KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (dược LIỆU và dược cổ TRUYỀN) chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất trong cây cỏ nhọ nồi (eclipta alba)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ
XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT
TRONG CÂY CỎ NHỌ NỒI
(Eclipta alba)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện:

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ
XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT
TRONG CÂY CỎ NHỌ NỒI
(Eclipta alba)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa

:

Người hướng dẫn: 1.
2.

Hà Nội – 2019

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này là kết quả cho quá trình học tập, rèn luyện của em tại Khoa Y
Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực hành tại Khoa Hóa
Thực vật 2 – Viện Dược liệu.
Trong q trình nghiên cứu và hồn thành bài luận văn này, em đã nhận được
rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các Thầy, Cô giáo, các nhà khoa học của Khoa Y
Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Dược Liệu cùng gia đình và bạn bè.
Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể Ban Giám hiệu Khoa Y Dược, Đại học
Quốc gia Hà Nội và Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng đã tạo điều kiện cho em
được làm khóa luận tốt nghiệp.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Dương Thị Ly Hương,
PGS.TS. Đỗ Thị Hà, Ths. Nguyễn Thị Hồng Anh, TS. Trần Thanh Hà cùng các
cán bộ nghiên cứu tại Khoa Hóa Thực vật 2 – Viện Dược liệu đã giúp đỡ em trong
q trình thực hiện khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 23 tháng 3 năm 2019
Sinh viên


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
13

C-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13
(Cacbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

1

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
(Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

CC

Sắc ký cột (Column Chromatography)

DCM

Dicloromethan

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

DM

Dung môi

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DL/DM

Tỉ lệ dược liệu/dung mơi

ESI-MS

Phổ khối ion hóa phun mù điện tử
(Electronspray Ionization Mass Spectrum)

EtOAc

Etylacetat

HMBC

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

of

(Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)
HSQC

Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết
(Heteronuclear Single Quantum Coherence)

MeOH

Methanol

MS

Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy)

SKĐ

Sắc ký đồ

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

UV-Vis

Phổ tử ngoại (Ultra violet- Visible)


DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC HÌNH

Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất N01 và wedelolacton...........................19
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ của hợp chất N02 và quercetin.................................20
Bảng 3.3. Dữ liệu phổ của hợp chất N03 và methyl gallat...........................22
Hình 1.1. Cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)........................................................3
Hình 1.2. Cấu trúc của các hợp chất Alkaloid.................................................5
Hình 1.3. Cấu trúc của các hợp chất Coumestan.............................................5
Hình 1.4. Cấu trúc của các hợp chất Flavonoid..............................................6
Hình 1.5. Cấu trúc của các hợp chất Sterol.....................................................6
Hình 1.6. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 1................................7
Hình 1.7. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 2................................8
Hình 1.8. Cấu trúc của các dẫn xuất thiophen và polyacetylen.......................8
Hình 3.1. Sơ đồ phương pháp chiết xuất phân đoạn Cỏ nhọ nồi...................15
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn EtOAc của Cỏ nhọ
nồi................................................................................................................. 16

Hình 3.3. SKĐ TLC của N01 và cao EtOAc.................................................17
Hình 3.4. SKĐ TLC của N02 và cao EtOAc.................................................17
Hình 3.5. SKĐ TLC của N03 và cao EtOAc.................................................17
Hình 3.6. Cấu trúc hợp chất N01 (Wedelolacton).........................................18
Hình 3.7. Cấu trúc hợp chất N02 (Quercetin)...............................................21
Hình 3.8. Cấu trúc hợp chất N03 (Methyl gallat)..........................................23


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN.................................................................................... 2
1.1. Vài nét về họ Cúc (Asteraceae)..........................................................................2
1.2. Tổng quan về cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)......................................................2
1.2.1. Vị trí phân loại của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)..........................................2
1.2.2. Đặc điểm thực vật Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)............................................3
1.2.3. Thành phần hóa học Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba).........................................4
1.2.4. Tác dụng sinh học Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)............................................9
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................12
2.1. Đối tượng.......................................................................................................... 12
2.2. Hoá chất, thiết bị...............................................................................................12
2.2.1. Hoá chất..................................................................................................12
2.2.2. Thiết bị.................................................................................................... 12
2.3. Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết.......13
2.3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập........................................................13
2.3.2. Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc.........................................14
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..........................................................15

