Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn tại hưng yên, khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan

ii

Lời cảm ơn

iii

Mục lục

iv

Danh mục những chữ viết tắt

vi

Danh mục bảng

vii

Danh mục biểu đồ

viii

Danh mục hình

ix

MỞ ĐẦU

1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

4

1.1.1. Nước ngoài

4

1.1.2. Trong nước

6

1.2. Tình hình dịch bệnh PED trên thế giới và ở Việt Nam trong những năm
gần đây

6

1.2.1. Tình hình dịch bệnh PED trên thế giới

6

1.2.2. Tình hình dịch bệnh PED ở Việt Nam

7

1.2.3. Tình hình PED trên địa bàn tỉnh Hưng Yên

7

1.3. Bệnh dịch tiêu chảy cấp tính ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED)

8

1.3.1. Phân loại

8

1.3.2. Hình thái, cấu trúc của PEDV

8

1.3.3. Đặc tính nuôi cấy của virút

9

1.3.4. Dịch tễ học

10

1.3.5. Triệu chứng lâm sàng

12

1.3.6. Bệnh tích

13

1.3.7. Các phương pháp chẩn đoán PEDV

14

Chương 2. NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

17

2.1. Nội dung nghiên cứu.

17

iv


2.2. Nguyên liệu.

17

2.3. Địa điểm nghiên cứu.

17

2.3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học

18

2.3.2. Khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh

18

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

21

3.1. Một số đặc điểm dịch tễ của bệnh

21

3.1.1. Kết quả điều tra bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn theo lứa tuổi

21

3.1.2. Tỷ lệ tử vong do bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn theo lứa tuổi

29

3.1.3. Triệu chứng lâm sàng của bệnh

32

3.1.4. Kết quả mổ khám bệnh tích đại thể

35

3.2. Khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh

36

3.2.1. Kết quả chẩn đoán bệnh PED bằng phương pháp PT-PCR

36

3.2.2. Kết quả chẩn đoán bệnh PED phân theo lứa tuổi

38

3.2.3. Kết quả RT-PCR để nhân đoạn gen S của virus PED

40

3.2.4. Kết quả phân tích trình tự gen S của các chủng virus PED

42

3.2.5. Phân tích trình tự protein S (spike) của virus PED

45

3.2.6. Kết quả xây dựng cây phả hệ (phylogenetic tree)

47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

51

v


DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

DNA

Axit deoxyribonucleic

ELISA

Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay

EVD

Epidemic Viral Diarrhea

PED

Porcine Epidemic Diarrhea

PEDV

Porcine Epidemic Diarrhea Virus

RNA

Axit ribonucleic

RT - PCR

Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction

TGE

Transmissible Gastro Enteritis

95% CI

95 % Confidence Level

vi


DANH MỤC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

3.1

Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi với độ tin

21

3.2

Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện

23

3.3

Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện Phù Cừ với
độ tin cậy 95%CI.

24

3.4

Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện

25

3.5

Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện

27

3.6

So sánh tỷ lệ lợn mắc bệnh theo lứa tuổi của bệnh PED tại

28

3.7

Tỷ lệ tử vong do bệnh PED theo lứa tuổi

38

3.8

Kết quả so sánh tỷ lệ tử vong do bệnh tiêu chảy thành dịch

31

3.9

Triệu chứng lâm sàng của bệnh theo lứa tuổi

33

3.10 Kết quả mổ khám bệnh tích đại thể

35

3.11 Kết quả chẩn đoán bệnh PED bằng RT-PCR theo loại mẫu

37

3.12 Kết quả chẩn đoán bệnh PED bằng RT-PCR theo lứa tuổi

39

3.13 Thông tin về các mẫu bệnh phẩm được sử dụng giải trình

41

3.14 Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự nucleotide của gene S của các chủng 43
3.15 Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự acid amin của gene S của

vii

45


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
STT

Tên biểu đồ

Trang

3.1

Tỷ lệ lợn mắc bệnh PED theo độ tuổi

22

3.2

Tỷ lệ lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện Tiên Lữ

23

3.3

Tỷ lệ lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện Phù Cừ

25

3.4

Tỷ lệ lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện Ân Thi

26

3.5

Tỷ lệ lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện Văn

27

3.6

So sánh tỷ lệ lợn mắc bệnh theo lứa tuổi của bệnh PED tại huyện
Tiên Lữ, Phù Cừ, Ân Thi và Văn Giang

29

3.7

Tỷ lệ tử vong do mắc bệnh PED theo độ tuổi

30

3.8

Tỷ lệ tử vong do bệnh PED theo lứa tuổi của 4 huyện Tiên

32

3.9

Kết quả mổ khám bệnh tích đại thể

36

3.10 Kết quả chẩn đoán mẫu bằng kỹ thuật RT-PCR

38

3.11 Kết quả chẩn đoán mẫu bằng kỹ thuật RT-PCR của 4

38

3.12 Kết quả chẩn đoán mẫu bằng kỹ thuật RT-PCR theo lứa

39

viii


DANH MỤC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

1.1

Hình thái, cấu trúc của PEDV

9

1.2

Bệnh tích ruột căng phồng ở lợn con

3.1

Kết quả chẩn đoán virus PED bằng phản ứng RT-PCR. M: Marker

13

DNA (1 kb Plus DNA Ladder, Invitrogen). Giếng 1 – 8: 8 mẫu bệnh

phẩm khác nhau tương ứng là VNUA/PED-HY1, VNUA/PED-HY2,
VNUA/PED-HY3,VNUA/PED-HY4,

VNUA/PED-HY5,

VNUA/PED-HY6, VNUA/PED-HY7, VNUA/PED-HY8 . Sản phẩm
PCR có kích thước là 651bp
3.2

41

So sánh trình tự nucleotide của gen S giữa các chủng virus PED
trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng virus PED tham
chiếu khác. Dấu (.) biểu thị trình tự nucleotide giống với trình tự
nucleotide của chủng virus VNUA/PED-HY1

3.3

44

So sánh trình tự amino acid suy diễn của gen S giữa các chủng virus
PED trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng virus PED
tham chiếu khác. Dấu (.) biểu thị giống với trình tự amino acid của
chủng VNUA/PED- HY1, sự sai khác về amino acid của các chủng

3.3

tiếp theo được thể hiện bằng các chữ cái ký hiệu của chúng.

