KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (DL và DLS) nghiên cứu tác dụng của tam thất hoang trên sự biểu hiện COX 2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG
(Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)
TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL HÓA
VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CƠ LẬP

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG
(Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)
TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL
HÓA VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CƠ LẬP

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa

:

Người hướng dẫn : 1.
2.

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn bộ Ban chủ nhiệm khoa Y - Dược,
Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng, Bộ môn Y - Dược
học cơ sở đã tạo điều kiện cho em để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin
chân thành cảm ơn các thầy cơ đã giảng dạy, giúp đỡ em hồn thành chương trình
học tập trong suốt 5 năm qua.
Em xin bày tỏ sự tri ân và lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Thị Thơm và
PGS. TS. Dƣơng Thị Ly Hƣơng, những người đã ln tận tình hướng dẫn, tạo
điều kiện giúp em hồn thành khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Bộ
môn Dược lý – Dược lâm sàng, thầy cô Bộ môn Y – Dược học cơ sở đã giúp đỡ em
trong quá trình hồn thành khóa luận.
Em xin cảm ơn chương trình thuộc đề tài Tây Bắc: “Ứng dụng các giải pháp
khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ 2 loài
cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax
stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/1318 đã tài trợ kinh phí để em thực hiện được nội dung nghiên cứu này. Em cũng xin
cảm ơn Bộ môn Sinh lý học, Học viên Quân Y đã giúp đỡ em thực hiện thí nghiệm.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân
đã luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ em hồn thành khóa luận này.
Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi thiếu sót,
em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cơ để khóa luận thêm hồn thiện.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Sinh viên

3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Giải thích

ACh

Acetylcholin

BH4

Tetrahydrobiopterin

CaM

Camodulin

CD

Cụm biệt hóa (Cluster of differentiation)

cGMP

GMP vịng (Cyclic guanosine monophosphate)

COX

Cyclooxygenase

COX-1

Cyclooxygenase-1

COX-2

Cyclooxygenase-2

eNOS

Endothelial nitric oxide synthase

FAD

Flavin adenine dinucleotide

FMN

Flavin mononucleotide

GTP

Guanosine-5'-triphosphate

HUVEC

Tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (Human umbilical
vein endothelial cell)

ICAM - 1

Phân tử kết dính liên bào 1 (Intercellular adhesion molecule 1)

iNOS

Inducible nitric oxide synthase

LD50

Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lethal Dose 50%)

LPS

Lipopolyshaccharide

NADPH

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

nNOS

Neuronal nitric oxide synthase

NO

Nitric oxide

NOS

Nitric oxide synthase

NSAIDs

Thuốc chống viêm không steroid (Non-steroidal
anti- inflammatory drugs)

NST

Nhiễm sắc thể

PDGF

Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (Platelet-derived
growth factor)

PG

Prostaglandin

PGE2

Prostaglandine E2

PGI2

Prostacyclin

PS27

Cao giàu saponin Tam thất hoang

PSBt

Cao chiết bằng dung môi n - butanol Tam thất hoang

PSnH

Cao chiết bằng dung môi n - hexan Tam thất hoang

PST

Cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70% Tam thất hoang

RT-PCR

PCR thời gian thực (Reverse transcription polymerase
chain reaction)

Ser

Serine

sGC

Guanylyl cyclase hòa tan (Soluble guanylyl cyclase)

Thr

Threonin

TTH

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et
K.M.Feng)

VCAM-1

Phân tử kết dính tế bào mạch (Vascular cell adhesion
molecule)


DANH MỤC CÁC HÌNH

STT

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K.
M. Feng)

2

Hình 1.2

Cấu trúc hóa học các chất 1–15 phân lập từ

Panax stipuleanatus

3

Hình 1.3

Cấu trúc thành động mạch

5

Hình 1.4

Cấu trúc của eNOS

9

Hình 1.5

Sự điều hịa các vị trí phosphoryl hóa eNOS

11

Hình 1.6

Sự tổng hợp NO bởi eNOS và chức năng sinh lý của NO
nội mạc

12

Hình 1.7

Sinh tổng hợp prostaglandin

15

Hình 2.1

Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn Tam thất hoang

18

Hình 2.2

Sơ đồ chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang

19

Hình 2.3

Phương pháp gắn đoạn cơ trơn vào bình ni và hệ thống ghi

20

Hình 2.4

Sơ đồ phản ứng tạo màu của thuốc thử Griess với NO2

Hình 3.1

Sự giãn cơ trơn khí quản của cao tổng Tam thất hoang

25

Hình 3.2

Sự giãn cơ trơn cổ bàng quang của cao tổng Tam thất hoang

25

Hình 3.3

Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự
tổng hợp NO

26

Hình 3.4

Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự
biểu hiện protein eNOS phosphoryl hóa

27

Hình 3.5

Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự
biểu hiện mARN COX-2

28

Hình 3.6

Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự
biểu hiện protein COX-2

29

-

23


DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1

Các dạng của NOS

8

Bảng 3.1

Tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên cơ trơn cô lập

24


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1. Tổng quan về Tam thất hoang.............................................................................. 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật.................................................................................... 2
1.1.2. Sinh thái và phân bố................................................................................. 2
1.1.3. Thành phần hóa học................................................................................. 3
1.1.4. Tác dụng dược lý...................................................................................... 4
1.1.5. Công dụng................................................................................................ 4
1.2. Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS......................................................... 5
1.2.1. Nội mạc mạch máu................................................................................... 5
1.2.2. eNOS........................................................................................................ 6
1.3. Tổng quan về viêm và COX-2.......................................................................... 14
1.3.1. Viêm và prostaglandin trong viêm.......................................................... 14
1.3.2 COX – 2................................................................................................. 15

