Báo cáo đề tài nghiên cứu khao học sinh viên: Khảo sát đa dạng di truyền và xác lập chỉ thị phân tử cho việc nhận dạng một số dòng Bơ (persea americana miller) đã qua sơ bộ tuyển chọn tại Lâm Đồng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC

BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN


ĐỀ TÀI
KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC
LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHO VIỆC NHẬN
DẠNG
MỘT SỐ DÒNG BƠ
(Persea americana Miller)
ĐÃ QUA SƠ BỘ TUYỂN CHỌN TẠI LÂM
ĐỒNG
Giáo viên hướng dẫn:
LÊ NGỌC TRIỆU
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HOÀNG PHONG (CSK 38)
NGUYỄN THANH TIỀN (CSK 38)
MAI TIẾN ĐẠT (CSK 39)
THÁI THẠCH BÍCH (CSK 39)


ĐẶT VẤN ĐỀ




Đánh giá đa dạng di truyền, xác lập chỉ thị phân tử cùng với khảo sát
hình thái cũng như đặc điểm nơng học của các tập đồn giống đã được
tiến hành phổ biến trên các đối tượng tài nguyên thực vật. Đây là
những công việc cần thiết nhằm làm tăng hiệu quả cho quá trình nhận

dạng, phát triển và chọn tạo giống mới đối với cây trồng.
Bơ là một loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao, có tiềm năng phát triên
ở Lâm Đồng. Đã có nhiều chủng giống bơ được trồng nơi đây nhưng cơ
sở dữ liệu cho việc nhận dạng, chọn tạo và công nhận giống cịn chưa
hồn thiện, cần phải được nghiên cứu thêm. Trước mặt cần triển khai
ghi nhận đặc điểm sơ bộ về hình thái quả và năng suất của các dòng bơ
đang được phát triển; đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn này và xác
lập chỉ thị phân tử cho việc nhận dạng các dòng bơ tiềm năng nhằm:
- Bổ sung cho cơ sở dữ liệu nhận dạng dòng đối với cây trưởng thành
cũng như ngay từ giai đoạn vườn ươm.
- Tạo cơ sở cho chiến lược chọn tạo và phát triển giống.
Đó là lý do đề tài này được đăng ký và triển khai thực hiện.


Vật liệu:
Qua khảo sát ban đầu, có nhiều dịng/giống bơ nhập nội và được chọn tạo trong
nước được canh tác tại Lâm Đồng. Tuy vậy có 11 dịng bơ được chọn tạo trong
nước đang được phát triển. Đây là đối tượng nghiên cứu chính của đề tài.

11 dịng được khảo sát các đặc
điểm cơ bản về năng suất và hình
thái quả và đánh giá đa dạng di
truyền gồm:
04
05
Hải triều 1
Hải Triều 2
34
36
34 lai

HO
TO
BM00
BM02

Trong đó, 06 dịng cần được
xác lập chỉ thị phân tử, gồm:
04
05
Hải triều 1
Hải Triều 2
34
36


Nội dung, phương pháp và kết quả
Nội dung 1: Ghi nhận sơ bộ đặc điểm hìnhnghiên
thái và nơng cứu
học của
các dòng bơ khảo sát

Phương pháp:
Dựa vào dữ liệu ghi nhận thực tế và thu thập thông tin từ người
dân, các nhà nghiên cứu, kinh doanh bơ, đặc biệt là tham khảo
kết quả nghiên cứu của Trung tâm Nghiên cứu và phát triển cây
trồng thành phố Bảo Lộc.
Các đặc điểm ghi nhận gồm:
+ Đặc điểm quả: màu sắc, độ dày vỏ, chất lượng thịt quả, kích
thước hạt, trọng lượng và hình dạng chung của quả.
+ Đặc điểm năng suất

thông qua các phiếu hỏi.


Kết quả:
DÒNG BƠ 04
Địa chỉ thu mẫu: Đức Giang – Bảo Lâm
Năng suất: 300kg/cây/năm
Quả thon dài, thịt quả vàng nhạt, ráo, dẻo
Khi chín vỏ quả màu xanh
Cỡ hạt: Trung bình


DỊNG BƠ 05
Địa chỉ thu mẫu: Thơn 8 – Tâm châu – Di Linh
Năng suất: 220kg/cây/năm
Thịt qủa vàng, hạt nhỏ
Quả thn dài
Vỏ quả chín có màu xanh
Cỡ hạt: Trung bình
Trọng lượng quả trung bình: 600g


DÒNG BƠ 34
Địa chỉ thu mẫu: khu 4 – Phường B’Lao – Bảo Lộc.
Năng suất: khoảng 300kg/cây/năm
Chín vỏ da màu xanh thn dài, cơm vàng, hạt bé ( có trái không hạt )
Chiều dài quả từ 25 cm đến 35 cm
Khối lượng quả từ 300g đến 800g

