơng có tín hiệu chất phân tích. ................................. 47

Nguyễn Thị Nhung

Trường ĐHKH Tự Nhiên


Hình 3.13: Sắc đồ mẫu chuẩn ở mức 200 ng/mL....................................................... 48
Hình 3.14: Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn ở mức 200 ng/mL .................................... 48
Hình 3.15: Sắc kí đồ STX tại LOD 10 ng/mL (tương đương 100 µg/kg trên mẫu) ... 49
Hình 3.16: Sắc kí đồ NEO tại LOD 15 ng/mL (tương đương 150 µg/kg trên mẫu)... 49
Hình 3.17: Sắc kí đồ GTX-1 tại LOD 15 ng/mL (tương đương 150 µg/kg trên mẫu) .... 50
Hình 3.18: Đường chuẩn STX theo diện tích pic........................................................ 51
Hình 3.19: Đường chuẩn GTX-1 theo diện tích pic.................................................... 52
Hình 3.20: Đường chuẩn NEO theo diện tích pic ....................................................... 52

Nguyễn Thị Nhung

Trường ĐHKH Tự Nhiên


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
CAN

AOAC

Tiếng Anh
Acetonitrile
Association of Official
Analytical Communities

Tiếng Việt
Acetonitril
Hiệp hội các nhà phân tích chính
Độc tố nhuyễn thể gây mất trí

ASP

Amnesic Shellfish Poisoning

CAD

Collision Gas Pressure

Áp suất khí va chạm

CE

Collision Energy

Năng lượng va chạm

CUR

Curtain Gas

Khí màng

CXP

Collision Cell Exit Potential

Thế đầu ra

DP

Declustering Potential

Thế phân mảnh

DSP

Diarrhetic Shellfish Poisoning

Độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy

d-SPE

Dispersive solid phase
extraction

nhớ

Chiết phân tán pha rắn

Eq

Equivalents

Tương đương

ESI

Electronspray ionization

Ion hóa phun điện tử

FLD

Fluoroscence detector

Detector huỳnh quang

GCB

Graphitized carbon black

Than hoạt tính

GS1

Ion Source Gas 1

Khí nguồn ion 1

GS2

Ion Source Gas 2

Khí nguồn ion 2

GTX-1

Gonyautoxins-1

Độc tố gonyautoxins-1

HPLC

High performance liquid
chromatography

Nguyễn Thị Nhung

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trường ĐHKH Tự Nhiên


HILIC
IS
LC-MS/MS

Hydrophilic interaction liquid

chromatography
Ionspray Voltage
Liquid chromatography tandem
mass spectrometry

Sắc kí lỏng tương tác thân nước
Thế phun ion
Sắc ký lỏng ghép khối phổ 2 lần

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lượng

MBA

Mouse bioassay

Thử nghiệm sinh học trên chuột

ML

Maximum level

Giới hạn tối đa cho phép

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

NEO

Neosaxitoxin

Độc tố neosaxitoxin

PSP

Paralytic Shellfish poisoning

Độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ

R(%)

Recovery

Hiệu suất thu hồi

RSD(%)