2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu............................................................... 18
2.1.1. Nguyên liệu............................................................................................ 18
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu............................................................................. 19
2.2. Dung mơi, hóa chất và thiết bị.......................................................................... 20
2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................... 21
2.3.1. Nghiên cứu tác dụng trên cơ trơn cô lập................................................. 21
2.3.2. Nghiên cứu sự biểu hiện của COX-2 và eNOS phosphoryl hóa.............22

3.1. Kết quả.............................................................................................................. 24

3.1.1. Tác dụng trên cơ trơn cô lập................................................................... 24
3.1.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa................................. 26
3.1.3. Tác dụng trên sự biểu hiện COX-2......................................................... 28
3.2. Thảo luận................................................................................................................. 30
3.2.1 Tác dụng trên cơ trơn cô lập................................................................... 30
3.2.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa................................. 31
3.2.3. Tác dụng trên sự biểu hiện của COX-2.................................................. 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nội mạc mạch máu là một lớp tế bào nội mơ mỏng nằm lót mặt trong của
lịng mạch [1]. Các tế bào này có khả năng sản xuất ra nitric oxid (NO), một chất
giãn mạch quan trọng và có nhiều vai trị trong điều hịa chức năng sinh lý của
mạch máu như trương lực mạch, sự kết tập tiểu cầu, sinh mạch, sự kết dính bạch cầu
– nội mô… Tại nội mạc mạch máu, NO được tổng hợp nhờ các enzym nitric oxide
synthase ở nội mạc (eNOS - Endothelial nitric oxide synthase). Hoạt động của
enzym này được điều khiển bởi nhiều cơ chế trong đó có q trình phosphoryl hóa
eNOS [41,69]. Viêm là một trong những nguyên nhân gây rối loạn chức năng nội
mạc [67]. Rối loạn chức năng nội mạc có liên quan đến NO, phosphoryl hóa eNOS
và quá trình viêm đã được báo cáo trong nhiều bệnh lý tim mạch như xơ vữa động
mạch, cao huyết áp…[24,37]. Trong những năm gần đây, sự điều hòa eNOS thơng
qua q trình phosphoryl hóa đang là một mục tiêu y học triển vọng trong điều trị
nhiều bệnh lý [41].
Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng ) thuộc chi
Panax L., ở nước ta cây chỉ có ở vùng núi cao thuộc dãy Hồng Liên Sơn [9].
Nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học cho thấy trong rễ và lá của Tam thất
hoang có chứa saponin với hàm lượng cao [6]. Đặc biệt, saponin trong các lồi

thuộc chi Panax L. đã được chứng minh có tác dụng giãn cơ trơn, tăng tổng hợp
NO, tăng biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa [39,73] và chống viêm [32,45,58].
Tuy nhiên, đến nay các nghiên cứu về loài này vẫn còn hạn chế. Điều này đặt ra câu
hỏi liệu với thành phần giàu saponin, Tam thất hoang có những tác dụng kể trên hay
khơng? Để làm sáng tỏ điều đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của
Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên sự biểu
hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập” với ba mục tiêu:
1. Bước đầu đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên
cơ trơn cơ lập của khí quản, bàng quang và thể hang.
2. Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu
hiện của eNOS phosphoryl hóa và sự tổng hợp NO.
3. Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu
hiện của gen COX-2 và protein COX-2.

10


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Tam thất hoang
Tam thất hoang có tên khoa học là Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M.
Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), chi Panax L.; hay còn được gọi với các tên
khác như Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Thổ tam thất [2,8].
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây thân thảo cao 25 – 75 cm; thẫn rễ mập, nằm ngang, có nhiểu vết lõm do
vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm thường có 1 thân mang lá, ít khi 2 – 3 lá.
Lá kép chân vịt, gồm 1 – 3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5 – 10 cm. Lá chét 5,
có cuống ngắn, hình thn hay mác thuôn, dài 5 – 13 cm, rộng 2 – 4 cm, nhọn hai
đầu, cuống hoa dài 1 – 1,5 cm. Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5
nhị và bầu 2 ô. Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính 0,6 – 1,2 cm, khi chín màu
đỏ. Hạt gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng (Hình 1.1) [2].

Hình 1.1. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) [11]
1.1.2. Sinh thái và phân bố
Tam thất hoang (TTH) ưa ẩm và sáng. Cây mọc rải rác trên đất có nhiều
mùn, dưới tán rừng kín thường xanh, ở độ cao 1600 – 2300 m. Tái sinh bằng hạt. Ra
hoa tháng 4 – 5, có quả tháng 5 – 9. Cho đến nay, trên tồn thế giới, lồi này mới
chỉ tìm thấy ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc gia
Hoàng Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [2,9].


