KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (DL và DLS) đánh giá tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường típ 2 của cao chiết hạt cà phê xanh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
----------

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HỖ TRỢ
ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG TÍP 2 CỦA
CAO CHIẾT HẠT CÀ PHÊ XANH (Coffea canephora)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI
HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
----------

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HỖ TRỢ
ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG TÍP 2 CỦA
CAO CHIẾT HẠT CÀ PHÊ XANH (Coffea canephora)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
(NGÀNH DƯỢC HỌC)
Khóa:

Người hướng dẫn 1:
Người hướng dẫn 2:

Hà Nội – 2020

LỜI CẢM ƠN
Để thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, tôi đã nhận
được sự hỗ trợ, giúp đỡ cũng như là quan tâm, động viên từ gia đình, bạn bè
và tồn thể thầy cơ trong khoa. Nghiên cứu khoa học cũng được hoàn thành
dựa trên sự tham khảo, học tập kinh nghiệm từ các kết quả nghiên cứu liên
quan, các sách, báo chuyên ngành của nhiều tác giả ở các cơ quan, các tổ chức
nghiên cứu, tổ chức chính trị của Việt Nam và các nước khác trên thế giới…
Đặc biệt hơn nữa là sự hỗ trợ của cán bộ giảng viên các trường đại học và sự
giúp đỡ, tạo điều kiện về vật chất và tinh thần từ phía gia đình, bạn bè và
các đồng nghiệp.
Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn hai thầy đã hướng dẫn tơi trong
khóa luận này là PGS.TS Bùi Thanh Tùng và PGS.TS Vũ Mạnh Hùng và
các thầy cô trong Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng khoa Y Dược. Các thầy
cô là người trực tiếp hướng dẫn khoa học đã luôn dành nhiều thời gian, cơng
sức hướng dẫn em trong suốt q trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành đề
tài nghiên cứu khoa học. Thầy cơ cũng là người ln quan tâm, tận tình chỉ
bảo những kĩ năng, kiến thức khơng chỉ trong khóa luận này mà cịn định
hướng cho tơi trên con đường tương lai sắp tới, giúp tôi vững tin trên con
đường phía trước.
Tơi xin trân trọng cám ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược cùng tồn thể
các thầy cơ giáo cơng tác trong khoa đã tận tình truyền đạt những kiến thức
q báu, giúp đỡ tơi trong q trình học tập và nghiên cứu.
Tuy có nhiều cố gắng, nhưng trong đề tài nghiên cứu khoa học này
không tránh khỏi những thiếu sót. Em kính mong q thầy cơ, các chun gia,
những người quan tâm đến đề tài, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè tiếp tục có
những ý kiến đóng góp, giúp đỡ để đề tài được hoàn thiện hơn.
Một lần nữa em xin chân thành cám ơn!
Hà Nội, ngày 5 tháng 5 năm 2020
Sinh viên

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
DANH MỤC CÁC BẢNG
MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
Chương I: TỔNG QUAN................................................................................2
1........................................................................................Bệnh tiểu đường
2
1.1 Khái niệm..............................................................................................2
1.2 Phân loại................................................................................................2
1.3 Các yếu tố nguy cơ của bệnh tiểu đường típ 2...................................... 3
1.3.1 Thừa cân và béo phì........................................................................3
1.3.2 Tuổi................................................................................................. 3
1.3.3 Tiền sử gia đình...............................................................................4
1.3.4 Yếu tố gen....................................................................................... 4
1.3.5 Chế độ dinh dưỡng và hoạt động thể lực........................................4
1.4 Cơ chế bệnh sinh của tiểu đường típ 2.................................................. 4
1.5 Các biến chứng bệnh tiểu đường...........................................................6
1.6 Phương pháp điều trị bệnh tiểu đường..................................................6
1.6.1 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 1............................................6
1.6.2 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 2............................................7
1.7 Dịch tễ học............................................................................................ 7
2. Mơ hình gây tiểu đường...........................................................................8
2.1 Tác nhân hóa học...................................................................................9
2.2 Phẫu thuật gây tiểu đường...................................................................12
2.3 Tiểu đường do di truyền...................................................................... 12
3. Tổng quan về enzym α–glucosidase và chất ức chế enzym α- glucosidase
12

3.1 Enzym và chất ức chế enzym..............................................................12
3.2 Enzym α–glucosidase..........................................................................13
3.3 Các chất ức chế enzym α-glucosidase.................................................14
4. Q trình oxy hóa, chất chống oxy hóa và phương pháp đánh giá
hoạt tính chống oxy hóa in vitro................................................................ 16
4.1 Q trình oxy hóa trong cơ thể............................................................16
4.2 Cơ chế chống oxy hóa.........................................................................17
4.3 Các chất chống oxy hóa...................................................................... 17
4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro..................... 19
5. Quan niệm về tiểu đường của đông y................................................... 21
6. Cây cà phê vối (Coffea canephora )– hạt cà phê xanh.........................22
6.1 Cây cà phê vối (Coffea canephora )....................................................22
6.2 Đặc điểm thực vật và phân bố cây cà phê vối.....................................23
Đặc điểm thực vật của cây cà phê vối.......................................................23
6.3 Thành phần hóa học của hạt cà phê.....................................................24
6.4 Tác dụng dược lý.................................................................................26
Chương II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............28
1. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................28
1.1 Mẫu nghiên cứu...................................................................................28
1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu....................................................................29
1.3 Động vật thí nghiệm............................................................................29
2. Phương tiện nghiên cứu......................................................................... 30
2.1 Hóa chất và thuốc thử..........................................................................30
2.2 Thiết bị và dụng cụ..............................................................................30
3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................31
3.1 Xây dựng mơ hình chuột tiểu đường típ 2.................................................31
3.2 Đánh giá tác dụng hạ glucose của dịch chiết hạt cà phê xanh.............32
3.3 Đánh giá tác tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết hạt cà phê xanh

theo phương pháp DPPH.....................................................................33


