ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN GIỐNG LÚA CÓ KHA NĂNG CHỊU HẠN BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN GIỐNG LÚA CÓ KHA
NĂNG CHỊU HẠN BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR

Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thị Nhài, Nguyễn Thị Thanh Thuy
Viện Di truyền Nông nghiệp
MỞ ĐẦU
Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực có khả năng
chịu hạn kém và khá nhạy cảm với môi trường bên ngoài. Tính trạng chịu hạn là
mợt tính trạng đa gen phức tạp, những nghiên cứu về sinh lý học đã chỉ ra rằng
tính chịu hạn của lúa phụ tḥc vào các yếu tố sau: thứ nhất, khả năng đâm xuyên
của rễ tìm nước dưới tầng đất sâu phục vụ nhu cầu nước của cây khi lớp nước
trên bề mặt bị bốc hơi; thứ hai, khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào
lá giúp cây duy trì được sức căng bề mặt bảo vệ cho mô phân sinh khỏi bị mất
nước; thứ ba, cơ chế điều khiển thoát hơi nước ở khí khổng (Nguyen & cs.,
2000). Hiện nay, các nhà khoa học cho rằng có khoảng 200 gen tham gia vào cơ
chế kháng hạn ở cây nhưng các gen này không quy tụ vào một giống cố định.
Kết quả nghiên cứu sơ bộ trên một số giống lúa cho thấy nước ta có nguồn
gen chịu hạn phong phú từ các giống lúa địa phương. Tuy nhiên, chưa có nhiều
những phân tích, đánh giá đặc tính chịu hạn của các giống lúa bản địa theo hướng
nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này
chúng tơi đã phân tích đa dạng di truyền tập đoàn 39 giống lúa địa phương Việt
Nam có khả năng chịu hạn bằng chỉ thị phân tử SSR, với mục đích đưa ra nguồn
thơng tin hữu ích cho những nghiên cứu về tạo lập cơ sở dữ liệu cho nguồn gen
bản địa Việt Nam.

1


I. TỔNG QUAN VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CÂY LÚA
1.1. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền có vai trị quan trọng trong cơng nghệ sinh học nông

nghiệp. Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể
quy hoạch và bảo tồn các nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗ
trợ xác định gen mục tiêu hoặc quá trình lai - chọn tạo giống thông qua lựa chọn
các cặp bố mẹ trong phép lai. Trên nhiều đối tượng thực vật, nghiên cứu đa dạng
di truyền đã được thực hiện từ khá lâu với nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau,
mỗi phương pháp cung cấp cho người sử dụng các loại thông tin khác nhau. Việc
lựa chọn phương pháp đánh giá phụ thuộc vào mục đích của người nghiên cứu.
1.1.1. Chỉ thị hình thái
Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị hình thái là phương pháp đánh
giá thơng qua các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bợ
phận). Với ưu điểm là dễ dàng tiếp cận, khơng địi hỏi các thiết bị đắt tiền cũng
như quy trình phức tạp. Hiện nay phương pháp này vẫn được sử dụng phổ biến
trên cây trồng để giúp các nhà nghiên cứu phân biệt các giống khác nhau bằng
mắt thường. Tuy nhiên, việc sử dụng chỉ thị hình thái trong phân tích đa dạng di
truyền có những hạn chế: Thứ nhất, số lượng các chỉ tiêu hình thái có hạn, chỉ thị
hình thái chịu tác động của môi trường và phụ thuộc vào giai đoạn nhất định của
quá trình phát triển; hạn chế thứ hai, việc đánh giá mang tính chất thơng kê nên
cần thực hiện với số lượng lớn để đảm bảo tính chính xác; thứ ba, có nhiều tính
trạng do đa gen quy định mà không phải toàn bộ gen đều biểu hiện ra kiểu hình
mà có thể đánh giá được. Vì thế, các nhà chọn giống thường kết hợp sử dụng các
chỉ tiêu hình thái với việc xác định bằng chỉ thị sinh hoá và chỉ thị phân tử ADN
để đạt được kết quả chính xác nhất.
1.1.2. Chỉ thị sinh hóa
Chỉ thị sinh hoá là loại chỉ thị có bản chất là đa hình protein, bao gồm chỉ thị
isozyme và các loại protein dự trữ.