1.1.3. Thành phần hóa học
Trong thân rễ của TTH chứa các saponin khung oleanan (hầu hết đều là
saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin
khung dammaran với hàm lượng thấp [19].
Năm 1985, từ dịch chiết methanol của thân rễ TTH đã phân lập được 2
saponin dẫn chất của acid oleanolic là stipuleanosid R1và stipuleanosid R2 [19].
Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Đại học Toyama, Nhật Bản phân tích thành
phần dịch chiết ethanol của TTH thu hái ở Trung Quốc đã xác định được một hàm
lượng nhỏ các saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd
[43].
Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun Liang và cộng sự đã phân lập được
11 hợp chất saponin là dẫn chất của acid oleanolic, trong đó có một chất mới là
spinasaponin A methyl ester từ rễ TTH thu hái ở Việt Nam [15]. Năm 2013, nhóm
tiếp tục xác định được thêm 4 hợp chất saponin khung oleanan khác [45]. Ngoài ra
3 polyacetylen, 1 sesquiterpen và 1 acid béo cũng được phân lập [15] (Hình 1.2).

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 15 chất phân lập từ P. stipuleanatus [45]
Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Trần Cơng Luận và cộng sự chỉ ra trong
TTH ngồi saponin cịn có thành phần khác như: polyacetylen, triterpenoid, tinh
dầu, đường khử, acid hữu cơ, acid polyuronic, acid béo, acid amin và các nguyên tố

vi lượng [5,6].


1.1.4. Tác dụng dược lý
Trên thế giới, năm 2010, từ 11 hợp chất saponin phân lập được từ TTH (1 –
11, hình 1.2) nhóm nghiên cứu của Chun Liang đã tiến hành thử tác dụng gây độc
trên các tế bào ung thư bạch cầu cấp tiền tủy bào (HL-60) và ung thư ruột kết người
(HCT-116) thu được kết quả: Chất 1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể với
giá trị IC50 lần lượt là 4,44 và 0,63 µM trên 2 dòng tế bào HL-60 và HCT-116 [15].
Năm 2013, Chun Liang và cộng sự tiếp tục đánh giá hoạt tính của 15 chất (1 – 15,
hình 1.2) lên yếu tố nhân kappa B (NF-κB) trên tế bào HepG2 cho kết quả: Các chất
từ 6 – 11 ức chế NF-κB với IC50 từ 3,1 – 18,9 µM. Các chất 8, 10 và 11 ức chế sự
biểu hiện của mARN iNOS (inducible nitric oxide synthase) và COX-2
(cyclooxygenase-2) phụ thuộc nồng độ. Điều này đem lại tiềm năng trong điều trị
như là chất chống viêm, chống xơ vữa động mạch và chống loạn thần [45].
Năm 2011, 2 polyacetylen mới được phân lập từ TTH là stipudiol và stipuol
ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế bào ung thư HL-60 và HCT-116 thơng qua kích
hoạt q trình apotosis của tế bào [46].
Tại Việt Nam, nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 cho thấy: Cao
TTH có tác dụng phục hồi thời gian ngủ do stress, đưa về trạng thái bình thường ở
các mức liều thử 44; 88 và 176 mg/kg. Ở các nồng độ 25; 50 và 100 μg/ml cao
saponin toàn phần của TTH có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành
malonyl dialdehyd. Cao thân rễ và rễ củ TTH thể hiện độc tính cấp đường uống với
liều LD50 = 8,8 g/kg [5].
Nghiên cứu của Lê Thị Tâm và Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2016) cho kết quả
TTH có tác dụng chống đông và ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro [7,11].
1.1.5. Công dụng
Sách đỏ Việt Nam (2007) có ghi “Tất cả các bộ phận của cây đều có cơng
dụng làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh
dục, chống stress. Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an

thần”. TTH có tác dụng tán ứ, định thống. Bộ phận dùng là thân rễ Rhizoma
Panacis Stipuleanati [2].


1.2. Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS
1.2.1. Nội mạc mạch máu
1.2.1.1 Đặc điểm cấu trúc
Về giải phẫu học từ trong ra ngồi, thành động mạch có cấu tạo gồm 3 lớp áo
đồng tâm: Lớp áo ngoài là lớp vỏ xơ, có các sợi thần kinh chi phối; lớp áo giữa gồm
những sợi cơ trơn và sợi đàn hồi; lớp áo trong là lớp tế bào nội mô (Hình 1.3) [3].

Phar
m and
Hình 1.3. Cấu trúc thành động mạch [1]
Tương tự như thành động mạch, thành tĩnh mạch, mao mạch và mạch bạch
huyết cũng có một lớp tế bào nội mơ lợp mặt trong lịng mạch. Lớp nội mơ thuộc biểu
mô lát đơn, gồm một hàng tế bào nội mơ hình đa giác dẹt, có phần bào tương chứa
nhân lồi vào trong lòng mạch, phần bào tương ở ngoại vi tỏa thành lá mỏng. Các tế bào
nội mô liên kết với nhau bằng những dải bịt hoặc liên kết khe [1]. Ở người
13

trưởng thành, nội mạc mạch máu gồm khoảng mười ngàn tỷ (10 ) tế bào, bao phủ
2

một diện tích khoảng 1 - 7 m hình thành nên một tổ chức nặng khoảng 1 kg [27,52].
1.2.1.2. Chức năng của nội mạc mạch máu
Nội mạc mạch máu có vai trị quan trọng trong việc kiểm sốt sự lưu thơng
dịng máu, trương lực mạch máu, sự kết tập tiểu cầu cũng như tham gia điều hịa các
q trình viêm, miễn dịch, sinh mạch, chuyển hóa và duy trì sự hằng định nội môi
[30]. Các tế bào nội mô thực hiện cả hai chức năng trao đổi chất và tổng hợp [52].