3.1. Chiết các phân đoạn Cỏ nhọ nồi và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn etyl
acetat........................................................................................................................ 15
3.1.1. Kết quả chiết phân đoạn Cỏ nhọ nồi....................................................... 15
3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất trong Cỏ nhọ nồi..................................... 16
3.2. Biện luận cấu trúc các hợp chất phân lập được từ Cỏ nhọ nồi..........................18
3.2.1. Biện luận cấu trúc N01............................................................................ 18
3.2.2. Biện luận cấu trúc N02............................................................................ 20
3.2.3. Biện luận cấu trúc N03............................................................................ 21


3.3. Bàn luận............................................................................................................ 23
3.3.1. Về chiết xuất...........................................................................................23
3.3.2. Về phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất.................................23
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................26
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là quốc gia có khí hậu nhiệt đới rất thuận lợi cho sự phát triển của
nhiều loại cây thuốc. Với sự đa dạng, phong phú về cây thuốc đã tạo ra nguồn tài
nguyên dược liệu vô cùng quý báu cho nước ta. Từ xa xưa, ông cha ta đã sử dụng
những bài thuốc cổ truyền từ các loại cây để chữa trị một số bệnh thường gặp như:
cảm, sốt, chảy máu, đau bụng,… Đó là những bài thuốc được sử dụng rất phổ biến
và được truyền lại từ đời này sang đời khác. Tuy nhiên những bài thuốc này mới chỉ
dựa trên kinh nghiệm của cha ông ta mà chưa có cơ sở về khoa học.
Ngày nay, khi khoa học kỹ thuật phát triển thì con người đã đi sâu vào nghiên
cứu làm sáng tỏ các thành phần, cấu trúc, tác dụng,… của các loài cây thường được
sử dụng trong các bài thuốc dân gian. Trong các nghiên cứu y dược hiện đại, các

hợp chất hữu cơ từ các cây thuốc như flavonoid, saponin, alkaloid, coumarin,…. là
những nguồn cung cấp các hợp chất có tiềm năng để thử hoạt tính sinh học, phục
vụ cho nhiều lĩnh vực khoa học, đặc biệt là y học.

Một trong số các loài cây được sử dụng phổ biến trong các bài thuốc cổ truyền là cây cỏ nhọ nồ
cứu rất nhiều cả trong nước và quốc tế như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Thái
Lan,…với nhiều tác dụng như kháng viêm, kháng nấm, cầm máu, chống ung thư…
và sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền để điều trị các bệnh như: nơn, chảy máu
cam, rụng tóc, suy nhược thần kinh, nấm, viêm loét, lở ngứa, ban chẩn,…[2]
Trước sự đa dạng về cấu trúc lý hóa, hoạt tính sinh học cũng như mối tương
quan giữa cấu trúc và tác dụng, để hiểu được rõ hơn về vai trò của từng hợp chất có
trong cỏ nhọ nồi và đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc, ta cần tiếp tục
tiến hành tách chiết và xác định cấu trúc của các thành phần hóa học đặc biệt và các
thành phần chưa được phân lập trong cây, từ đó đặt tiền đề để nghiên cứu thêm về
tác dụng, hoạt tính sinh học của các hợp chất này.

@

Để góp phần nghiên cứu thành phần hóa học của cây Cỏ nhọ nồi, chúng tôi
thực hiện đề tài: “Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất trong
cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)” với 2 mục tiêu:
Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn Ethyl acetat.
Xác định cấu trúc của các chất phân lập được trong phân đoạn Ethyl acetat.