46

Mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus PED trong nghiên cứu này

48

ix


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngành chăn nuôi ở nước ta hiện nay đang phát triển mạnh mẽ đáp ứng
nhu cầu thực phẩm ngày càng lớn của xã hội và góp phần thúc đẩy kinh tế xã hội
phát triển. Đặc biệt, chăn nuôi lợn đã có nhiều thay đổi đáng kể, đáp ứng được
phần lớn nhu cầu về thực phẩm cho xã hội. Ở nhiều nước trên thế giới, mức tiêu
thụ thịt lợn tính trên đầu người chiếm tỷ lệ cao so với các loại thịt khác. Ở Việt
Nam, tỷ lệ thịt lợn hơi tính theo đầu người chiếm phần lớn (khoảng 73%) trên
tổng số các loại thịt được tiêu thụ hàng năm. Chăn nuôi lợn đã trở thành nguồn
thu nhập quan trọng đối với các hộ nông dân và là một trong những nghề góp
phần chuyển dịch cơ cấu kinh tế trong nông nghiệp.
Hưng Yên là tỉnh có ngành chăn nuôi tương đối phát triển, hiện nay tổng
đàn trâu, bò có khoảng 40.000 con, đàn lợn trên 500.000 con, đàn gia cầm gần 8
triệu con và chăn nuôi của tỉnh ngày càng phát triển theo hướng sản xuất hàng
hóa, đem lại thu nhập chính cho ngành nông nghiệp.
Song song với sự phát triển đó, vấn đề về dịch bệnh diễn biến ngày càng
phức tạp làm ảnh hưởng xấu tới sự phát triển của ngành chăn nuôi cũng như làm
thiệt hại về kinh tế.
Trong những năm gần đây “bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn” thường
xuyên xảy ra làm thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn do làm tăng chi
phí phòng, chống bệnh, thiệt hại về số lượng…
Bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED) là một

bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc họ Coronaviridae
gây ra. Bệnh PED xảy ra quanh năm nhưng thường phổ biến hơn vào mùa đông và
trên 90% ca bệnh xảy ra ở lợn con dưới 7 ngày tuổi. Ở Châu Âu Dịch PED xuất
hiện lần đầu tiên vào năm 1971 (Wood, 1977), sau đó bệnh lây lan ra nhiều Quốc
gia khác ở Châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật, Hàn Quốc và Thái Lan.
Ở Việt Nam, bệnh PED lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 và từ
đó đến nay dịch bệnh thường xuyên xảy ra và gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng

1


cho ngành chăn nuôi lợn trong cả nước. Việc phòng chống bệnh tiêu chảy do
virus PED gây ra chủ yếu dựa vào sử dụng vắc xin. Trong khi các chủng virus
thực địa thường xuyên có những biến đổi phức tạp về mặt di truyền, do đó việc
nắm bắt và cập nhật được các đặc tính sinh học của các chủng virus PED đóng
vai trò quan trọng, giúp cho việc lựa chọn được vắc xin thích hợp và hiệu quả
phục vụ cho công tác tiêm phòng.
Để hạn chế dịch bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn do virus PED gây ra thì
việc nghiên cứu về dịch tễ học, và nghiên cứu được những đặc tính sinh học phân
tử của virus PED là vô cùng quan trọng và là công việc nghiên cứu hết sức cần
thiết mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn to lớn để từ đó góp phần quan trọng
trong công tác phòng, chống dịch bệnh xảy ra trên đàn lợn và định hướng chiến
lược cho việc sản xuất vắc xin phòng bệnh trong tương lai. Vì vậy, xuất phát từ
yêu cầu của thực tiễn chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của bệnh tiêu chảy thành dịch ở
lợn tại Hưng Yên, khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu tổng quát
Xác định một số đặc điểm dịch tễ, sự phân bố của các type virus PED
đang lưu hành trên địa bàn tỉnh Hưng Yên để làm cơ sở đề xuất các biện pháp

phòng chống bệnh PED nhằm tạo điều kiện cho chăn nuôi phát triển bền vững.
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Xác định một số đặc điểm dịch tễ của bệnh PED ở lợn trên địa bàn tỉnh
Hưng Yên:
+ Tỷ lệ mắc bệnh PED ở lợn theo lứa tuổi.
+ Tỷ lệ tử vong do mắc bệnh PED ở lợn theo lứa tuổi.
+ Một số triệu chứng lâm sang của bệnh PED.
+ Một số đặc điểm về bệnh tích của bệnh PED ở lợn.
- Xác định một số đặc tính sinh học phân tử của PEDV được phân lập tại
các ổ dịch trên địa bản tỉnh Hưng Yên:

2


+ Ứng dụng kỹ thuật RT- PCR trong chẩn đoán nhanh virus gây bệnh tiêu
chảy cấp ở lợn (PED)
+ Giải mã, phân tích gen S (gen mã hóa cho protein Spike) của các chủng
PEDV thu thập được trong các mẫu bệnh phẩm.
+ Xây dựng cây phả hệ (phylogenetic tree) để đánh giá về nguồn gốc tiến
hóa, sự biến đổi di truyền của các chủng PEDV thu thập được.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Cung cấp, hoàn thiện thêm các thông tin dịch tễ học về bệnh tiêu chảy
thành dịch ở lợn và đặc tính sinh học phân tử của virus.
- Dựa trên những kết quả nghiên cứu khoa học của đề tài để đề xuất
các biện pháp phòng, chống phù hợp, từ đó khuyến cáo tới người chăn nuôi
cũng như chính quyền địa phương triển khai áp dụng các biện pháp đồng bộ
trong việc phòng, chống bệnh trên địa bàn tỉnh giúp cho ngành chăn nuôi phát
triển ổn định.