DÒNG BƠ 34 LAI

Địa chỉ thu mẫu: Trang trại giống bơ Hải Triều – Đambri – Bảo
Lộc
Năng suất: khoảng 250kg/cây/năm
Khi chín vỏ quả có màu xanh, quả hơi trịn
Hạt trung bình, khơng dính vỏ


DÒNG BƠ 036
Địa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS. Nguyễn Văn Kết - Đức Trọng- Lâm
Đồng
Năng suất: 200- 300 kg/cây/năm
Vỏ quả chín có màu xanh, quả hình bầu dục, thịt quả dày màu vàng
đậm, dẻo, béo
Trọng lượng quả trung bình 750g
Kích cỡ hạt: Trung bình


DÒNG BƠ HO
Địa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS. Nguyễn Văn Kết
Đức Trọng- Lâm Đồng
Năng suất: 160 – 180 kg/cây/năm
Trọng lượng quả: 380 – 450 g
Vỏ quả già màu tím nhạt, thịt quả vàng kem, khá béo, không xơ.
Hạt gắn khít thịt quả nhưng dễ tách.
Hoa sai, khả năng đậu quả cao


DÒNG BƠ TO

Địa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS. Nguyễn Văn Kết
Đức Trọng- Lâm Đồng
Năng suất: 150 – 200 kg/cây/năm
Trọng lượng quả: 380 – 450 g
Vỏ quả già màu tím nhạt, hơi sần, khơng xơ
Kích cỡ hạt: Trung bình
Hoa trổ đồng thời và đều nhau trên toàn cây


DÒNG BƠ BM00
Địa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS. Nguyễn Văn Kết
Đức Trọng- Lâm Đồng
Năng suất: 160 – 180 kg/cây/năm
Trọng lượng quả: 380 – 450 g
Vỏ quả già màu tím, mỏng, nhẵn bóng, cơm dày, ít sơ
Kích cỡ hạt: Trung bình


DÒNG BƠ BM02
Địa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS. Nguyễn Văn Kết
Đức Trọng- Lâm Đồng
Năng suất: 140 – 180 kg/cây/năm
Trọng lượng quả: 180 – 200 g
Quả hình trịn đều
Vỏ quả chín xanh, hơi sần,
Kích cỡ hạt: Trung bình


DÒNG BƠ HẢI TRIỀU 2
Địa chỉ thu mẫu: Trang trại giống bơ Hải Triều – Đambri - Bảo Lộc

Năng suất: Vẫn chưa rõ
Màu quả khi chín : Xanh
Hình hạng quả: Oval hơi dài
Thịt quả: Vàng nhạt, không sơ, đặc đều
Hạt: Trịn, khơng lắc
Khối lượng của quả: 250- 475g
DỊNG BƠ HẢI TRIỀU 1
Địa chỉ thu mẫu: Trang trại giống bơ Hải Triều – Đambri - Bảo Lộc
Năng suất: 650 kg/cây/năm
Màu quả khi chín : Xanh
Hình hạng quả: Oval dài đều
-Hạt: Dính thịt quả , khơng lắc, hình trịn
-Khối lượng của quả: 420- 680g


Nội dung 2: Tách chiết, kiểm tra nồng độ và chất lượng DNA
DNA từ mẫu lá được tách chiết theo quy trình CTAB I có cải tiến (bổ sung SDS 10%
vào đệm chiết)

DNA sau tách chiết được kiểm tra nồng độ và chất lượng bằng
phương pháp kiểm tra mật độ quang ở các bước sóng 260nm và
280nm.
Kết quả
+ 11 mẫu DNA của 11 dịng bơ khảo sát, trong đó có 6 dòng cần phát triển marker
nhận dạng với 3 mẫu/dòng đã được tách chiết và tinh sạch
+ Các mẫu DNA sau tách chiết đạt độ tinh sạch cao với lượng đủ cho các thực
nghiệm tiếp theo.


Nội dung 3: Làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA dựa trên PCR

Phương pháp:
Sử dụng kỹ thuật ISSR (Khuếch đại đoạn giữa các trình tự lặp đơn giản) để làm nảy
sinh đặc trưng nhận dạng DNA với 10 mồi được sử dụng sau:
STT

Tên mồi

Trình tự

Ta
(0C)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

ISSR 808
ISSR 844B
ISSR 17899B
HB9
HB14
HB13
UBC 856C

UBC 856T
UBC 873
UBC 859G
Tổng thể

5' –(AG)8 C-3'
5' –(CT)8 GC-3'
5'-(CA)6 GG-3'
5'-(GT)6 GG-3'
5'-(CTC)3 GC-3'
5'-(GAG)3 GC-3'
5'-(AC)8 CA-3'
5'-(AC)8 TA-3'
5'-(GACA)4 -3'
5' –(TG)8 GC-3'