2


Các protein khác nhau có khối lượng phân tử và điểm đẳng điện khác nhau,

vì vậy chúng có thể di chuyển với tốc đợ khác nhau trong quá trình điện di tạo
thành những đặc điểm đặc trưng trên gel điện di và có thể hiện thị bằng phương
pháp nhuộm. Cơ chế này được điều khiển bởi vật chất di truyền là ADN, thơng
qua dịng thơng tin di truyền từ ADN  ARN  Protein.
Chỉ thị protein và chỉ thị enzyme thuộc loại đồng trội có độ tin cậy cao đồng
thời có thể phát hiện ra các biến dạng khác nhau của protein. Tuy nhiên, do số
lượng không nhiều và sự biểu hiện chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và
phát triển của cá thể, nên các chỉ thị protein và isozyme được ứng dụng tương đối
hạn chế.
1.1.3. Chỉ thị phân tử ADN
Các chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình ADN.
Nó được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài
hoặc giữa các loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài, dùng để
lựa chọn tổ hợp lai.
Chỉ thị phân tử ADN có thể là một gen hoặc những đoạn ADN đặc hiệu, có
tính ổn định cao và có thể xác định trong tất cả các loại mơ với đợ chính xác cao
mà không bị ảnh hưởng bởi điều kiện của môi trường. Chỉ thị phân tử được chia
làm hai nhóm chính:
• Chỉ thị dựa trên cơ sở ngun lý lai ADN: chỉ thị RFLP.
• Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR: RAPD,
AFLP, SSR, ...)
2.1.3.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism- Đa hình
chiều dài đoạn phân cắt giới hạn)
RFLP là một kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai axit nucleic, nguyên lý
của phương pháp: chiều dài ADN của bộ gen sau khi cắt bằng enzyme giới hạn sẽ
thành những đoạn có kích thước khác nhau. Khi điện di những đoạn này sẽ phân
bố ở những vị trí khác nhau trên gel, qua biến tính các đoạn này trở thành sợi đơn
và được chuyển lên màng celulose hoặc nylon. Trong quá trình lai ADN tiếp theo,
3

nếu chúng bổ sung với mẫu dị (là mợt đoạn ADN đã được đánh dấu phóng xạ
hoặc hoá học) thì sẽ cho phản ứng lai. Kết quả của phản ứng lai là chúng ta có thể
xác định được sự đa hình giữa các mẫu ADN khác nhau
Kỹ thuật RFLP đã được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong
nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người (Botstein và cs. 1980)
Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội được sử dụng phổ biến trong tạo giống cây trồng
với nhiều mục đích khác nhau: lập bản đồ di truyền, chọn lọc sớm tính trạng đơn
gen, phân tích đa hình di truyền. Tuy nhiên, hạn chế của kỹ thuật này là tốn nhiều
thời gian, công sức, kỹ thuật phức tạp, độc hại do sử dụng chất phóng xạ và đòi
hỏi ADN chất lượng cao.
2.1.3.2. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình
chiều dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)
Chỉ thị AFLP được phát hiện bởi Zabeau Vos(1993) và được mô tả chi tiết
bởi Vos và cs. (1995). Ưu điểm của kỹ thuật này là có đợ nhạy cao, dễ phát hiện
đa hình trong toàn bộ hệ gen. Kỹ thuật AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định,
đáng tin cậy, có khả năng ứng dụng trong lập bản đồ hệ gen (Thomas và cs. 1995)
và chọn giống (Vos và cs. 1995). Nhược điểm của kỹ thuật AFLP là chỉ thị di
truyền trội do đó không có khả năng phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể
dị hợp tử, kỹ thuật phức tạp, đòi hỏi phải có các phương pháp xử lý số liệu tự
đợng trong quá trình phân tích, giá thành cho nghiên cứu là tương đối cao.
2.1.3.3. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - ADN đa hình
được nhân bội ngẫu nhiên)
Kỹ thuật RAPD cho phép phát hiện đa hình các đoạn ADN được nhân bản
ngẫu nhiên bằng việc sử dùng một mồi đơn chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên.
Vào đầu thập kỷ 90, William và cs.(1990) những người đầu tiên đã thông báo về
việc sử dụng các đoạn mồi đơn dài 10 nucleotide và có trình tự tuỳ ý để phân tích
đa hình của bợ genome thực vật (khoai tây, lúa mì). Ngày nay kỹ thuật RAPD đã
được thống nhất theo phương pháp của William và cs. (1990), sử dụng các đoạn
mồi đơn dài từ 9 - 12 nucleotide, tối thiểu là 4 nucleotide, có trình tự ngẫu nhiên.