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

SPE

Solid phase extraction

Chiết pha rắn

STX

Saxitoxin

Độc tố saxitoxin

TEM

Ion source temperature

Nhiệt độ nguồn

Nguyễn Thị Nhung

Trường ĐHKH Tự Nhiên

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây việc nuôi trồng thủy sản nói chung và việc ni
các lồi hai mảnh vỏ nói riêng đã và đang phát triển rầm rộ ở nhiều địa phương
ven biển nước ta. Điều này đã góp phần vào việc phát triển ngành kinh tế biển,
phục vụ cho nhu cầu thị trường tiêu thụ trong và ngoài nước, tăng thêm thu nhập,
cải thiện đời sống cho nhiều hộ dân cư ven biển.
Đơ thị hóa, ơ nhiễm mơi trường làm mơi trường biển ngày càng bị suy
thối tạo điều kiện cho sự xuất hiện và bùng nổ của các loài vi tảo biển độc hại.
Các loài thân mềm hai mảnh vỏ là đối tượng trung gian chính để gây ra hiện
tượng ngộ độc ở người và các sinh vật bậc cao như chim biển, thú biển. Đặc biệt
sự có mặt các nhóm độc tố độc tố gây liệt cơ PSP (Paralytic Shellfish Poisoning).
Chính vì vậy, nghien cứu phát hiện các độc tố cần được quan tâm để giảm nguy
cơ ảnh hưởng đến sức khỏe cũng như tính mạng của con người.
Trong đề tài này tập trung nghiên cứu nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ
PSP (Paralytic Shellfish Poisoning). Độc tố này gây nguy hiểm đến sức khoẻ và
tính mạng con người là do động vật nhyễn thể bị nhiễm và tích lũy độc tố PSP do
ăn phải tảo độc nhóm Dinoflagellates bao gồm lồi Dinophysis spp, Aurocentum,
prorocentrumlima.Việc xác định một số độc tố nhuyễn thể gây liêt cơ là rất cần
thiết, là công cụ rất tốt phục vụ cho công tác thanh tra, kiểm tra an tồn thực phẩm.
Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu phát triển phương pháp “Xác định đồng
thời một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng sắc ký lỏng khối
phổ LC-MS/MS”. Phương pháp hiện đại, có độ tin cậy và chính xác cao.
Mục tiêu của thực hiện đề tài luận văn là:
- Xây dựng phương pháp xác định đồng thời một số độc tố gây liệt cơ trong
nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC - MS/MS.
- Sơ bộ đánh giá một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
tiêu thụ tại Hà Nội.

Nguyễn Thị Nhung

1

Trường ĐHKH Tự Nhiên


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ
Độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ (PSP) là một nhóm các alkaloid gây độc trên
thần kinh. STX là độc tố PSP được phát hiện sớm nhất vào năm 1957, và kể từ
đó đến nay đã có 57 dẫn xuất được mô tả [28].
Độc tố PSP là những độc tố thân nước và chịu được nhiệt độ cao nên khó
có thể bị phá hủy khi nấu ăn hay đun nóng [15], [18]. Chúng có thể được chia
thành 4 phân nhóm chính [8], [22], [28]:
Độc tố nhóm carbamate gồm: saxitoxin (STX), neosaxitoxin (NEO),
gonyautoxins (GTX1-4) có độc tính mạnh nhất.
Độc tố nhóm decarbamoyl gồm: decarbamoyl saxitoxin (dcSTX),
decarbamoyl gonyautoxins (dcGTX1-4) có độc tính trung bình, được báo cáo
xuất hiện trong một vài động vật hai mảnh vỏ, nhưng ít được tìm thấy trong các
lồi tảo độc.
Các độc tố nhóm N-sulfocarbamoyl như: B1 [GTX5], B2 [GTX6] and C14 ít mạnh hơn.
Nhóm thứ 4 là nhóm deoxycarbamoyl nhưng độc tính của nó chưa được
xác định 1 cách rõ ràng [12].
STX là độc tố mạnh nhất trong nhóm PSP. Độc tính của các PSP khác được
xác định dựa trên độc tính của STX bởi Oshima được trình bày ở bảng 1.1 [24].

Hình 1.1: Công thức cấu tạo tổng quát của các độc tố PSP

Nguyễn Thị Nhung

2

Trường ĐHKH Tự Nhiên


Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học và độc tính của một vài độc tố PSP
Độc tố