3.4 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α–glucosidase in vitro của dịch chiết
hạt cà phê xanh....................................................................................35
4. Phương pháp xử lý số liệu......................................................................36
Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................. 37
1. Kết quả.................................................................................................... 37
1.1............................Quy trình chiết, tách hạt cà phê xanh bằng ethanol
37
1.2 Xây dựng mơ hình tiểu đường típ 2 thực nghiệm............................... 37
1.3 Tác dụng của cao chiết hạt cà phê xanh trên chuột nhắt thực nghiệm38
1.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết hạt cà phê xanh theo
phương pháp DPPH...................................................................................41
1.5 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α–glucosidase in vitro của dịch chiết hạt
cà phê xanh................................................................................................42
2. Bàn luận.................................................................................................. 44
Chương IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT......................................................47
1. Kết Luận..................................................................................................47
2. Đề Xuất....................................................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DPPH

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

DMSO Dimethyl sulfoxid

EtOAc Ethyl Acetate
EtOH

Ethanol

FDA

Hiệp hội Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ

HPTLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
IC50
IU

Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%)
Đơn vị quốc tế (Interational Unit)

mTOR Mammalian target of the rapamycin
n-BuOH n-buthanol
RNS

Nitrogen hoạt tính

ROS

Oxy hoạt tính


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1. 1 Các biến chứng của bệnh tiểu đường.................................................6

Hình 1. 3 Cơng thức hóa học của Streptozocin................................................. 9
Hình 1. 4 Cơng thức hóa học của Alloxan.......................................................10
Hình 1. 5 Cơng thức hóa học của Acarbose.................................................... 14
Hình 1. 6 Cây cà phê vối (Coffea canephora).................................................23
Hình 1. 7 Cấu trúc phân tử của acid clorogenic...............................................25
Hình 1. 8 Cấu trúc phân tử của Cafein............................................................ 25
Hình 2. 1 Cây cà phê vối (Coffea canephora)................................................. 28
Hình 2. 2 Hạt cà phê vối (Coffea canephora)..................................................28
Hình 2. 3 Chuột nhắt trắng chủng Swiss......................................................... 29
Hình 2. 4 Chuột được tiêm màng bụng Alloxan monohydrate........................31
Hình 3. 1 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do DPPH của cao chiết toàn
phần, các phân đoạn của hạt cà phê xanh và axit ascorbic.............................. 41


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. 1 Các chất tự nhiên có tác dụng ức chế hoạt động của enzym α –
glucosidase.......................................................................................................15
Bảng 1. 2 Các chất chống oxy hóa nội sinh.....................................................18
Bảng 1. 3 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa...................... 20
Bảng 1. 4 Các chất thơm trong cà phê rang Coffea canephora và Coffea
arabica.............................................................................................................26
Bảng 3. 1 Sự thay đổi nồng độ glucose huyết trước và sau 72 giờ tiêm
Alloxan................................................................................................................ 38
Bảng 3. 2 Chỉ số đường huyết của chuột tiểu đường do Alloxan gây ra trước
và trong 28 ngày điều trị bằng thuốc và cao chiết hạt cà phê..........................39
Bảng 3. 3 Trọng lượng của chuột trước và sau 28 ngày điều trị......................40
Bảng 3. 4 Giá trị IC50 của cao chiết toàn phần và các phân đoạn của hạt cà phê
xanh và axit Ascorbic về khả năng quét gốc tự do DPPH...............................42
Bảng 3. 5 Kết quả IC50 của cao chiết của hạt cà phê xanh và Acarbose..........42

MỞ ĐẦU
Ngày nay, bệnh tiểu đường hay còn gọi là tiểu đường ngày càng phổ biến
và có sự gia tăng về tỉ lệ và mức độ ảnh hưởng đến sức khỏe. Tiểu đường là một
trong những nguyên nhân gây tử vong và gây ra các biến chứng bệnh trầm trọng
ảnh hưởng đến sức khỏe cũng như chất lượng cuộc sống của người bệnh. Mặc dù
đã có những tiến bộ đáng kể trong điều trị bệnh tiểu đường bằng các thuốc đường
uống nhưng việc tìm kiếm các loại thuốc mới vẫn tiếp tục vì những hạn chế do
các tác dụng bất lợi và chi phí điều trị của các thuốc đang được sử dụng [60].
Ở Việt Nam, các bệnh nhân mắc bệnh mãn tính thường có xu hướng sử
dụng các loại thuốc Đơng Y hoặc thuốc Y học cổ truyền có nguồn gốc từ tự
nhiên do độc tính thấp, rẻ tiền và sẵn có của chúng để giảm bớt các gánh nặng
về kinh tế khi sử dụng các thuốc tân dược[40]. Vì vậy, trong những năm gần
đây đã có nhiều cơng trình nghiên cứu được tiến hành để đánh giá tiềm năng
của các hợp chất tự nhiên được tìm thấy từ cây cỏ để chữa bệnh béo phì và tiểu
đường mà ít gây tác dụng phụ, đồng thời tác dụng của thuốc có hiệu quả trong
thời gian kéo dài điển hình như: Thân cây Ý dĩ, thân cây Mướp đắng, quả cây
Chuối hột [14], [18], [21]. Các nghiên cứu này đã cho thấy kết quả khả quan, có
thể dần dần đưa vào sử dụng lâm sàng [4].
Cây cà phê là loài cây công nghiệp khá phổ biến ở nước ta, được trồng
nhiều ở vùng Tây Ngun. Trong đó, 3 lồi cà phê được trồng nhiều nhất ở nước
ta là cà phê chè (coffea arabica), cà phê vối (coffea canephora), cà phê mít
(coffea excels). Lồi được trồng nhiều, cho năng suất cao là cà phê vối (coffea
canephora). Cây cà phê là loài cây thân gỗ hoặc cây bụi chứa nhiều thành phần
có tác dụng điều trị nhiều bệnh. Một số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng
cây cà phê có tác dụng trên tim mạch, thần kinh, hô hấp… Nhưng qua tìm hiểu
thì tại Việt Nam chưa có nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa, hạ đường
huyết của hạt cà phê xanh để phục vụ cho việc phát triển thành sản phẩm có
tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường. Do đó, đề tài nghiên cứu khoa học:

“Đánh giá tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường type 2 của cao chiết
hạt cà phê xanh (Coffea canephora)” được thực hiện nhằm các mục tiêu sau:
1. Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của cao chiết hạt cà phê xanh
trên mơ hình in vivo của chuột nhắt bị tiểu đường bằng Alloxan.
2. Đánh giá tác dụng chống oxi hóa in vitro theo phương pháp DPPH.
3. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro.

1
0


Chương I: TỔNG QUAN
1. Bệnh tiểu đường
1.1 Khái niệm
Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) “Tiểu đường là một rối loạn chuyển hóa
do rất nhiều ngun nhân, được mơ tả là sự tăng đường huyết mạn tính cùng với
rối loạn chuyển hóa carbohydrat, chất béo và protein, nó là hậu quả của sự suy
giảm tiết insulin và giảm hoạt tính insulin” [57]
Theo định nghĩa của Hiệp hội Đái Tháo Đường Hoa Kỳ năm 2019
(American Diabetes Association - ADA): “Tiểu đường là bệnh rối loạn chuyển
hóa đặc trưng bởi sự tăng đường huyết, gây ra bởi sự giảm tiết insulin và/hoặc
giảm hoạt tính của insulin. Sự tăng đường huyết mạn tính dẫn đến những tác hại
lâu dài, rối loạn hoặc suy yếu chức năng các cơ quan đặc biệt là mắt, thận, hệ
thần kinh, tim và mạch máu” [30]
Theo hướng dẫn của bộ y tế Việt Nam: “Bệnh tiểu đường là bệnh rối loạn
chuyển hóa khơng đồng nhất, có đặc điểm tăng glucose huyết do khiếm khuyết
về tiết insulin, về tác động của insulin, hoặc cả hai. Tăng glucose mạn tính trong
thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrat, protid, lipid,
gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mạch máu, thận,
mắt, thần kinh” [7]

Tiểu đường là bệnh rối loạn chuyển hóa của cơ thể, đặc trưng bởi sự tăng
glucose trong máu. Bệnh gây ra nhiều biến chứng phức tạp trên nhiều bộ phận
của cơ thể.

1.2 Phân loại
Tiểu đường nguyên phát [2], [6], [7], [30]
-

Tiểu đường típ 1: do phá hủy tế bào β đảo tụy, thường dẫn đến sự thiếu
insulin tuyệt đối.

-

Tiểu đường típ 2: do giảm chức năng của tế bào beta tụy tiến triển trên nền
tảng đề kháng insulin
Tiểu đường thai kỳ: được chẩn đoán trong khoảng từ tháng thứ ba đến
tháng thứ chín của thai kỳ và được phát hiện lần đầu trong lúc mang thai.

-


Tiểu đường thứ phát:
Bệnh tiểu đường do các nguyên nhân khác: giảm chức năng tế bào β do
khiếm khuyết gen; bệnh nội tiết; tăng đường huyết do thuốc và hóa chất như sử
dụng glucocorticoid, trong điều trị HIV/AIDS hoặc sau khi ghép tạng.

1.3 Các yếu tố nguy cơ của bệnh tiểu đường típ 2
Bệnh tiểu đường típ 2 hay cịn gọi là tiểu đường không phụ thuộc insulin
thường thấy ở người trên 40 tuổi và có thể trạng béo. Bệnh tiểu đường típ 2 là
một rối loạn mạn tính mà nguyên nhân được cho là do có sự tương tác giữ yếu

tố gen và yếu tố môi trường [24].

1.3.1 Thừa cân và béo phì
Tỷ lệ người trưởng thành bị thừa cân (BMI từ 25 – 30 kg/m2) và béo phì
(BMI >30 kg/m2) trên thế giới đã được dự đoán là sẽ tăng lên 57% vào năm
2030. Thừa cân và béo phì dẫn tới viêm, tăng tiết từ mơ mỡ các hoạt chất
nhóm adipocytokyne. Tất cả những hiện tượng này đều có vai trị gây ra kháng
insulin ở gan, mơ cơ và làm tăng nguy cơ dẫn đến bệnh tiểu đường [58]. Theo
khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới, đối với người châu Á, BMI từ 23-25
kg/m2 là thừa cân và trên 25 kg/m2 là béo phì [24].
Đặc điểm của đa số bệnh nhân tiểu đường ở Việt Nam thường có BMI
bình thường nhưng lượng mỡ của cơ thể thường cao, đặc biệt là ở phụ nữ [36].
Nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy những người có BMI > 23 kg/m2 thì có nguy
cơ mắc tiểu đường typ 2 cao gấp 2,89 lần so với người bình thường.

1.3.2 Tuổi
Nguy cơ tiểu đường tăng cùng với tuổi do tăng tính kháng insulin liên
quan tới béo phì và tình trạng ít vận động. Cùng với thời gian, các tế bào β suy
yếu do chúng phải tăng tiết insulin để bù đắp cho sự tăng mức độ kháng insulin
của cơ thể. Ở châu Á, tỷ lệ này cao ở người trẻ tuổi và trung niên (độ tuổi lao
động sản xuất chính của xã hội). Điều này gây nên gánh nặng lớn cho các nước
Châu Á mà trong đó chủ yếu là những nước đang phát triển và kém phát triển
[55].
Tại Việt nam, nghiên cứu dịch tễ bệnh tiểu đường tại 4 thành phố lớn thực
hiện năm 2003 cho kết quả tỷ lệ mắc tiểu đường ở nhóm người dưới 35 tuổi là


0,9% cịn ở nhóm người 45-54 tuổi là 6,5% và ở nhóm người 55-64 tuổi là
10,3%.