52
52
54
52
52
52
52
52
52
51,5

Số band ghi nhận
cho đánh giá đa
dạng di truyền11

dòng bơ
7
10
16
7
10
11
9
11
15
2
98

Số band ghi nhận cho
việc xác lập chỉ thị
phân tử nhận dạng 6
dòng bơ
17
18
12
14
11
10
14
13
14
02
125

Khuếch đại DNA: Phản ứng PCR được thực hiện với dung tích 20
µl chứa 2 mM MgCl2, 0.25 mM mỗi loại dNTP, 1U Taq DNA
polymerase (ThermoScientific), 0.2 µM mồi và khoảng 30 ng
khn mẫu DNA, BSA 0.5%.
Chương trình nhiệt sau:
94 0C trong 5 phút;
10 chu kỳ, mỗi chu kỳ có tiến trình nhiệt
94 0C trong 45 giây
Nhiệt độ bắt mồi thích hợp +5 (Ta +5) 0C (Ta trong bảng trên)
trong 45 giâygiảm dần 0,5 0C/chu kỳ
Kéo dài mạch ở 720C trong 1 phút 30 giây;
36 chu kỳ, mỗi chu kỳ có tiến trình nhiệt
94 0C trong 45 giây
Nhiệt độ bắt mồi thích hợp (Ta) trong 45 giây
Kéo dài mạch ở 720C trong 1 phút 30 giây
Bước kéo dài mạch cuối cùng ở 720C trong 15 phút.
(Touchdown PCR)
Điện di, chụp ảnh gel: Sản phẩm khuếch đại được phân tách trên gel agarose 2%,
sử dụng đệm TBE với điện thế 60 Volt, gel sau điện di được nhuộm với ethidium
bromide (0.5 µg/ml), và được chụp ảnh dưới các ánh sáng cực tím có bước sóng
254/312 nm


Kết quả:
Ảnh gel Đặc trưng nhận dạng DNA phục vụ cho đánh
giá đa dạng di truyền 11 dòng bơ theo 10 mồi
Mồi ISSR 808

Mồi ISSR 844B

Mồi ISSR 856C

Mồi ISSR 856T

Mồi ISSR 17899B

Mồi ISSR HB13

Mồi ISSR UBC859G

Mồi ISSR UBC873

Mồi ISSR HB9

Mồi ISSR HB14

Ghi chú: 1: dòng 04, 2: dòng 05, 3: dòng Hải Triều 2, 4: dòng Hải Triều 1, 5: dòng
34; 6: dòng 36; 7: dòng 34 lai; 8: dòng HO, 9: dòng TO; 10: dòng BM00, 11: dòng
BM020.


Ảnh gel Đặc trưng nhận dạng DNA phục vụ cho việc xác lập marker phân tử
nhận dạng 06 dòng bơ theo 10 mồi
Mồi ISSR 808

Mồi ISSR 844B

Mồi ISSR 856C

Mồi ISSR 856T

Mồi ISSR 17899B

Mồi ISSR HB9

Mồi HB13

Mồi HB14

Mồi ISSR UBC873

Mồi ISSR UBC859G

Ghi chú: 1, 2, 3: các mẫu dòng 04; 4, 5, 6: các mẫu dòng 05; 7, 8, 9: các mẫu dòng
Hải Triều 2; 10, 11, 12: các mẫu dòng Hải Triều 1; 13, 14, 15: các mẫu dòng 34; 16,
17, 18: các mẫu dòng 36.

Dựa trên sự xuất hiện hay vắng mặt các band trên gel, thiết lập ma trận 0/1 để
đánh giá đa dạng và xây dựng marker cho việc nhận dạng dòng


Nội dung 4: Đánh giá đa dạng di truyền
Sử dụng phương pháp đánh giá đa dạng di truyền trong tập hợp mẫu của de
Vicente và cs., 2003 với công cụ Microsoft Excel, các chỉ tiêu:
Tỷ lệ % band đa hình:
Cơng thức tính : PPB = npj/ntotal × 100
Với npj là số lượng band đa hình và ntotal là tổng số band ghi nhận.
Mức độ dị hợp trung bình:
Cơng thức tính : He = ΣjLhj/L; hj = 1 – Σ(pi)2
Với hj là mức độ dị hợp tử của locus thứ j, pi là tần số của allele thứ i ở

locus thứ j, He là mức độ dị hợp trông đợi trung bình cho tất cả các locus
khảo sát và L là tổng số locus.
Ngoài ra, phần mềm Popgen32 được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền
tập hợp các dòng bơ khảo sát, hai chỉ số đa dạng là chỉ số đa dạng gene (h)
và chỉ số đa dạng Shannon (I) cho tập hợp mẫu thu được.


