KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

KIỂM NGHIỆM THUỐC
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)


1. GIỚI THIỆU CHUNG

Sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Sự tách sắc ký được
dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha ln tiếp xúc nhưng khơng hịa lẫn vào nhau: một
pha tĩnh và một pha động.

Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột.


2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT

2.1. Khái niệm
HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được
phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng
liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ.


2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT

2.2. Các đại lượng đặc trưng
Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại và ghi thành sắc ký đồ:


2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT

2.2. Các đại lượng đặc trưng

- Thời gian lưu tR (Retention time)

- Hệ số phân bố (Distribution factor)

- Hệ số dung lượng k' (Capacity factor)

- Độ chọn lọc α (Selectivity-factor) hay còn gọi là Độ lưu giữ tỷ đối r:


2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT

2.2. Các đại lượng đặc trưng
- Pic sắc ký

- Hiệu năng của cột và số đĩa lý thuyết biểu kiến N (Theoretical plates)

- Hệ số đối xứng As (Symmetry factor) hay hệ số kéo đuôi T (Tailing factor)


2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT

2.2. Các đại lượng đặc trưng

- Tỷ số đỉnh-hõm (Peak-to-valley ratio)

- Tỷ số tín hiệu trên nhiễu (Signal-to-noise ratio)

- Độ lặp lại của hệ thống (System repeatability)

- Các thơng số động học và sự dỗng pic

3. TÍNH PHÙ HỢP HỆ THỐNG:

Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến đặc tính sắc ký bao gồm thành phần pha động, sức ion, nhiệt độ và pH biểu kiến
của pha động, lưu lượng, kích thước cột, nhiệt độ và áp suất, và các đặc tính của pha tĩnh, mức biến đổi hóa học như
độ xốp (cỡ lỗ), cỡ hạt, kiểu các hạt, diện tích bề mặt riêng, và trong trường hợp pha đảo là mức độ biến đổi hóa học.


3. TÍNH PHÙ HỢP HỆ THỐNG:
Nếu khơng có chỉ dẫn gì khác trong chuyên luận thì hệ thống phải đạt các yêu cầu sau đây:
Hệ số đối xứng của pic chính phải trong khoảng 0,8 - 1,5, trừ khi có chỉ dẫn khác trong tiêu chuẩn.
Trừ khi có chỉ dẫn riêng, độ lệch chuẩn tối đa được phép cho các lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn là 2,0%. Yêu cầu
này chỉ áp dụng cho các phép định lượng thành phẩm.


4. ĐIỀU CHỈNH CÁC ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ:
Để thỏa mãn các tiêu chí trong yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống, mà không làm thay đổi cơ bản phương pháp,
có thể điều chỉnh các thơng số sắc ký trong phạm vi nhất định.

Với các thông số quan trọng, việc điều chỉnh được xác định rõ ràng trong tiêu chuẩn để đảm bảo tính phù hợp của
hệ thống.

Nên tránh điều chỉnh nhiều thứ một lúc vì có thể gây tác động tích lũy trên hiệu năng của hệ thống.


4. ĐIỀU CHỈNH CÁC ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ:
4.1 ĐẲNG DÒNG:

a). Thành phần pha động: Lượng thành phần dung môi nhỏ có thể điều chỉnh ± 30% nồng độ tương đối hay ± 2%

nồng độ tuyệt đối tùy theo trị số nào lớn hơn. Không thành phần dung môi nào được thay đổi lớn hơn 10% nồng độ tuyệt
đối.


4. ĐIỀU CHỈNH CÁC ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ:
4.1 ĐẲNG DÒNG:

b). pH của thành phần nước trong pha động: ± 0,2 pH, trừ các chỉ dẫn khác, hoặc ± 1,0 pH khi chất phân tích khơng bị
ion hóa.
c). Nồng độ muối: Được thay đổi ± 10%.
d). Bước sóng detector: Khơng được điều chỉnh.


4. ĐIỀU CHỈNH CÁC ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ:
4.1 ĐẲNG DÒNG:
f). Tốc độ dòng: ± 50%. (sao cho lưu lượng qua cột khơng thay đổi) theo cơng thức sau (*):

Trong đó:
F1, F2

: Lần lượt là tốc độ dòng đã quy định và được điều chỉnh (ml/min)

l1, l2 : Lần lượt là chiều dài cột đã quy định và được sử dụng (mm)
d1, d2

: Đường kính trong của cột đã quy định và cột được sử dụng (mm)


4. ĐIỀU CHỈNH CÁC ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ:
4.1 ĐẲNG DÒNG:

o
g). Nhiệt độ: ± 10 C nhiệt độ quy định trong tiêu chuẩn, trừ khi có chỉ dẫn khác.
h). Thể tích tiêm: Có thể giảm nếu giới hạn phát hiện và độ lặp lại của các pic được xác định là thỏa đáng. Khơng
được tăng thể tích tiêm.