R1

R2

R3

Hệ số độc

M

STX

-H

-H

-H

1

299

NEO

-OH

-H

-H

0,92

315

GTX-1

- OH

-H

-OSO3-

0,99

411

GTX-2

-H

-H

-OSO3-

0,36

395

GTX-3

-H

-OSO3- -H

0,64

395

GTX-4

- OH

-OSO3- -H

0,73

411

R4

O

NH2
O

- Nguồn gốc: Sinh ra bởi vi sinh vật sống cộng sinh trên một sinh vật khác, gồm
các tảo dinoflagellates Gonyaulax catenella và G. Tamarensi, tìm thấy ở các loài
nhuyễn thể ở vùng Alaska, Saxidomus giganteus và các loài, Mytiluscalifornianeus. Độc tố có thể sản sinh riêng biệt bởi S. giganteus hay M.
californianeus.
- Lý hóa tính: Các độc tố PSP không bị phân hủy bởi nhiệt ở môi trườngacid
nhưng khơng bền vững và dễ bị oxy hóa trong mơi trường kiềm.
- Tác hại: Các triệu chứng nhiễm độc PSP có thể xuất hiện sau khi ăn vài phút
cho đến 10 giờ. Triệu chứng bao gồm cảm giác tê ở mơi, cổ, mặt, cùng cảm thấy
như có kiến bị trong các ngón tay và ngón chân, nhức đầu, chóng mặt và buồn
nơn, nói năng khơng cịn mạch lạc, mạch đập nhanh, thở khó... Trường hợp nặng
có thể dẫn đến tử vong do suy hơ hấp.
- Hệ số độc: Trong nhóm các độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ thì STX là độc tố
mạnh nhất và ta quy ước nó có hệ số cao nhất là 1. Độc tố có độ mạnh thứ hai là
GTX-1 và đến NEO. Độc tố ít gây độc nhất là độc tố GTX-2.

Nguyễn Thị Nhung

3

Trường ĐHKH Tự Nhiên


- Xâm nhập: qua đường ăn uống, hít thở.
- Cơ chế tác dụng: Saxitoxin và các dẫn chất khác phong bế kênh Na + của các tế
bào thần kinh do đó chúng gây ảnh hưởng đến hoạt cả hoạt động thần kinh và các
phản ứng của hệ cơ.

1.1.1 Giới thiệu về STX
- Danh pháp thường: Saxitoxin
- Danh pháp quốc tế:
(3aS-(3a-α,4-α,10aR*))-2,6-diamino-4-(((amino-carbonyl)oxy)methyl)3a,4,8,9-tetrahydro-1H,10H-pyrrolo(1,2-c)purine-10,10-diol
- Cơng thức cấu tạo:

Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo của STX
- Công thức thu gọn: C10H17N7O4
-

Khối lượng mol phân tử : 299.29 g/mol

1.1.2 Giới thiệu về NEO
- Danh pháp thường: Neosaxitoxin
- Danh pháp quốc tế:
[(3aS,4R,10aS)-5,10,10-Trihydroxy-2,6-diiminooctahydro-1H,8Hpyrrolo[1,2-c]purin-4-yl]methyl carbamate

Nguyễn Thị Nhung

4

Trường ĐHKH Tự Nhiên


- Cơng thức cấu tạo:

Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo của Neo
- Công thức thu gọn: C10H17N7O5
-

Khối lượng mol phân tử : 315.286 g/mol.

1.1.3 Giới thiệu về GTX-1
- Danh pháp thường: Gonyautoxins-1
- Danh pháp quốc tế: {4-[(carbamoyloxy)methyl]-5,10,10-trihydroxy-2,6diimino-decahydropyrrolo[1,2-c]purin-9-yl}oxidanesulfonic acid
- Công thức cấu tạo:

Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo của GTX-1
- Cơng thức thu gọn: C10H17N7O9S
-

Khối lượng mol phân tử

Nguyễn Thị Nhung

: 411.34848g/mol.

5

Trường ĐHKH Tự Nhiên


1.1.4 Giới hạn tối đa cho phép (ML)
- Mức tối đa cho phép (ML) là giới hạn của độc tố PSP , được phép tồn tại về
mặt pháp lí hoặc xem như có thể chấp nhận được ở trong nhuyễn thể hai mảnh
vỏ, mà không gây hại cho người sử dụng.
Bảng 1.2: Một số nước đã đưa ra qui định giới hạn tối đa cho phép (ML) của các
PSP như sau [13]:
Đất nước/