Nghiên cứu này cũng chứng minh rằng tuổi cao là một yếu tố nguy cơ đặc biệt,
có liên quan chặt chẽ đến bệnh tiểu đường.

1.3.3 Tiền sử gia đình
Tiền sử gia đình là một yếu tố quan trọng liên quan tới bệnh tiểu đường,
điều này thể hiện cho vai trò của yếu tố di truyền đối với nguy cơ mắc bệnh.
Những đối tượng có nguy cơ mắc bệnh cao nếu có ít nhất 1 người trong gia đình
bị bệnh. Theo một nghiên cứu của Tạ Văn Bình và cộng sự, tiền sử gia đình có
bố mẹ hoặc con ruột, anh, chị, em ruột bị mắc tiểu đường thì có nguy cơ mắc
bệnh cao gấp 3,28 lần so với nhóm bình thường khơng có người thân trong gia
đình mắc bệnh tiểu đường [36].

1.3.4 Yếu tố gen
Nghiên cứu ở các cặp sinh đôi đã cung cấp những bằng chứng thuyết phục
về những ảnh hưởng của yếu tố di truyền đối với bệnh tiểu đường. Các cặp sinh
đơi cùng trứng có tỷ lệ tương đồng cao hơn so với các cặp sinh đôi khác trứng.
Sự tương đồng về nguy cơ mắc tiểu đường típ 2 ở người sinh đơi cùng trứng từ
34- 83% và ở người sinh đôi khác trứng là 16-40% [57].

1.3.5 Chế độ dinh dưỡng và hoạt động thể lực
Chế độ dinh dưỡng và luyện tập phù hợp là chìa khóa để chống lại trình
trạng béo phì và cao huyết áp, tăng hoạt động của insulin và giảm sự tạo
glucogen ở gan. Hoạt động thể lực có vai trị đặc biệt quan trọng đối với bệnh
tiểu đường típ 2. Nhóm đối tượng ít vận động (<30 phút/ ngày) có nguy cơ
mắc bệnh tiểu đường cao gấp 2,4 lần so với nhóm hoạt động nhiều. Nhiều
nghiên cứu đã có thấy rằng việc vận động thể lực thường xuyên có tác dụng làm
giảm nồng độ glucose máu đồng thời giúp duy trì sự ổn định của lipid máu,
huyết áp và giúp cải thiện tinh thần. Sự phối hợp các hoạt động thể lực và điều
chỉnh chế độ ăn phù hợp có thể giúp giảm 58% tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường típ 2

[58].

1.4 Cơ chế bệnh sinh của tiểu đường típ 2
Tiểu đường típ 2 là dạng tiểu đường thường gặp nhất, chiếm khoảng 80 90% trong số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường. Thơng thường, với bệnh tiểu
đường típ 2, trong cơ thể vẫn còn khả năng sản xuất insulin, nhưng insulin được
sản xuất


ra không đủ hoặc các tế bào không thể sử dụng nó và được gọi là kháng insulin
[30].
Có hai yếu tố cơ bản đóng vai trị quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của
tiểu đường típ 2 là đề kháng với insulin và suy giảm chức năng tiết insulin kết
hợp với nhau [30].
Glucose đóng vai trị là nguồn cung cấp năng lượng chính cho các tế bào
trong cơ thể. Tuy nhiên để có thể nhận được glucose các tế bào phải cần đến
insulin hoạt động như một “chiếc chìa khóa” giúp glucose có thể vào được tế
bào. Kháng insulin có thể xảy ra ở gan và các mô ngoại vi theo các hình thức
sau: giảm sử dụng glucose ở các cơ quan, giảm thu nhận glucose ở mô ngoại vi
và khả năng ức chế sản xuất glucogen ở gan bị giảm. Thừa cân và béo phì là
những yếu tố quan trọng làm gia tăng tình trạng kháng insulin, trong đó béo phì
thường là do cơ thể hấp thu quá nhiều chất béo nhưng lại ít vận động. Axit béo
tự do có nhiều ở những người bệnh béo phì sẽ cạnh tranh với glucose trong
chuyển hóa tại cơ vân dẫn đến sự rối loạn sử dụng glucose ở ngoại biên và gây
nên tình trạng đề kháng insulin [14].
Khi cơ thể có hiện tượng kháng insulin, nồng độ glucose trong máu sẽ
tăng cao hơn mức bình thường. Tế bào β đảo tụy lại đáp ứng bằng cách sản xuất
nhiều hơn insulin. Quá trình này diễn ra kéo dài sẽ dẫn đến chức năng của tế
bào β bị suy giảm. Ngoài ra khi cả axit béo tự do và insulin đều tăng, quá trình
chuyển hóa sẽ tăng lên tại ty thể, làm gia tăng các gốc tự do dẫn đến gia tăng tình
trạng viêm. Thêm vào đó, insulin trong máu cao cịn gây hiện tượng stress lưới

nội chất. Cả hai tình trạng này đều dẫn đến kết quả là tế bào sẽ chết theo chu
trình. Hậu quả là tế bào β giảm tiết insulin. Khi nồng độ insulin ở tế bào cửa gan
thấp, gan đáp ứng bằng cách giải phóng glucose vào máu trong khi nồng độ
glucose đã cao sẵn sau bữa ăn. Ngoài ra ở tế bào cơ vân, nồng độ insulin thấp
làm glucose ít vào tế bào, góp phần dẫn đến glucose trong máu cao. Trong giai
đoạn này, nồng độ insulin thấp do tụy ít sản xuất và bài tiết insulin kèm theo
tình trạng kháng insulin làm khả năng kiểm sốt nồng độ glucose ngày càng
xấu đi và có thể gây nên nhiều biến chứng nghiêm trọng cho người bệnh [14].