4. ĐIỀU CHỈNH CÁC ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ:
4.2 RỬA GIẢI GRADIENT :

Điều chỉnh điều kiện sắc ký trong rửa giải gradient cần thận trọng hơn nhiều so với điều chỉnh điều kiện rửa giải đẳng dòng.
a). pH của thành phần nước trong pha động: Không được điều chỉnh.
b. Nồng độ muối trong tp đệm của pha động: Không được điều chỉnh.


4. ĐIỀU CHỈNH CÁC ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ:
4.2 RỬA GIẢI GRADIENT :

c). Bước sóng detector: Khơng được điều chỉnh.
o
d). Nhiệt độ: ± 5 C nhiệt độ quy định trong tiêu chuẩn, trừ khi có chỉ dẫn khác.
e). Thể tích tiêm: Có thể giảm nếu độ lặp lại của các pic được xác định là thỏa đáng. Không được tăng thể tích tiêm. (Giống
đẳng dịng)


4. ĐIỀU CHỈNH CÁC ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ:
4.2 RỬA GIẢI GRADIENT :
f). Thành phần pha động: Có thể điều chỉnh một chút về thành phần pha động và chương trình dung môi (gradient), nhưng phải
đáp ứng các yêu cầu sau:
+ Đáp ứng đầy đủ yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống sắc ký.

+ Pic chính được rửa giải ra trong khoảng ± 15% so với thời gian lưu ghi trong tiêu chuẩn.


4. ĐIỀU CHỈNH CÁC ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ:
4.2 RỬA GIẢI GRADIENT :
f). Thành phần pha động:
+ Thành phần cuối cùng của pha động khơng được có hiệu lực rửa giải kém hơn so với thành phần đã ghi trong tiêu chuẩn.
g). Thơng số cột:
Giống như đẳng dịng, nhưng khơng được thay đổi cỡ hạt.


4. ĐIỀU CHỈNH CÁC ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ:
4.2 RỬA GIẢI GRADIENT :

h). Tốc độ dịng:
Khi kích thước cột thay đổi, tốc độ dịng có thể cần được điều chỉnh theo cơng thức (*) ở phần rửa giải đẳng dịng:

Quy định hiện hành của USP, đối với rửa giải gradient: Không cho phép thay đổi chiều dài cột, đường kính cột và kích
thước hạt nhồi.


5. MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
5.1. Sơ đồ cấu tạo

1.

Bình chứa dung mơi động

2.

Bơm cao áp

3.

Bộ phận tiêm mẫu

4.

Cột HPLC (pha tĩnh)

5.

Detector

6.

Máy ghi tín hiệu


5. MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
5.2. Cấu tạo chi tiết và tính năng

5.2.1. Bình đựng dung mơi và hệ thống xử lý dung môi
5.2.2. Bơm cao áp
5.2.3. Bộ phận tiêm mẫu


5. MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
5.2. Cấu tạo chi tiết và tính năng

5.2.4. Cột phân tích
Chất nhồi cột tùy theo loại cột và kiểu SK. Thông thường chất nhồi cột là Silicagel hoặc là Silicagel đã được silan hóa hoặc được bao
một lớp mỏng hữu cơ Đối với các phương pháp phân tích yêu cầu nhiệt độ cột cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phịng thì cột sẽ được đặt trong bộ
phận điều nhiệt.


5. MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
5.2. Cấu tạo chi tiết và tính năng

5.2.5. Detector
Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiêu ghi trên sắc đồ để có thể định tính và định lượng. Tuỳ
theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp


5. MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
5.2. Cấu tạo chi tiết và tính năng

5.2.6. Máy ghi tín hiệu

Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang.

- Máy ghi đơn giản thì có thể vẽ sắc đồ, ghi thời gian lưu , diện tích pic hoặc chiều cao pic,% diện tích pic ...

- Phần mềm thiết bị ngồi khả năng ghi cịn có khả năng xử lý kết quả, lưu kết quả, bảo mật, phân quyền sử dụng.


6. KỸ THUẬT TIẾN HÀNH
6.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc

Máy HPLC phải được hiệu chuẩn theo định kỳ để đảm bảo độ đúng và độ lặp lại kết quả. Tiến hành hiệu chuẩn

theo tài liệu của hãng sản xuất hoặc theo SOP của phịng thí nghiệm. Đặc biệt về cột sắc ký phải được kiểm tra số đĩa
lý thuyết định kỳ và rửa đúng quy định sau mỗi lần chạy.