Sản phẩm

Độc tố

Mức cho phép

Australia

Động vật có vỏ

Saxitoxin

80 µg/100g

Canada

Nhuyễn thể

PSP

<80µg/100g

Châu Âu

Nhuyễn thể

PSP

80µg/100g

Guatemala

Nhuyễn thể

Saxitoxin

400 MU/100g

HongKong

Động vật có vỏ

PSP

400 MU/100g

Nhật

Nhuyễn thể

PSP

400 MU/100g

Hàn Quốc

Nhuyễn thể

Gonyautoxins

400 MU/100g

Vùng lãnh thổ

c

Động vật có vỏ

PSP, NSP, DSP,
ASP

40-80 µg/100g

Na Uy

Tất cả

PSP

40-80 µg/100g

Panama

Nhuyễn thể

PSP

400 MU/100g

Singapore

Nhuyễn thể

Saxitoxin

80 µg/100g

M

Nhuyễn thể

PSP

80 µg/100g

Nguyễn Thị Nhung

6

Trường ĐHKH Tự Nhiên


Nhận xét: Hiện nay Việt Nam chưa đưa ra qui định giới hạn tối đa cho phép
(ML) của các PSP. Vậy chúng tôi chấp nhận giá trị ML bằng 80 µg/100g là giá
trị ML của M và nhiều nước khác.
1.1.5 Những tác hại của độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ
 Ảnh hưởng đến động vật giáp xác thân mềm.

Thủy triều đỏ là tên gọi khi vùng biển có hiện tượng nở hoa bùng phát của tảo.
Khi tảo nở hoa gây ảnh hưởng xấu đến hàng loạt động vật giáp xác thân mềm

như nghêu, trai, sò vẹm, hàu. Những đợt bùng phát tảo nở hoa xảy ra ở cửa sông,
mặt biển nhanh chóng tích tụ những đám hoa. Sự nở hoa của tảo có khi làm nước
biển có màu đỏ, có khi màu xanh, màu xám… Đa số các lồi tảo nở hoa làm môi
trường xấu đi, làm giảm lượng oxi hòa tan trong nước làm cho động vật biển chết
hàng loạt [14].
Ở Việt Nam, hiện tượng thủy triều đỏ xuất hiện chủ yếu ở khu vực vùng biển
Nam Trung Bộ. Trong đó Bình Thuận là nơi hiện tượng này xảy ra thường
xuyên, hàng năm từ tháng 3 đến tháng 9. Gần đây, trong khoảng tháng 3-6/2012
ở Cát Bà Hải Phòng cũng đã xuất “thủy triều đỏ”, tuy nhiên loại tảo này có tên
Noctiluca scintillans khơng sinh độc tố, nên khơng có nguy cơ gây độc cho người
[11].
 Ảnh hưởng của tảo độc trong ao tôm.

Trên các ao nuôi tôm sú Penaeus monodon và P. orientalis ở Đài Loan, Trung
Quốc và Malaysia có nhiều giống tảo nở hoa do mơi trường giàu ding dưỡng bao
gồm: Euglena spp, Noctiluca scintillan, Alexdrium tamarense, Chattonella spp,
chúng gây ra tình trạng thiếu oxy máu, tiết ra độc tố PSP, ASP làm giảm sinh
trưởng ở tôm, gây bệnh, hoặc trực tiếp gây chết tôm.
Ở Việt Nam, tảo độc Noctiluca scintillans nở hoa ở khu vực Vân Phong thuộc
vùng biển Khánh Hòa đã làm chết khoảng 20 tấn tơm hùm với thiệt hại ước tính
khoảng 6 tỷ đồng.

Nguyễn Thị Nhung

7

Trường ĐHKH Tự Nhiên


 Ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người.

Ở người, nhiễm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ (PSP) là do ăn phải nhuyễn thể
chứa độc tố này. Nhuyễn thể bị nhiễm và tích lũy các loại độc tố này là do ăn tảo
độc.
Dấu hiệu đầu tiên của sự nhiễm độc trên người xuất hiện khoảng 5-30 phút sau
khi ăn nhuyễn thể bị nhiễm với các triệu chứng: cảm giác kim châm hoặc tê nhẹ
đến liệt cơ hơ hấp hồn tồn. Trong trường hợp nặng có thể tử vong do liệt cơ hơ
hấp, xảy ra trong vịng từ 2-12h sau khi ăn thực phẩm nhiễm độc PSP.
Mỗi năm, các trường hợp ngộ độc do PSP vẫn được ghi nhân trên tồn thế giới.
Từ năm 1970 có khoảng 1.600 trường hợp ngộ độc do PSP đã được báo cáo, dặc
biệt là ở Bắc M và Châu Âu. Bên cạnh đó, có thêm khoảng 900 trường hợp ngộ
độc PSP được ghi nhận ở các vùng trên thế giới mà trước đó PSP chưa được biết
đến.
Ở Nhật, trường hợp ngộ độc đầu tiên được ghi nhận vào cuối những năm 1960. Ở
Malaysia, Philippin và Indonesia, các ca ngộ độc đầu tiên được báo cáo vào
những năm 1970 và đầu những năm 1980. Trong suốt 20 năm qua, dường như có
sự gia tăng các vụ ngộ độc PSP do việc nuôi và tiêu thụ nhuyễn thể được mở
rộng.
 Nhóm nhuyễn thể được xác định trong những vụ ngộ độc PSP gồm chủ yếu
động vật thân mềm hai mảnh vỏ gồm vẹm, ngao, hàu, điệp và sị. Cần chú ý: do PSP
tích lũy trong nhuyễn thể nên chúng có thể gây ngộ độc cho người cả khi khơng có
hiện tượng thủy triều đỏ. Tác dụng độc lên động vật.

