Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào in vitro của cao chiết từ cây sài đất (wedelia chinensis (osbeck ) merr ) trên tế bào đơn nhân được chiết từ máu ngoại vi người

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ BẢO ANH

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO
CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY SÀI ĐẤT
(WEDELIA CHINENSIS (OSBECK.) MERR.)
TRÊN TẾ BÀO ĐƠN NHÂN ĐƯỢC CHIẾT TỪ MÁU NGOẠI VI NGƯỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Tp Hồ Chí Minh - 2020

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ BẢO ANH

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO
CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY SÀI ĐẤT
(WEDELIA CHINENSIS (OSBECK.) MERR.)
TRÊN TẾ BÀO ĐƠN NHÂN ĐƯỢC CHIẾT TỪ MÁU NGOẠI VI NGƯỜI

Luận văn thạc sĩ dược học

Chuyên ngành: Dược lý và Dược lâm sàng
Mã số chuyên ngành: 8720205

Người hướng dẫn khoa học : TS. Nguyễn Thị Minh Thuận

Thành phố Hồ Chí Minh - 2020

.


.

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập của tôi, dưới sự hướng
dẫn của TS. Nguyễn Thị Minh Thuận. Số liệu trong đề tài này được thu thập và sử
dụng một cách trung thực. Kết quả và nội dung trình bày trong luận văn này không sao
chép của bất kỳ luận văn nào và chưa được trình bày hay cơng bố ở bất cứ cơng trình
nghiên cứu nào trước đó.

Nguyễn Thị Bảo Anh

.

.

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO
CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY SÀI ĐẤT (WEDELIA CHINENSIS (OSBECK.) MERR.)
TRÊN TẾ BÀO ĐƠN NHÂN ĐƯỢC CHIẾT TỪ MÁU NGOẠI VI NGƯỜI
Nguyễn Thị Bảo Anh
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Minh Thuận
Tổng quan: Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr., Asteraceae) có hoạt tính chống oxy
hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, bảo vệ gan và điều hòa miễn dịch. Tuy nhiên, những nghiên
cứu về tác động của Sài đất trên các tế bào miễn dịch vẫn còn hạn chế. Mục tiêu của đề tài này
là khảo sát hoạt tính gây độc tế bào in vitro của cao chiết từ cây Sài đất trên tế bào đơn nhân
được chiết từ máu ngoại vi người (PBMCs).
Phương pháp nghiên cứu: Đánh giá tác động của cao toàn phần ethanol 50% Sài đất và các
cao phân đoạn trong chloroform, ethylacetat, n-butanol) trên tỉ lệ sống của tế bào PBMCs (5 x
105 tế bào/ml) sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ nuôi cấy với thuốc thử WST-1. Đánh giáquá trình
hoại tử và apoptosis của tế bào PBMCs bởi tác động của các cao chiết Sài đất trong 48 giờ và
72 giờ bằng phương pháp định lượng hoạt độ LDH trong môi trường nuôi cấy và định lượng tỉ
lệ ADN phân mảnh. Khảo sát khả năng sản xuất interleukin-1β (IL-1β) của tế bào PBMCs
trong mơi trường có cao Sài đất trong 48 giờ bằng phương pháp ELISA. Khảo sát sự thay đổi
tỉ lệ các tế bào T CD4+ và T CD8+ dưới tác động của phân đoạn chloroform và phân đoạn nbutanol Sài đất trong 24 giờ trên máy flow cytometry.
Kết quả: Cao chiết phân đoạn chloroform ức chế sự tăng sinh của PBMCs sau 48 giờ mạnh
mạnh nhất với IC50 là 10,35 ppm và gây cảm ứng quá trình apoptosis của PBMCs sau 72 giờ
mạnh nhất với IC50 là 9,82 ppm. Sự sản xuất IL-1β của PBMCs bị ức chế dưới tác động của
các cao chiết Sài đất. Tỉ lệ tế bào T CD4+ và T CD8+ bị thay đổi dưới tác động của phân đoạn
chloroform và phân đoạn n-butanol sau 24 giờ nuôi cấy.
Kết luận: Các cao chiết Sài đất có độc tính tiềm ẩn trên các tế bào PBMCs.
Từ khóa: Sài đất, PBMCs, độc tính

.


.

IN VITRO CYTOTOXIC ACTIVITIES OF
WEDELIA CHINENSIS (OSBECK.) MERR. EXTRACTS
ON HUMAN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS
Nguyen Thi Bao Anh
Supervisor: PhD. Nguyen Thi Minh Thuan
Background: Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr., belonging to the Asteraceae family, is a
medicinal plant with antioxidant, anti-inflammatory, anti-bacterial, hepato-protective and
immunomodulatory activities. However, studies on the immunomodulatory effects of Wedelia
chinensis are still limited. Therefore, this study was conducted with the aim of investigating
the effects of the W.chinensis extracts on cell proliferation and cytokine production of human
peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and the change in CD4+/CD8+ ratio of T cells.
Materials and methods: Effects on PBMC proliferation of 50% ethanol crude extract and its
fractions (chloroform, ethylacetat, n-butanol) after 24, 48 and 72 hours were evaluated by
using WST-1 reagent. Effects of W.chinensis extracts on necrosis and apoptosis process of
PBMCs were evaluated after 48 and 72 hours using lactat dehydrogenase (LDH) actitity
quantitation and diphenylamin method, respectively. Interleukin-1β (IL-1β) concentrations
secreted by PBMCs under effects of W.chinensis extracts for 48 hours were quantitated using
ELISA method. Human CD4+ and CD8+ T cell activation after 24-hour exposure to
chloroform and n-butanol fractions of W.chinensis was analysed by flowcytometry.
Results: Chloroform fractions of W.chinensis induced the strongest effects on inhibition of
PBMC proliferation after 48 hours and apoptosis of PBMCs after 72 hours with IC50 at 10,35
ppm and 9,82 ppm, respectively. W.chinensis extracts were also inhibited the production of
IL-1β after 48 hours. The ratio of CD4 + and CD8 + T-cells was chandged after 24-hour
exposure to chloroform and n-butanol fractions.
Conclusion: The results of this study showed that W.chinensis may have potetntial cytotoxic