Nội mạc mạch máu hình thành nên một hàng rào bán thấm kiểm sốt sự di
chuyển của các chất hịa tan, các đại phân tử và cả các tế bào giữa dịng máu với các
mơ xung quanh [27,30]. Irie và Tavassoli gọi đó là hàng rào máu – mơ [65]. Rối
loạn tính thấm nội mạc có thể gây ra nhiều bệnh lý như phù, sốc, xung huyết.


Các tế bào nội mơ có khả năng sản xuất ra nhiều phân tử khác nhau như các
chất giãn mạch: nitric oxide (NO), prostacyclin (PGI2), EDHF (yếu tố cường phân
cực có nguồn gốc nội mơ/ endothelium-derived hyperpolarizing factor); các chất co
mạch: Endothelin, thromboxan A2, angiotensin II; các phần tử kết dính: E-selectin,
P-selectin, ICAM -1 (phân tử kết dính liên bào/ intercellular adhesion molecule) và
VCAM-1 (phân tử kết dính tế bào mạch/ vascular cell adhesion molecule); cytokin
và yếu tố tăng trưởng: GM-CSF (Yếu tố kích thích quần thể bạch cầu hạt – đại thực
bào/ Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), interleukin (IL-1, IL-6)
và SCF (Yếu tố tế bào gốc/ Stem cell factor); các chemokin: α và β chemokin,
fractalkin; các yếu tố liên quan đến q trình cầm máu: t-PA (yếu tố hoạt hóa
plasminogen mơ), PAI-1 (chất ức chế yếu tố hoạt hóa plasminogen), yếu tố
Willebrand, thromboxan A2, NO, PGI2, TF (yếu tố mô), TFPI (chất ức chế con
đường yếu tố mô); hay các yếu tố liên quan đến sự tăng sinh cơ trơn và sinh mạch:
VEGF (yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch/ vascular endothelial growth factor),
PDGF (yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu/ platelet derived growth factor)
[17,26,27,38].
Rối loạn về cấu trúc cũng như chức năng nội mạc mạch máu liên quan đến
nhiều quá trình bệnh lý như xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, bệnh động mạch
vành, suy tim mạn, bệnh mạch ngoại vi, tiểu đường, tăng áp lực phổi, nhiễm khuẩn
và các hội chứng viêm [26,27].
1.2.2. eNOS
1.2.2.1. Nitric oxide
Năm 1980, Furchgot và Zawadzki đã chứng minh được rằng sự giãn của
động mạch thỏ khi kích thích bằng acetylcholin (ACh) cần sự có mặt của nội mơ

ngun vẹn và ACh đã kích thích sự giải phóng của một chất được gọi là yếu tố
giãn mạch nguồn gốc nội mạc (Endothelium derived relaxing factor – EDGR). Năm
1987, Palmer và cộng sự đã xác định được yếu tố đó là nitric oxide (NO) [25]. Ngày
nay, NO được biết đến là một trong những gốc khí tự do đơn giản nhất và đóng vai
trị tín hiệu trung gian quan trọng trong cơ thể [41]. NO tham gia điều hịa nhiều q
trình sinh lý như sự dẫn truyền thần kinh, trương lực mạch máu, sự co cơ, kết tập
tiểu cầu, chuyển hóa, đáp ứng miễn dịch, phiên mã gen và dịch mã mARN, quá
trình biến đổi sau dịch mã của protein [25,69].


Về đặc điểm cấu trúc và tính chất, NO là một gốc khí tự do nhỏ nặng 30
Dalton, khơng màu và nhiệt độ nóng chảy khoảng 163,6 °C, trong cấu trúc của
NO có một electron chưa ghép cặp [25,60]. NO có khả năng phản ứng với các
nguyên tố kim loại chuyển tiếp để hình thành nên nitrosyl kim loại, đây là đặc
tính quan trọng trong con đường tín hiệu của nó. Mặt khác, NO tan kém trong
nước, có thể dễ vượt qua được màng tế bào để tham gia điều hịa các q trình
sinh lý. Tuy nhiên, chất này khơng bền có thời gian bán thải (T1/2) ngắn và bị
chuyển hóa nhanh trong cơ thể [25].
Trong cơ thể NO được tổng hợp qua hai con đường: thông qua các enzym
-

NOS (Nitric oxide synthase) hoặc từ quá trình khử của NO2 . NOS là enzym xúc tác
cho phản ứng hình thành NO và L-citrullin từ L-arginin và O2 [69]. Ở động vật có
vú, NOS có ba dạng chính, mã hóa bởi các gen riêng biệt trên nhiễm sắc thể (NST)
khác nhau: NOS thần kinh (nNOS) hay NOS loại 1; NOS do cảm ứng (iNOS) hay
NOS loại 2 và NOS nội mạc (eNOS) hay NOS loại 3 (Bảng 1.1). Con đường thứ hai
-

để hình thành NO là từ phản ứng khử NO2 , phản ứng này được tạo điều kiện bởi
-

enzym NO2 reductase như các enzym chứa molypden (xanthin oxidase), NOS và
nhiều thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử ti thể. Phản ứng khử NO2 đóng vai
trị quan trọng trong trường hợp thiếu oxy khi đó hoạt động của NOS bị giới hạn.
-

Trong cơ thể NO được chuyển hóa bằng quá trình oxy hóa để hình thành nên NO2
-

và NO3 . Q trình này có thể tự xảy ra (autooxidation) hoặc được xúc tác. Một
-

phần NO bị bất hoạt trong stress oxy hóa, NO kết hợp với superoxid (O2 ) để hình
-

thành nên peroxynitrit (ONOO ) [25,69].