1.5 Các biến chứng bệnh tiểu đường
Bệnh tiểu đường nếu khơng được điều trị tốt và q trình điều trị không
chặt chẽ sẽ gây ra các biến chứng nguy hiểm và các bệnh mạn tính, cấp tính kèm
theo. Một số biến chứng cấp tính giai đoạn đầu của tiểu đường như: Nhiễm toan
ceton – thường xảy ra với tiểu đường típ 2, hạ đường huyết – thường gặp bệnh
nhân dùng thuốc hạ đường huyết quá liều hoặc dùng thuốc trong lúc đói bỏ bữa,
hơn mê do tăng áp lực thẩm thấu máu. Một số biến chứng mãn tính như: Biến
chứng mạch máu lớn (bệnh mạch vành, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu,..), các
bệnh lý mạch máu nhỏ (bệnh lý võng mạc, bệnh lý thận, bệnh lý thần kinh,.)[2],
[6]. Hậu quả để lại nặng nề, gây ra gánh nặng cho người bệnh và gia đình người
bệnh.

Hình 1. 1 Các biến chứng của bệnh tiểu đường.

1.6 Phương pháp điều trị bệnh tiểu đường
1.6.1 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 1 [2], [26]
Do tế bào β tuyến tụy bị phá hủy bởi chất trung gian miễn dịch nên cơ thể
khơng có khả năng tạo ra insulin. Do đó, bệnh nhân phải tiêm insulin thường
xuyên trong suốt cuộc đời để bổ xung đủ lượng insulin cho cơ thể.

1.6.2 Phương pháp điều trị tiểu đường típ 2 [2], [26]
Thuốc điều trị đối với nhóm đối tượng này được chia làm 3 nhóm chính:
- Nhóm thuốc kích thích tụy bài tiết insulin như nhóm sulphonylurea:
gliclazid, glibenclamid, glimepiride…
- Nhóm thuốc làm tăng nhạy cảm insulin ở ngoại vi, giảm đề kháng
insulin như nhóm biguanide: metformin (thuốc duy nhất được sử dụng thuộc
nhóm này); nhóm thiazolidinedion.
- Thuốc ức chế enzym α-glucosidase như: acarbose, voglibose, miglitol làm hấp
thu chậm glucose từ ruột vào máu.
Đối với bệnh nhân tiểu đường típ 2, ngồi uống thuốc điều trị cần phải kết
hợp với chế độ ăn, vận động thể lực hợp lí để điều trị đạt hiệu quả tốt nhất. Chế
độ ăn lành mạnh là một yếu tố khá quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến bệnh tiểu
đường, cần lựa chọn các loại thực phẩm có nhiều chất xơ, ăn nhiều đạm có
nguồn gốc thực vật, ăn nhiều trái cây, ít chất béo. Chế độ tập luyện thường
xuyên sẽ giúp cải thiện sức khỏe, giúp chống lại bệnh tật nhất là các bệnh về
tim mạch, xương khớp. Vận động thường xuyên giúp tăng cường sức khỏe, giảm
cân và giảm đường huyết nên được coi là một biện pháp quan trọng trong điều
trị bệnh tiểu đường [58]. Hơn nữa, mỗi đối tượng cụ thể sẽ có bệnh lý kèm
theo cũng như thể trạng khác nhau nên việc kết hợp các thuốc trong nhóm với
nhau nhằm giảm đường huyết hữu hiệu.

1.7 Dịch tễ học
Bệnh tiểu đường là căn bệnh rối loạn chuyển hóa hay gặp ở các nước phát
triển và đang phát triển gây ra các gánh nặng về tài chính, y tế, xã hội nghiêm
trọng. Bệnh gây ra các biến chứng nguy hiểm liên quan mật thiết với nhau, là
nguyên nhân hàng đầu về các bệnh tim mạch, cụt chi, mù lòa, suy thận.
Tiểu đường trở thành bệnh lý đáng báo động nhất trên toàn thế giới từ
những năm đầu của thế kỷ 21. Theo cuộc điều tra của Liên đoàn Tiểu đường
Thế giới (International Diabetes Federation - IDF): năm 2015 tồn thế giới có

415 triệu người (trong độ tuổi 20-79) bị bệnh tiểu đường (tiểu đường), tương
đương cứ 11 người có 1 người bị tiểu đường. Năm 2017 dân số thế giới là 7,5
tỷ người trong đó có 425 triệu người (trong độ tuổi 20 - 79) bị bệnh tiểu đường.
Dự tính đến năm