3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.1.1. Nước ngoài
Bệnh PED ở lợn lần đầu tiên được phát hiện ở Anh vào năm 1971 do virus
PED gây ra. Ban đầu virus PED được gọi là EVD (Epidemic viral diarrhea) gây
bệnh trên lợn con, đặc biệt là lợn mới sinh, có tỉ lệ gây chết lên tới 100%. Đến
năm 1976, một phân type mới của virus EVD được phát hiện trên lợn ở mọi lứa
tuổi, được gọi là virus EVD type 2 để phân biệt với virus EVD type 1 ban đầu
(Wood, 1977). Năm 1978, Debouck và Pensaert đã phát hiện virus EVD type 2 là
một dạng giống với coronavirus (Debouck and Pensaert, 1980), cũng từ thời gian
này, dịch EVD được chuyển tên thành dịch PED.
Trong khoảng thời gian từ năm 1980 tới 1990, các ổ dịch liên tục được
phát hiện và xảy ra phổ biến ở các Quốc gia Châu Âu như Bỉ, Anh, Đức, Pháp,
Hà Lan, Thụy Sỹ. Hiện nay, PED ngày càng xuất hiện phổ biến ở các Quốc gia
Châu Á, đặc biệt PED ngày càng trở nên cấp tính và nghiêm trọng hơn (Song and
Park, 2012). Ở Trung Quốc, trường hợp nhiễm PEDV đầu tiên được phát hiện
năm 1973, sau hơn hai thập kỷ sử dụng vaccine vô hoạt nhũ dầu, sự xuất hiện trở
lại của PEDV tương đối ít. Tuy nhiên đến năm 2010, bệnh đã xuất hiện trở lại và
bùng phát ngày càng trầm trọng ở các Tỉnh có sự phát triển ngành chăn nuôi lợn.
Từ tháng 2 năm 2010 đến tháng 11 năm 2011, tỷ lệ lợn chết từ 90 tới 100%
(tương ứng 50.000 con), chủ yếu là lợn dưới 7 ngày tuổi (Chen et al., 2012). Ở
Nhật, dịch PED xuất hiện lần đầu tiên năm 1993, gây chết 14.000 con, tỉ lệ chết
từ 30 tới 100% lợn con, dịch PED năm 1996 gây chết 39.509 con. Ở Hàn Quốc,
dịch PED xuất hiện đầu tiên năm 1992, sau đó đến năm 2007-2008, dịch liên tiếp
xuất hiện ở các Quốc gia Ðông Nam Á như Thái Lan, Philippines và Việt Nam.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, PEDV là một virus có vỏ ngoài, vật chất di
truyền là RNA dạng sợi dương có kích thước khoảng 28kb. Hệ gen bao gồm ít

4


nhất bảy khung đọc mở mã hoá cho 4 loại protein cấu trúc (gai(S), vỏ (E), màng
(M) và nucleocapsid (N)) và 3 loại protein không cấu trúc (replicase 1a, 1b và
ORF3), với thứ tự trên hệ gen 5’-replicase (1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3’(Bridgen et
al., 1993; Bridgen et al., 1998; Duarte and Laude, 1994. Để xác định mối quan hệ
giữa các chủng PEDV, các phân tích về cây phả hệ (phylogenetic tree) và đặc
điểm di truyền được tiến hành dựa trên các trình tự gen S, M, và ORF3 (Song
and Park, 2012). Nghiên cứu trên một phần của gen S và toàn bộ gen M đã gợi ý
chia PEDV thành 3 nhóm (G1, G2, và G3), mỗi nhóm cũng được chia thành các
nhóm nhỏ hơn (G1-1, G1-2, và G1-3) (Park et al., 2007). Phân tích cây phả hệ
dựa trên trình tự gen S và M đều chỉ ra rằng các chủng PEDV phân lập được ở
Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam có độ tương đồng cao và khác
biệt với các chủng PEDV phân lập được từ các Quốc gia Châu Âu (Do Tien Duy
et al., 2011; Puranaveja et al., 2009). ORF3 là gen mã hoá cho protein không cấu
trúc và là protein phụ trợ, không cần thiết cho quá trình nhân lên của PEDV. Tuy
nhiên các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra chức năng quan trọng của protein này
trong việc quyết định độc tính của PEDV. Sự biến đổi của gen ORF3 trong quá
trình cấy chuyển nhiều lần trên tế bào có thể làm giảm độc tính của chủng thực
địa. Sự khác biệt của gen ORF3 cũng được thể hiện rõ rệt giữa các chủng thực
địa và các chủng nuôi cấy trong phòng thí nghiệm.
Do các virus gây ra tiêu chảy có các đặc điểm lâm sàng tương đối giống
nhau nên không thể dựa vào các đặc điểm này để chẩn đoán PEDV, do đó việc
chỉ ra sự có mặt của PEDV được thực hiện trong các phòng thí nghiệm
(Kusanagi et al., 1992). Nhiều kỹ thuật được sử dụng trong việc phát hiện PEDV
như miễn dịch huỳnh quang, sử dụng kính hiển vi điện tử hoặc phản ứng ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay), tuy nhiên các kỹ thuật này tiêu tốn nhiều
thời gian và độ nhạy cũng như tính đặc hiệu thấp. Kỹ thuật chẩn đoán dựa trên

phương pháp RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) được
phát triển để phát hiện virus cả trong phòng thí nghiệm và từ thực địa (Tobler and
Ackermann, 1995; Tobler and Ackermann, 1996). Để khẳng định sự có mặt của

5


PEDV trong mẫu bệnh phẩm, mồi đặc hiệu được thiết kết dựa trên trình tự gen
M. Trong những năm gần đây, dựa trên kỹ thuật RT-PCR cơ bản, đã có rất nhiều
những cải tiến để cho những ứng dụng hiệu quả hơn, như việc sử dụng multiplexRT-PCR để phát hiện PEDV trong sự có mặt của nhiều virus khác nhau, là một kỹ
thuật thường được sử dụng cho chẩn đoán nhanh, độ nhạy và hiệu quả kinh tế cao trên
các đối tượng với các virus gây ra viêm ruột-dạ dày cấp tính ở lợn (Song et al., 2006).
RT loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) cũng là một kỹ thuật hữu
dụng được phát triển dựa trên kỹ thuật RT-PCR cơ bản. Trong kỹ thuật này, 4-6 mồi
được sử dụng để nhận biết 6-8 vùng DNA đích, điều này tạo ra tính đặc hiệu cao hơn
so với kỹ thuật gel-based RT-PCR hay ELISA bởi vì nó tạo ra số lượng lớn hơn các
đoạn DNA (Ren and Li, 2011). Các kit phân tích Immunochromatography cũng được
sử dụng phổ biến ở các trại chăn nuôi để phát hiện PEDV trên cơ sở protein S với độ
nhạy 92% và độ đặc hiệu 98%. Kỹ thuật này có độ chính xác kém hơn RT-PCR tuy
nhiên cho phép chẩn đoán nhanh trong vòng 10 phút (Song and Park, 2012).
1.1.2. Trong nước
Hiện nay ở Việt Nam, Nguyễn Đình Quát và cộng sự đã sử dụng phương
pháp nested-RT-PCR để phát hiện PEDV (Nguyen Dinh Quat et al., 2011) và
Nguyễn Tất Toàn và cộng sự đã nghiên cứu đặc tính di truyền của PEDV phân
lập được từ các Tỉnh Miền Nam Việt Nam (Nguyễn Tất Toàn et al., 2012). Ngoài ra
chưa có nghiên cứu nào về mức độ quy mô và chuyên sâu để đánh giá một cách có
hệ thống về đăc điểm dịch tễ và sự phân bố của các chủng PEDV đang lưu hành ở
Việt Nam hiện nay. Các kết quả nghiên của đề tài này sẽ là cơ sở khoa học quan
trọng trong việc khoanh vùng dịch, định hướng chọn chủng sản xuất vaccine, cũng
như góp phần đánh giá chất lượng vaccine nhập khẩu và sản xuất trong nước để từ