8


CHƯƠNG 1:
TỔNG
QUAN

1.1 Vài nét về họ Cúc (Asteraceae)
Trong lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), họ Cúc (Asteraceae hay Compositae) là
họ lớn nhất trong lớp này, với hơn 1.600 chi và 23.000 loài. Chúng thường tập
trung chủ yếu ở đồng cỏ và thảm thực vật trên núi, ít gặp hơn trong các vùng rừng
nhiệt đới ẩm với độ cao thấp. Họ Cúc là họ thực vật nổi bật trong số các loài thực
vật được sử dụng bởi các dân tộc trong các nền văn hóa bản địa ở tất cả các nơi
trên thế giới, đặc biệt là cho các mục đích y học [8].
Các lồi thuộc họ Cúc có các đặc điểm: cụm hoa dạng đầu, bao phấn hữu tính,
chùm lơng trên quả, quả là loại quả bế tạo thành từ một lá nỗn và khơng nẻ ra khi
chín [1].
Họ Cúc có chứa các chất chuyển hóa thứ cấp phong phú và đa dạng, sự phát
triển của các hợp chất này rất quan trọng trong sự tiến hóa của họ. Nguồn thơng tin
về các hợp chất này rất có giá trị trong việc phân loại; sự xuất hiện hoặc vắng mặt
của các hợp chất hóa học cụ thể hoặc nhóm hợp chất thường biểu thị mối quan hệ
phân loại ở phân họ và cấp thấp hơn [8].
1.2 Tổng quan về cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)
1.2.1 Vị trí phân loại của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)
Cây Cỏ nhọ nồi hay còn gọi là cỏ mực, hạn liên thảo và có tên khoa học là
Eclipta alba hoặc Eclipta prostrata (L.), thuộc họ Cúc Asteraceae (Compositae) [1],
[2].
Theo “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của tác giả Võ Văn Chi [1], Cỏ nhọ nồi có
vị trí phân loại như sau:
Giới Thực vật: Plantae
Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta
Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida
Phân lớp Cúc: Asteridae
Bộ Cúc: Asterales
Họ Cúc: Asteraceae

Loài: Eclipta alba


1.2.2 Đặc điểm thực vật của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) [2]
Mô tả: Cây thảo mọc hằng năm, thân cao 10-60 cm, phân nhánh, màu lục,
đơi khi hơi đỏ tía, phủ lơng cứng. Lá mọc đối, phiến hình ngọn giáo tới bầu dục –
thuôn, dài 3-10 cm, rộng 0,5-2,5 cm, mép ngun hoặc khía răng, có lơng tơ dày ở
cả hai mặt. Cụm hoa hình bán cầu, đường kính 1-1,2 cm, trên cuống dài 1,5 mm, ở
nách lá hoặc ở ngọn cành. Tổng bao gồm 1 hàng lá bắc hình bầu dục, có lơng tơ
ở mặt lưng. Đế hoa lồi, rộng 1 cm. Các hoa ở mép là hoa cái có tràng dạng lưỡi
nhỏ, màu trắng, đầu có hai thùy; các hoa lưỡng tính ở giữa, hình ống, ở đầu có 4-5
thùy. Quả bế dẹt, có 3 cạnh màu đen.

Hình 1.1. Cây cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) [12]
Bộ phận dùng: Phần cây trên mặt đất. Có thể thu hái quanh năm, dùng tươi
hay phơi khô.
Phân bố: Ra hoa và kết quả từ tháng 3 đến tháng 11. Mọc hoang ở chỗ ẩm
mát ven làng, đồng ruộng từ vùng thấp lên tới độ cao 1800m. Phân bố phổ biến
khắp nơi từ Bắc vào Nam và còn phân bố ở các nước nhiệt đới khác thuộc châu Á,
châu Phi.


Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, chua, tính hàn. Quy kinh vào can và thận.
Công dụng: Tư âm bổ thận, lương huyết, bổ huyết, thanh nhiệt giải độc.
Thường được sử dụng để trị nôn ra máu, chảy máu cam, tử cung xuất huyết; Viêm
gan mạn, viêm ruột, lỵ; Trẻ em suy dinh dưỡng; Ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy
nhược thần kinh; Nấm da, vết loét, chảy máu, viêm da. Còn dùng làm thuốc
trong viêm họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, đau dạ dày, bệnh nấm
ngoài da gây rụng tóc.