2040 con số này sẽ là 642 triệu, tương đương cứ 10 người có 1 người bị tiểu
đường [8] và đến năm 2045 con số này sẽ là 629 triệu; đặc biệt trong hai người
trưởng thành (trong độ tuổi 20 - 79) bị tiểu đường thì có một người khơng
được chẩn đốn. Đơng Nam Á có số người trưởng thành bị tiểu đường cao thứ
hai trong các vùng theo IDF, chiếm tỷ lệ 8,5% tổng số người bị tiểu đường trên
thế giới, trong đó khoảng 45,8% các trường hợp bị tiểu đường khơng được
chẩn đốn và gần 48,8% người trưởng thành mắc bệnh tiểu đường sống ở các
thành phố [42].
Tại Việt Nam, trong kết quả công bố của “Dự án phòng chống tiểu đường
quốc gia” do Bệnh viện Nội tiết Trung ương thực hiện năm 2012 trên 11000
người trong độ tuổi 30 - 69 sống tại 6 vùng miền gồm: miền núi phía Bắc,
đồng bằng sơng Hồng, dun hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và
Tây Nam Bộ đã cho thấy tỷ lệ hiện mắc tiểu đường trên toàn quốc ở người
trưởng thành là 5,42%, tăng gấp gần hai lần so với tỷ lệ tiểu đường năm 2012 là
2,7%. Ngồi ra, tỷ lệ tiểu đường chưa được chẩn đốn trong cộng đồng lên tới
63,6% [3]. Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose trong cả nước là 7,3%, rối loạn
glucose máu lúc đói 1,9% (năm 2003). Theo kết quả điều tra của Bộ Y tế, hiệp
hội Nội tiết – Tiểu đường Việt Nam, nước ta hiện có hơn 3,16 triệu người mắc
bệnh tiểu đường. Tỷ lệ này đang chiếm hơn 5% dân số trưởng thành trong độ
tuổi 20-79. Và tỷ lệ người mắc bệnh tiểu đường ngày càng trẻ hoá. Nhưng một
điều đáng mừng là có tới 70% trường hợp tiểu đường típ 2 có thể dự phịng
hoặc làm chậm xuất hiện bệnh bằng tuân thủ lối sống lành mạnh, dinh dưỡng
hợp lý và tăng cường luyện tập thể lực [8].

2. Mơ hình gây tiểu đường
Thử nghiệm tiểu đường trên mơ hình động vật là điều cần thiết để nâng
cao nhận thức và hiểu biết về các khía cạnh khác nhau của cơ chế bệnh sinh từ
đó tìm ra các liệu pháp và các phương pháp điều trị mới. Hầu hết các mơ hình
hiện nay đều sử dụng động vật gặm nhấm làm đối tượng thí nghiệm do nhiều ưu
điểm của chúng như kích thước nhỏ, khoảng cách thế hệ ngắn, tính sẵn có và chi
phí thấp. Bệnh tiểu đường thực nghiệm thường được gây ra ở động vật thí
nghiệm bằng các phương pháp phổ biến như: tác nhân hóa học, phẫu thuật, di
truyền [45].


2.1 Tác nhân hóa học
Các tác nhân hóa học gây ra tiểu đường có thể phân thành ba loại: phá hủy
tế bào β đảo tụy, gây ức chế tạm thời việc sản xuất và/hoặc tiết insulin, làm giảm
chuyển hóa insulin trong mơ đích.
Streptozocin (STZ 61%) và Alloxan (31%) cho đến nay là những thuốc
được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu về bệnh tiểu đường và giúp ích
cho nghiên cứu nhiều khía cạnh của bệnh. Các loại thuốc này có thể được đưa
vào cơ thể bằng cách tiêm tĩnh mạch, tiêm màng bụng hoặc tiêm dưới da. Liều
cần thiết để gây ra bệnh tiểu đường phụ thuộc vào loại động vật, đường dùng
thuốc và tình trạng dinh dưỡng. Tùy theo liều dùng của các thuốc này mà các
hội chứng tương tự như tiểu đường típ 1, tiểu đường típ 2 hoặc khơng dung nạp
glucose có thể được gây ra. Tác dụng gây độc tế bào của các loại thuốc này đều
qua trung gian là các phản ứng oxy hóa nhưng chúng có sự khác nhau về cơ chế
hoạt động [45].
 Streptozotocin
Streptozotocin (STZ) là chất hóa học thuộc nhóm hợp chất glucosamine
nitrosorea, có cơng thức hóa học là C8H15N3O7, đã được thử nghiệm lâm sàng từ
năm 1967. STZ tồn tại trong tự nhiên, chúng có khả năng gây độc đặc hiệu với tế
bào β sản xuất insulin của tuyến tụy ở động vật có vú. STZ được phát hiện có

trong một chủng vi khuẩn có tên là Streptomyces achromogenes vào những năm
50 của thế kỷ 20, hiện nay STZ đang được sử dụng trong y tế để điều trị một số
ung thư trên đảo tụy Langerhan và là chất gây tiểu đường được sử dụng phổ
biến nhất và có hiệu quả trên các mơ hình động vật thực nghiệm, nhằm phục vụ
cho các nghiên cứu y học [56] .

Hình 1. 2 Cơng thức hóa học của Streptozocin


STZ xâm nhập vào tế bào β đảo tụy thông qua chất vật chuyển glucose GLUT2 và gây ra sự alkyl hóa axit deoxyribonucleic (DNA). Ngồi ra, STZ cịn
gây kích hoạt sự ribosyl hóa poly adenosin diphosphat và giải phóng nitric oxid.
Kết quả là tế bào tụy bị phá hủy do hoại tử [45].
Sử dụng STZ trong mơ hình bằng nhiều phương pháp:
- STZ cho chuột mới sinh: Mơ hình tiêm STZ cho chuột mới sinh (với sự thay
đổi liều và ngày tiêm STZ) biểu hiện các giai đoạn khác nhau của tiểu đường típ
2 như làm giảm dung nạp glucose, glucose máu giảm nhẹ/ trung bình/ nặng.
Các tế bào β ở chuột mới sinh tiêm STZ có sự tương đồng về đặc điểm bài tiết
insulin ở bệnh nhân tiểu đường típ 2 [31], [61].
- Kết hợp Nicotinamid - Streptozocin (NAD - STZ): Nicotinamid là một chất
chống oxy hóa có tác dụng bảo vệ bằng cách làm sạch các gốc tự do và do đó
bảo vệ được một phần tế bào β khỏi tác động gây độc tế bào của STZ [52].
Tùy vào liều lượng STZ và cách thức tiến hành tiêm thuốc mà có thể gây
mơ hình động vật tiểu đường típ 1 hoặc tiểu đường típ 2. Liều trên chuột nhắt
dao động từ 100 - 150 mg/kg [29], trên chuột cống dao động từ 40 - 100 mg/kg
[28].
Một vấn đề khi sử dụng STZ là tác dụng độc hại của nó khơng giới hạn ở
tuyến tụy vì nó có thể gây tổn thương thận, gây viêm và rối loạn chức năng nội
mô.
 Alloxan
Alloxan, đôi khi được gọi là alloxan hydrate; 2,4,5,6-Tetraoxypyrimidine;

2,4,5,6-pỷimidinetetrone; Axit 5,5-dihydroxybarbituric. Nó là dẫn xuất của axit
uric, khơng bền ở pH trung tính, khá ổn định ở pH=3.