đó có chiến lược phòng chống dịch PED lâu dài ở Việt Nam.
1.2. Tình hình dịch bệnh PED trên thế giới và ở Việt Nam trong những năm
gần đây
1.2.1. Tình hình dịch bệnh PED trên thế giới
Từ đầu những năm 2000 trở lại đây, những trận dịch bùng phát cấp tính đã
trở nên hiếm có ở những vùng mà virus trước kia đã từng lan rộng. Hiện nay, các ổ
dịch PED ít được ghi nhận ở châu Âu và ngày càng có ít nghiên cứu về bệnh. Hơn

6


nữa, bệnh thường được thấy nhất ở lợn choai, lợn trưởng thành và lợn mới sinh sản,
trong khi lợn con bú mẹ lại ít khi nhiễm bệnh. Tuy nhiên ở châu Á, dịch bệnh dữ dội
với tỷ lệ tử vong cao vẫn xảy ra ở lợn mọi lứa tuổi và không có sự khác biệt về mặt
lâm sàng với dịch TGE cấp tính, gây tổn thất nặng nề về kinh tế.
Trong thời gian cuối năm 2007 – 2008, tại Thái Lan, dịch phát hiện đầu
tiên ở tỉnh Nakornpathom trước khi nó lan rộng trong cả nước. Dịch lan rộng đã
gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn của Thái Lan. Phân tích phát sinh loài,
thấy tất cả các PEDV phân lập được trong thời gian bùng phát dịch đều giống
chủng ở Trung Quốc JS – 2004 – 2 (S.Puranaveja và cs, 2009).
1.2.2. Tình hình dịch bệnh PED ở Việt Nam
Năm 2008, virus PED đã được phát hiện trong một số đàn lợn bị tiêu chảy
ở Việt Nam (Nguồn: Báo Nông Nghiệp VN số 178 ra ngày 7/9/2011). Trong năm
2008 – 2009, bệnh lan rộng nhanh chóng ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ gây ảnh
hưởng lớn đến ngành chăn nuôi lợn nước ta. Bệnh xảy ra rất nhanh, trên toàn đàn
lợn và gây chết gần như 100% lợn con theo mẹ. Tỷ lệ tử vong giữa các tỉnh dao
động từ 65 – 91%. Theo nhận định của các chuyên gia thì nguyên nhân của tiêu
chảy cấp có thể là do bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) hoặc do viêm dạ dày
ruột truyền nhiễm (TGE) gây ra. Năm 2010, dịch vẫn tiếp tục xảy ra ở một số
trại, thậm chí tái phát ở những trại đã từng xảy ra dịch trong năm 2009. Theo

thống kê của phòng xét nghiệm nhanh công ty C.P Việt Nam trong 5 tháng đầu
năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED và tỉnh có nhiều ca bệnh nhất là
Đồng Nai với 15 ca bệnh. Các trại bị nhiễm bệnh này chủ yếu tập trung ở miền
Nam (Đồng Nai, Lâm Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Phước, Củ Chi), ở các
tỉnh ở miền Bắc thì phòng xét nghiệm nhanh chỉ mới ghi nhận có một trại bị
nhiễm bệnh này thuộc tỉnh Thái Nguyên.
Nhìn chung, bệnh chủ yếu xảy ra ở khu vực Nam Bộ với những trận dịch
lớn, tuy nhiên ở khu vực phía Bắc cũng đã xuất hiện rải rác ở 1 số trại tại các tỉnh
Thái Nguyên, Bắc Ninh, Bắc Giang…
1.2.3. Tình hình PED trên địa bàn tỉnh Hưng Yên
Trên địa bàn tỉnh Hưng Yên trong những năm gần đây bệnh vẫn xảy ra rải
rác, tập trung chủ yếu tại những địa phương có mật độ chăn nuôi lợn cao. Bệnh

7


xảy ra quanh năm không theo mùa nhất định. Bệnh tiến triển rất nhanh, trên toàn
đàn lợn và gây chết gần như 100% lợn con theo mẹ. Tỷ lệ tử vong dao động từ
65 – 91%. Tuy nhiên, hiện chưa có nghiên cứu cụ thể nào về dặc điểm dịch tễ và
đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh trên địa bàn do vậy việc áp dụng các
biện pháp phòng chống bệnh của người chăn nuôi còn gặp nhiều khó khăn gây ra
tổn thất về kinh tế cũng như cơ cấu đàn.
1.3. Bệnh dịch tiêu chảy cấp tính ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED)
1.3.1. Phân loại
Năm 1978, Pensaert và Deouck đã phân lập được virus gây dịch tiêu chảy
ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea Virus – PEDV), mẫu được lấy từ ổ dịch xảy ra
ở Bỉ và Anh (1976). Virus gây dịch tiêu chảy (PEDV) là một thành viên họ
Coronaviridae, phân họ Coronavirinae, giống Coronavirus. PEDV được xếp vào
nhóm 1 giống Coronavirus, cùng với TGEV, coronavirus gây bệnh cho mèo
(feline coronavirus), coronavirus gây bệnh cho chó (canice coronavirus) và

coronavirus gây bệnh cho người chủng 229E (human coronavirus). Dựa vào kết
quả giải trình tự gen cho thấy PEDV có quan hệ gần gũi nhất với coronavirus gây
bệnh cho người chủng 229E và TGEV.
1.3.2. Hình thái, cấu trúc của PEDV
Hình thái, tính chất lý hóa và đặc điểm sinh học của hạt vius PED là đặc
trưng cho họ Coronavirus. Cấu trúc của PEDV giống với các virus khác trong họ,
có đường kính khoảng 90 – 190nm, là virus có vỏ bọc, nhân có cấu trúc là RNA
sợi đơn, có kích thước lớn nhất từ 27 – 32 kb, với đầu 5’ và đuôi poly A 3’. Trên
bề mặt hạt virus có nhiều gai dạng hình chùy nhô ra, dài khoảng 20 nm. Virus nhân
lên thông qua việc nảy chồi từ các màng bên trong bào tương tế bào vật chủ.