effects on human PBMCs.
Keywords: Wedelia chinensis, PBMCs, cytotoxic effects.

.


.

i

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................... 3
1.1. Tế bào đơn nhân chiết từ máu ngoại vi (PBMCs)................................................. 3
1.1.1. Thành phần...................................................................................................... 3
1.1.2. Vai trò của tế bào PBMCs đối với hệ miễn dịch............................................ 3
1.1.3. Cytokin.............................................................................................................6
1.1.4. Vai trò của tế bào PBMCs trong các nghiên cứu in vitro............................... 8
1.2. Chu kỳ tế bào và các điểm kiểm soát trong chu trình tế bào................................. 8
1.3. Các phương pháp đánh giá độc tính trên tế bào...................................................11
1.3.1. Đánh giá độc tính trên tế bào bằng các phương pháp đo quang...................11
1.3.2. Đánh giá độc tính trên tế bào bằng phương pháp đo huỳnh quang.............. 11
1.3.3. Đánh giá quá trình necrosis của tế bào..........................................................12
1.3.4. Đánh giá quá trình apoptosis của tế bào........................................................13
1.4. Cây Sài đất Việt Nam (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr., Asteraceae)........... 14
1.4.1. Đặc điểm thực vật học loài Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr................... 14
1.4.2. Thành phần hóa học.......................................................................................16
1.4.3. Tác dụng dược lý........................................................................................... 17
1.4.4. Kinh nghiệm sử dụng cây Sài đất trong dân gian......................................... 20
1.4.5. Tình hình nghiên cứu về tác dụng điều hịa miễn dịch của cây Sài đất trên

thế giới và ở Việt Nam.............................................................................................20

.


.

ii

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................22
2.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................................... 22
2.2. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất, thuốc thử.................................................................. 22
2.2.1. Dụng cụ..........................................................................................................22
2.2.2. Thiết bị........................................................................................................... 22
2.2.3. Hóa chất, thuốc thử........................................................................................24
2.3. Dược liệu...............................................................................................................25
2.3.1. Xác định độ ẩm, độ tro toàn phần của dược liệu.......................................... 25
2.3.2. Điều chế cao toàn phần ethanol 50%............................................................ 25
2.3.3. Điều chế các cao phân đoạn.......................................................................... 26
2.3.4. Sơ bộ định tính hóa thực vật..........................................................................27
2.4. Chiết PBMCs từ máu ngoại vi người................................................................... 27
2.4.1. Nguyên tắc..................................................................................................... 28
2.4.2. Tiến hành....................................................................................................... 28
2.5. Khảo sát độ sống tế bào PBMCs dưới tác động in vitro của cao chiết toàn phần
và các cao phân đoạn bằng thuốc thử WST-1.............................................................29
2.5.1. Nguyên tắc..................................................................................................... 29
2.5.2. Tiến hành....................................................................................................... 29
2.6. Khảo sát hoạt tính độc tế bào của cao chiết toàn phần và các cao phân đoạn trên
tế bào PBMCs.............................................................................................................. 31
2.6.1. Thử nghiệm LDH.......................................................................................... 31

2.6.2. Định lượng ADN phân mảnh........................................................................ 33

.


.

iii

2.7. Khảo sát tác động của các cao chiết toàn phần và các cao phân đoạn lên sự sản
xuất IL-1 in vitro của tế bào PBMCs........................................................................ 34
2.7.1. Nguyên tắc..................................................................................................... 34
2.7.2. Tiến hành....................................................................................................... 34
2.8. Khảo sát tác động của cao chiết Sài đất trên các tế bào lympho TCD4+ và
TCD8+......................................................................................................................... 35
2.9. Xử lý số liệu..........................................................................................................36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ..................................................................................................37
3.1. Dược liệu...............................................................................................................37
3.1.1. Độ ẩm và độ tro toàn phần của dược liệu..................................................... 37
3.1.2. Độ ẩm và độ tro toàn phần của cao toàn phần.............................................. 37
3.2. Sơ bộ định tính hóa thực vật của các cao chiết.................................................... 38
3.3. Khảo sát độ sống tế bào PBMCs dưới tác động in vitro của cao chiết toàn phần
và các cao phân đoạn bằng thuốc thử WST-1.............................................................39
3.3.1. Sau 24 giờ nuôi cấy....................................................................................... 39
3.3.2. Sau 48 giờ nuôi cấy....................................................................................... 41
3.3.3. Sau 72 giờ nuôi cấy....................................................................................... 43
3.4. Khảo sát hoạt tính độc tế bào của cao tồn phần và các cao phân đoạn trên tế
bào PBMCs.................................................................................................................... 2
3.4.1. Thử nghiệm LDH............................................................................................ 2
3.4.2. Định lượng ADN phân mảnh.......................................................................... 6

.