Hình 1. 3 Cơng thức hóa học của Alloxan

10


Alloxan cũng giống như streptozotocin là những hóa chất gây tiểu đường
nổi bật nhất trong nghiên cứu bệnh tiểu đường. Cả hai đều là chất tương tự
glucose gây độc tế bào. Mặc dù độc tính tế bào của chúng đạt được thông qua
các con đường khác nhau, cơ chế hoạt động chọn lọc tế bào β của chúng là giống
hệt nhau.
Alloxan tác động trên tế bào qua bốn giai đoạn [54]:
Giai đoạn thứ nhất: hạ đường huyết thoáng qua đầu tiên lên đến 30 phút
bắt đầu trong vòng vài phút sau khi tiêm Alloxan. Phản ứng hạ đường huyết
trong thời gian ngắn này là kết quả của sự kích thích thoáng qua bài tiết
insulin, được ghi nhận bằng sự gia tăng nồng độ insulin trong huyết tương. Cơ
chế cơ bản của chúng là giảm tiêu thụ tạm thời và tăng khả năng tiêu thụ
ATP do ức chế quá trình phosphoryl hóa glucose thơng qua ức chế glucokinase.
Giai đoạn hạ đường huyết thống qua ban đầu này khơng được quan sát khi
gây mơ hình tiểu đường bằng streptozotocin, vì streptozotocin khơng ức chế
glucokinase. Sự thay đổi hình thái là tối thiểu trong giai đoạn này.
Giai đoạn thứ hai bắt đầu với sự gia tăng nồng độ glucose trong máu, 1 giờ
sau khi tiêm alloxan và giảm insulin huyết tương. Giai đoạn tăng đường huyết
này, thường kéo dài 2 - 4 giờ, được gây ra bởi sự ức chế bài tiết insulin dẫn
đến hạ đường huyết. Trong giai đoạn này, các tế bào β cho thấy các đặc điểm
hình thái thay đổi như: không bào nội bào, giãn màng lưới nội chất thơ, giảm
diện tích Golgi, giảm bài tiết và hàm lượng insulin, ty thể bị sưng…
Giai đoạn thứ ba, một lần nữa là giai đoạn hạ đường huyết, thường xảy ra

sau khi tiêm alloxan và kéo dài vài giờ. Nó có thể gây co giật và thậm chí có thể
gây tử vong nếu không sử dụng glucose, đặc biệt là khi glycogen ở gan bị cạn
kiệt do đói. Sự hạ đường huyết nghiêm trọng này được tạo ra do lưu thông
insulin (kết quả của việc tiết ra chất độc làm vỡ màng tế bào). Ngồi những thay
đổi về hình thái được thấy trong giai đoạn đầu tiên, các nhân tế bào β có hình
chóp và khơng có màu dương tính với TUNEL.
Giai đoạn thứ tư là giai đoạn tăng đường huyết vĩnh viễn. Sự thối hóa
hồn tồn và mất tính tồn vẹn của tế bào β được nhìn thấy trong 48-72 giờ sau
khi tiêm Alloxan. Các tế bào khác vẫn còn nguyên vẹn, thể hiện tính chất chọn
lọc tế bào β. Các mảnh vụn tế bào có nguồn gốc từ các tế bào β bị phá hủy được
loại bỏ bởi các đại thực bào.
21


2.2 Phẫu thuật gây tiểu đường
Phương pháp này bao gồm cắt bỏ hoàn toàn hoặc một phần tụy để gây tiểu
đường típ 1 hoặc típ 2. Trong lịch sử, mơ hình mắc bệnh tiểu đường ở chó được
Oskar Minkowski phát hiện thông qua phẫu thuật cắt bỏ tụy được coi là mơ hình
động vật đầu tiên về bệnh tiểu đường [51]. Một số nhà nghiên cứu đã sử dụng
mơ hình này để thử nghiệm các sản phẩm tự nhiên trên chuột, chó, linh trưởng
[48], [77].

2.3 Tiểu đường do di truyền
Các động vật mắc bệnh tiểu đường típ 2 có thể được lấy từ việc chọn
giống (các động vật có một hoặc một số gen đột biến được truyền từ thế hệ này
sang thế hệ khác) hoặc từ lai tạo chuột ob không bị tiểu đường bằng nhân giống
lặp đi lặp lại qua nhiều thế hệ với chuột BB, chuột tiểu đường béo phì
Tsumara Suzuki. Những động vật này bị tiểu đường là do di truyền hoặc do
khiếm khuyết đơn hoặc đa gen (chuột KK, chuột db/db hoặc chuột béo Zucker).
Bệnh tiểu đường típ 2 ở người phần lớn là kết quả của sự tương tác giữa môi

trường và sự khiếm khuyết đa gen. Do đó, động vật khiếm khuyết đa gen sẽ
gần giống với người hơn động vật khiếm khuyết đơn gen [71].

