Nghiên cứu phương pháp sản xuất và một số đặc tính của dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm (Holothuroidea).PDF

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

NGUYỄN THỊ ÁNH

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT
VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN
TỪ NỘI TẠNG HẢI SÂM (Holothuroidea)

C
C
R
UT.L

D

Chuyên ngành: Cơng nghệ Sinh học
Mã số: 8420201

TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đà Nẵng – Năm 2020


Cơng trình được hồn thành tại
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Người hướng dẫn khoa học: T.S Tạ Ngọc Ly
PGS.TS Đặng Minh Nhật

Phản biện 1: PGS.TS Trần Thị Xô

Phản biện 2: TS. Bùi Xuân Đông

C
C
R
UT.L

D

Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ
Công nghệ Sinh học họp tại Trường Đại học Bách khoa vào
ngày 16 tháng 12 năm 2020

Có thể tìm hiểu luận văn tại:
− Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng tại Trường Đại học Bách khoa
− Thư viện Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa - ĐHĐN


1
MỞ ĐẦU
1.

Tính cấp thiết của đề tài
Hải sâm là lồi hải sản có giá trị dinh dưỡng và y học cao. Ở

Việt Nam, Hải sâm là một trong những nhóm nguồn lợi quan trọng, có
mức độ phong phú về thành phần lồi, trong đó có nhiều lồi có giá trị
thương mại cao (khoảng 9 loài) đã được khai thác với sản lượng lớn
(trong những năm 90).
Ước chừng nội tạng Hải sâm chiếm 40% trọng lượng cơ thể.

Nhiều thành phần trong nội tạng của Hải sâm đã được nghiên cứu phát
hiện ra như là EPA, DHA là các axit béo chiếm lần lượt là 13,09% và
6,88% , 8 loại axit amin thiết yếu chiếm 39,93% tổng axit amin toàn
cơ thể [1]. Các cơ quan nội tạng cũng rất giàu khoáng chất như các

C
C
R
UT.L

nguyên tố Mg, Fe, Zn, V, Se [1], lectin [2] [3] [4]. Với hàm lượng chất
dinh dưỡng, protein lớn như vậy, nội tạng Hải sâm cần được ứng dụng

D

nhiều hơn vào các lĩnh lực như chế biến đồ hộp, sản xuất nước mắm,
phân bón, ngồi ra cịn có thể nghiên cứu cho lĩnh vực dược phẩm. Sự
đánh giá ngày càng cao về Hải sâm ở các thị trường châu Á, châu Âu
và sự công nhận của các nhà khoa học về hàm lượng dinh dưỡng của
Hải sâm đã dẫn đến việc sức tiêu thụ Hải sâm ngày càng tăng trên thế
giới, kéo theo lượng phụ phẩm của Hải sâm bị thải bỏ cũng tăng theo.
Chính vì vậy, việc chế biến, xử lý các phụ phẩm Hải sâm nhằm thu
được protein có giá trị thương mại cao hơn, đồng thời tránh các vấn đề
về môi trường đang là những mục tiêu được quan tâm nghiên cứu.
Hiện nay nhu cầu về thực phẩm chế biến sẵn ngày càng tăng cao
trên toàn thế giới, nên protease đang là đối tượng được nghiên cứu
rộng rãi trong lĩnh vực này vì chúng có khả năng phân giải làm mềm
thịt, tạo ra dịch đạm thủy phân giàu dinh dưỡng. Do đó, việc thủy phân
bằng protease để thu hồi protein từ phụ phẩm Hải sâm là một cách tiếp

2
cận hiệu quả và nên được ứng dụng rộng rãi. Tuy nhiên vẫn chưa có
một cơng trình nào cơng bố về việc nghiên cứu nội tạng Hải sâm để
ứng dụng vào một lĩnh vực cụ thể. Do đó, trong nghiên cứu này, tôi
tiến hành xác định điều kiện tối ưu hóa nội tạng Hải sâm, từ đó thu
nhận dịch đạm thủy phân và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng,
nhằm góp phần giảm thiểu ơ nhiễm mơi trường góp phần xử lý chất
thải một cách khoa học, giúp phát triển bền vững ngành khai thác, chế
biến thủy - hải sản.
Mục đích nghiên cứu

2.

Đề tài hướng đến 3 mục đích nghiên cứu chính:
- Xác định động học phản ứng enzyme.
- Xác định các thông số công nghệ sản xuất và hồn thiện quy

C
C
R
UT.L

trình sản xuất dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm.

- Xác định được một số đặc tính của dịch đạm thủy phân từ nội
tạng Hải sâm

D

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.
a.

Ý nghĩa khoa học

- Thu được một quy trình sản xuất dịch đạm thủy phân từ nội tạng
Hải sâm một cách tối ưu.
- Từ những đặc tính của dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm,
có thể ứng dụng rộng rãi hơn trên các đối tượng khác và lĩnh vực khác.
b.

Ý nghĩa thực tiễn
Tận dụng được nguồn nguyên liệu bỏ đi là nội tạng Hải sâm để

tạo nên sản phẩm thủy phân với hàm lượng dinh dưỡng cao, đồng thời
góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường, hướng đến việc khai thác và
chế biến Hải sâm bền vững.