4


Ưu điểm của kỹ thuật này là nhanh, giá thành cho mỗi mẫu phân tích thấp,
khơng cần biết những thơng tin ban đầu về trình tự, dễ dàng phân tích cho số
lượng mẫu lớn. Nhược điểm của kỹ thuật là nhạy cảm, phụ tḥc và điều kiện thí
nghiệm, các thiết bị nghiên cứu và giai đoạn nghiên cứu. Mặt khác, RAPD là chỉ
thị trội nên không thể nhận biết được cá thể dị hợp tử, khó nhận biết những đoạn
cùng kích thước từ 2 mẫu ADN khác nhau thực sự có được tạo ra từ cùng 1 vị trí
trên hệ gen.
2.3.1.3. Chỉ thị Microsatellite (SSR - Simple Sequence Repeats - sự lặp lại của
một trật tự đơn giản).
Trong cơ thể thực vật, hiện tượng lặp lại của một trật nucleotide đơn giản là
khá phổ biến. Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị
lặp lại có thể ít hay nhiều và số lần lặp có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngàn
lần. Phương thức lặp lại rất phong phú, được chia ra làm 3 kiểu lặp lại sau:
• Lặp lại hoàn toàn (các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau).
• Lặp lại không hoàn toàn (xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là mợt hoặc mợt số
nucleotide khác).
• Lặp lại phức tạp (có sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau).
Chỉ thị SSR có ưu điểm so với các chỉ thị ADN khác:
- Tính đặc hiệu cao: các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình tự
sườn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp SSR, do đó sản phẩm nhân gen của
phản ứng SSR - PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị ADN ngẫu nhiên
- Di truyền đồng trội và mức đợ đa hình cao: Trải qua tiến hóa và các biến
đổi di truyền, số lần lặp lại các motip SSR thay đổi rất nhiều và làm cho các đoạn
SSR có chiều dài khác nhau. Do đó phản ứng SSR - PCR có thể phát hiện các
allene khác nhau trong cùng một locus SSR, qua đó phát hiện được các cá thể
đồng hợp tử/dị hợp tử của locus đó.
Nhược điểm cơ bản của việc sử dụng chỉ thị này là: tốn công sức, giá thành