3.Tổng quan về enzym α–glucosidase và chất ức chế enzym αglucosidase
3.1 Enzym và chất ức chế enzym
Enzym là chất xúc tác sinh học được hình thành trong tế bào sinh vật có
cấu trúc đặc thù và có thành phần cơ bản là protein. Trong tế bào sinh vật ln
xảy ra q trình trao đổi chất, nhờ có enzym mà nhiều phản ứng hóa học xảy ra
nhanh chóng với hiệu suất cao mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp
suất, pH. Các phân tử tham gia vào ngay lúc đầu của quá trình phản ứng được
gọi là chất nền và enzym biến đổi chất nền thành các phân tử khác. Chúng có
thể được thu nhận từ các cơ thể sống khác nhau của động vật, thực vật và vi
sinh vật [27]. Enzym có tính đặc hiệu và chọn lọc rất cao đối với các chất nền
của nó [19]. Vì vậy trong cơ thể sinh vật enzym có chức năng xúc tác chọn lọc,
đóng vai trị định hướng tất cả các phản ứng xảy ra trong tế bào. Khi ở ngồi tế
bào, nhiều enzym vẫn có khả năng hoạt động tương tự [75].


Chất ức chế enzym là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn
toàn tác dụng của enzym. Các chất ức chế enzym có bản chất hóa học rất khác
nhau, chúng có thể là các cation, các anion, các hợp chất hữu cơ phân tử nhỏ
hoặc thậm chí là các protein. Chất ức chế có thể có phản ứng thuận nghịch hoặc
không thuận nghịch với enzym. Thông thường được phân chia thành hai loại ức
chế thuận nghịch là ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh [76].
Đối với chất ức chế cạnh tranh: chất kìm hãm có cấu trúc tương tự cơ
chất, gắn thuận nghịch vào trung tâm phản ứng của enzym, gây giảm chức năng
xúc tác của enzym.
Đối với chất ức chế không cạnh tranh: chất kìm hãm gắn thuận nghịch vào
vị trí khác trên enzym (vị trí dị lập thể) chứ khơng gắn vào vị trí xúc tác và làm
thay đổi cấu hình vị trí hoạt động của enzym khiến chúng khơng phù hợp để cơ

chất gắn vào. Dù theo hình thức ức chế nào thì khi chất kìm hãm được giải
phóng, hoạt động xúc tác của enzym sẽ bình thường trở lại [19].

3.2 Enzym α–glucosidase
Enzym α-glucosidase có những tên gọi khác như maltase, glucoinvertase,
glucosidosucrase,
maltase-glucoamylase,
α-glucopyranosidase,
glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, thuộc nhóm
hydrolase (nhóm enzym làm gẫy các liên kết bằng thủy phân) [64].
Enzym α-glucosidase là enzym 1 thành phần, có hoạt tính exohydrolysis,
xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tận cùng không khử
của carbonhydrate để giải phóng phân tử α-D-glucose. Chất nền đặc trưng của
enzym này là các disaccharide, oligosaccharide, các aryl và akyl- α-glucosidase
khác [74].
Enzym α-glucosidase là một trong những enzym thuộc lớp glycoside
hydrolase – là một lớp các enzym thường tách liên kết glycoside giữa 2 phân tử
carbohydrate, một trong những liên kết mạnh nhất được tìm thấy ở các polymer
tự nhiên. Các enzym này có khả năng bẻ gãy các liên kết glycoside nhanh hơn
10- 17 lần so với phản ứng khơng có enzym xúc tác [34].
Nguồn gốc, phân bố: Enzym α-glucosidase được tìm thấy trên màng bề
mặt của đường ruột, tham gia vào bước cuối của quá trình tiêu hóa [10].


 Cơ chế hoạt động
Chúng ta biết rằng carbohydrat chứa trong thức ăn là nguồn cung cấp
đường cho cơ thể. Sau khi vào cơ thể, chúng được thủy phân thành những phân
tử đường đơn bởi những enzym trong ruột non và các phân tử đường này được
đưa đến các cơ quan, các tế bào ở khắp cơ thể [80].
Nguồn carbohydrat này sau khi vào cơ thể sẽ được các enzym ở tụy (αamylase) và ruột non (α-glucosidase) tiết ra, thủy phân thành những phân tử

đường đơn rồi thẩm thấu vào máu. Enzym α-glucosidase có chức năng xúc tác
việc cắt đứt các liên kết 1,4-α-D-glucosid của cơ chất để giải phóng α-D-glucose
[80].
Bằng cách kiềm chế sự hoạt động của enzym α-glucosidase có thể làm
giảm sự thủy phân của carbohydrate và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu
[34].

3.3 Các chất ức chế enzym α-glucosidase
Một số chất tổng hợp được sử dụng để ức chế hoạt động của enzym này
được được sử dụng rộng rãi như Acarbose, Miglitol, Voglibose …[2] Các chất
này được sử dụng như một thuốc giúp điều trị tiểu đường típ 2, chúng ức chế
các enzym α-glucosidase ở ruột. Acarbose là một tetrasaccharid, ít hấp thụ ở
đường tiêu hóa và ức chế cạnh tranh với enzym α-glucosidase ở ruột non [26] có
tác dụng chống tăng đường huyết sau ăn và không làm tăng tiết insulin, không
làm hạ đường huyết. Tuy nhiên, Acarbose có tác dụng phụ thường gặp trên
đường tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng, tiêu chảy, buồn nơn… nhất là khi ăn
đường mía và thực phẩm có đường do carbohydrate không được hấp thu và lên
men ở đại tràng [26]. Vì vậy, việc nghiên cứu các dược liệu có tác dụng ức chế
enzym α-glucosidase rất cần thiết để giúp q trình điều trị tiểu đường típ 2 có
nhiều lựa chọn phù hợp.


Hình 1. 4 Cơng thức hóa học của Acarbose