8


Hình 1.1: Hình thái, cấu trúc của PEDV
Nguồn: Daesub Song và Bongkyun Park, 2012 (14)
1.3.3. Đặc tính nuôi cấy của virút
- Đặc tính nuôi cấy trong môi trường tế bào: Ban đầu, việc nhân virus
PED được thực hiện bằng cách gây nhiễm cho lợn con theo đường miệng
(DeBouck và Pensaert, 1980), bằng cách cho lợn con uống virus. Việc nuôi cấy
virus trong điều kiện phòng thí nghiệm thời gian đầu gặp rất nhiều khó khăn,
người ta đã thử nghiệm nuôi cấy trên nhiều loại tế bào nhưng rất ít thành công.
Phân lập virus có ý nghĩa rất quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh, dịch tễ học,
và công tác quản lý dịch bệnh.
Năm 1988, Hofmann và Wyler đã nghiên cứu thành công môi trường tế
bào thích hợp để PEDV phát triển, nhân lên và có thể phân lập được virus. Đến
nay, tế bào Vero (thận khỉ xanh châu Phi) có thể cấy chuyển được PEDV, gây
bệnh tích tế bào, tuy nhiên, sự phát triển của virus phụ thuộc vào sự có mặt của
men trypsin trong môi trường nuôi cấy. Trong môi trường nuôi cấy, virus tác
động lên tế bào hình thành các không bào và thể hợp bào (có thể lên tới 100

nhân). Hiệu giá virus đạt tối đa sau khi nuôi cấy 15 giờ. Ngoài ra, virus PED đã
được nhân lên thành công trên các tế bào thận lợn và bàng quang lợn ở Nhật Bản
(Shibata và cs, 2000). Chủng virus phân lập tại Nhật Bản (P – 5V) đã được sử

9


dụng làm chủng virus vaccine và được nuôi cấy trên các dòng tế bào lợn KSEK6
và IB – RS2 (Kadoi K và cs,2002).
- Sức đề kháng: PEDV ổn định giữa pH 5 – 9 tại 40C và giữa pH 6.5 – 7.5
tại 370C, bất hoạt khi pH < 4 và pH > 9. Trong môi trường nuôi cấy thích nghi,
virus bị mất khả năng lây nhiễm ở nhiệt độ 600C/30’, nhưng ổn định ở 500C.
Virus mẫn cảm với ether, chloroform và không gây ngưng kết hồng cầu
của nhiều loài. PEDV bị bất hoạt bởi hầu hết các chất khử trùng bao gồm cả:
cresol, natri hydroxyt 2% (NaOH 2%), formol 1%, natri cacbonate (4% muối
khan hoặc 10% dạng tinh thể với 0,1% chất tẩy rửa), chất tẩy rửa có ion và không
ion, iodophor mạnh (1%) trong acid phosphoric và dung môi lipid như
chloroform (Callebaut P và DeBouck, 1981).
1.3.4. Dịch tễ học
1.3.4.1. Động vật cảm nhiễm
Bệnh xảy ra ở loài lợn. Lợn có thể mắc ở mọi lứa tuổi. Trong nhiều ổ dịch,
tỷ lệ nhiễm có thể lên đến 100%, tỷ lệ chết trung bình của lợn con là 50% nhưng
cũng có thể rất cao 100%.
- Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi 0 – 5 ngày tuổi: tỷ lệ chết 100%
- Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi 6 – 7 ngày tuổi: tỷ lệ chết khoảng 50%
- Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi lớn hơn 7 ngày tuổi: tỷ lệ chết khoảng 30%
1.3.4.2.Phương thức truyền lây:
Phương thức truyền lây của PEDV tương tự với TGEV, nhưng PEDV có
xu hướng tồn tại dễ dàng hơn trên cơ thể đã bị nhiễm bệnh. Đường truyền phân
miệng có thể là phương thức chủ yếu để virus truyền sang vật chủ khác. PED cấp

tính thường xảy ra ở thời điểm 4 – 5 ngày sau khi lợn bán hoặc mua về. Virus có
thể xâm nhập vào trại thông qua lợn nhiễm virus được chuyển về hoặc các dụng
cụ có mang virus như: xe vận chuyển, ủng, quần áo bảo hộ…đây là những nguồn
lây nhiễm tiềm năng cho lợn mẫn cảm. PEDV không khác nhiều TGEV về
đường truyền lây nhưng virus này có vẻ tồn tại lâu hơn trong các trang trại sau
khi dịch PED cấp tính đã qua đi. Khi dịch xảy ra ở trại lợn sinh sản, virus có thể
được bài thải từ đàn mắc bệnh hoặc trở thành dịch địa phương. Một chu kỳ dịch
địa phương có thể được hình thành nếu số lứa lợn được sinh ra và lợn cai sữa

10


trong trại đủ lớn để duy trì sự lưu hành của virus thông qua việc lây nhiễm giữa
các lứa kế tiếp nhau khi lợn con mất khả năng miễn dịch lúc cai sữa. PEDV có
thể gây ra tiêu chảy dai dẳng trên lợn con sau cai sữa ở những trại như vậy.
Khả năng lây lan sang người và sự tác động tới sức khỏe cộng đồng cho tới
nay chưa có công bố nào về sự lây truyền của PEDV sang người và các loài khác.
1.3.4.3.Cơ chế gây bệnh:
Cơ chế sinh bệnh của PEDV được nghiên cứu trên lợn con không được bú
sữa đầu. Cho lợn con 3 ngày tuổi uống virus PED chủng CV777, sau khoảng 22
– 36 giờ lợn bắt đầu nôn và tiêu chảy. PEDV nhân lên trong bào tương của các tế
bào lông nhung, phá hủy các tế bào biểu mô, làm ngắn lông nhung niêm mạc ruột
và làm giảm hoạt động của enzym bề mặt biểu mô ruột. Tỷ lệ chiều cao và độ
dày của lông nhung thay đổi từ 7:1 xuống còn 3:1 (Utiger và cs, 1995; Porpischil
A, 1981). Các tế bào biểu mô hấp thu ở lông nhung rất mẫn cảm với PEDV,
những tế bào biểu mô nhiễm virus có thể quan sát được sau 12 – 18 giờ gây
nhiễm, rõ nhất sau khoảng 24 – 36 giờ, tuy nhiên không quan sát thấy có sự phá
hủy tế bào biểu mô ở kết tràng. Đặc điểm sinh bệnh của PEDV ở ruột non của
lợn rất giống với TGEV. So với TGEV, sự nhân lên và lây lan trong ruột non của
virus PED diễn ra chậm hơn và thời gian nung bệnh lâu hơn.