3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Hải sâm
1.1.1.

Khái niệm và phân bố

C
C
R
UT.L
Hình 1.1. Hải sâm

Hải sâm hay cịn gọi là dưa biển, sâm biển, đỉa biển, là lồi động

D

vật khơng xương sống, thành viên lớp Holothuroidea, cùng ngành
động vật da gai với sao biển, nhím biển,… Thân có dạng ống dài như
quả dưa, phình ra ở giữa và thon nhỏ ở hai đầu với những gai thịt nhỏ.
Phía trước miệng có vành tua rõ rệt, phía sau là hậu mơn. Dọc thân là
các dãy chân ống. Da mềm có các phiến xương nằm rải rác dưới da.
Hải sâm là động vật phân tính, trừ một số lồi thuộc bộ Khơng chân
(Apoda). Trứng thụ tinh và phát triển ngoài cơ thể mẹ. Hải sâm được
coi như là loại thuốc bổ thận, bổ âm, tráng dương ích tinh, nhuận táo,
chữa lị, chữa viêm phế quản, thần kinh suy nhược, cầm máu, thành
phần lipit của Hải sâm có tác dụng chữa xơ vữa động mạch, hen suyễn
Hải sâm là một nhóm đa dạng và phong phú, chúng phân bố
khắp đại dương trên thế giới với khoảng 2500 loài thuộc 25 họ khác
nhau [6]. Nghiên cứu năm 2009 tại các rạn san hô của Biển Đơng, Biển
Sulu và Biển Sulawesi đã tìm thấy 12 lồi Hải sâm từ 4 họ và 9 chi


4
khác nhau. Họ chiếm ưu thế nhất là Holothurridae (5 loài), tiếp theo là
Stichopodidae (3 loài), Synaptidae (3 loài), Cucumarridae (1 loài) [8].
Năm 1991, cuộc khảo sát về sự phân bố của một loại Hải sâm

điển hình đó là Hải sâm đỏ ở vùng biển Đông Nam Alaska cho thấy
mật độ Hải sâm đếm được trong các tuyến trung bình là 20,8 cá thể
trên 1ha ở tầng trong; 70,9 cá thể ở tầng giữa và 103,7 cá thể ở tầng
ngoài của vịnh. Có 6 loại địa tầng bắt gặp được Hải sâm đó là bùn/cát,
mảnh vụn, đá, vỏ sị, tường đá và tảo. Hải sâm thu thập thức ăn bằng
cách lấy thức ăn dưới dạng hạt từ đáy biển hoặc bằng cách nuốt một
lượng lớn chất nền chứa đầy dinh dưỡng mà chúng đào bới được [11].
1.1.2.

Vai trò, giá trị của Hải sâm

Hải sâm có các chất dinh dưỡng quý như Vitamin A, Vitamin

C
C
R
UT.L

B1 (thiamine), Vitamin B2 (riboflavin), Vitamin B3 (niacin) và các
khoáng chất, đặc biệt là canxi, magiê, sắt và kẽm [13]. Thành cơ thể

D

Hải sâm chứa nhiều collagen, được sử dụng như chất bổ sung dinh
dưỡng cho quá trình tạo máu. Protein Hải sâm rất giàu lysine, arginine
và tryptophan. Ở Đông Á, Hải sâm từ lâu đã được sử dụng như một
loại thuốc truyền thống để điều trị hen suyễn, tăng huyết áp, thấp khớp,
thiếu máu và tắc nghẽn xoang [15]. Chúng cũng đã được báo cáo là có
hiệu quả trong việc chữa lành các vết thương bên ngồi khác nhau [15].
Hải sâm có khả năng ức chế sự hình thành các gốc tự do AAPH và

DPPH, các mẫu có cơ quan nội tạng có khả năng ức chế các gốc oxy
hóa cao hơn so với các mẫu khơng có nội tạng, cho thấy các cơ quan
nội tạng có hoạt chống oxy hóa cao hơn thành cơ thể của chúng [18].
Trong hệ sinh thái, Hải sâm giữ vai trò quan trọng như chúng là
động vật ăn lọc, ăn mùn bã và cả con mồi. Trong các khu rừng tảo bẹ
và rạn san hô, chúng tiêu thụ kết hợp cả vi khuẩn, tảo cát và mùn bã


5
hữu cơ [19] [20]. Chức năng của chúng như một hệ thống treo hoặc bộ
lọc có giá trị đáng kể dưới đáy biển.
Ngoài tầm quan trọng về sinh thái, Hải sâm cịn có giá trị xã hội
và kinh tế to lớn đối với các cộng đồng dân cư ven biển. Chẳng hạn,
nghề khai thác Hải sâm là nguồn thu nhập chính của nhiều cộng đồng
ven biển ở Quần đảo Solomon [29] và cho 4000 – 5000 gia đình ở Sri
Lanka [30].
1.1.3.

Tình hình khai thác Hải sâm

1.1.3.1.