cao trong việc xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình bao gồm

5


việc tách dịng và đọc trình tự mợt số lượng lớn các đoạn ADN trong hệ gen chứa
SSR, mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài.
2.1.3.4.Một số loại chỉ thị ADN khác.
Phân tử ADN không chỉ khác nhau về trình tự mà cịn khác nhau về hình
dạng khơng gian khi ADN ở trạng thái sợi xoắn kép. Hai trình tự ADN chỉ cần có
mợt vị trí nucleotide khác nhau cũng có thể mang hình dạng khác nhau. Bằng
phương pháp điện di có thể phát hiện được sự đa hình (về hình dạng) giữa các
đoạn ADN này (chỉ thị CS.GE- Conformation Sensitive Gel Electrophoresis).
Cùng với những thành tựu của công nghệ sinh học, nhiều loại chỉ thị mới đã
được phát triển và ứng dụng, làm phong phú hơn những công cụ sử dụng trong
nghiên cứu đa dạng di truyền. Với mục tiêu làm sáng tỏ hơn bản chất phân tử
trong các nghiên cứu, các chỉ thị mới đi sâu vào phân tích trình tự ADN của các
gen cụ thể (chỉ thị STS, EST và ADN microarray…) giúp nghiên cứu đa dạng di
truyền chính xác và chi tiết hơn. Tuy nhiên, những chỉ thị này yêu cầu kỹ thuật và
chi phí cao hơn so với các loại chỉ thị ADN “thế hệ cũ” (RAPD, SSR, …). Đây
được xem là điểm cơ bản hạn chế sự phổ biến của những chỉ thị này trong nghiên
cứu đa dạng di truyền.
1.2. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa
1.2.1. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa trên thế giới
Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học cùng với sự ra đời của nhiều
loại chỉ thị chỉ thị cũng như số lượng của mỗi loại chỉ thị đã làm tăng hiệu quả
trong quá trình đánh giá, bảo tồn, khai thác và sử dụng trong với mục đích khác
nhau. Chỉ thị ADN được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu di truyền thực vật
mà phân tích đa dạng di truyền, xác định các locus kiểm soát các tính trạng, hay
chọn giống phân tử là các lĩnh vực được triển khai hiệu quả.

Tác giả Virk và cs.(1995) tiến hành nghiên cứu 12 giống lúa trồng ở châu Á
đại diện cho các vùng sinh thái, địa lý khác nhau bằng chỉ thị RAPD. Kết quả cho
thấy 18 trong số 24 mồi cho 83 băng, trong đó có 48 băng đa hình. Số lượng băng
đa hình xuất hiện từ 1- 5 băng/mồi, các băng nằm trong khoảng 300 - 2700bp.
6


Tác giả Xu (2004) sử dụng 113 chỉ thị RFLP và 60 chỉ thị SSR để định
lượng đa dạng allene của 125 giống lúa thu được từ các bang miền Tây và miền
Nam nước Mỹ và 111 giống từ tập đoàn lúa Quốc tế IRRI. Các tác giả nhận thấy
cơ sở di truyền các giống lúa hiện nay có ở Mỹ hẹp hơn nhiều so với các giống từ
tập đoàn lúa Quốc tế (56% SSR allele so với 96% và 92 RFLP so với 99%). Với
31 trong số 236 giống lúa có số lượng các allele cao (chiếm 95% số allele của
RFLP và 74% số allele của SSR) có thể sử dụng làm tập đoàn hạt nhân. Kết quả
cho thấy, chỉ thị SSR sử dụng hữu hiệu hơn RFLP cả về khả năng phát hiện các
allele lẫn chi phí và kỹ thuật.
Tác giả Victoria và cs (2007) tiến hành nghiên cứu đa dạng trên 24 giống lúa
ở Philippin có chất lượng tốt bằng 164 chỉ thị SSR. Trong số 164 chỉ thị SSR có
151 chỉ thị cho đa hình với tổng số allele thu được là 890, trung bình 5,89
allele/locus. Trong đó, có 89 chỉ thị cho 147 allele hiếm. Hệ số đa dạng di truyền
PIC từ 0,18 - 0,91, đạt trung bình 0,68/chỉ thị. Theo kết quả phân tích UPGMA, ở
độ tương đồng 40%, tổng số 24 giống lúa được chia thành ba nhóm: Nhóm 1 gồm
8 giống Japonica, nhóm 2 và 3 là các giống lúa Indica. Nghiên cứu này cho ta
thấy việc sử dụng chỉ thị SSR là rất hiệu quả trong phân nhóm các loài phụ của
lúa, những giống lúa có chất lượng tốt thì thường có khoảng cách di truyền cao
hơn và vì thế chúng là nguồn vật liệu cho công tác chọn giống.
1.2.2. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa tại Việt Nam
Việt Nam được xem là trung tâm khởi nguyên của cây lúa, tài nguyên di
truyền lúa của nước ta phong phú cả về số lượng và chất lượng. Những nghiên
cứu về đa dạng di truyền và phân loại một cách hệ thống lúa trồng ở Việt Nam