Cơ chế sinh bệnh của PEDV ở lợn giai đoạn lớn hơn vẫn chưa được
nghiên cứu chi tiết, nhưng bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang có thể quan sát
thấy virus có mặt trong tế bào biểu mô kết tràng của lợn mắc bệnh tự nhiên hoặc
được gây nhiễm. Ý nghĩa của việc virus xâm nhiễm ở kết tràng có làm cho bệnh
nặng hơn hay không vẫn chưa được rõ. Hiện vẫn chưa có cơ chế thích hợp nào
được đưa ra để lý giải hiện tượng lợn chết đột ngột kèm theo việc hoại tử cơ lưng
cấp tính quan sát thấy ở lợn vỗ béo và lợn trưởng thành. (Nguyễn Văn Điệp và
Nguyễn Thị Lan, 2012).
Vị trí nhân lên của virus được xác định thông qua kĩ thuật miễn dịch
huỳnh quang và kính hiển vi điện tử. Cho tới nay, chưa có công bố nào cho thấy
sự nhân lên của virus ở các tế bào bên ngoài đường tiêu hóa. Shibata và cộng sự
(2000) đã chỉ ra rằng ở lợn sạch bệnh (SPF - specific pathogen free) khi được
uống virus PED phân lập từ thực địa ở độ tuổi từ 2 ngày đến 12 tuần, sức đề

11


kháng tăng dần theo tuổi và lợn chỉ bị chết khi trong giai đoạn từ 2 – 7 ngày tuổi
(Shibata và cs, 2000). Cơ chế sinh bệnh của PEDV ở lợn giai đoạn lớn hơn vẫn
chưa được nghiên cứu chi tiết, nhưng bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang có
thể quan sát thấy virus có mặt trong tế bào biểu mô kết tràng của lợn mắc bệnh tự
nhiên hoặc được gây nhiễm. Ý nghĩa của việc virus xâm nhiễm ở kết tràng có
làm cho bệnh nặng hơn hay không vẫn chưa được rõ. Hiện vẫn chưa có cơ chế
thích hợp nào được đưa ra để lý giải hiện tượng lợn chết đột ngột kèm theo hoại
tử cơ lưng cấp tính quan sát thấy ở lợn vỗ béo và lợn trưởng thành.
Biểu hiện và tiến triển lâm sàng của lợn sạch bệnh bị gây nhiễm chủng
PEDV đã thích nghi trên môi trường nuôi cấy tế bào (ca – PEDV) nhẹ hơn nhiều
so với lợn nhiễm chủng thể hoang dại (wt – PEDV), độc lực của chủng ca –
PEDV yếu hơn nhiều, tốc độ sinh sản của virus chậm hơn và sự biến đổi về mặt
vi thể ở các cơ quan của lợn nhiễm virus cũng kém rõ ràng hơn.

1.3.5. Triệu chứng lâm sàng
Các mức độ nghiêm trọng gây ra bởi PEDV là rất khác nhau, phần lớn phụ
thuộc vào tình trạng miễn dịch và tình hình dịch bệnh ở các trang trại lợn. Khi
lợn mắc PED, biểu hiện chủ yếu và thường là duy nhất ở lợn đó là tiêu chảy
mạnh, phân rất nhiều nước. Lợn có hiện tượng bỏ ăn, mệt mỏi.
Lợn con theo mẹ: gầy, lười bú, ỉa chảy, phân lỏng, tanh, màu vàng, có sữa
không tiêu; nôn mửa, lợn con sụt cân nhanh do mất nước. Lợn con thích nằm lên
bụng mẹ, điều trị bằng các loại kháng sinh đặc trị tiêu chảy không có kết quả.
Lợn sinh sản: tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết rất khác nhau. Lợn thường qua khỏi
sau 1 tuần. Bệnh xảy ra ở những trại giống mẫn cảm có tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong
rất khác nhau. Lợn ở tất cả các lứa tuổi đều có thể mắc với tỷ lệ có thể lên tới
100%. Biểu hiện của PED tương tự TGE, tuy rằng PED lây lan chậm hơn và có
tỷ lệ chết ở lợn con thấp hơn. Lợn con dưới 1 tuần tuổi có thể chết do mất nước
sau khi tiêu chảy 2 – 4 ngày. Tỷ lệ chết ở lợn con trung bình khoảng 50%, nhưng
có thể cao hơn tới 100%. Ở giai đoạn lớn hơn, lợn thường tự hồi phục sau khi
quá trình tiêu chảy kéo dài được 1 tuần. Khi PED cấp tính ở 1 trại nào đó qua đi
thì lợn con giai đoạn 2 – 3 tuần sau cai sữa vẫn có thể có biểu hiện tiêu chảy và
lợn mới nhập về thường phát bệnh. Vài năm gần đây, những đợt bùng phát cấp

12


tính điển hình với tỷ lệ chết cao trên lợn sơ sinh hiếm xảy ra ở châu Âu, nhưng
các ổ dịch tại Nhật Bản và Hàn Quốc lại cho thấy tỷ lệ lợn sơ sinh chết rất cao
(Sueyoshi M và cs, 1995; Chae C và cs, 2000).
Lợn trong giai đoạn vỗ béo: nếu PED bùng phát ở thể cấp tính, trong vòng
1 tuần tất cả lợn sẽ có biểu hiện tiêu chảy. Lợn có biểu hiện chán ăn, mệt mỏi,
phân rất loãng, chứa nhiều nước. Biểu hiện lợn mắc PED trong giai đoạn vỗ béo
có thể nặng hơn so với mắc TGE. Lợn thường có biểu hiện đau vùng bụng nhiều
hơn. Sau khoảng 7 – 10 ngày, lợn sẽ hồi phục.Tỷ lệ tử vong lợn ở giai đoạn này

thường từ 1 -3%, lợn chết nhanh thường ở giai đoạn mới bắt đầu tiêu chảy hoặc
trước khi có biểu hiện tiêu chảy.Tỷ lệ chết cao nhất được thấy ở những trại lợn có
giống mẫn cảm và chịu nhiều stress.
1.3.6. Bệnh tích
Bệnh tích đại thể và vi thể của PED tương tự như bệnh TGE. Bệnh tích
thường tập trung ở đường tiêu hóa, đặc biệt là ở ruột non. Dạ dày thường trống
rỗng do lợn nôn và ống dưỡng chấp không chứa nhiều dịch dưỡng do sự kém hấp
thu ở ruột. Ruột non màu nhợt nhạt, chứa đầy dịch, căng phồng, thành ruột mỏng
tới mức có thể nhìn thấy được bên trong do sự teo lại của tầng niêm mạc.Chất
chứa trong ruột non lợn cợn. Hạch ruột xung huyết, xuất huyết.