.

iv

3.5. Khảo sát tác động của cao toàn phần và cao phân đoạn trên sự sản xuất IL-1 in
vitro của tế bào PBMCs...............................................................................................10
3.6. Khảo sát tác động của cao chiết Sài đất trên các tế bào T CD4+ và T CD8+.....13
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN.............................................................................................. 15
4.1. Tác động của các cao Sài đất trên tỉ lệ sống của PBMCs....................................16
4.2. Các tác động gây độc của cao sài đất trên PBMCs..............................................19
4.3. Tác động của các cao chiết lên sự sản xuất IL-1 của PBMCs...........................21
4.4. Tác động của các cao sài đất trên sự phân bố tế bào T CD4+ và T CD8+..........22
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................. 24
5.1. Kết luận.................................................................................................................24
5.2. Kiến nghị...............................................................................................................25

.


.

v

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 . Vai trò của cytokin trong quá trình miễn dịch của cơ thể............................... 7
Bảng 1.2 . Một vài nghiên cứu về tác động in vitro của Sài đất trên hệ miễn dịch........21

Bảng 2.1 . Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ..........................................................23
Bảng 2.2 . Hóa chất, thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu..............................................24
Bảng 3.1 . Độ ẩm và độ tro toàn phần............................................................................. 37
Bảng 3.2 . Độ ẩm và độ tro của cao toàn phần................................................................37
Bảng 3.3 . Kết quả sơ bộ định tính hóa thực vật của cao toàn phần và các cao phân
đoạn của dược liệu Sài đất............................................................................................... 38
Bảng 3.4 . Tóm tắt kết quả tác động của các cao Sài đất lên tỉ lệ sống của PBMCs sau
24 giờ................................................................................................................................39
Bảng 3.5 . Tóm tắt kết quả tác động của các cao Sài đất lên tỉ lệ sống của PBMCs sau
48 giờ................................................................................................................................41
Bảng 3.6 . Kết quả tác động của các cao Sài đất lên tỉ lệ sống của PBMCs sau 72 giờ 43
Bảng 3.7 . Kết quả thử nghiệm LDH sau 48 giờ nuôi cấy................................................3
Bảng 3.8 . Kết quả thử nghiệm LDH sau 72 giờ nuôi cấy................................................5
Bảng 3.9 . Kết quả của mơ hình ADN phân mảnh sau 48 giờ nuôi cấy PBMCs............. 7
Bảng 3.10 . Kết quả của mơ hình ADN phân mảnh sau 72 giờ nuôi cấy tế bào.............. 8
Bảng 3.11 . Kết quả định lượng IL-1β của các mẫu tế bào nuôi cấy sau 48 giờ........... 11
Bảng 3.12 . Sự thay đổi tỉ lệ tế bào lympho T CD3+4+ và T CD3+8+ sau 24 giờ........13

.


.

vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 . Ngun tắc định lượng LDH.......................................................................... 13
Hình 1.2 . Cây Sài đất Việt Nam (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr., Asteraceae)..... 15
Hình 2.1 . Sơ đồ chiết cao phân đoạn..............................................................................26
Hình 3.1 . Tác động của các cao chiết lên tỉ lệ sống của PBMCs sau 24 giờ.................40

Hình 3.2 . Tác động của các cao chiết lên tỉ lệ sống của PBMCs sau 48 giờ.................42
Hình 3.3 . Tác động của các cao chiết lên tỉ lệ sống của PBMCs sau 72 giờ...................2
Hình 3.4 . Tỉ lệ TB hoại tử do cao chiết sau 48 giờ ......................................................... 3
Hình 3.5 . Tỉ lệ TB hoại tử do cao chiết sau 72 giờ.......................................................... 5
Hình 3.6 . Tác động của các cao chiết lên tỉ lệ ADN phân mảnh của PBMCs sau 48 giờ7
Hình 3.7 . Tác động của các cao chiết lên tỉ lệ ADN phân mảnh của PBMCs sau 72 giờ9
Hình 3.8 Đường tuyến tính của IL-1β chuẩn................................................................. 12

.


.

vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Từ nguyên

Từ tiếng Việt

ALP

Alkaline phosphatase

Phosphatase kiềm

ALT

Alanin amino transferase

APC

Antigen presenting cell

ATP

Adenosine triphosphate

AST

Aspartate amino transferase

CD

Cluster of differentiation

CF

Chloroform

COX

Cyclooxygenase

CXCL

CXC-type chemokin ligand

DMSO

Dimethyl sulfoxyd

DPPH

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

DTH

Delayed-type hypersensitivity

DWL

Demethylwedelolacton

EA

Ethylacetate

ELISA

Enzym-linked immunosorbent
assay

Xét nghiệm miễn dịch gắn men

FBS

Fetal bovine serum

Huyết thanh thai bò

FITC

Fluorescein isothiocyanat

Isothiocyant phát huỳnh quang

He

n-hexan

IL

Interleukin

.