Bảng 1.1. Các dạng của NOS [13,69]

Tên phổ
biến

Tế bào
biểu hiện

Gen
Đặc điểm

Chức năng

và các quá
trình sinh
học

NOS - 1

NOS – 2

NOS - 3

nNOS

iNOS

eNOS

(Neuronal NOS)

(Inducible NOS)

(Endothelial NOS)

Neuron thần kinh và Nhiều loại tế bào hệ Tế bào nội mô
một số tế bào khác.
thống miễn dịch như
đại thực bào khi đáp
ứng
với
lipopolysaccharid
(LPS), cytokin và các

chất khác.
NST 12, gồm 29 exon NST 17, 26 exon
NST 7, 26 exon
Enzym cấu trúc

Enzym cảm ứng

Enzym cấu trúc

Ở hệ thần kinh trung
ương: có liên quan
đến q trình học tập
và ghi nhớ; kiểm soát
huyết áp trung ương.
Ở hệ thần kinh ngoại
vi: Chất dẫn truyền
thần kinh, giãn cơ trơn
và mạch

Tham gia vào sinh lý
bệnh của quá trình
viêm và hệ thống
miễn dịch

Tham
gia
vào
nhiều chức năng
tim mạch quan
trọng: Giãn mạch,

ức chế các quá
trình như kết tập
tiểu cầu, kết dính
bạch cầu, tăng sinh
của tế bào cơ trơn
thành mạch.

1.2.2.2. eNOS
eNOS (Endothelial nitric oxide synthase) là một trong 3 dạng của NOS. NO
sản xuất tại nội mô bởi eNOS là một hợp chất vận mạch quan trọng, tham gia điều
hịa nhiều q trình sinh lý đặc biệt liên quan đến chức năng tim mạch. eNOS biểu
hiện chủ yếu trong tế bào nội mơ, ngồi ra enzym này cũng được phát hiện trong tế
bào cơ tim, tiểu cầu, neuron ở não, hợp bào lá nuôi của nhau thai người và trong tế
bào biểu mô ống thận LLC-PK1 [69,70].


Cấu trúc gen và protein
eNOS được mã hóa bởi một gen nằm trên nhiễm sắc thể số 7 (7q35–7q36);
có cấu trúc gồm 26 exon, gen này chiếm một đoạn khoảng 21 – 22 kb [13,66,70].
Về cấu trúc, eNOS là một protein chứa 1203 acid amin, nặng 133 kDa, có dạng
homodimer gồm 2 domain (Hình 1.4) [13,70]:
-

-

Domain reductase nằm ở đầu –COOH, chứa vị trí gắn của NADPH
(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), FAD (Flavin adenine
dinucleotide) và FMN (Flavin mononucleotide).
Domain oxygenase nằm ở đầu –NH2 chứa vị trí gắn của BH4
(Tetrahydrobiopterin), hem và L-arginin.

Hai domain này được gắn kết với nhau bởi một trình tự dài khoảng 30 acid
amin chứa vị trí gắn của Camodulin (CaM).

Hình 1.3. Cấu trúc của eNOS (Ser: Serine; Thr: Threonin) [29]
Phosphoryl hóa eNOS
Hoạt động của eNOS được điều khiển bởi 2 cơ chế đó là cơ chế phụ thuộc
2+

2+

Ca và không phụ thuộc Ca :
2+

2+

Cơ chế phụ thuộc Ca : eNOS là một enzym phụ thuộc Ca /CaM. Khi nồng
2+

độ Ca nội bào tăng, tạo điều kiện cho CaM gắn được vào vị trí của nó trên eNOS.
CaM là protein đầu tiên tương tác với eNOS, sự gắn của CaM làm dịch chuyển điện
tử từ NADPH ở domain reductase đến hem ở domain oxygenase thông qua FAD và
FMN. Tại vị trí hem các điện tử được dùng để khử và hoạt hóa O2 từ đó oxi hóa Larginin thành L-citrullin và NO. Các yếu tố thiết yếu cần cho eNOS chức năng bao
gồm L-arginin, Fe, BH4, NADPH, FAD và FMN [69].
Phosphoryl hóa eNOS: Phosphoryl hóa eNOS là một biến đổi sau dịch mã,
được điều khiển bởi hệ thống các kinase, phosphatase và tương tác protein – protein
và đây là một trong những cơ chế tham gia điều khiển eNOS. Mặc dù hoạt động của
eNOS phụ thuộc vào nồng độ Ca

2+

nhưng đây không phải là yếu tố duy nhất cần


cho sự điều hòa hoạt động của enzym này. Sự gắn của CaM và sự dịch chuyển của
dòng các điện tử từ domain reductase đến domain oxygenase của enzyme cũng phụ
thuộc vào sự phosphoryl hóa và khử phosphoryl hóa eNOS [41]. Các nghiên cứu
chỉ ra rằng, sự phosphoryl hóa eNOS xảy ra tại Serin (Ser) và ở một mức độ thấp
1177

hơn trên Tyrosin (Tyr) và Threonin (Thr). Ở người, phosphoryl hóa Ser
633

495

617

, Ser
114

và Ser làm kích hoạt eNOS trong khi phosphoryl hóa tại Thr và Ser làm
giảm chức năng eNOS. Sự phosphoryl hóa eNOS có thể được điều hịa bởi nhiều
yếu tố như “shear stress”, yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô mạch máu (VEGF),
bradykinin, insulin, estrogen… làm hoạt hóa các enzym khác nhau như serin/
2+