Trên thế giới

Vào những năm 1990, tổng sản lượng đánh bắt Hải sâm thương
mại trên toàn thế giới đạt mức 30.000 tấn/năm, chủ yếu là do nhu cầu
ngày càng tăng ở thị trường Trung Quốc.

C
C

R
UT.L

Nghề khai thác Hải sâm đã mở rộng trên toàn thế giới về sản
lượng và giá trị trong hai đến ba thập kỷ qua [40] [41] [42]. Các khu

D

vực Ấn Độ - Thái Bình Dương đã thu hoạch và khai thác hơn một năm
nay để cung cấp cho thị trường châu Á, chủ yếu là Trung Quốc [40].
Tuy nhiên việc quản lý không đầy đủ nghề khai thác Hải sâm đã dẫn
đến tình trạng đánh bắt nghiêm trọng tại nhiều quốc gia, do đó nguồn
dự trữ thiên nhiên bị cạn kiệt ở hầu hết ở những nơi mà chúng phân
bố. Quần thể Hải sâm dễ bị đánh bắt quá mức vì ít nhất hai lý do chính.
Đầu tiên, người đánh bắt có thể dễ dàng thu hoạch được Hải sâm ở các
vùng nước nông [43] [24]. Thứ hai, tuổi trưởng thành của chúng muộn,
tăng trưởng chậm [43] [44], hơn nữa mật độ quần thể thấp, việc sinh
sản của chúng có thể gây ra hiệu ứng Allee [45], dẫn đến sự suy thoái
quần thể và ức chế sự phục hồi [46] [44]. Do các yếu tố này cùng với
việc đánh bắt quá mức đã làm suy giảm nghiêm trọng số lượng của
nhiều quần thể Hải sâm.


6
Ở Việt Nam

1.1.3.2.

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về đặc điểm phân bố của Hải sâm
tại Việt Nam cho thấy, vùng biển ở nước ta có khoảng 60 lồi Hải sâm,

trong đó chủ yếu tập trung ở vùng biển Phú Yên, Khánh Hòa và các
đảo xa bờ như Phú Quốc, Thổ Chu, Trường Sa, Côn Đảo… với nhiều
loại như Hải sâm vú, Hải sâm mít, Hải sâm lựu, Hải sâm trắng, hải sâm
đen, hải sâm gai [48].
Hải sâm vú (Holothuria fuscogilva) và Hải sâm lựu (Thelenota
ananas) là hai loài đang có nguy cơ bị tuyệt chủng. Tại huyện Phú Q
(Bình Thuận) sản lượng khai thác khoảng năm 2012 khoảng 15
tấn/chuyến. Sau đó sản lượng giảm dần qua các năm. Đến năm 2017,
sản lượng cịn 5 tấn/chuyến. Qua đó, có thể thấy nguồn lợi Hải sâm vú

C
C
R
UT.L

và Hải sâm lựu đã bị suy giảm nghiêm trọng. Tương tự tại vùng biển
Nha Trang, sản lượng khai thác Hải sâm cũng suy giảm, cụ thể năm

D

2012 sản lượng khai thác là 5 tấn/chuyến, sau đó giảm dần qua các
năm. Đến năm 2017, sản lượng khai thác chỉ cịn 2 tấn/chuyến.
Ngồi khai thác từ tự nhiên, hiện nay Hải sâm được nuôi thương
phẩm theo các mơ hình ni bãi, ni lồng, ni biển rất phổ biến ở
các tỉnh ven biển như Vân Đồn – Quảng Ninh, Khánh Hịa, Vũng
Tàu…, ước tính ni trên 1.000 ha; năng suất ni đạt 2,5 tấn/ha [50].
1.2.

Tình hình nghiên cứu về việc sử dụng các chế phẩm nội
tạng hải sản

1.2.1.

Nghiên cứu trên thế giới

Holanda and Netto (2006) nghiên cứu thu hồi 3 thành phần
chính của phế liệu tơm, protein, chitin, astaxanthin bằng việc sử dụng
enzyme alcalase và pancreatin [56]. Sản phẩm thủy phân protein cịn
là nguồn peptit có hoạt tính sinh học mang đến tiềm năng đáng kể trong
dược phẩm như: khả năng chống oxy hóa, khả năng kiểm soát enzyme


7
gây cao huyết áp [56] [57] [58], khả năng chống đột biến gen có khả
năng gây ung thư [59] [60].
Các thành phần và chất lượng dinh dưỡng của các sản phẩm phụ
chế biến (đầu, vỏ và đuôi) của tôm hồng Bắc và tôm đốm được đánh
bắt gần Tongyeong, Hàn Quốc, đã được Min Soo Heu (2003) khảo sát.
Hàm lượng protein thô nằm trong khoảng 9,31% và tổng lượng chất
béo xấp xỉ 0,7%. Axit aspartic, axit glutamic, phenylalanine, lysine và
arginine là các axit amin chiếm ưu thế trong phần protein.
1.2.2.