Tế bào trình diện kháng ngun

Nhóm biệt hóa

Phối tử chemokin tp CXC

Quá mẫn chậm


.

viii

INF

Interferon

iNOS

Inducible nitric oxid synthase

INT

Iodonitrotetrazolium

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromide

NAD(P)H

Nicotinamide adenin
dinucleotide (phosphate)
hydrogen

NK

Natural killer

NO

Nitric oxid

PBMCs

Perpheral blood mononuclear
cell

Tế bào đơn nhân máu ngoại vi

PBS

Phosphate-buffer saline

Đệm muối phosphat

PGE2

Prostaglandin E2

PHA

Phytohaemagglutinin

RPMI

Roswell Park Memorial Institute

SD

Standard deviaion

TB

Tế bào

TNF

Tumor necrosis factor

TP

Toàn phần

WL

Wedelolacton

WST

Water-solube tetrazolium salt

.

Men tổng hợp NO được cảm ứng

Tế bào giết tự nhiên

Độ lệch chuẩn

Yếu tố hoại tử khối u

Muối tetrazolium tan trong nước


.

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Rối loạn hệ miễn dịch có thể gây ra các bệnh lý. Những sai lệch trong quá trình nhận
diện kháng nguyên bản thân có thể dẫn đến các bệnh tự miễn như viêm khớp dạng thấp,
lupus, vảy nến. Khi hệ miễn dịch bị giảm sút hoặc thiếu hụt một số thành phần, sức đề
kháng của cơ thể giảm sút, do đó cơ thể dễ bị các tác nhân gây bệnh tấn công như vi
khuẩn, virus, nấm và dẫn đến các bệnh lý nhiễm trùng, ung thư, v.v. Ngược lại, đáp
ứng miễn dịch quá mức về cường độ, vị trí hoặc thời gian gây nên hiện tượng quá mẫn
cảm, đôi khi dẫn đến tử vong [2], [6]. Trong dân gian, đã có rất nhiều bài thuốc sử
dụng các nguồn dược liệu tự nhiên để điều trị những bệnh lý liên quan đến rối loạn hệ
miễn dịch. Khi so sánh với thuốc tân dược, các bài thuốc có nguồn gốc dược liệu mang
lại hiệu quả điều trị tốt và hạn chế đáng kể các tác dụng phụ. Vì vậy, việc nghiên cứu
thành phần hóa học và các tác dụng dược lý của các dược liệu là một hướng nghiên
cứu mới đầy tiềm năng cho nền y học hiện đại.
Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr., Asteraceae) được sử dụng rộng rãi trong y
học cổ truyền với các công dụng bảo vệ gan, trị ho, tiêu chảy, vàng da, và trị một số
bệnh ngoài da. Các nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy Sài đất có tính
chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng viêm, kháng khuẩn, ức chế tế bào ung thư và điều
hòa miễn dịch [3], [4], [15], [21], [34], [59], [62]. Tuy nhiên, nghiên cứu về tác động
của cây Sài đất trên hệ miễn dịch và các tế bào miễn dịch vẫn cịn khá hạn chế.
Nhằm góp phần làm hiểu rõ hơn tác động trên hệ miễn dịch của cây Sài đất, chúng tôi
thực hiện đề tài “Khảo sát hoạt tính độc tế bào in vitro của cao chiết toàn phần từ cây
Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.) trên tế bào đơn nhân được chiết từ máu

ngoại vi người”, là phân đoạn giàu các tế bào lympho có vai trò quan trọng trong hệ
miễn dịch, với các mục tiêu sau:

.


.

2

- Khảo sát tác động của cao chiết toàn phần và các cao phân đoạn từ cây Sài đất lên độ
sống của tế bào đơn nhân người (PBMCs) trên mô hình in vitro
- Khảo sát một số cơ chế gây độc tế bào của cao chiết từ cây Sài đất
- Khảo sát tác động của cao chiết từ cây Sài đất lên sự thay đổi thành phần CD3, CD4,
CD8 trong quần thể tế bào lympho T và sự sản xuất Interleukin - 1β của PBMCs.

.


.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TẾ BÀO ĐƠN NHÂN CHIẾT TỪ MÁU NGOẠI VI (PBMCS)
1.1.1. Thành phần
PBMCs bao gồm các tế bào máu có một nhân trịn: lympho T, lympho B, tế bào giết tự
nhiên (tế bào NK), đại thực bào, tế bào tua, trong đó các tế bào lympho chiếm tỷ lệ cao
nhất [27], [42], [64].

1.1.2. Vai trò của tế bào PBMCs đối với hệ miễn dịch
Các tế bào PBMCs đóng vai trị quan trọng trong cả miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch
thể [2], [6].

1.1.2.1. Vai trò của tế bào lympho T
Quần thể tế bào lympho T gồm có tế bào T giúp đỡ (T helper - Th) với protein màng
CD4+ và tế bào T độc (T cytotoxic - Tc) với protein màng CD8+. Tế bào Th kích thích
sự tăng trưởng và biệt hóa của lympho B bằng cách sản xuất các cytokin (IL-4, IL-6),
trong khi tế bào Tc có vai trị gây độc và loại trừ các tế bào nhiễm virus, các tế bào u.
Ngoài ra, trong quần thể tế bào lympho T cịn có các tế bào T ức chế (T suppressor –
Ts) có chức năng điều hịa, kiểm sốt q trình miễn dịch của cơ thể và tế bào T gây
quá mẫn chậm (TDTH) [2], [6].
a. Chức năng điều hòa và chi phối của tế bào Th:
Th chi phối toàn bộ các hoạt động hiệu ứng, tức là hoạt động của các tế bào miễn dịch,
bao gồm sự sản xuất kháng thể của tế bào lympho B và vai trò gây độc của tế bào Tc.
Th có thể tiết ra các cytokin giúp cho sự sinh sản đủ mức của các tế bào hiệu ứng, giúp
chúng hoạt hóa đủ mức để loại trừ kháng nguyên [2], [6].
Có 2 phân nhóm trong tế bào Th: tế bào Th1 và tế bào Th2. Các tế bào Th1 sản xuất
các cytokin: TNF-α, INF-γ, IL-2, đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch tế

.