1.2.3 Thành phần hóa học của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)
Các nghiên cứu khác nhau về thành phần hóa học đã cho thấy cỏ nhọ nồi có
chứa nhiều hợp chất hóa học bao gồm coumestans, alkaloids, glycosides, flavonoids,
triterpenoids, saponins, lipids, hợp chất polyacetylen, steroids, phytosterol,….Trong
lá cây có chứa wedelolactone, demethylwedelolactone, demethylwedelolactone-7glucoside, stigmasterol và β-terthienylmethanol. Rễ chứa hentriacontanol và
heptacosanol [15]. Phần trên mặt đất chứa phytosterol, β-amyrin trong chiết xuất nhexane và luteolin-7-glucoside, β- glucoside của phytosterol, glucoside của axit
triterpenic và wedelolactone [23].
a. Alkaloid
Các nghiên cứu về thành phần hóa học trên Eclipta alba cho thấy sự xuất
hiện của các alkaloid như ecliptine và nicotine, và các alkaloid steroid có hoạt tính
sinh học verazine, dehydroverazine ecliptalbine. Năm 1998, M. S. Kader và cộng sự
(Đại học Quốc gia Virginia, Hoa Kỳ) đã phân lập từ phần dịch chiết methanol của
Eclipta alba được tám hợp chất alkaloid có khung steroid. Alkaloid chính được xác
định là (20S,25S)-22,26-iminocholesta-5,22 (N) -dien-3-β-ol (verazine) (1), (20R)verazine
(2) và các alkaloid khác được xác định là 20-epi-3-dehydroxy-3-oxo-5,6-dihydro4,5 dehydroverazine (3), ecliptalbine [(20R)-20-pyridyl-cholesta-5-ene-3β,23-diol]
(4), (20R)-4β-hydroxyverazine (5), 4β-hydroxyverazine (6), (20R)-25βhydroxyverazine
(7) và 25β-hydroxyverazine (8) [4].


1 R1=R2=H

2 R1=R2=H

6 R1=OH, R2=H

5 R1=OH, R2=H

8 R1=H, R2=OH

7 R1=H, R2=OH

3

4

Hình 1.2. Cấu trúc của các hợp chất Alkaloid
b. Coumestan
Coumestan là một dẫn xuất của coumarin được tìm thấy trong nhiều loại thực
vật. Wedelolactone (9), demethylwedelolactone (10), demethyl-wedelolactone-7glucosid (11) là các coumestan chính phân lập được từ cỏ nhọ nồi [33].

9 R=CH3
10 R=H
11 R=Glc
Hình 1.3. Cấu trúc của các hợp chất Coumestan


c. Flavonoid và Sterol
Các flavonoid được tìm thấy trong cỏ nhỏ nồi là apigenin (12), luteolin (13),
luteolin-7-glucoside (14) và quercetin (15). Các sterol hiện diện trong cỏ nhọ nồi là
phytosterol, glucoside của phytosterol, daucosterol (16), β-sitosterol (17),
stigmasterol (18) và stigmasterol-3-O-glycoside (19) [56].

12

13 R1=H, R2=H
14 R1=Glc, R2=H
15 R1=H, R2=OH
Hình 1.4. Cấu trúc của các hợp chất Flavonoid

16 R=Glc

18 R=H

17 R=H

19 R=Glc
Hình 1.5. Cấu trúc của các hợp chất Sterol


d. Saponin triterpen
Saponin triterpene là eclalbatin (20), cùng với α-amyrin, axit ursolic và axit
oleanolic đã được phân lập từ Eclipta alba [34], [53]. Năm 1997, S. Yahara và cộng
sự thuộc Đại học Kumamoto, Nhật Bản đã phân lập được eclalbasaponin VII-X (2124) [55]. Năm 2008, M. K. Lee và công sự tại Đại học quốc gia Seoul Hàn Quốc đã
phân lập được acid echinocystic (25) và các dẫn xuất glycosid, eclalbasaponin I-III
(26-28) và eclalbasaponin V (29) [40].

25

20 R1=Glc, R2=H, R3=Ara

28 R1=Glc, R2=Glc

26 R1=Glc, R2=OH, R3=Glc

29 R1=SO3H, R2=H

27 R1=Glc, R2=OH, R3=H

Hình 1.6. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 1

21 R=H

22 R=H

23 R=SO3H

24 R=SO3

Hình 1.7. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 2
e. Dẫn xuất thiophen và polyacetylen
Năm 1966, F. Bolhman và cộng sự thuộc Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin
Đức đã phân lập 2 dẫn xuất thiophen (30, 31) và polyacetylen (32) từ lá khô của cỏ
nhọ nồi. Cùng năm 1966, N. R. Krishnaswamy và cộng sự tại Đại học Delhi Ấn Độ
đã xác định được cấu trúc của α-terthienyl methanol (33) từ Eclipta alba. Năm
1985,
P. Sing và cộng sự tại Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin Đức đã phân lập từ rễ và
phần trên mặt đất của Eclipta alba được một thành phần dithienyl acetylen (34).