còn hạn chế. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã bắt đầu
quan tâm ứng dụng các kỹ thuật chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng tài nguyên
lúa nước ta.
Tác giả Bùi Chí Bửu (1999) đã sử dụng 20 mồi RAPD để đánh giá đa dạng
di truyền của 72 giống lúa địa phương. Trong 20 mồi thử nghiệm thuộc nhóm
OPA kit, có 10 mồi cho kết quả tốt với 59 băng. Kết quả có hai nhóm chính bao
7


gồm các giống lúa mùa, lúa chiêm ở đồng bằng sông Hồng, lúa nước sâu của
đồng bằng sông Cửu Long, lúa nếp của Tây Nguyên và lúa nước trời của Duyên
Hải Trung bộ.
Tác giả Nguyễn Đức Thành và cs (2001) đã sử dụng 10 mồi RAPD, 50 cặp
mồi SSR, 15 cặp mồi AFLP để nghiên cứu 72 giống lúa nương. Kết quả cho thấy,
các giống lúa nương có đa dạng di truyền cao và là nguồn vật liệu tốt phục vụ
công tác chọn giống.
Tác giả Trần Danh Sửu và cs (2006) sử dụng 48 chỉ thị SSR để đánh giá đa
dạng di truyền của 17 giống lúa Tám. Hệ số đa dạng gen thu được từ các giống
lúa là 0,35. Số allele thu được trung bình 3,37 allele/mồi. 17 giống lúa này còn
được phân loại Indica và Japonica dựa trên sự khác biệt của ADN lục lạp. Kết
quả 17 giống lúa Tám đều thuộc nhóm Japonica.
Tác giả Phạm Thị Bé Tư và cs (2008) đã đánh giá đa dạng của 90 giống lúa
mùa địa phương bằng chỉ thị SSR. Hệ số đa dạng từ 0,68 - 9,95, trung bình là
0,88. Kết quả thu được từ 90 giống lúa mùa địa phương được phân thành 6 nhóm
giống khác nhau.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu:
- Tổng số có 40 giống lúa (Bảng 1), trong đó:
 Có 39 giống lúa địa phương Việt Nam có khả năng chịu hạn tốt được
cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Thực vật và Viện Lúa đồng bằng

sông Cửu Long
 Có 01 giống lúa (IR64) là giống mẫn cảm với khô hạn.
- Có 50 mồi SSR cung cấp bởi hãng IDT, Mỹ, bao phủ trên 12 nhiễm sắc thể
của hệ gen lúa (Bảng 2)

8


Bảng 1: Danh sách các giống lúa địa phương sử dụng trong nghiên cứu
TT

SĐK

Tên giống

Ký hiệu

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39

412
930
1832

1837
2021
2125
2127
2131
2135
2642
3351
3371
7099
3429
3483
3525
6430
3588
4666
3895
3935
3947
3970
4123
4723
4726
4748
4762
4792
4793
4794
4806
4840

4843
5057
5015
5018
5020

Nếp bồ hóng Hải Dương
Lia tón
Khẩu nuột cung
Lúa mộ trắng
Khẩu mèo
B'le tolo
Ble blu
Ble la tong
Ble lenh xi
Ble’ la
Lúa can đỏ
Nếp mậm
Kháu căm pị
Chiêm đỏ
Lúa muối
Ba chơ K'tê
Khẩu kẻn
Tan ngần
IR64
Ble mạ mùa
Mồng lu
Khẩu bò khá
Ble ch cấu
Khẩu lẩy khao

Chăm soóng
Nếp cái cạn
Hang ngụa
Lọ cang
Khẩu mà giàng
Khẩu nón
Khẩu hin
Blào sinh sái
Blào đóng
Blào cô ném
Khẩu cụ
Chạo lựu
Khẩu sán
Khẩu đó đón
Nàng quớt biển
9