.

4

bào, trong khi các tế bào Th2 sản xuất các cytokin: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 đóng
vai trị quan trọng trong đáp ứng miễn dịch dịch thể [2], [6].
b. Chức năng kiểm sốt của tế bào Ts:

Ts là phân nhóm của lympho T, có CD8+ trong đa số trường hợp, là phân nhóm có
chức năng ức chế q trình miễn dịch. Ts ức chế các phản ứng loại trừ kháng nguyên
do tế bào Th phát động nếu phản ứng này diễn ra q mức. Ngồi ra, Ts cịn có chức
năng kìm hãm suốt đời các tế bào Th “tự phản ứng”, tức là những tế bào Th có tiềm
năng chống lại những kháng nguyên của chính cơ thể. Nhờ cơ chế điều hịa này mà cơ
thể khơng mắc các bệnh tự miễn [2].
c. Chức năng loại trừ kháng nguyên của tế bào Tc:
Tế bào Tc chống lại những tế bào mang kháng nguyên nội sinh, tức là kháng nguyên
được hình thành từ trong nội bào, như tế bào nhiễm virus, tế bào ung thư, tế bào ghép
dị gen. Sự hoạt hóa tế bào Tc dẫn đến sự tiết ra các độc tố, gây hủy hoại các tế bào
xung quanh. Tc có khả năng tạo ra tế bào trí nhớ nên nhiều bệnh được miễn dịch suốt
đời như đậu mùa, sởi, thủy đậu [2].
d. Chức năng của tế bào T gây quá mẫn chậm (TDTH)
Các tế bào TDTH mang dấu ấn CD4+ trên bề mặt tế bào, có vai trị trong việc tạo ra một
ổ viêm nhằm khu trú kháng nguyên lại và loại trừ kháng nguyên tại chỗ. TDTH được
hoạt hóa bởi IL-2 do tế bào Th và đại thực bào tiết ra. Sau khi được hoạt hóa, các tế
bào TDTH tập trung vào nơi có kháng nguyên, sinh sản để đạt nồng cộ cao tại khu vực
mà kháng nguyên khu trú. Các tế bào TDTH tiết ra các cytokin tác động lên quá trình
miễn dịch, bao gồm yếu tố hoạt hóa đại thực bào (MAF), có tác dụng kích thích đại
thực bào tiết ra các cytokin gây viêm (IL-6, TNF), và yếu tố ức chế đại thực bào (MIF),
có tác dụng ức chế đại thực bào di chuyển ra khỏi ổ viêm. Ổ viêm do các tế bào TDTH
gây ra nên xảy ra chậm (hình thành sau 48 – 72 giờ) và tập trung dày đặc các tế bào

.


.

5

lympho và đại thực bào. Đây là cách rất hiệu quả để cơ thể loại trừ các kháng nguyên
vi khuẩn (lao, phong, nấm) và các kháng nguyên hóa chất, thuốc. Khi đáp ứng miễn
dịch tạo ra bởi các tế bào TDTH quá mức cần thiết sẽ gây ra phản ứng quá mẫn tuýp IV
(quá mẫn chậm) [2].

1.1.2.2. Vai trò của tế bào lympho B
Tế bào lympho B với dấu ấn CD19+ trên bề mặt, có vai trị sản xuất kháng thể và chịu
sự chi phối chặt chẽ của tế bào Th. Tế bào Th tự hoạt hóa bởi chính IL-2 do nó tiết ra,
sau đó tiết ra IL-4 giúp kích thích tế bào lympho B phát triển và IL-6 giúp biệt hóa tế
bào lympho B thành tế bào trí nhớ [2], [6].

1.1.2.3. Vai trò của tế bào NK
Tế bào NK là những tế bào lớn, có hạt, trên bề mặt tế bào mang dấu ấn của tế bào
lympho chưa trưởng thành (CD38+). Tế bào NK được hoạt hóa bởi IL-2 (sản xuất bởi
lympho T và đại thực bào), có vai trò tiêu diệt các tế bào ung thư. Các tế bào NK có thể
nhận diện các tế bào “bệnh” mà khơng cần thơng qua tín hiệu của lớp phù hợp mơ, tức
là khơng cần thơng qua trình diện kháng ngun – kháng thể, và khơng cần phải hoạt
hóa để trở thành dạng hoạt động. Do đó các tế bào NK tạo đáp ứng miễn dịch nhanh,
đóng vai trị quan trọng trong miễn dịch tự nhiên của cơ thể [2], [46].

1.1.2.4. Vai trị của tế bào tua
Tế bào tua đóng vai trò quan trọng trong miễn dịch tự nhiên của cơ thể để chống lại sự
nhiễm khuẩn. Ngồi ra, chúng cịn có vai trị liên kết giữa miễn dịch tự nhiên và miễn
dịch thu nhận của cơ thể. Các tế bào tua nhận biết kháng nguyên, và biểu lộ các phân
tử kháng nguyên cho tế bào lympho nhận diện. Tế bào tua hoạt hóa tiết ra các cytokin
như IL-4, IL-12, TNF-α và INF-γ, qua đó kích thích đáp ứng miễn dịch tự nhiên, cũng
như đáp ứng miễn dịch dịch thể của cơ thể. Tế bào tua cịn có vai trị trong sự hoạt hóa
tế bào T non, tế bào B non, tế bào B trí nhớ [27].