Nghiên cứu trong nước

Một nghiên cứu khác trên phụ phẩm cá Tra, kết quả hoạt độ
chống oxy hóa của dịch đạm thủy phân cho thấy nồng độ ức chế 50%
DPPH (IC50) của dịch đạm thủy phân đạt khoảng 6775 μg / mL cao

C
C

R
UT.L

hơn 1645 lần so với vitamin C và cao hơn 17 lần so với BHT (
Butylated Hydroxytoluene) với mức độ thủy phân (DH) của dịch đạm

D

thủy phân là 14,6% khi thời gian thủy phân là 5h, tỷ lệ enzyme/cơ chất
(E/S) là 30 U/g protein, nhiệt độ thủy phân là 55 oC, và pH là 7,5 [69].
Theo nghiên cứu của Trần Kiều Anh (2017), dịch đạm thủy phân
thu được từ phụ phẩm các hồi có hàm lượng acid amin đạt 29,48 mg/ml
và có hoạt tính chống ơ xi hóa đo qua khả năng bắt gốc tự do DPPH
(SC) là 70,34% [71].
1.3.

Papain
1.3.1.

Cấu tạo của papain

Papain dạng bột màu vàng nâu nhạt tùy thuộc vào phương pháp
sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan trong H2O hay
glycerine. Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm -SH của cystein
25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole
của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen. Vùng


8
tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các acid amin là:

Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys [74].

Hình 1.2. Cấu trúc 3D của papain
1.3.2.

C
C
R
UT.L

Hoạt tính của papain

Papain là một chất endoprotease có chứa 16,1% N và 1,2% S.

D

Khoảng pH thích hợp để papain hoạt động là 6,0 ÷ 8,0. Nhiệt độ tối
thích để có thể duy trì hoạt tính đến 60oC.

Papain thủy phân protein, đóng vai trị vừa là endopeptidase
vừa là exopeptidase. Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu tạo
thành peptide.

Trong đó: i + k = n
Các exopeptidase thủy phân protein tạo thành acid amin:

Trong đó: i’ + k’ = n


9

1.4.

Hoạt tính chống oxy hóa
1.4.1.

Khái niệm

Chất chống oxy hóa là chất trung hịa các gốc tự do có hại trong
cơ thể. Chất chống oxy hóa hoạt động như '' người nhặt gốc tự do '' và
do đó ngăn ngừa hoặc làm chậm thiệt hại do các gốc tự do này gây ra.
Thử nghiệm thu gom gốc 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl
(DPPH) là một thử nghiệm so màu xác định phần trăm ức chế chất
chống oxy hóa. Nó có màu tím trong dung dịch metanol và cực đại hấp
thụ mạnh ở bước sóng 517 nm được quan sát do sự hiện diện của một
điện tử lẻ [85]. Ngay sau khi gốc tự do DPPH được trộn với chất chống
oxy hóa, DPPH trong dung dịch metanol chuyển từ màu tím sang màu
vàng [86].

C
C
R
UT.L

1.4.2. Các nghiên cứu hoạt tính chống oxy từ dịch đạm thủy
phân

D

Thịt đầu tơm thẻ chân trắng đã được Nguyễn Văn Mười (2018)
khảo sát và phát hiện ra dịch đạm thủy phân này có khả năng kháng

DPPH cao nhất là 31,57% [87]. Phụ phẩm cá hồi được thủy phân bằng
Trypsin 2% ở pH 8,5, nhiệt độ 40oC trong 4 giờ có khả năng bắt gốc
DPPH 70,34% [88].
Năm 2002, Chia – Ling Jao cùng cộng sự đã nghiên cứu hoạt
tính chống oxi hóa trên dịch đạm thủy phân cá ngừ. Sản phẩm thủy
phân thu được ở mức độ thủy phân 25,68% cho thấy hiệu quả thu hồi
gốc DPPH đạt cao nhất, đạt 82,19% [89]. Chia – Ling Jao cũng đã
tham gia nghiên cứu dịch đạm thủy phân cá ngừ với men orientase
(Bacillus subtilis) năm 2009 cùng với Kuo – Chiang Hsu và cộng sự,
kết quả khá tương đồng khi hiệu suất thu hồi gốc tự do DPPH khoảng
80% sau khi thủy phân 60 phút [90].


10
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

1.1. Đối tượng nghiên cứu

C
C
R
UT.L

Hình 2.1. Nội tạng Hải sâm

- Nội tạng Hải sâm được cung cấp bởi công ty TNHH chế biến

D

thủy sản – xuất nhập khẩu Việt Trường, bảo quản trong tủ lạnh -20◦C.