H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
H9
H10
H11
H12
H13

H14
H15
H16
H17
H18
H19
H20
H21
H22
H23
H24
H25
H26
H27
H28
H29
H30
H31
H32
H33
H34
H35
H36
H37
H38
H39

Nguồn gốc
Hải Dương
-

QNam ĐNẵng
QNam ĐNẵng
Quảng Trị
Quảng Ngãi
Bình Định
Yên Bái
IRRI
Sơn La
Lai Châu


TT
40

SĐK

Tên giống
Nàng quớt vàng

Ký hiệu
H40

10

Nguồn gốc


Bảng 2: Danh sách mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu
TT

Primer

NST

Repeat Motif

Primer F

Primer R

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

20
21
22
23
24
25

RM13
RM25
RM145
RM152
RM162
RM210
RM237
RM259
RM267
RM314
RM342B
RM495
RM566
RM1103
RM1153
RM1155
RM1233
RM1313
RM1364
RM1367
RM1761
RM2191
RM3288

RM3248
RM3431

5
8
2
8
6
8
1
1
5
6
9
1
9
12
4
4
11
2
7
2
11
11
4
2
6

(GA)6-(GA)16

(GA)18
(GGC)10
(AC)20
(CT)23
(CT)18
(CT)17
(GA)21
(GT)8(CG)3(GT)5
(CAT)12
(CTG)7
(AG)15
(AG)12
(AG)13
(AG)13
(AG)15
(AG)19
(AG)26
(AG)27
(AT)16
(AT)23
(CT)14
(CT)13
(CT)18

TCCAACATGGCAAGAGAGAG
GGAAAGAATGATCTTTTCATGG
CCGGTAGGCGCCCTGCAGTTTC
GAAACCACCACACCTCACCG
GCCAGCAAAACCAGGGATCCGG
TCACATTCGGTGGCATTG

CAAATCCCGACTGCTGTCC
TGGAGTTTGAGAGGAGGG
TGCAGACATAGAGAAGGAAGTG
CTAGCAGGAACTCCTTTCAGG
CCATCCTCCTACTTCAATGAAG
AATCCAAGGTGCAGAGATGG
ACCCAACTACGATCAGCTCG
CAGCTGCTGCTACTACACCG
ACCAACGCCAAAAGCTACTG
AGGGAGTGTGGCAACTATGC
TTCGTTTTCCTTGGTTAGTG
TGTGTCTGAAAACCAAGGGG
AAGAAATTCAAAACACATGA
GTGTGTACGTAGGATCGGAG
ACGCTTAAAGAACATTTGAT
AATAAGGGAGAGCCAATCTG
CTCGTACCGTCAAAAGACC
AGAAGGTTGCTTTCTTGGCC
ATCCAAATCCAATGGTGC

GGTGGCATTCGATTCCAG
CTACCATCAAAACCAATGTTC
CAAGGACCCCATCCTCGGCGTC
CCGTAGACCTTCTTGAAGTAG
CAAGGTCTTGTGCGGCTTGCGG
CGAGGATGGTTGTTCACTTG
TGGGAAGAGAGCACTACAGC
CTTGTTGCATGGTGCCATGT
AGCAACAGCACAACTTGATG
AACATTCCACACACACACGC

ACTA-TGCAGTGGTGTCACCC
CAACGATGACGAACACAACC
CTCCAGGAACACGCTCTTTC
CTACTCCACGTCCATGCATG
TACTCGCCCTGCATGAGC
GGGAGGAGTGAGAAGGGATC
ATTGGCTCCTGAAGAAGG
CGTCCAAGCTGTTCGTTCTC
AAACATCTACTTTGATCCA
TGCTACTCCTAGCTGCTACC
GCGATTAACTTTTAACCATT
TAGTAGATGGCCGTTCTCTC
AATCTGGAGGCACTGTCAC
CTTGCAAGGTCTGTTGCATC
GCGAAAGGGAACATTCTG

26

RM3436

3

(CT)18

GCATCCCGGTGACTAGTACG

TGTGCATGTGGTAAGGAACC

11

Kích thước
(bp)
141
146
151
229
140
130
162
156
118
141
159
239
216
114
148
175
94
158
159
143
237
209
197
161