PSP có thể gây độc lên nhiều động vật khác như cá, chim, ếch, gà, chuột, thỏ,
chó mèo. Trong các thí nghiệm trên động vật, PSP làm chết thú thử nghiệm do
gây liệt hệ thống hô hấp. Ngoài ra, PSP thể hiện tác dụng độc lên hệ thần kinh
cơ, hệ thần kinh trung ương, hệ thống tim mạch và ở liều 1 µg/kg trọng lượng cơ
thể đã gây tăng huyết áp.
 Hấp thụ và thải các độc tố PSP trong cơ thể thủy sản.

Nguyễn Thị Nhung

8

Trường ĐHKH Tự Nhiên


Trong quá trình lọc thức ăn, các tế bào và bào tử của tảo giáp đã chuyển vào thực
quản dạ dày của nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Nội tạng của nhuyễn thể chỉ chiếm
30% tổng khối lượng của mô mềm nhưng lại chứa đến 96% tổng độc tố. Trong
cơ thể động vật nhuyễn thể, các độc tố tập trung nhanh chóng trong nội tạng và
sau giảm dần. Thành phần các độc tố không giống nhau mà biến đổi theo thời
gian và vị trí trong động vật. Cơ khép vỏ khơng tích lũy độc tố mà thực tế cho
thấy đã làm bất hoạt độc tố. Ống tiêu hóa, màng, tuyến sinh dục và mô mang giữ
lại độc tố với trọng lượng khác nhau giữa các mơ và giữ các lồi. Sau khi hấp thụ
và phân bố, các độc tố có thể bị biến đổi. Các lồi hai mảnh vỏ có cách xử lý và
phản ứng với PSP khác nhau và sự nhạy cảm của chúng với độc chất này cũng
khác nhau, ví dụ: vẹm tích lũy các độc tố PSP nhiều hơn hàu trong cùng hồn
cảnh. Các nghiên cứu ni trong phịng thí nghiệm cho thấy vẹm hấp thụ dễ dàng
các độc tố của tảo giáp nhưng với lượng độc tố tương đương như thế thì hàu
ngừng lọc.
1.2. Các phƣơng pháp xác định độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
Có hai nhóm phương pháp chính để xác định các độc tố sinh học biển
trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bao gồm nhóm phương pháp sinh học và nhóm
phương pháp hố học:
1.2.1. Các phương pháp thử sinh học
Thử nghiệm sinh học trên chuột (MBA) vẫn là phương pháp thử nghiệm
chính trong hầu hết các chương trình giám sát ngộ độc thủy sản. MBA được sử
dụng phổ biến trên thế giới trong hơn 50 năm qua và là phương pháp chính thức
của AOAC.

PSP trong mẫu được chiết tách bằng dung dịch HCl 0,1N, dịch chiết được
tiêm vào chuột theo tỷ lệ 1 mL dịch/20 g chuột, quan sát biểu hiện của chuột
trong vòng 60 phút và xác định thời gian chết của chuột. Dựa vào thời gian chết
của chuột tra bảng Sommer sẽ xác định được giá trị đơn vị chuột (MU), từ đó
tính được nồng độ độc tố PSP trong mẫu [23], [30].