.

.

6

1.1.3. Cytokin
Cytokin là các protein được tiết ra bởi hầu hết các tế bào có nhân (lympho B, lympho T,
đại thực bào, tế bào NK). Một tế bào có thể tiết ra nhiều loại cytokin và một loại
cytokin có thể được tiết bởi nhiều loại tế bào. Các cytokin có thể tác động trên chính tế
bào tiết ra nó (autocrine), tác động trên các tế bào lân cận xung quanh (paracrine) hoặc
theo máu đến tác động lên các tế bào đích ở xa (telecrine). Một cytokin có thể tác động
lên nhiều loại tế bào khác nhau, gây nên nhiều hoạt tính sinh học khác nhau trên tế bào
đích. Mặt khác, nhiều cytokin khác nhau có thể gây ra những tác động sinh học tương
tự nhau cho cùng một loại tế bào đích. Một số cytokin có tác động hiệp đồng với nhau,
như IL-4 và IL-5 hiệp đồng hoạt hóa tế bào B tiết kháng thể IgE. Ngược lại, một số
cytokin lại có tác động đối kháng nhau, như INF-γ ức chế IL-4 trong hoạt động tiết
kháng thể IgE của tế bào lympho B [2], [6].
Các cytokin tồn tại trong máu trong một thời gian ngắn và ở một nồng độ rất thấp. Tuy
nhiên, ở nồng độ 10-15 M các cytokin đã có tác dụng sinh học như tác động trên các tế
bào, điều hịa thụ thể cytokin, kích thích tế bào tiết cytokin khác,…Các cytokin đóng
vai trị quan trọng trong quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ thể, biểu hiện qua số lượng
và chức năng của các cytokin tham gia điều hịa q trình miễn dịch và điều hịa sự
tương tác giữa các tế bào miễn dịch [2].
Một số cytokin có vai trị trong q trình miễn dịch của cơ thể được trình bày trong
Bảng 1.1 [2], [6].

.

.

7

Bảng 1.1. Vai trị của cytokin trong q trình miễn dịch của cơ thể
Cytokin

Nguồn gốc

Tế bào đích

Tác động

IL-1

Đơn nhân thực Tế bào Th
Kích thích tế bào Th tiết IL-2
bào
Tế bào lympho B
Kích thích tế bào lympho B tăng sinh,
hoạt hóa, biệt hóa, sản xuất kháng thể
Tế bào NK
Bạch cầu trung tính Hoạt hóa tế bào NK, hoạt hóa và hóa
hướng động bạch cầu trung tính

IL-2

Tế bào Th1 đã Hầu hết các tế bào Kích thích hầu hết các tế bào miễn dịch
được hoạt hóa
miễn dịch

tăng sinh và phát triển, bao gồm tế bào
lympho T, tế bào lympho B, đại thực
Tế bào Tc
bào, tế bào NK,…
Tế bào NK

IL-4

Tế bào Th2
Tế bào mast

Tế bào lympho T
Tế bào lympho B
Đại thực bào

Kích thích tế bào lympho T tăng trưởng
Kích thích, hoạt hóa và tăng biểu lộ
phức hợp phù hợp mô lớp II của tế bào
lympho B
Tăng biểu lộ phức hợp phù hợp mô lớp I
và II của đại thực bào

IL-6

Tế bào Th2

Tế bào lympho B

Tăng sinh, biệt hóa tế bào lympho B sản
xuất kháng thể

IL-10

Tế bào Th2
Tế bào T CD8+
Tế bào lympho B

Tế bào Th1
Tế bào NK
Đơn nhân thực bào
Tế bào lympho B
Tế bào mast

Ức chế tế bào Th1, tế bào NK, đơn nhân
thực bào tiết cytokin
Kích thích tế bào lympho B tăng sinh và
sản xuất kháng thể
Tăng trưởng tế bào mast

IL-12

Tế bào lympho B Tế bào Tc, Th1, Tăng sinh và tăng hoạt tính tế bào NK
đã hoạt tác
Đơn nhân thực Th2
bào
Tế bào NK
Cảm ứng tế bào Th1, ức chế tế bào Th2

INF

Đại thực bào
Tế bào Th1
Tế bào NK

Đại thực bào
Tế bào NK
Tế bào Tc, TDTH

Ngăn không cho virus thâm nhập vào tế
bào lành
Hoạt hóa đại thực bào, tế bào NK
Tăng chức năng của Tc, TDTH

TNF

Đại thực bào
Tế bào Th1

Tương tự IL-1

Tác dụng tương tự IL-1
Gây độc và hoại tử tế bào u

.


.

8

1.1.4. Vai trò của tế bào PBMCs trong các nghiên cứu in vitro
PBMCs là phân đoạn giàu các tế bào lympho, đóng vai trị là thành phần chủ yếu trong
hệ miễn dịch và được sử dụng rộng rãi trong các thử nghiệm về độc tính.
- Thử nghiệm độc tính: các chất độc ảnh hưởng đến PBMCs có thể gây nên các các
dụng phụ nghiêm trọng khi sử dụng, bao gồm sự suy giảm và rối loạn chức năng hệ
miễn dịch.
- So sánh: một vài thử nghiệm sử dụng PBMCs từ người khỏe mạnh và PBMCs từ
bệnh nhân có các bệnh lý để so sánh tác động của thuốc lên hệ miễn dịch của người
khỏe mạnh và người có bệnh lý [42], [64].