30

31

32

33

34
Hình 1.8. Cấu trúc của các dẫn xuất thiophen và polyacetylen

f. Tinh dầu
Các thành phần tinh dầu chính bao gồm heptadecane, 6,10,14-trimethyl-2pentadecanone, axit n-hexadecanoic, pentadecane, eudesma-4 (14), 11-diene,
phytol, octadec-9-enoic axit diisooctylester, (Z, Z) -9,12- octadecadienoic acid,
(Z) -7,11- dimethyl-3- methylene-1,6,10-dodecatriene và (Z, Z, Z) -1,5, 9,9tetramethyl-1,4,7- cycloundecatriene. D-dithienylacetylene ester, ecliptal hoặc αterthienyl aldehyd, α- terthienyl-metanol và α-formylterthienyl [31].
1.2.4 Tác dụng sinh học của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)
a. Tác dụng giảm đau, chống viêm
Dữ liệu thu được từ các thí nghiệm cho thấy dịch chiết ethanol và alkaloid
toàn phần của Eclipta alba có hoạt tính giảm đau tốt khi được dùng với liều
150mg/kg, 250 mg/kg và 500 mg/kg theo đường uống. Tác dụng giảm đau này có
hiệu quả như nhau ở cả cơn đau trung tâm cũng như ngoại biên [47].
Khả năng chống viêm của dịch chiết methanolic của lá cỏ nhọ nồi đã được
nghiên cứu trên mơ hình gây phù chân chuột bằng carrageenin và lòng trắng trứng.
Sử dụng liều 100 và 200 mg/kg dịch chiết methanol của cỏ nhọ nồi bằng đường
uống cho thấy hoạt động chống viêm đáng kể trên mơ hình gây phù chân chuột
bằng carrageenin và lòng trắng trứng được so sánh với indomethacin
(10mg/kg) và cyproheptadine (8 mg/kg) [9].
b. Tác dụng kháng khuẩn, chống nấm
Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu tiềm năng chống vi khuẩn của Eclipta
alba và đã chỉ ra rằng Eclipta alba có đặc tính kháng khuẩn. Các nghiên cứu cho
thấy rằng các hợp chất thu được từ Eclipta alba cho hoạt động tốt chống lại
Staphylococcus aureus, Eclipta Coli, Staphylococcus cholermidis và Salmonella
typhimurium [18].
Cỏ nhọ nồi có tác dụng chống lại các chủng nấm: Aspergillus niger,
Aspergillus fumigatus, Fusarium solani và Aspergillus flavus. Hoạt tính kháng nấm
in vitro của dịch chiết Eclipta alba đã được nghiên cứu chống lại nấm Candida
tropicalis, Rhodotorula glutinis và Candida albicans [29].


c. Tác dụng bảo vệ gan

Dịch chiết ethanol/nước (1:1) của Eclipta alba ức chế tác dụng của CCl4 và
điều chỉnh các enzyme chuyển hóa thuốc của microsome gan (amidopyrine-Ndemethylase và glucose-6-phosphatase liên kết màng). Nghiên cứu cho thấy rằng
hoạt động bảo vệ gan của Eclipta alba là sự điều chỉnh mức độ của các enzyme
chuyển hóa thuốc của microsome gan. Các dịch chiết methanol của lá và dịch chiết
chloroform của rễ Eclipta alba cho thấy các hoạt động tương ứng làm giảm 72,8%
và 47,96% enzyme lysosomal. Từ dịch chiết methanol của lá, triterpenoid
eclabasaponin làm giảm 78,78% và alkaloid làm giảm 60,65% lượng CCl4 làm
tăng enzyme lysosomal trong máu. Coumestan và saponin triterpenoid từ dịch
chiết chloroform của rễ tương ứng làm giảm 75,6% và 52,41% nồng độ CCl4.
Eclipta alba được báo cáo là có tác dụng bảo vệ đối với tổn thương gan cấp tính
do CCl4, bằng cách làm giảm hoại tử, thối hóa của các tế bào nhu mơ gan [48],
[50].
d. Tác dụng lên thần kinh và chống độc
Các nghiên cứu liên quan đã chỉ ra rằng dịch chiết Eclipta alba với liều 300
mg/kg cho thấy hoạt động của các chất cải thiện khả năng hoạt động của hệ thần
kinh ở chuột [51].
Chiết xuất ethyl acetate của Eclipta alba và wedelolactone đã chứng minh
hoạt tính chống tăng huyết áp và chống lại nọc độc rắn Malaya Pit Viper [44].
Hoạt tính chống sốt rét của dịch chiết từ lá Eclipta alba đã được đánh giá là
chống lại chủng Plasmodium berghei ANKA ở chuột [10].
e. Hoạt động diều hòa miễn dịch
Các nghiên cứu sơ bộ đã cho thấy hoạt động điều hòa miễn dịch của dịch
chiết methanol của Eclipta alba. Wedelolactone và demethylwedelolactone, được
phân lập từ Eclipta alba đã chứng minh tác dụng ức chế trypsin. Cả hai hợp chất
cho thấy hoạt động mạnh mẽ với giá trị IC50 là 2,9 và 3,0 μg/ml, tương ứng.
Eclipta alba có tác dụng bảo vệ các mơ thần kinh có thể là do hoạt động điều hịa
miễn dịch của Eclipta alba. Do đó, Eclipta alba có thể phục vụ như một bộ điều
biến bộ nhớ tiềm năng. Thử nghiệm được thực hiện để đánh giá hoạt tính điều hịa
miễn dịch của dịch chiết metanol của toàn bộ cây Eclipta alba ở năm mức liều từ
100 đến 500 mg/kg làm tăng đáng kể chỉ số thực bào và hiệu giá kháng thể và tỷ