Nguyễn Thị Nhung

9

Trường ĐHKH Tự Nhiên


Tác giả Đào Việt Hà – Viện Hải Dương Học Nha Trang [1] đã tiến hành
thử nghiệm sinh học trên chuột (MBA.AOAC 1990) để xác định hàm lượng độc
tố PSP trong nghêu Meretrix lyrata tại một số vùng nuôi trọng điểm khu vực Cần
Giờ. Tác giả đã tiến hành tiêm phúc mạc chuột nhắt trắng (Swiss wiss) (có trọng
lượng 20g ± 2g) 1 mL dịch chiết thơ, sau đó theo dõi triệu chứng và thời gian
chết của chuột (nếu xảy ra). Tính tốn độc lực tổng dựa theo phương pháp
AOAC, 1990. Kết quả cho thấy, hàm lượng độc tố PSP ở tất cả các mẫu đều dưới
mức độ phát hiện của phương pháp MBA (36 µg/100g, với hệ số CF = 0.18).
-

Ưu điểm: thời gian thực hiện nhanh, có khả năng đánh giá được tổng các

độc tố và khơng địi hỏi trang thiết bị phức tạp.
-

Nhược điểm là độ nhạy thấp, khơng thể tự động hóa, khơng định danh

chính xác loại chất độc, bị ảnh hưởng bởi các đặc tính động vật và đặc biệt là vấn
đề đạo đức [22], [23]. Do đó, nhóm phương pháp này hiện nay khơng còn đáp
ứng được nhu cầu và dần được thay thế bằng các phương pháp hoá học .
1.2.2. Phương pháp xét nghiệm miễn dịch ELISA
ELISA (Enzym-linked immunosorbent assay) là một kĩ thuật sinh hóa để
phát hiện kháng nguyên hay kháng thể trong mẫu xét nghiệm, và thường được
quan sát bởi sự thay đổi màu sắc. Usleber và cộng sự bằng cách sử dụng các
kháng thể đa dòng đã phát triển thành công kit thử nghiệm cho STX. Giới hạn
phát hiện là 4 ng/g mô nhuyễn thể [26].
-

Ưu điểm: Dễ thực hiện và thời gian phân tích ngắn.

-

Nhược điểm: chi phí mua kit thử đắt, khơng có khả năng định danh và

phân loại các thành phần của độc tố PSP. Do đó, khi phát hiện mẫu thử dương
tính phải dùng phương pháp sắc ký để kiểm tra [23].
1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao sử dụng detector huỳnh quang
(HPLC-FLD) là phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong phân tích các PSP
và AOAC 2005:06.

Nguyễn Thị Nhung

10

Trường ĐHKH Tự Nhiên

Ưu điểm của phương pháp là có độ chính xác, độ nhạy và độ chọn lọc cao.
Nhược điểm là tốn thời gian vì các PSP phải được dẫn xuất hóa trước cột
hoặc sau cột để phân tích bằng detector huỳnh quang. Ngoài ra, việc xác định
PSP phức tạp hơn do sự chồng chéo các sản phẩm oxi hóa các chất tương tự PSP
trong trường hợp oxi hóa trước cột.
Bảng 1.3: Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC-FLD để xác định PSP
TLTK và

Nền mẫu và điều kiện phân tích

Tác giả

Kết quả

- Nền mẫu: sinh khối tảo khô
- Điều kiện sắc kí
+ Cột C18
+ Kênh

A:

acid

heptanesulfonic

6

octanesulfonic
mmol/L,

và

ammonium

photphat 48 mmol/mL và tetrahydrofuran

0,035

0,75% trong nước
Etheridge
[12]

LOD =

(µg/g)
+ Kênh

B:

acid

heptanesulfonic

7

octanesulfonic
mmol/L,

và

ammonium

photphat 48 mmol/mL, tetrahydrofuran 1% và
ACN 10% trong nước

LOQ =
0,07
(µg/g)

+ Oxi hóa trước cột
+ Tốc độ dịng 1 mL/phút
+ Bước sóng kích thích: 330 nm
+ Bước sóng phát xạ: 390 nm.
Wiberg
[27]

- Nền mẫu: Trai, nghêu, sò, hàu

0,017

- Điều kiện sắc kí

Nguyễn Thị Nhung

LOD =

11

Trường ĐHKH Tự Nhiên

+ Cột Angilent Zorbax Bonus RP (3,5 µm; 4,7 x
150 mm)

µg/g
LOQ =

+ Kênh A: Heptane sulfonat 11 mM, H3PO4 5,5

0,051
µg/g

mM trong nước (pH = 7,1)
+ Kênh B: Heptane sulfonat 11 mM, H3PO4 16,5
mM, methylnitril 11,5% trong nước (pH = 7,1)