Hình 2.2. Papain thương mại
- Papain: cung cấp bởi Công ty cổ phần dược phẩm Novaco,
nhiệt độ hoạt động tối ưu: 50-60oC, pH tối thích: 6-7. Hoạt lực của
enzyme được kiểm tra lại bằng phương pháp Anson là 2.245 UI/g
- Papain thô được thu nhận từ nhựa đu đủ


11

1.2. Phương pháp nghiên cứu
1.2.1.

Phương pháp thủy phân bằng enzyme

Hình 2.3. Mẫu thủy phân trong tủ ấm ở 62oC
Nội tạng Hải sâm được bổ sung nước xay nhuyễn, thủy phân

C
C
R
UT.L

bằng papain với nồng độ là 0,06 g/ml. Thủy phân trong nhiệt độ 62oC,
pH 8, thời gian thủy phân 180 phút. Thêm TCA trong 15 phút, đưa

D

mẫu về nhiệt độ phòng và ly tâm thu lấy dịch trong. Phần dịch trong

tiếp tục được lọc, sau đó được xác định hàm lượng N acid amin [96].
1.2.2.

Xác định hàm lượng N acid amin giải phóng bằng

phương pháp Ninhydrin
Nguyên tắc:
Dung dịch protein, peptid hoặc acid amin khi đun nóng với
Ninhydrin 8% sẽ tạo thành phức chất có màu xanh tím
Ninhydrin tạo nên phản ứng khử carboxyl oxy hóa của các acid
amin với H2O tạo thành CO2, NH3, một andehyl ngắn đi một cacbon
so với acid amin ban đầu và ninhydrin bị khử. Ninhydrin bị khử tiếp
tục tác dụng lại với NH3 và phóng thích và kết hợp với một phân tử
Ninhydrin thứ hai, tạo thành sản phẩm ngưng kết có màu xanh tím


12

Hình 2.4. Dịch đạm thủy phân sau khi thêm thuốc thử Ninhydrin
Đo mẫu:
Hút 4 ml dịch đạm thủy phân cho vào ống nghiệm, thêm vào 1
ml dung dịch Ninhydrin 8% trong acetone, lắc đều các ống sau đó đậy
miệng ống. Đặt các ống nghiệm vào bể nước sôi 15 phút, sau đó làm

C
C
R
UT.L

nguội trong nước lạnh. Thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml ethanol 50%

D

rồi đo ở bước sóng 570 nm [97].
Tính kết quả:

❖ Hàm lượng đạm acid amin được tính theo cơng thức:

Trong đó: Mn

Trong đó:

: Hàm lượng đạm amin (mgN/g)

VS

: Thể tích dịch đạm thủy phân (ml)

14

: Khối lượng mol nguyên tử Nitơ

m

: Khối lượng mẫu (g)

1000

: Hệ số quy đổi từ µg sang mg

CS

: Nồng độ mmol/mL Ni có trong mẫu ư

ODS

: Độ hấp thụ của mẫu thật


13
: Độ hấp thụ của mẫu trắng

OD0

0,0086; 0,0449: Lấy từ đường chuẩn Glycine y = 0,0447x + 0,0096
: Khối lượng mol của Glycine

75,07

Đường chuẩn Glycine
OD A570 nm

2.5
y = 0.0447x + 0.0096
R² = 0.9996

2
1.5
1
0.5

0
0

10

20

30

40

50

60

Nồng độ Glycine (µg/ml)

C
C
R
UT.L

Hình 2. 5. Đường chuẩn Glycine

D

❖ Mức độ thủy phân:

Trong đó: DH : Mức độ thủy phân (%)
Mn : Đạm amin trong dịch đạm thủy phân (mgN/g)

Mn tổng số: Đạm amin tổng số (Hàm lượng Nitơ tổng
số mgN/g tính theo phương pháp Kjeldahl).
Hàm lượng Mn tổng số đã được xác định là 13% hàm lượng chất khô.
1.2.3.

Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung

nước/nội tạng Hải sâm đến mức độ thủy phân
Hỗn hợp nội tạng Hải sâm được xay nhuyễn với các tỷ lệ
nước/nội tạng Hải sâm (v/w) là: 0/1; 0,5/1; 1/1; 1,5/1; 2/1; 2,5/1; 5/1.
Tiến hành: cài đặt các điều kiện thủy phân ban đầu và tiến hành
thủy phân.


14
1.2.4.

Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy

đến mức độ thủy phân
Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy trên máy khuấy từ gia
nhiệt T.ARE Velp ở các mức độ: không khuấy, mức 1, mức 2 và mức
3. Mẫu sau khi thủy phân được lọc và xác định hàm lượng N acid amin.
1.2.5.

Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của thời gian

thủy phân đến mức độ thủy phân
Khảo sát mức độ thủy phân tại các thời điểm 20; 40; 60; 80; 100;
120; 140; 160; 180; 210; 240 phút . Mẫu sau khi thủy phân được lọc

và xác định hàm lượng N acid amin.
1.2.6.