threonin kinase Akt, CaMKII (Ca / calmodulin dependent protein kinase II),
AMPK (AMP-activated protein kinase), PKA (protein kinase A) và gây phosphoryl
hóa eNOS tại các vị trí khác nhau (Hình 1.5) [29,34,41].
Ngồi ra, hoạt động của eNOS còn được điều khiển bởi sự tương tác với các
protein như Hsp90 hay Caveolin-1. Cav-1 (Caveolin-1) là protein vỏ chính của

caveolae tại tế bào nội mơ, cav-1 gắn với eNOS và kết quả là làm bất hoạt eNOS
[59]. Hsp90 (Protein shock nhiệt 90) làm tăng hoạt động của eNOS theo cơ chế điều
hòa dị lập thể, nghiên cứu cho thấy sự hình thành phức hợp eNOS – Hsp90 ở tế bào
nội mơ khi bị kích thích bởi histamin, bradykinin, yếu tố tăng trưởng nội mạc và
“shear stress” làm tăng hoạt tính của eNOS lên 3 lần [31]. Sự tương tác của eNOS
với
2+
2 protein này đều là những cơ chế điều hịa hoạt tính của eNOS độc lập với Ca .


Hình 1.5. Sự điều hịa các vị trí phosphoryl hóa eNOS.
Các vị trí eNOS phosphoryl hóa được đánh số theo thứ tự eNOS người/ bò [41]
(VEGF: Vascular endothelial cell growth factor/ Yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô
mạch máu; 8-Br-cAMP: 8-bromoadenosine-3’,5’- monophosphate vòng; S-1-P:
sphingosine 1-phosphate; PMA: phorbol 12-myristate 13-acetate; HDL: highdensity lipoprotein/ lipoprotein trọng lượng phân tử cao; S: Serin; T: Threonin; )
1.2.2.3. Chức năng sinh lý của eNOS và NO nội mạc
a. Điều hòa trương lực mạch máu
Tại nội mạc NO được tạo ra bởi eNOS làm hoạt hóa guanylyl cyclase hịa tan
(sGC/ soluble guanylyl cyclase) kích hoạt con đường truyền tin cGMP (GMP
vòng). sGC xúc tác cho phản ứng chuyển GTP (Guanosine-5'-triphosphate) thành
cGMP là một chất truyền tin thứ hai, cGMP hoạt hóa các protein kinase G (PKG),
2+

thúc đẩy q trình phosphoryl hóa các protein kết quả là làm giảm nồng độ Ca nội
bào và giãn mạch (Hình 1.6) [25]. Nghiên cứu cho thấy huyết áp tăng ở nhóm chuột
bị xóa bỏ gen eNOS [47].
b. Ức chế sự kết dính bạch cầu và viêm mạch máu
NO kiểm soát sự biểu hiện của các gen liên quan đến xơ vữa động mạch. NO
làm giảm sự biểu hiện của protein hóa hướng động bạch cầu mono MCP-1
(Monocyte chemoattractant protein-1) [56], ức chế sự kết dính của bạch cầu với

thành mạch bằng cách can thiệp vào khả năng gắn của các phân tử kết dính bạch
cầu CD11/ CD18 (Cụm biệt hóa/ Cluster of differentiation) với bề mặt tế bào nội
mơ hoặc ức chế sự biểu hiện của CD11/ CD18 ở bạch cầu. Sự kết dính bạch cầu là


sự kiện sớm của xơ vữa động mạch do vậy NO có thể bảo vệ chống sự hình thành
xơ vữa động mạch [69]. Rối loạn tính tồn vẹn của hàng rào nội mơ có thể khởi
phát các sự kiện của tiền viêm. NO ngăn chặn quá trình apotosis của tế bào nội mô
gây ra bởi các cytokin và các yếu tố tiền xơ vữa như oxygen hoạt tính (ROS reactive oxygen species) và angiotensin II. Điều này có thể góp phần vào tác dụng
chống viêm và chống xơ vữa của NO được sản xuất tại nội mạc [64].
c. Ức chế sự kết tập tiểu cầu
NO sản xuất trong mạch là một chất ức chế sự kết tập và kết dính tiểu cầu
vào thành mạch [68,72].
d. Kiểm soát sự tăng sinh của cơ trơn mạch
NO thể hiện hoạt tính ức chế tổng hợp ADN, ức chế sự sinh sản và tăng sinh
của tế bào cơ trơn thành mạch. Tác dụng này có thể thơng qua trung gian cGMP
[14,51]. Bên cạnh đó NO cịn ngăn chặn sự giải phóng của yếu tố tăng trưởng có
nguồn gốc tiểu cầu (PDGF), là chất kích thích sự tăng sinh của cơ trơn. NOS cũng
quan trọng đối với sự tái tạo lại mạch máu để thích ứng với sự thay đổi dịng chảy
trong bệnh mạn tính [22].

Hình 1.6. Sự tổng hợp NO bởi eNOS và chức năng sinh lý của NO nội mạc [52]


1.2.2.4. Vai trị của eNOS phosphorayl hóa và NO trong một số bệnh lý
a. Xơ vữa động mạch
Xơ vữa động mạch là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh tim mạch mãn
tính như bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não và tắc động mạch ngoại vi [16]. Quá
trình này được đặc trưng bởi giảm hoạt động của eNOS và sinh khả dụng của NO
kèm theo đó là tăng sự biểu hiện của các phần tử kết kính như VCAM-1, ICAM-1.