Độ thu
hồi: 88%
– 113%

+ Oxi hóa sau cột
+ Tốc độ dịng 0,8 mL/phút
+ Bước sóng kích thích và phát xạ: 330 nm và 390
nm
- Nền mẫu: Hàu, sò, hến
- Điều kiện sắc kí
+ Cột Supelcosil LC-18 (5 µm; 4,6 x 15 mm)
+ Kênh A : ammonium formate 0,1 M
Llewellyn

+ Kênh B : ammonium forrmate 0,1 M trong 5%
ACN/H2O (pH = 6)

[20]

LOD =
0,02 µg/g
LOQ =
0,06 µg/g
Độ thu

+ Oxi hóa trước cột

hồi: 70 –

+ Tốc độ dịng 2 mL/phút

104%

+ Bước sóng kích thích: 330 nm
+ Bước sóng phát xạ: 390 nm
1.2.4 Kỹ thuật điện di
Điện di mao quản (CE) là một k thuật tương đối mới đã được phát triển
và ứng dụng trong lĩnh vực phân tích độc tố. Điện di mao quản là một k thuật
tách các chất trong dung dịch lỏng dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân
tử chất mang điện tích trong cột mao quản dưới ảnh hưởng của điện trường tạo

Nguyễn Thị Nhung

12

Trường ĐHKH Tự Nhiên


bởi điện áp cao thế (15 – 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Các độc tố này di
chuyển qua cột khi điện áp cao được áp vào và có thể được phát hiện khi chúng
đi qua một detector UV hoặc huỳnh quang. K thuật này được áp dụng cho các
hợp chất mang điện, và thậm chí khi khơng có điện tích nó có thể hợp chất bẫy
trong mixen mà sau đó sẽ di chuyển.
Wright và cộng sự (1989) [29] áp dụng một hệ thống CE cùng với một
máy dò huỳnh quang để xác định STX. K thuật này cho phép phát hiện các STX
ở cấp µg /kg. Mặc dù khối lượng tiêm là nhất thiết phải nhỏ (1-10 nL), giới hạn
phát hiện lý thuyết cho các mẫu nằm trong khoảng pg/kg. Những nhược điểm
hiện nay với k thuật là không xác định được độc tố hỗn hợp.
Thibault và cộng sự (1991) đã áp dụng một phương pháp CE cho các mẫu
sinh vật biển. Sự phân tách của Neo và STX đã đạt được và sử dụng phép đo phổ
UV với giới hạn phát hiện cỡ 1,5 µg/mL. Các tác giả cho rằng k thuật CE-UV
có thể áp dụng cho việc kiểm tra thường xuyên các chất độc trong các chiết xuất
tự nhiên, nhưng giới hạn phát hiện hiện nay là quá cao để có thể sử dụng trong
các chương trình giám sát.
1.2.5 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), (LC-MS/MS)
Gần đây phương pháp sắc kí lỏng tương tác ưa nước kết hợp với detector
2 lần khối phổ cho độ nhạy, độ đặc hiệu cao khi phân tích các PSP (HILICMS/MS).
Liyang uo [31] đã sử dụng kĩ thuật QuEChERS (nhanh, dễ dàng, giá rẻ,
hiệu quả, bền và an toàn) cho việc tách chiết, làm sạch và phát hiện 10 độc tố
PSP trong thực phẩm biển bằng HILIC-MS/MS ở chế độ ESI dương.
-

Nền mẫu: nhuyễn thể + cá.

-

Dung môi chiết: ACN/H2O (90:10, v/v).

-

Làm sạch: d-SPE (chất hấp phụ HLB và than hoạt tính GCB).

-

Điều kiện sắc kí:
+ Cột: TSK-gel Amide-80đ (3 àm; 2,0 x 150 mm).