Hình 1.2: Bệnh tích ruột căng phồng ở lợn con
Nguồn: Daesub Song và Bongkyun Park, 2012(14)

13


Về mặt vi thể, có sự hình thành không bào to, rõ trong bào tương tế bào
biểu mô và sự bong tróc của tế bào này làm cho lông nhung ngắn và dồn lại, hòa
lẫn vào nhau rõ rệt. Tuy nhiên, các biểu hiện này không rõ bằng TGE. Ở kết
tràng chưa có bệnh tích vi thể nào được báo cáo. Điều thú vị là các nghiên cứu
siêu vi thể đã cho thấy sự hiện diện rõ rệt của các hạt virus bên trong bào tương
tế bào và sự thay đổi ở các tế bào biểu mô ruột non và kết tràng. Những thay đổi
cấu trúc siêu vi thể được khởi đầu đặc trưng bằng sự mất đi của các bào quan, vi
nhung, lưới tận và phần nhô ra của bào tương tế bào hấp thu vào trong xoang
ruột. Sau đó, các tế bào trở nên phẳng, dẹt, các mối liên kết chặt chẽ bị mất đi và
các tế bào rơi vào trong lòng ống ruột.
1.3.7. Các phương pháp chẩn đoán PEDV
1.3.7.1. Chẩn đoán lâm sàng
Dựa vào triệu chứng lâm sàng để chẩn đoán. Các triệu chứng điển hình như:

lợn con theo mẹ lười bú, ỉa chảy, phân lỏng, tanh, màu vàng như kem, có sữa
không tiêu, nôn mửa, lợn con sụt cân nhanh do mất nước, lợn con hay nằm lên
bụng mẹ.
1.3.7.2. Chẩn đoán huyết thanh học
Sử dụng phương pháp chẩn đoán miễn dịch huỳnh quang hoặc hóa mô miễn
dịch có thể cho kết quả tương đối nhanh và chính xác. Tuy nhiên, phương pháp
này có hạn chế là mẫu bệnh phẩm để chẩn đoán phải là ruột của lợn được giết khi
mới bị tiêu chảy. Nếu bệnh phẩm của lợn bị chết tự nhiên thì kết quả không được
tin cậy.
Hiện nay, một số Kit ELISA được phát triển để xác định kháng nguyên
(PEDV) có trong phân của lợn và xác định sự có mặt của kháng thể trong huyết thanh.
1.3.7.3. Chẩn đoán virus học
Sử dụng phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction) để phân biệt hai virus gây bệnh PED và bệnh TGE.
1.3.7.4. Chẩn đoán phân biệt
Ngoài tiêu chảy do PEDV, có nhiều bệnh khác cũng gây ra triệu chứng tiêu
chảy, đó là phản ứng của cơ thể và hậu quả có liên quan đến đường ruột như:

14


* Bệnh viêm dạ dày, ruột truyền nhiễm (TGE-Transmissible Gastro Enteritis):
Nguyên nhân do virus thuộc họ Coronavirus, bệnh lây lan nhanh và tỷ lệ
chết của lợn con rất cao. Bệnh xảy ra ở lợn con dưới 2 tuần tuổi, lợn mất nước,
sút cân nhanh, nôn mửa, ỉa chảy phân nhiều nước, màu vàng hoặc hơi xanh, lổn
nhổn mùi khó chịu. Bệnh tích là thành ruột non mỏng, dạ dày chứa sữa không
tiêu màu trắng do TGEV phá hủy nhung mao ruột. Ở lợn trưởng thành bệnh ở thể
mang bệnh ít biểu hiện.
* Bệnh do Rotavirus:
Bệnh do virus thuộc họ Reoviridae gây ra, thường xảy ra ở lợn 1-5 ngày tuổi,

tỷ lệ chết cao 50 - 100%. Triệu chứng điển hình là phân nhão như hồ sau phân
lẫn nhiều nước màu vàng trắng hoặc xám, chứa nhiều chất vón. Do virus cư trú,
hủy hoại làm thoái hóa lớp nhung mao ruột làm khả năng tiêu hóa và hấp thu
kém nên khi lợn khỏi bệnh nếu được nuôi tiếp lợn sẽ còi cọc và chậm lớn.
* Bệnh do E.coli (Colibaccillosis):
Sau khi xâm nhập vào hệ thống tiêu hóa, vi khuẩn bám dính vào tế bào
nhung mao ruột non bằng các yếu tố bám dính. Tại đây vi khuẩn phát triển nhân
lên, phá hủy tế bào tổ chức, gây viêm và sản sinh độc tố Toxigenic hoặc
Verotoxin, gây tụ huyết, xuất huyết, hoặc vi khuẩn cư trú tại ruột gây chứng viêm
ruột cấp. Nếu con vật vượt qua giai đoạn này thường để lại bệnh tích ở hạch
màng treo ruột, gan, lách và túi mật. Với những gia súc trưởng thành khỏe mạnh
có thể không có triệu chứng lâm sàng nhưng có bệnh tích ở phủ tạng, vùng bụng.
* Bệnh phó thương hàn (Salmonellosis):
Nguyên nhân bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra. Bệnh thường xảy ra ở lợn sau
cai sữa đến 4 tháng tuổi, lợn lớn ít mắc hơn. Con vật có triệu chứng bỏ ăn, sốt
cao 40.5 -41.6oC, ho khan khò khè, lúc đầu đi táo, sau khi nhiệt độ hạ xuống, con
vật ỉa chảy nặng, phân lỏng sống màu vàng bột như cám, da xuất hiện những đám
tụ máu, gan có những điểm hoại tử hoặc áp se, lợn chết ở những ngày đầu lách
sưng to, tụ máu. Nếu lợn mắc ở thể mãn tính lách dai như cao su. Niêm mạc ruột

15


già viêm loét, vết loét lan tràn bờ nông. Do ỉa chảy nhiều, con vật dễ dẫn đến lòi
dom và giai đoạn sau liệt cơ vòng hậu môn. Da nhợt nhạt lông xù, bụng hóp lại
hõm sâu xuống.
* Bệnh hồng lỵ do Treponema:
Bệnh do xoắn khuẩn Treponema hyodysenteria gây nên thường kết hợp với phẩy
khuẩn Vibro và các nhóm vi khuẩn đường ruột khác. Bệnh thường xảy ra ở lợn
sau cai sữa từ 3-6 tháng tuổi, dấu hiệu lâm sàng chủ yếu là tiêu chảy, phân có lẫn

máu tươi màng niêm mạc và dịch nhầy do viêm ruột già, manh tràng, trực tràng.
Cơ thể suy nhược, mất nước, chậm lớn.
là thời điểm 1-3 ngày tuổi sau khi sinh. Triệu chứng chủ yếu là tiêu chảy ra
máu, tỷ lệ chết cao, có bệnh tích ở ruột non xuất huyết máu đỏ tươi.