lệ F của chỉ số thực bào và số lượng bạch cầu cũng tăng [32].


f. Hoạt động chống ung thư
Dịch chiết methanol của Eclipta alba được đánh giá là hoạt động chống ung
thư của nó chống lại Ehrlich Ascites Carcinoma (EAC) ở chuột bạch tạng. Hoạt
động chống ung thư được kiểm tra bằng cách xác định khối lượng khối u, số lượng
tế bào khối u, số lượng tế bào khối u còn sống, số lượng tế bào khối u không thể
sống, thời gian sống trung bình và tăng tuổi thọ trong các mơ hình động vật thí
nghiệm. Dịch chiết làm tăng tuổi thọ của chuột được điều trị EAC và khôi phục các
thông số huyết học so với chuột mang EAC [25].
Coumestans cũng được biết là hoạt động như phytoestrogen. Ở nhiều nước,
nó được sử dụng như chế độ ăn uống đóng vai trị là tác nhân phịng ngừa hóa học
trong ung thư vú và tuyến tiền liệt. Dasyscyphin-C (saponin) một hợp chất phân lập
mới từ Eclipta alba được báo cáo với hoạt tính chống ung thư - gây độc tế bào [40].
g. Ngăn rụng tóc, kích thích mọc tóc
Eclipta alba được sử dụng trong các chế phẩm dưỡng tóc vì nó thúc đẩy mọc
tóc và duy trì độ đen của tóc. 10% w/v của Eclipta alba là thành phần chính trong
việc điều chế công thức thảo dược hỗ trợ cho sự phát triển của tóc.
Eclipta Alba là một loại thảo dược phổ biến để kích thích sự phát triển của
tóc. Dịch chiết ether và dịch chiết ethanol đã được phối hợp vào dạng kem (nước
trong dầu) và bôi tại chỗ trên da bị bong tróc của chuột bạch tạng trong một thử
nghiệm. Thời gian cần thiết để bắt đầu phát triển tóc cũng như hồn thành chu kỳ
tăng trưởng tóc được ghi lại. Dung dịch Minoxidil 2% được áp dụng tại chỗ và
đóng vai trò chứng dương để so sánh. Kết quả điều trị với dịch chiết ether 2% và
5% tốt hơn so với minoxidi 2% (chứng dương) [46].
h. Tác dụng hạ đường huyết
Về tác dụng hạ đường huyết, sử dụng Eclipta alba qua đường uống trong 2
tháng đã được chứng minh là làm giảm glucose máu, glycosylated hemoglobin
HbA1c, giảm hoạt động của glucose-6-phosphatase và fructose-1,6-bisphosphatase,

và tăng hoạt động của hexokinase gan. Eclipta alba đã được chứng minh có hoạt
động trị tiểu đường và lợi tiểu bằng cách tác động lên tuyến tụy nhờ phục hồi và
tái tạo hoạt động tế bào β của tụy [8].