Nguyn Th Nhung

13

Trng HKH Tự Nhiên


+ Kênh A: HCOOH 0,1% trong ammonium formate 2 mmol/L.
+ Kênh B: HCOOH 0,1% trong ACN.
+ Chạy theo chương trình gradient.
Kết quả: Các nghiên cứu ở ba mức thêm chuẩn PSP trong khoảng 8,1225,5 µg/kg cho độ thu hồi trung bình từ 71,3% đến 104,6% với độ lệch chuẩn
tương đối (RSD) ≤ 15,8%.
Mattarozzi [21] đã tối ưu hóa phương pháp xử lý mẫu bằng kĩ thuật
QuEchERS để phân tích độc tố PSP bằng phương pháp HILIC-MS/MS.
-

Nền mẫu: trai.

-

Dung môi chiết: HCOOH 0,1%.

-

Làm sạch: d-SPE (chất hấp phụ polymeric ABS Elut – NEXUS).

-

Điều kiện sắc kí:
+ Cột: TSK-gel Amide-80 (3 µm; 2,0 x 150 mm).
+ Kênh A: acetonitril 95% với 5% là amoni format 20 mM và acid
formic 26 mM (pH = 3,2).
+ Kênh B: 95% nước và 5% là amoni format 20 mM và acid formic
26 mM (pH = 3,2).
+ Chạy theo chương trình gradient.
Kết quả: Phương pháp cho giới hạn phát hiện của các PSP là 3 µg/kg,

giới hạn định lượng là 7 µg/kg; hiệu suất thu hồi trong khoảng từ 98 – 109% tại
mức thêm chuẩn LOQ và mức giữa đường chuẩn xây dựng.
Aversano [10] đã tiến hành phân tích các độc tố PSP bằng phương pháp
HILIC-MS. Nhóm tác giả đã tiến hành khảo sát dung môi pha động và lựa chọn
cột HILIC với các điều kiện như sau:
-

Nền mẫu: Trai, sinh vật phù du.

-

Dung môi chiết : ACN/H2O chứa HCOOH 0,1%.

-

Điều kiện sắc kí:
+ Cột: TSK-gel Amide-80® (4,6 µm; 2,0 x 250 mm).

Nguyễn Thị Nhung

14

Trường ĐHKH Tự Nhiên


+ Kênh A: H2O chứa ammonium format 2 mM, HCOOH 3,6 mM
(pH = 3,5).
+ Kênh B: ACN/H2O (95/5, v/v) chứa ammonium format 2 mM,
HCOOH 3,6 mM (pH = 3,5).
+ Chạy theo chương trình gradient.
Kết quả: Có khả năng tách tốt với các độc tố STX, dcSTX, NEO. Tuy
nhiên các GTX khơng tách hồn tồn khi đi qua cột Amide - 80 do hiện tượng
dính píc.
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổLC-MS/MS có nhiều ưu điểm như độ
chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh, có thể định
lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau mà phương pháp sắc kí
lỏng thường khơng làm được.
Với những ưu điểm trên, chúng tôi đã chọn phương pháp sắc kí lỏng hai lần khối
phổ để nghiên cứu xác định đồng thời một số độc tố gây liệt cơ: Saxitoxin (STX)

và Neosaxitoxin (NEO) và Gonyautoxin-1 (GTX-1)

Nguyễn Thị Nhung

15

Trường ĐHKH Tự Nhiên


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn
thể hai mảnh vỏ gồm Saxitoxin (STX), Neosaxitoxin (NEO) và Gonyautoxin-1
(GTX-1)
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu được đặt ra như sau:
 Tối ƣu hóa điều kiện xác định một số độc tố gây liệt cơ bằng phƣơng
pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS), cụ thể:



Xây dựng quy trình tách chiết chất phân tích.



Thẩm định phương pháp:



Độ đặc hiệu / chọn lọc của phương pháp.



Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ



Khoảng tuyến tính.



Lập đường chuẩn và phương trình hồi quy của đường chuẩn.



Độ chụm (độ lặp lại)



Độ đúng (độ chệch, độ thu hồi).

 Ứng dụng phƣơng pháp

Áp dụng phương pháp mới xây dựng để xác định tồn dư một số độc tố
gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ trên địa bàn Hà Nội.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu
-

Thời gian lấy mẫu: Từ 01/10/2015 – 20/04/2016.

-

Địa điểm lấy mẫu: chợ Hà Đông, chợ Mơ, chợ Phùng Khoang, chợ Long
Biên, chợ Nghĩa Tân…..

Nguyễn Thị Nhung

16

Trường ĐHKH Tự Nhiên