16


Chương 2
NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu.
- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học bệnh PED trong những năm gần
đây trên địa bàn tỉnh Hưng Yên với các nội dung: lứa tuổi mắc bệnh, tỷ lệ chết,
triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể,…
- Khảo sát một số đặc điểm sinh học phân tử của virus gây bệnh PED trên
đàn lợn của tỉnh Hưng Yên.
2.2. Nguyên liệu.
- Đàn lợn được nuôi trên địa bàn tỉnh Hưng Yên.
- Số liệu điều tra tình hình bệnh PED theo phiếu điều tra một số ổ dịch tại
địa phương.
- Mẫu bệnh phẩm sử dụng trong nghiên cứu là các mẫu ruột và phân của
lợn nghi mắc bệnh PED.
- Trang thiết bị, dụng cụ cần thiết để mổ khám, lấy mẫu bệnh phẩm và các
trang thiết bị để sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử của mầm bệnh
như: Găng tay, khẩu trang, panh, kẹp, kéo, dao mổ, ống đựng mẫu, chày, cối, ống
Eppendorf, micropipette, máy li tâm, máy trộn, máy PCR System 9700, hóa chất
cần thiết khác,…
- Cặp mồi dùng trong chẩn đoán PEDV là cặp mồi P1/P2, trình tự cặp mồi
như sau:
Mồi xuôi/ngược

Trình tự mồi (5’ – 3’)

P1

TTCTGAGTCACGAACAGCCA

P2

CATATGCAGCCTGCTCTGAA

Kích thước (bp)

Tác giả

651

Kim và cs,
2001[20]

2.3. Địa điểm nghiên cứu.
- Địa điểm nghiên cứu: các huyện có cơ cấu đàn lợn lớn trên địa bàn tỉnh
Hưng Yên. Cụ thể, đề tài được tiến hành trên địa bàn 4 huyện: Tiên Lữ, Phù Cừ,

17


Ân Thi và Văn Giang. Nội dung nghiên cứu được thực hiện tại địa bàn 4 huyện
nêu trên.
2.4. Phương pháp nghiên cứu.

2.4.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học
a) Thu thập số liệu
Số liệu bệnh PED ở lợn, hộ chăn nuôi lợn có dịch năm 2014 - 2015 từ việc
điều tra và tổng hợp. Trong đó: Lợn mắc PED là lợn có các triệu chứng lâm sàng
đặc trưng của bệnh.
b) Phân tích số liệu
Dữ liệu thu thập được xử lý bằng phầm mềm Excel 2007.
2.4.2. Khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh
a) Lấy mẫu bệnh phẩm:
Mẫu bệnh phẩm là phân hoặc ruột của lợn nghi nhiễm bệnh tiêu chảy cấp
PED từ các trại lợn được thu thập bảo quản trong các ống chứa mẫu đã được vô
trùng. Các mẫu bệnh phẩm này sau đó được dùng cho phản ứng RT-PCR với các
cặp mồi đặc hiệu để chẩn đoán bệnh PED. Chỉ các mẫu dương tính với PEDV
mới được lựa chọn cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.
b) Phương pháp tách chiết RNA của PEDV từ các mẫu bệnh phẩm
Trizol (Invitrogen) được dùng để tách chiết RNA của PEDV, các bước được
tiến hành theo sự chỉ dẫn cụ thể theo hướng dẫn chuẩn của nhà sản xuất. Cụ thể, bổ
sung 800µl dung dịch Trizol vào 200µl huyễn dịch virus, vortex và sau đó bổ sung
tiếp 200µl dung dịch Chloroform, vortex mạnh trong 15 giây, ủ ở nhiệt độ phòng
trong 5 phút. Huyễn dịch trên được ly tâm 12000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC.
Sau khi ly tâm, chuyển pha trên có chứa RNA vào một ống Eppendorf mới (với
lượng khoảng 500µl). Tủa RNA của virus bằng cách bổ sung 500µl dung dịch
Isopropanol, ly tâm 12000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC. Rửa tủa RNA bằng 1ml
dung dịch Ethanol 70%, ly tâm 12000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC. Hòa RNA
trong 30µl nước vô trùng đã loại Rnase và bảo quản ở -20oC.

18


c) Phương pháp tổng hợp cDNA

cDNA được tổng hợp từ RNA đã được tách chiết nhờ enzyme phiên mã
ngược (reverse transcriptase). Để tạo cDNA chúng tôi dùng bộ Kit
SuperScriptTM (Invitrogen) sử dụng mồi Oligo dT với trình tự 5’CTGTGAATGCTGCGACTACGATTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’. Thành phần
phản ứng và điều kiện tổng hợp cDNA như sau: 5µl RNA tinh sạch, 4.5µl nước
đã loại RNase, 3µl dNTPs (2.5 mM mỗi loại), 2µl mồi oligo dT (200 pM/µl), 1µl
SuperscriptTM II RNase H-reverse transcriptase (200 U/µl), 0.5µl RNase
inhibitor (10 U/µl) và 4µl 5x first strand buffer. Phản ứng tổng hợp cDNA được
thực hiện ở 37°C trong 60 phút và sau đó 94°C trong vòng 5 phút.
d) Phương pháp PCR và giải trình tự gen (sequencing)
cDNA được tổng hợp ở trên được bổ sung trực tiếp vào ống phản ứng
PCR sử dụng Kit AccuPower PCR PreMix (BIONEER). Kit này chứa DNA taqpolymerase và các thành phần cần thiết cho quá trình khuếch đại DNA. Phản ứng
PCR được thực hiện theo chương trình chuẩn như sau: 30 chu kỳ (94°C - 1 phút,
54°C - 1 phút, 72°C - 1 phút) và cuối cùng 8 phút ở 72°C. Sản phẩm PCR sẽ
được kiểm tra trên gel agarose và được gửi sang công ty Macrogen của Hàn
Quốc để tiến hành giải trình tự gen. Trình tự DNA thu được sẽ được phân tích
bằng phần mềm BioEdit và DNAstar. Hơn thế nữa, chúng tôi cũng tiến hành so
sánh với trình tự genome của virus PED trong ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế
bằng phần mềm MegAlign (DNASTAR, Madison, WI).
e) Phương pháp one-step RT-PCR để chẩn đoán và định type PEDV
RNA sau khi tổng số được tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm
PEDV sẽ được bổ sung trực tiếp vào ống phản ứng RT-PCR sử dụng kit
Accupower RT-PCR premix (BIONEER, Hàn Quốc). Kit này chứa enzyme
phiên mã ngược, taq-polymerase và các thành phần cần thiết cho quá trình tạo
cDNA và khuếch đại DNA. Sau đó bổ sung cặp primer đặc hiệu được thiết kế
trên vùng bảo thủ của gen cấu trúc gai (S) của PEDV. Phản ứng one-step RTPCR được thực hiện theo chương trình như sau: 42o C trong 30 phút để tạo
cDNA, tiếp đến là 5 chu kỳ (94o C trong 30 giây, 55o C trong 30 giây, 72o C trong

19