1.2. CHU KỲ TẾ BÀO VÀ CÁC ĐIỂM KIỂM SỐT TRONG CHU
TRÌNH TẾ BÀO
Chu kỳ tế bào bao gồm 4 pha:
- Pha G1: pha sinh trưởng
- Pha S: giai đoạn tổng hợp và nhân đôi ADN
- Pha G2: tổng hợp các chất cần thiết cho quá trình phân bào
- Pha M: pha phân bào, kết quả tạo ra hai tế bào giống nhau và giống tế bào mẹ [29],
[65].
Những tế bào bị hư hỏng hoặc lỗi có thể thốt khỏi chu kỳ tế bào, bị bắt giữ thuận
nghịch (reversible) hoặc vĩnh viễn (permanent) để sửa chữa. Sự bất thường trong chuỗi
ADN được cảm nhận bởi một số protein như p53, các kinase phụ thuộc cyclin (cyclindependent kinase - CDK), các kinase kiểm soát (checkpoint kinase - CHK) các yếu tố
phiên mã họ E2F, aurora kinase, v.v, tại các điểm kiểm soát ở cuối mỗi pha. Những tế
bào lỗi được giữ lại ở cuối pha G1 (bởi tác động của CHK1 và protein p53), hoặc được
giữ lại trong pha S hoặc pha G2 (bởi tác động của CHK2) để sửa chữa. Sau khi được

.


.

9

sửa chữa, tế bào có thể bước vào các giai đoạn tiếp theo của chu kỳ tế bào. Nếu sự hư
hỏng là nghiêm trọng, không thể sửa chữa được, tế bào sẽ được loại bỏ theo con đường
chết theo chương trình (apoptosis) [40], [41], [63], [65].
Một số thay đổi về hình thái khi tế bào bị apoptosis tương tự như hình thái tế bào ở giai
đoạn phân bào, bao gồm cơ đặc chromatin, tế bào co rút về kích thước. Quá trình phân
bào và apoptosis của tế bào đều mất khoảng 30-60 phút để hoàn thành. Tuy nhiên, đối
với tế bào apoptosis, ADN bị phân rã thành các đoạn có kích thước < 200 bp, màng tế
bào co rút và tế bào bị phân rã thành các mảnh nhỏ. Những mảnh nhỏ này sau đó bị
thực bào bởi các tế bào kế cận hoặc đại thực bào. Trong khi đó, tế bào phân bào tạo ra
2 tế bào con giống nhau và giống tế bào mẹ [20], [40], [65].
Protein p53 có vai trị quan trọng trong việc hạn chế sự tăng sinh của các tế bào có bộ
gen bị hỏng bằng cách bắt giữ tế bào lỗi ở cuối pha G1 để sửa chữa sai sót trong chuỗi
ADN. Nếu khơng thể sửa chữa các ADN bị hỏng, những tế bào lỗi này sẽ bị loại bỏ
bằng con đường apoptosis. Các tế bào của khối u thường thoát khỏi sự điều hịa của
protein p53, do đó chúng khơng bị apoptosis dưới tác động của các tác nhân vật lí và
hóa học như các thuốc điều trị ung thư và phóng xạ. Các tế bào này, với các chuỗi
ADN hỏng, vẫn bước vào pha S và thực hiện tiếp chu trình tế bào. Điều này tiềm ẩn
nguy cơ tạo khối u ác tính, tăng sinh khơng giới hạn và dẫn đến ung thư. Tác động của
protein p53 phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm loại tế bào, điều kiện môi trường,
trạng thái của các cytokin và mơ hình thí nghiệm. Mặc dù cơ chế về tác động của
protein p53 trên quá trình apoptosis của tế bào vẫn chưa rõ ràng, một số nghiên cứu đã
cho thấy nồng độ protein p53 tăng tỉ lệ thuận với sự gia tăng ADN bị hỏng [25], [41],
[63], [65].
Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) là một protein đóng vai trị quan trọng trong q trình
apoptosis của tế bào. Bcl-2 ức chế sự phóng thích Ca2+ từ ti thể và lưới nội chất. Ca2+ là
ion cần thiết cho hoạt động của các enzym phá hủy tế bào, bao gồm protease và

.

.