Ức chế eNOS đã thể hiện làm tăng tốc độ xơ vữa động mạch cho thấy NO có thể ức
chế một số bước quan trọng trong quá trình xơ vữa động mạch. Do vậy, eNOS có
thể là một gen ứng cử viên liên quan đến xơ vữa động mạch và sự điều chỉnh hoạt
tính của eNOS thơng qua thay đổi sự phosphoryl hóa eNOS đang được quan tâm
đáng kể vì những vai trị sinh lý bệnh của nó [41].
b. Nhồi máu cơ tim
Nghiên cứu cho thấy, trong nhồi máu cơ tim mãn tính kích thước vùng nhồi
máu ở chuột bị loại bỏ eNOS không thay đổi nhưng mật độ mao mạch ít hơn, phì
đại tăng lên đi kèm với huyết áp tâm thu tăng, rối loạn chức năng tâm trương và
tăng tỷ lệ tử vong ở chuột sau 28 ngày, điều này cho thấy vai trị có lợi của NO và
eNOS trên tâm thất sau nhồi máu cơ tim [55].
c. Tăng huyết áp
Tăng huyết áp là một yếu tố nguy cơ của nhiều bệnh lý như xơ vữa động
mạch, suy tim, bệnh động mạch vành, đột quỵ. NO và eNOS có vai trò quan trọng
giãn mạch gây hạ áp. Sự tăng huyết áp đã được quan sát thấy ở nhóm chuột bị xóa
bỏ gen eNOS [47].
d. Stress oxy hóa
Stress oxy hóa là bệnh lý xảy ra do sự mất cân bằng trong sự hình thành và
phá hủy các ROS. Stress oxy hóa tham gia vào bệnh sinh của nhiều tình trạng bệnh
lý như dị tật tim mạch, tăng huyết áp, tiểu đường, xơ vữa động mạch, ung thư, dẫn
đến rối loạn chức năng nội mô. Sự sản xuất ROS liên quan đến sự bất hoạt của phân
tử tín hiệu NO dẫn đến rối loạn chức năng nội mơ [41].
Bên cạnh đó, sự rối loạn trong tổng hợp NO và phosphoryl hóa eNOS còn
liên quan trong nhiều bệnh lý khác như thiếu máu cục bộ, tiểu đường, rối loạn
cương dương, Alzheimer... Chính vì vậy, trong những năm gần đây eNOS
phosphoryl hóa trở thành một mục tiêu tiềm năng trong điều trị nhiều bệnh lý [41].


1.3. Tổng quan về viêm và COX-2
1.3.1. Viêm và prostaglandin trong viêm

Viêm vừa là phản ứng mang tính chất bảo vệ của cơ thể chống lại các yếu tố
gây bệnh vừa là phản ứng bệnh lý vì quá trình viêm có thể gây ra các tổn thương,
hoại tử hay rối loạn chức năng cơ quan [4]. Phản ứng viêm được đặc trưng bởi sự
tăng tính thấm của thành mạch, giãn mạch và kèm theo sự xuyên mạch của bạch
cầu, dẫn đến những dấu hiệu kinh điển là sưng, nóng, đỏ, đau. Q trình này có sự
tham gia của nhiều chất trung gian có hoạt tính như histamin, bradykinin,
prostaglandin, leucotrien. Trong đó, prostaglandin (PG) là một trong những yếu tố
đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của hội chứng viêm [3].
PG và thromboxan A2 (TXA2) được gọi chung là prostanoid, là các chất
được hình thành từ acid arachidonic (AA), một acid béo khơng bão hịa được giải
phóng từ phospholipid màng tế bào nhờ enzym phospholipase A2. Acid arachidonic
được oxi hóa bởi cyclooxygenase (COX) hay cịn được gọi là prostaglandin G/H
synthase để hình thành nên PGG2 và sau đó là PGH2. PGH2 khơng bền bị chuyển
hóa bởi các enzym prostaglandin synthase để tạo nên các PG khác nhau (Hình 1.7).
Có 4 PG hoạt tính sinh học chủ yếu được tạo ra trong in vivo đó là: prostaglandin E2
(PGE2), prostacyclin (PGI2), prostaglandin D2 (PGD2) và prostaglandin F2α (PGF2α)
[33,61]. Trong đó, PGE2 đóng vai trị quan trọng trong viêm vì nó tham gia vào tất
cả các quá trình dẫn đến các dấu hiệu kinh điển của viêm. Cụ thể, PGE2 gây
giãn mạch, làm tăng dịng máu đến mơ viêm, đồng thời cùng với các chất trung
gian của quá trình viêm như histadin, bradykinin, leucotrien, PGE2 làm tăng tính
thấm của thành mạch gây thoát dịch và kết quả đỏ và sưng xuất hiện. Đau là kết
quả PGE2 làm tăng nhạy cảm của các sợi thần kinh cảm giác ngoại vị và trung
ương ở não và tủy sống dẫn đến tăng cảm giác đau. Cuối cùng, PGE2 được xem
như một chất trung gian gây sốt. Trong viêm, các PG còn làm khuếch đại các phản
ứng viêm bằng cách tăng cường và kéo dài các tín hiệu gây ra bởi các chất tiền
viêm [21,36].
Sự sản xuất của PG phụ thuộc nhiều vào hoạt tính của enzym COX. Enzym
này có 2 dạng chính là COX-1 (cyclooxygenase - 1) và COX-2 (cyclooxygenase –
2). COX-1 được biểu hiện cơ định trong nhiều loại tế bào lành của cơ thể, tham gia
sản xuất các PG cần cho tác dụng sinh lý bình thường của một số cơ quan như tăng