CHƯƠNG 2:
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1

Đối tượng
Dược liệu nghiên cứu là cây cỏ nhọ nồi Eclipta alba được thu hái từ tỉnh
Thanh Hóa, trong tháng 06/2018. Dược liệu thu về được sấy khô ở nhiệt độ 50600C đạt độ ẩm khoảng 5%, thái nhỏ hoặc xay nhỏ và bảo quản trong túi polymer
để nơi khơ ráo, tránh ẩm.

2.2

Hóa chất, thiết bị

2.2.1 Hóa chất
- Dung mơi cơng nghiệp dùng trong chiết xuất: methanol, ethanol, n-hexan, ethyl
acetat, dicloromethan, aceton.
- Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol đốt nóng để phát hiện viết chất trên
bản mỏng.
- Bản mỏng tráng DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản
mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm).
- Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck).
- Chất chuẩn wedelolacton, quercetin, methyl gallat đạt tinh khiết 98%.
2.2.2 Thiết bị
- Máy cất quay Rotavapor R-220 (Buchi).

- Máy cất quay Buchi dung tích bình cất 250ml, 500ml, 1000ml.
- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115.
- Máy siêu âm Power sonic 405.
- Bếp điện, bếp cách thủy Memmert.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu Detector Diode array.
- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, Máy đo hàm ẩm.
- Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV.


- Dụng cụ thủy tinh: Bình gạn 1000ml, bình nón 250ml, bình cầu các dung
tích 250ml, 500ml, 1000ml, cột sắc ký các loại, phễu thủy tinh, ống đong, ống
nghiệm các kích thước,…
2.3

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập
- Cỏ nhọ nổi được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng với methanol, sau đó lọc
loại bã dược liệu và gộp dịch chiết. Tiếp theo cất thu hồi dung mơi dưới áp suất
giảm thu được cao đặc tồn phần.
- Cao toàn phần được phân tán trong nước và chiết phân đoạn lần lượt với dung
mơi có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat thu được các phân đoạn tương
ứng.
- Phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel
pha thường (0,040-0,063 mm, Merck) kết hợp với phương pháp kết tinh lại trong
dung mơi. Tiến hành q trình sắc ký cột:
+ Khảo sát cao tổng bằng sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung mơi khác
nhau, chọn hệ dung mơi có khả năng tách tốt để làm dung môi rửa giải.
+ Chuẩn bị cột: cột sắc ký khô, sạch, lắp thẳng đứng trên giá cố định. Nhồi
một lớp bông xuống đáy cột. Cân một lượng chất nhồi cột thích hợp vào cốc có mỏ,

thêm dung mơi thích hợp vào khuấy đều cho hết bọt khí. Đưa từ từ hỗn hợp chất
nhồi cột lên cột, gõ nhẹ, đều tránh bọt khí. Sau đó, tiếp tục cho dung mơi chảy liên
tục qua cột đến khi cột ổn định.
+ Nạp mẫu: trộn đều chất hấp phụ với dung dịch mẫu phân tích, làm bay hơi
dung mơi đến khi được bột tơi mịn thì đưa mẫu lên cột, rải thành một lớp đều trên
mặt cột. Sau đó, đặt một miếng bơng lên để bảo vệ bề mặt cột.
+ Rửa giải: sử dụng hệ dung môi thích hợp để rửa giải.
- Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành trên bản mỏng tráng
sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck), RP-18 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử
ngoại ở hai bước sóng 254 nm, 366 nm và dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%
trong ethanol.
- Thu gom các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau. Kiểm tra độ sạch của các chất
phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi phù hợp.


2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc
Cấu trúc các hợp chất được xác định thông qua sự kết hợp của các phương
pháp phổ hiện đại và các đặc trưng hóa lý (điểm nóng chảy). Các phương pháp phổ
được dùng phổ biến trong xác định cấu trúc là phổ khối lượng (Mass spectrometry
- MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance - NMR).
- Phổ khối lượng: Cung cấp thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử.
Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ
sẽ tuân theo những định luật nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra
những phân mảnh giống nhau. Từ khối lượng các phân mảnh của phân tử, cùng các
phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chất chưa
biết. So sánh phổ khối của một chất chưa biết với phổ khối của một chất đã biết có
thể giúp định danh chất chưa biết đó dễ dàng và chính xác [3].
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Khi đặt một chất có hạt nhân có số spin (I) lẻ (1H,
13

C...) được đặt trong một từ trường ngoài (B0), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp
lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân
bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái. Nếu dùng một
bức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng
lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ
trường). Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về
trạng thái cân bằng. Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố
trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của
các chất đó. Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ta có thể đo 1 hay
nhiều loại phổ khác nhau. Xác định phổ của cùng một loại hạt nhân ( 1H hay 13C)
như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hay các mối tương
quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY) [3].
Các phương pháp được sử dụng để xác định cấu trúc các hợp chất được phân
lập từ cỏ nhọ nồi là:
- Điểm nóng chảy.
- Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC.