Phương pháp xác định các thông số động học (Km,

Vmax) của phản ứng

C
C
R
UT.L

Phương trình Michaelis-Menten:

D

Từ đó suy ra:

Để khảo sát Vmax và Km, chuẩn bị hỗn hợp dung dịch đạm thủy
phân nội tạng Hải sâm với các nồng độ cơ chất: 1; 10; 50 mg/L, bổ
sung 0,01 g papain. Hỗn hợp được ủ ở 62 oC trong thời gian 2; 4; 6; 8;
10 phút. Sau thời gian khảo sát, thêm vào 5 ml TCA 0,4 M để kết thúc
phản ứng. Độ hấp thụ của dịch lọc được đo ở bước sóng 570 nm.
1.2.7. Xác định thành phần và tỷ lệ các acid amin
10 g mẫu Hải sâm xay nhuyễn, thêm 15 ml nước cất và 10 ml
papain nồng độ 0,06 mg/ml. Hỗn hợp ủ ở 62 oC trong 3 giờ. Thêm 20
ml TCA 0,4 M để dừng phản ứng rồi mang đi ly tâm, lọc được dịch


15

đạm thủy phân. Xác định thành phần và hàm lượng các acid amin của
dịch đạm thủy phân theo phương pháp TCVN 8764:2012.
1.2.8.

Xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch đạm thủy

phân bằng 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)
Nguyên tắc:
Các gốc DPPH tự do có độ hấp thụ cực đại mạnh tại bước sóng
517 nm và có màu đỏ tía.
Đo mẫu:
3 ml dịch đạm thủy phân sau khi lọc được cho vào ống nghiệm,
bổ sung 3 ml dung dịch DPPH 0,15 mM trong ethanol 95 %, mẫu được
trộn đều, để ở nhiệt độ phòng trong bóng tối trong 30 phút. Hoạt tính
chống oxy hố được đo bước sóng 517 nm được ước tính theo phương

C
C
R
UT.L

pháp của Yen và Wu (1999) [99].
Tính tốn:

D

Trong đó: ODc

: Giá trị mật độ quang của mẫu đối chứng âm

ODm : Giá trị mật độ quang của mẫu nghiên cứu
1.2.9.

Phương pháp thu nhận papain thô từ mủ đu đủ

Nghiên cứu sử dụng mủ đu đủ để thay thế papain thương mại.
Dùng dao vạch từ 5-7 rảnh, chiều sâu 1-2 mm lên bề mặt dọc trái đu
đủ, thu mủ vào ống nhựa. Sau đó sấy khơ trong tủ sấy ở 55oC đến khi
độ ẩm của nhựa khô đạt < 8%, nghiền mịn, rồi trữ mẫu ở -20oC.
1.2.10.

Phân tích thống kê

Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên. Kết quả thu được xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS 20.0 với
độ tin cậy 95%. Sử dụng phương pháp xử lý phân tích ANOVA, so
sánh sự khác biệt các giá trị trung bình dựa trên kiểm định LSD.


16
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

2.1. Động học của phản ứng thủy phân
Kết quả đã xác định được hàm lượng N acid amin trong thời
gian 2, 4, 6, 8, 10 đc thể hiện Bảng 3.1 và sự biến thiên theo Hình 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng N acid amin của các mẫu thử nghiệm động học
(mgN/g)
OD (570 nm)
Thời gian (phút)

S1 = 1 g/L

S2 = 10 g/L

S3 = 50 g/L

2

3,42

4,23

4,54

4

4,97

6,25

6,53

6

8,08

9,82

10,42

8

DUT

13,08

13,68

17,12

17,97

y = 1.7005x + 0.425
R² = 0.9876

y = 1.6305x + 0.317
R² = 0.989

11,19

10

14,29

Nồng độ sản phẩm (mgN/g)

20

C
C

R
.L

16
12

y = 1.398x + 0.002
R² = 0.9878

8
4
0
0

2

4

6

8

10

12

Thời gian (phút)
S1 = 1 g/L

S2 = 10 g/L

S3 = 50 g/L

Linear (S1 = 1 g/L)

Linear (S2 = 10 g/L)

Linear (S3 = 50 g/L)

Hình 3.1. Sự biến thiên nồng độ sản phẩm thủy phân theo thời gian


17
Bảng 3.1 cho thấy cùng với một nồng độ cơ chất thì hàm lượng
N acid amin được giải phóng tăng dần theo thời gian. Sau 10 phút thủy
phân, hàm lượng N acid amin tăng khoảng 4 lần so với thủy phân 2
phút đầu. Khi tăng nồng độ cơ chất từ 1 đến 10 g/L thì khả năng thủy
phân tăng nhanh khoảng 120%, nhưng khi tăng nồng độ cơ chất lên 50
g/L thì chỉ tăng thêm 6% so với nồng độ 10 g/L.
Hình 3.1, hằng số tốc độ phản ứng của mỗi nồng độ cơ chất
chính là hệ số góc của đường thẳng nối các điểm nồng độ sản phẩm tại
các thời gian khảo sát, được ghi nhận lần lượt là 1,3980; 1,6305;
1,7005 mgN/g tương đương với nồng độ cơ chất [S]: 1; 10 và 50 g/L.
Các thông số động học Km, Vmax được xác định theo phương
pháp Lineweaver – Burk (1934) bằng cách lập đồ thị 1/V = f (1/[S]),

C
C
R
UT.L

dựa trên các giá trị nghịch đảo 1/V và 1/[S] được thể hiện ở Hình 3.2

D

1.2

y = 0.123x + 0.593
R² = 0.9869

1

1/V

0.8
0.6
0.4
0.2
0
-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

1/[S]

Hình 3.2. Phương trình Lineweaer – Burk để tính Km, Vmax
Thơng qua phương trình Lineweaer – Burk:
y = 0,123x + 0,593
hay 1/V = 0,123 (1/[S]) + 0,593


18
Giá trị Km và Vmax của papain khảo sát được tính tốn như sau:
1/Vmax = 0,593
Km/Vmax = 0,123
Papain có giá trị Vmax đạt 1,69 mgN/phút và Km là 0,21 g/L.
Các kết quả nghiên cứu trên đây là cơ sở để xác định đặc tính
thủy phân của papain trên nền cơ chất nội tạng Hải sâm, từ đó có thể
xác định được cơng nghệ sản xuất dịch đạm thủy phân.