tiết chất nhầy ở dạ dày, kết tập tiểu cầu, tăng sức lọc cầu thận thận. Ngược lại,
COX-2 là một enzym cảm ứng, nó khơng biểu hiện hoặc chỉ biểu hiện ở mức độ rất
thấp trong các mơ bình thường; dưới kích thích của các yếu tố tiền viêm, hormon và


yếu tố tăng trưởng sự biểu hiện của COX-2 tăng lên đáp ứng để tạo ra các PG gây
viêm và tham gia vào bệnh lý viêm. Chính vì vậy, COX trở thành đích phân tử của
các thuốc chống viêm khơng steroid (NSAIDs - Non-steroidal anti-inflammatory
drugs) và các NSAIDs tác dụng chọn lọc trên COX-2 đang là xu hướng nghiên cứu
hiện nay [44].

Hình 1.7. Sinh tổng hợp prostaglandin [33]
(Thromboxan A2, PGD2, PGE2, PGI2, và PGF2α được tạo ra bởi các enzym
prostaglandin synthase khác nhau gồm TxAS, PGDS, PGES, PGIS và PGFS)
1.3.2. COX – 2
COX-2 là một trong 2 dạng chính của COX. Enzym này xúc tác cho hai
bước đầu tiên trong con đường tổng hợp PG [36]. Ở người, gen mã hóa cho COX-2
nằm trên NST số 1, kích thước nhỏ khoảng 8 Kb với 10 exon [35,63]. COX-2 là
enzym cảm ứng, đáp ứng chủ yếu để sản xuất các PG trong viêm. Sự tăng biểu hiện
của COX-2 đã được quan sát thấy trên các mơ hình viêm khớp ở động vật cũng như
trong hoạt dịch của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp [36,75].


1.3.2.1. COX-2 trong một số bệnh lý
a. Xơ vữa động mạch
Xơ vữa động mạch là sự tích tụ của cholesterol dưới lớp áo trong động mạch
gây ra hẹp, loét, xơ cứng lòng mạch. Đây là nguyên nhân của một số bệnh lý như
hội chứng mạch vành cấp, đột quỵ, thiếu máu cục bộ. Quá trình viêm xảy ra bên
trong các mảng xơ vữa đóng góp cho bệnh sinh của bệnh [35]. Một số nghiên cứu
cho thấy, enzym COX-1 xuất hiện trong cả động mạch bình thường và động mạch

xơ vữa trong khi COX-2 chỉ được tìm thấy trong các động mạch xơ vữa. Trong
mảng xơ vữa, COX-2 được biểu hiện bởi nhiều loại tế bào như tế bào đại thực bào,
bạch cầu mono, tế bào nội mơ. Enzym này có thể tham gia vào xơ vữa động mạch
theo nhiều cơ chế liên quan đến một số quá trình như hoạt hóa các chất hóa hướng
động, sản xuất của các cytokin gây viêm, biến đổi tính thấm của thành mạch [28].
Nghiên cứu trên chuột cũng cho thấy, celecoxib một chất ức chế chọn lọc COX-2 có
thể ngăn chặn sự tiến triển của tổn thương mảng xơ vữa [54]. Từ đó, có thể thấy
được vai trò của viêm và COX-2 trong xơ vữa động mạch. Tuy nhiên, các chất ức
chế chọn lọc COX-2 cũng có thể gây ra bất lợi trong sự ổn định của mảng xơ vữa và
do vậy làm tăng nguy cơ biến cố tim mạch và tử vong [35].
b. Sinh mạch và ung thư
Sinh mạch là sự hình thành các mạch máu mới trên nền các mạch máu cũ, xảy
ra trong suốt q trình phát triển của phơi thai, sinh mạch cũng tham gia vào bệnh
sinh nhiều rối loạn đặc biệt là ung thư. Các báo cáo chỉ ra rằng, các chất trung gian
gây viêm (như PGE2, CRP, IL-6, TNFα) tăng trong ung thư [23,35]. Sự tăng tổng hợp
PGE2 và tăng biểu hiện của COX-2 nhưng không phải là COX-1 cũng đã được quan
sát thấy trong mô ung thư đại trực tràng khi so sánh với mô lành [48,71]. Ngồi ra,
cả hai loại NSAIDs tác dụng khơng chọn lọc và chọn trên COX-2 đã thể hiện hoạt
tính ức chế sự sinh mạch và tăng sinh của khối u trên mơ hình động vật [50]. Từ đó
có thể gợi ý được vai trò quan trọng COX-2 trong sự tiến triển của ung thư [23,35].
c. Suy thận
Các PG đặc biệt là PGE2 và PGI2 đóng vai trị quan trọng trong chức năng
thận người trưởng thành. PG gây giãn mạch thận; ức chế sự tái hấp thu natri ở ống
thận; kiểm soát sự giải phóng renin và phát triển thận ở giai đoạn bào thai. Ở thận
vai trò của COX-2 trong tổng hợp PG khá phức tạp, tham gia cho đáp ứng cả chức
năng sinh lý và bệnh lý. Nghiên cứu cho thấy, trong suy thận, nồng độ của mARN