CHƯƠNG 3:
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Chiết các phân đoạn Cỏ nhọ nồi và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn
etyl acetat
3.1.1. Kết quả chiết phân đoạn Cỏ nhọ nồi
Lấy 2 kg cỏ nhọ nồi được xay mịn chiết nóng với MeOH, chiết 3 lần ở 700C,
mỗi lần 3 giờ, với tỉ lệ DL/DM: 1/8. Sau đó, lọc lấy dịch chiết và cô dưới áp suất
giảm thu được cao tổng NTP (288,3 g).
Phân tán 280g NTP vào 2l nước sau đó lắc phân đoạn với hệ dung mơi có độ
phân cực tăng dần: n-hexan và EtOAc, 3 lần với mỗi dung môi. Gộp dịch chiết và

cô dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn tương ứng: phân đoạn n-hexan
(NH: 20,6g), phân đoạn EtOAc (NE: 60,9g) và phân đoạn nước (NW: 197,3 g)
được biểu diễn như Hình 3.1.
Bột Cỏ nhọ nồi
(2kg)

Chiết với MeOH, 700C, 3 lần
Lọc lấy dịch
Cô quay

Cao tổng (NTP)
(288,3g)

Phân tán cao trong nước
Lắc phân đoạn lần lượt với
n-hexan (x3), EtOAc (x3)

Cao n-hexan (NH)
(20,6g)

Cao EtOAc (NE)
(60,9g)

Cao nước (NW) (197,3g)

Hình 3.1. Sơ đồ phương pháp chiết xuất phân đoạn Cỏ nhọ nồi


3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất trong Cỏ nhọ nồi
Dùng 60g cao phân đoạn NE tiến hành sắc ký cột pha thường silica gel với

hệ dung môi gradient là: DCM-MeOH (100%, 30/1, 20/1, 10/1, 8/1, 5/1) thu
được 7 phân đoạn ký hiệu là: NE1-7.
Sắc ký cột pha thường phân đoạn NE4 (5,3g) với hệ dung môi DCM-MeOH
(10/1) thu được phân đoạn ký hiệu là: NE4.1- 4.4. Phân đoạn NE4.1 (1,9g) được
tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi DCM-MeOH (8/1), kết tinh lại thu
được hợp chất N01 (426mg) và N02 (112mg). Phân đoạn NE4.2 (1,1g) được tiến
hành tiến hành sắc ký cột pha thường, hệ dung môi rửa giải DCM-MeOH (8/1), kết
tinh lại thu được hợp chất N03 (48 mg).
NE (60g)

nd

CC: pha thường
DCM/MeOH (100%, 30/1, 20/1,
10/1, 8/1, 5/1)

NE1

…

…

NE4 (5,3g)

NE7

CC: pha thường
DM: DCM/MeOH (10/1)

NE4.2 (1,1g)

NE4.1 (1,9g)

CC: pha thường
DM: DCM/MeOH (8/1)

NE4.3

NE4.4

CC: pha thường
DM: DCM/MeOH (8/1)

N03
(48mg)
N01
(426mg

N02
(112mg)

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao phân đoạn EtOAc của cỏ nhọ nồi


N01

N01

NE

UV 254nm

NE

UV 366nm

N01

V

NE

TT H2SO4 10%/Ethanol

DM: DCM/MeOH: 8/1
Hình 3.3. SKĐ TLC của N01 và cao EtOA

N02

NE

N02

UV 254nm

NE

UV 366nm

N02

NE

TT H2SO4 10%/Ethanol

DM: DCM/MeOH: 8/1
Hình 3.4. SKĐ TLC của N02 và cao EtOAc

@
N03

N03

NE

UV 254nm

NE

UV 366nm

N03

NE

TT H2SO4 10%/Ethanol

DM: DCM/MeOH: 8/1
Hình 3.5. SKĐ TLC của N03 và cao EtOAc