2.2. Hồn thiện công nghệ sản xuất dịch đạm thủy phân
Trong nghiên cứu trước đây, nhóm chúng tơi đã xác định được
một số thông số cơ bản trong công nghệ thủy phân nội tạng Hải sâm,
trong đó xác định được thơng số pH = 8, nhiệt độ 62 oC, thời gian thủy

C

C
R
UT.L

phân 3 giờ [103].
2.2.1.

Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung nước/nội tạng

D

Hải sâm đến mức độ thủy phân

Thí nghiệm khảo sát tỷ lệ bổ sung nước/nội tạng Hải sâm ghi
nhận kết quả mức độ thủy phân được thể hiện ở Hình 3.3
16.00

MỨC ĐỘ THỦY PHÂN %

14.00
12.00
10.00
8.00
6.00
4.00
2.00
0.00
0/1

0,5/1

1/1

1,5/1

2/1

2,5/1

5/1

TỶ LỆ NƯỚC/NGUYÊN LIỆU (V/W)

Hình 3.3. Ảnh hưởng tỷ lệ nước/nguyên liệu đến mức độ thủy phân


19
Hình 3.3 cho thấy mức độ thủy phân tăng dần khi tăng tỷ lệ
nước/nguyên liệu từ 0/1 đến 1/1 với mức tăng đều khoảng 0,5 %. Tốc
độ thủy phân tăng nhanh hơn và đạt đỉnh tại tỷ lệ 1,5/1 với mức độ
thủy phân 14,4 %. Tuy nhiên khi tăng sự pha loãng nồng độ cơ chất
lên 2,5/1 và 5/1 mức độ thủy phân có xu hướng giảm dần, chỉ cịn
khoảng 10% tại tỷ lệ 5/1.
Nghiên cứu đã khảo sát được tỷ lệ nước/nội tạng Hải sâm tối ưu
nhất là 1,5/1.
2.2.2.

Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến mức độ

thủy phân

Mức độ thủy phân tại các mức độ khuấy khác nhau: không
khuấy, khuấy mức 1, khuấy mức 2 và khuấy mức 3 được thể hiện ở

C
C
R
UT.L

Hình 3.4
18.00

Mức độ thủy phân %

16.00

D

14.00
12.00
10.00
8.00

6.00
4.00
2.00
0.00
Khơng khuấy

Mức 1

Mức 2

Mức 3

Các mức độ khuấy

Hình 3.4. Ảnh hưởng tốc độ khuấy đến mức độ thủy phân
Hình 3.4 cho thấy: hỗn hợp dịch đạm thủy phân khơng khuấy
thì mức độ thủy phân là thấp nhất (8,8 %), mức độ thủy phân khi hỗn


20
hợp được khuấy ở mức 1 là cao nhất (15,3 %). So với khơng khuấy thì
khuấy ở mức 1 hiệu suất tăng gần gấp 2 lần. Tuy nhiên mức độ thủy
phân giảm khi tăng tốc độ khuấy lên mức 2 và mức 3.
Nghiên cứu đã cho thấy mức độ khuấy tối ưu nhất cho phản ứng
thủy phân nội tạng Hải sâm bằng papain là mức 1.
2.2.3. Xác định sự thay đổi của mức độ thủy phân theo thời
gian
Nội tạng hải sâm được thủy phân trong thời gian 4 giờ với kết
quả mức độ thủy phân ghi nhận tại các thời điểm có bước nhảy là 20
phút, thể hiện ở Biểu đồ 3.2.
30

C
C
R
UT.L

20

D

15
10
05

240 phút

220 phút

200 phút

180 phút

160 phút

140 phút

120 phút

100 phút

80 phút

60 phút

40 phút

20 phút

00

0 phút

Hiệu suát thủy phân %

25

Thời gian thủy phân

Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi mức độ thủy phân theo thời gian
Biểu đồ 3.3 cho thấy mức độ thủy phân sẽ tăng dần theo thời
gian khi kết quả thủy phân ghi nhận từ các thời điểm từ lúc chưa thủy
phân đến 160 phút tăng khá đều từ 4,2% đến 17,7%. Đến phút 180 mức
độ thủy phân tăng nhanh đột ngột và đạt cực đại 25,1%. Từ phút 200
đến 240 mức độ thủy phân có dấu hiệu giảm từ 22,9 % đến 13,3%. Sau
khi khảo sát mức độ thủy phân trong thời gian từ 0 đến 240 phút, thời
gian tối ưu để thủy phân nội tạng Hải sâm bằng papain là 180 phút.