10

nuclease. Do đó, sự tăng biểu hiện của bcl-2 làm ức chế quá trình apoptosis của tế bào
[40], [41].
Khác với apoptosis, quá trình hoại tử của tế bào (necrosis) là q trình khơng phụ
thuộc ATP. Các tế bào hoại tử mất tính thấm chọn lọc của màng tế bào, do đó tế bào
phồng lên và bị vỡ, phóng thích các thành phần nội bào vào môi trường. Sự hoại tử của
tế bào dẫn đến việc thúc đẩy phản ứng viêm và các quá trình miễn dịch. Trái lại, các tế
bào apoptosis khơng phóng thích các thành phần nội bào ra mơi trường. Vì thế, q
trình apoptosis hầu như khơng gây phản ứng viêm. Tuy nhiên, sự hoại tử có thể xảy ra
ở cả các tế bào apoptosis [20], [22], [40], [65].
Một trong những dấu hiệu của tế bào chết theo chương trình là sự hoạt hóa enzym
caspase, một protease chứa cystein. Caspase-9 có liên quan đến những thay đổi về hình
thái của ti thể, trong khi caspase-3 ức chế sự tạo thành ROS [16]. Tuy vậy, một số tế
bào chết theo chương trình mà khơng phụ thuộc vào sự hoạt hóa của caspase. Các
nghiên cứu cho rằng các tế bào này chết theo con đường tự thực (autophagy). Ở những
tế bào này, tế bào chất và các bào quan được bao bọc, sau đó được vận chuyển đến
khơng bào và lysosom để thối hóa. Khác với tế bào apoptosis, các tế bào tự thực
không bị thực bào bởi đại thực bào hoặc các tế bào kế cận [20].
Như vậy, các tế bào có thể chết theo nhiều con đường khác nhau: tự thực, hoại tử, chết
theo chương trình. Việc đo lường các yếu tố liên quan giúp xác định mức độ tổn
thương và đánh giá sự chết của tế bào. Một số mơ hình đánh giá số lượng tế bào sống
thông qua đo lường hoạt động của các enzym dehydrogenase trong ti thể như mơ hình
MTT, hoặc thơng qua sự hô hấp tế bào. Mức độ gây độc tế bào được đánh giá thông
qua việc nghiên cứu sự tổng hợp protein, cấu trúc ADN, sự giảm tính thấm chọn lọc
của màng tế bào và màng ti thể,… Sự hiện diện của lactat dehydrogenase (LDH) trong

môi trường là một chỉ dấu cho quá trình hoại tử của tế bào, trong khi sự tăng tỉ lệ ADN
phân mảnh là một dấu hiệu cho thấy quá trình apoptosis của tế bào được cảm ứng [20].

.


.

11

1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH TRÊN TẾ BÀO
Các phương pháp đánh giá độc tính tế bào dựa trên việc đánh giá các chức năng tế bào,
bao gồm: tính nguyên vẹn của màng tế bào, tính thấm của màng tế bào, sự nguyên vẹn
của ADN, hoạt động của các enzym, sự sản xuất ATP, sự sản xuất các co-enzym và
hoạt động thu hồi các nucleotid [10], [20], [68].

1.3.1. Đánh giá độc tính trên tế bào bằng các phương pháp đo quang
1.3.1.1. Nguyên tắc
Nguyên tắc của việc đánh giá độc tính tế bào bằng các phương pháp đo quang dựa trên
đo độ hấp thu của một chất chỉ dấu sinh học nhằm đánh giá hoạt động chuyển hóa của
tế bào. Một số thuốc thử thường dùng như MTT, reasuzin, MTS, XTT, WST [10], [44],
[68].

1.3.1.2. Ưu điểm và nhược điểm
Ưu điểm: nhanh, an toàn, thao tác đơn giản, độ lặp lại cao
Nhược điểm: Các hóa chất, thuốc thử dùng trong thử nghiệm có thể gây độc tính với tế
bào. Ngồi ra, kết quả đo có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác như thời gian ủ, số
lượng tế bào trong mỗi giếng, pH môi trường, nồng độ các ion trong mơi trường ni
cấy [10].

1.3.2. Đánh giá độc tính trên tế bào bằng phương pháp đo huỳnh quang
1.3.2.1. Nguyên tắc
Các thuốc thử (alamar blue, 5-carboxyfluorescein diacetate) là những chất có thể thấm
qua màng tế bào và khơng phát huỳnh quang. Những tế bào sống có khả năng chuyển
hóa những thuốc thử này thành những sản phẩm có huỳnh quang. Cường độ phát
huỳnh quang tỷ lệ thuận với tỷ lệ tế bào sống [10], [44], [68].

.


.

12

1.3.2.2. Ưu điểm và nhược điểm
Ưu điểm: độ nhạy cao hơn phương pháp nhuộm màu và phương pháp đo quang, thao
tác đơn giản, chi phí khơng q cao.
Nhược điểm: kết quả đo có thể bị ảnh hưởng bởi các hóa chất, thuốc thử dùng trong
thử nghiệm [10].

1.3.3. Đánh giá quá trình necrosis của tế bào
Các tế bào necrosis có màng tế bào bị tổn thương và phóng thích các thành phần nội
bào vào môi trường. Sự tổn thương của màng tế bào có thể được đánh giá thơng qua
các phương pháp nhuộm màu hoặc định lượng các enzym nội bào trong môi trường
[20].

1.3.3.1. Đánh giá sự tổn thương màng tế bào bằng các phương pháp nhuộm màu
a. Nguyên tắc
Xác định tỷ lệ tế bào sống/ chết thông qua đánh giá tính tồn vẹn của màng tế bào:
những tế bào sống (màng tế bào nguyên vẹn) không bắt màu thuốc nhuộm, do đó

khơng màu, trong khi những tế bào chết (màng tế bào mất tính thấm chọn lọc hoặc
khơng cịn ngun vẹn) bắt màu thuốc nhuộm và có màu. Một số thuốc nhuộm thường
dùng như trypan blue, eosin, đỏ Congo, erythrosin B [10].
b. Ưu điểm và nhược điểm
Ưu điểm: nhanh, thao tác đơn giản, số lượng tế bào dùng trong thử nghiệm nhỏ, tiết
kiệm chi phí.
Nhược điểm: khơng phân biệt được tế bào sống và tế bào bị mất chức năng, thao tác
đếm bằng buồng đếm dễ gây sai số [10].

.