Kết quả
Sử dụng công cụ Excel với các công thức như trình bày như trên, thu
được kết quả về sự đa dạng di truyền tập hợp 11 mẫu khảo sát như
sau:
+ Tỷ lệ phần trăm band đa hình:
PPB = 91,84%
+ Mức độ dị hợp trơng đợi trung bình:
He = 0,3072
Sử dụng phần mềm Popgen 32, thu được kết quả sau:
+ Chỉ số đa dạng gene (tương ứng với mức độ dị hợp trơng đợi trung
bình):
h = 0,3072
+ Chỉ số Shannon:
I = 0,4608
Mức độ đa dạng di truyền của tập hợp mẫu trong nghiên cứu này
thấp hơn so với các nghiên cứu trước đây với tập hợp mẫu lớn hơn
của các dòng/giống bơ thu thập từ nhiều nơi trên thế giới. Điều này
cho thấy có thể các dịng bơ được phát triển nội địa được khảo sát
trên địa bàn tỉnh Lâm Đồng có nguồn gốc gần nhau.


Nội dung 5: Xây dựng marker phân tử cho việc nhận dạng 06
dòng bơ tiềm năng

Phương pháp:
Dựa trên Kết quả phân tích ảnh điện di và ma trận dữ liệu về sự xuất
hiện/thiếu vắng các band một cách đặc biệt trên gel điện di, hai kiểu
chỉ thị phân tử đơn và kép được xác định để nhận dạng các dòng.


Kết quả


Với cách thức như trên, 9 chỉ thị đơn và 25 chỉ thị kép đã được xác định để
nhận dạng 06 dòng bơ khảo sát, cụ thể:
+ Nhận dạng dòng 04: Vắng band 520bp mồi UBC 873; Vắng band 700bp mồi
UBC 856T (02 chỉ thị đơn); Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời có band
400bp mồi 17899B; Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời có band 400bp
mồi UBC 856C; Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời có band 540bp mồi
808; Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời vắng band 750bp mồi 17899B và
Vắng band 280bp mồi UBC873 đồng thời vắng band 1500bp mồi HB13 (07 chỉ
thị kép).
+ Nhận dạng dịng 05: Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi
17899B; Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi UBC 856C;
Vắng band 580bp mồi HB9 đồng thời có band 540bp mồi 808; Vắng band
580bp mồi HB9 đồng thời vắng band 750bp mồi 17899B và Vắng band 580bp
mồi HB9 đồng thời vắng band 1500bp mồi HB13 (chỉ có 05 chỉ thị kép).
+ Nhận dạng dịng Hải Triều 2: Vắng band 400bp mồi 17899B; Vắng band
400bp mồi UBC 856C; Vắng band 540bp mồi 808; Có band 750bp mồi 17899B
và Có band 1500bp mồi HB13 (05 chỉ thị đơn); Có band 890bp mồi HB9 nhưng
vắng band 700bp mồi 17899B; Vắng band 280bp mồi UBC 873 nhưng có band
520bp mồi UBC 873 và Vắng band 280bp mồi UBC 873 nhưng có band 700bp
mồi UBC 856T (03 chỉ thị kép).

Kết quả
+ Nhận dạng dịng Hải Triều 1: Có band 790bp mồi HB14 đồng thời có
band 400bp mồi 17899B; Có band 790bp mồi HB14 đồng thời có band
400bp mồi UBC 856C; Có band 790bp mồi HB14 đồng thời có band
540bp mồi 808; Có band 790bp mồi HB14 đồng thời vắng band 750bp
mồi 17899B; Có band 790bp mồi HB14 đồng thời vắng band 1500bp mồi
HB13 và Có band 500bp mồi 844B đồng thời vắng band 700bp mồi
17899B (chỉ có 06 chỉ thị kép).
+ Nhận dạng dịng 34: Có band 700bp mồi 17899B (01 chỉ thị đơn); Có
band 890bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi 17899B; Có band
890bp mồi HB9 đồng thời có band 400bp mồi UBC 856C; Có band
890bp mồi HB9 đồng thời có band 540bp mồi 808; Có band 890bp mồi
HB9 đồng thời vắng band 750bp mồi 17899B; Có band 890bp mồi HB9
đồng thời vắng band 1500bp mồi HB13 và Có band 500bp mồi 844B
đồng thời có band 890bp mồi HB9 nhưng có band 400bp mồi 17899B/
band 400bp mồi UBC 856C/ band 540bp mồi 808 hoặc vắng band 750bp
mồi 17899B/ band 1500bp mồi HB13 (06 chỉ thị kép).
+ Nhận dạng dịng 36: Có band 220bp mồi HB9 (chỉ có 01 chỉ thị đơn)