21
2.2.4.

Khả năng sử dụng papain thô thay thế papain

thương mại
Trong nghiên cứu này đã sử dụng mủ đu đủ để thay thế papain
thương mại. Kết quả chỉ ra, khi tiến hành thủy phân với nồng độ cơ
chất 0,05%, enzyme thô từ mủ đu đủ chiếm 1% cơ chất, trong 10 phút,

tại 62 oC, pH =8 thì mức độ thủy phân lên đến 16,95 %.
Từ đó cho thấy, papain thơ từ mủ đu đủ hồn tồn có thể thay
thế được papain thương mại trong nghiên cứu cũng như các hoạt động
sản xuất, giúp giảm chi phí sản xuất.
Từ các kết quả khảo sát về điều kiện tối ưu để thu nhận dịch đạm
thủy phân từ nội tạng Hải sâm, nghiên cứu đã xây dựng được quy trình
cơng nghệ sản xuất.
Nội tạng •Lạnh đông
HS
•100 g

C
C
R
UT.L

D

Xay

•Thêm 150 ml nước cất

Điều
chỉnh pH

•pH = 8
Thủy
phân

•

•
•
•

6 mg enzyme papain
Nhiệt độ 62oC
Tốc độ khuấy: mức 1
Thời gian: 3 giờ
Dừng
phản ứng
Lọc
Dịch đạm thủy
phân

Hình 3.5. Sơ đồ hồn thiện quy trình thủy phần nội tạng Hải sâm


22

2.3. Đặc tính của dịch đạm thủy phân nội tạng Hải sâm
2.3.1.

Thành phần acid amin của sản phẩm dịch đạm thủy

phân nội tạng Hải sâm
Thành phần acid amin cơ bản của sản phẩm thủy phân nội tạng
Hải sâm sau 3 giờ thủy phân đã được phân tích và trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Thành phần acid amin của sản phẩm dịch đạm thủy phân
(mg/g chất khô)
Thành phần acid

Nội tạng
amin
Hải sâm
1
Alanine
1,925
2
Arginine
0,066
3
Aspartic acid
0,116
4
Glutamic acid
3,182
5
Glycine
1,415
6
Histidine *
0,192
7
Isoleucine *
0,200
8
Leucine *
0,321
9
Lysine *
0,417

10
Methionine *
0,113
11
Phenylalanine *
0,222
12
Proline
0,078
13
Serine
0,248
14
Threonine *
0,365
15
Tyrosine
0,090
16
Valine *
0,696
Tổng acid amin
9,642
(*): acid amin không thay thế.
STT

Hải sâm
[110]
14,6
13,3

20,4
30,6
32,0
2,10
7,15
10,9
8,85
3,35
5,10
15,3
10,2
10,9
5,45
9,2
199,4

C
C
R
UT.L

D

Đầu cá
ngừ [111]
44,5
41,2
76,2
24,1
50,8

51,2
42,7
63,8
31,3
21,6
25,8
14,7
23,9
33,2
21,9
36,5
603,4

Kết quả phát hiện được 16/22 loại acid amin, với tổng lượng đạt
được là 9,642 mg/g chất khơ. Trong đó acid amin khơng thay thế có
8/9 loại, chiếm 26,2 % tổng acid amin. Các acid amin có hàm lượng
cao là Glutamic (3,182 mg/g chất khô), Alanine (1,925 mg/g chất khô).


23
2.3.2.

Hoạt tính chống oxy hóa của dịch đạm thủy phân

nội tạng Hải sâm
Nghiên cứu này tiến hành khảo sát khả năng chống oxy hóa của
dịch đạm thủy phân này tại các mức độ thủy phân khác nhau (5; 10;
15; 20%) để kiểm tra sự thay đổi khả năng bắt gốc tự do DPPH theo
thời gian và kết quả trình bày ở Hình 3.4.

% bắt gốc tự do DPPH

100
y = -0.307x2 + 8.229x + 8.225
R² = 0.9326

80
63

60

60

51
41

40

C
C
R
UT.L

20
00
0

D
5

10

15

20

25

Mức độ thủy phân %

Hình 3.6. Phần trăm bắt gốc tự do của dịch đạm thủy phân nội tạng
Hải sâm
Khi tăng mức độ thủy phân từ 5% đến 10% thì hoạt tính chống
oxy hóa tăng dần. Theo khảo sát tại các thời điểm thì mức độ thủy phân
10% cho hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, đạt 62,8%. Tiếp tục tăng
mức độ thủy phân lên 15%, 20% thì tỷ lệ bắt gốc DPPH giảm dần cịn
lần lượt 60 và 51%.
Tính IC50 dựa vào phần trăm bắt gốc tự do DPPH của dịch đạm
thủy phân thu được kết quả: IC50 = 6,8% mức độ thủy phân tương
đương với nồng độ 589,3 mgN/l.