184

27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50

RM3455
RM3467
RM3468
RM3476
RM3483

RM3515
RM3534
RM5501
RM5586
RM5599
RM5639
RM5766
RM5811
RM6051
RM6314
RM6570
RM6648
RM7003
RM7372
RM7419
RM7654
RM8214
RM25271
RM25319

12
3
1
5
12
2
4
1
4
11

3
11
1
9
4
9
1
12
9
1
11
12
10
10

(CT)20
(CT)21
(CT)21
(CT)22
(CT)22
(CT)28
(GA)12
(TC)27
(TG)30
(AAC)11
(AAG)13
(AGA)9
(AGG)10
(CCG)10
(CTT)11

(GGA)8
(GTC)8
(AAAC)6
(CTTC)6
(GGAA)6
(TTTC)9
(CT)22
(TC)17
(CT)14

TGAATCCACACTCGCAGATC
ATAATGGCAGGGTTGTCTCG
ACTAATTGCATGCAGTCTCC
GATTCTCGTCGTAATCAAGA
CCTAGCTTTCAGGAGCAAG
GGAAAGAAGATATGCCATGC
TTGAGCTTCGTCTACAAGCG
GCGCTTCTACTTCCACAAGG
CTCCATAATCAAGGAAGCTA
CTCACAATATCACCATCCAC
GGAAGAACAGAGTTGCTCGG
ATTGCTGCAAAGTGGGAGAC
GGATTTGGTCGAACAGGTTG
AGGCTGATCCAAGATCCATG
GATTCGTGTCGGTTGTCAAG
CGATCCGCATCTCGAATC
ACAGCAGGTTGATGAGGACC
GGCAGACATACAGCTTATAGGC
GCCCTTGTCTTCTTCACGTC
GAGGAGAAGAATGCTGGCTG

CAAAAGTCTGACCGTTTACC
CCTAGCTTTCAGGAGCAAG
AGACGCTACTCCCACCTGTAACC
AGGGTAGAGTATGTCGGTGTTTCC

12

GCCAGTCCACGATTGGTC
CTCGGTGAGCCTCCTACAAC
GTTAACGGGATCTTGTTCG
ATCCACGGTTAAGATAAATG
CCCACAATGAGAAACAGTTG
AGAGAGAATCAGAAACACCAAC
CAGCTCCCACCATCTCTCTC
GGTTGGCGTACGTAGAGAGG
ATGAGTTCTTTCGTCAGTGT
AATTTTGTGCTGTTGTTGAA
GTGCCATTTATTTCCGTCCC
AAGTGGAGGCAGTTCACCAC
TTCGCGCTCTCCAAGCTC
CCCGGAGGCTGATTCTTG
GGTTCAGGGACGAATTTCAG
CCTCCAAGGTCCTCATCCTC
GATCGATCATGGCCAGAGAG
TGCAAATGAACCCCTCTAGC
CAAAGTCGAGAGTCTGCGTG
AGTGCTCACCGAGTCACTGG
TAAGAGACGGAAGAGTGAGC
CCCACAATGAGAAACAGTTG
ATATCATTGCCGCAACACAAGC

CCGTGGCAGTAGCAGTAGGC

92
123
201
132
174
196
129
135
134
141
123
104
97
136
169
119
207
101
148
146
193
174
185
179


2.2. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp tách chiết ADN: ADN tổng số được tách chiết theo phương

pháp "NaOH extraction" của Wang (1992). Quy trình tách chiết ADN bao gồm
các bước:
 Mẫu lá non được cắt nhỏ vào ống eppendorf 2ml. Thêm 200µl NaOH
0.25N. Nghiền mịn mẫu lá bằng máy nghiền RETSCH Mixer Mill MM
200.
 Thêm 800µl dung dịch Tris 100mM pH7.5, trợn đều.
 Ly tâm 12.000vịng/phút trong 20 phút.
 Chuyển 200µl dung dịch vào ống eppendorf 1.5ml. Lưu giữ ở -200C để làm
dung dịch ADN gốc.
 Pha loãng dung dịch gốc 10 lần, sử dụng 5µl dung dịch ADN pha loãng cho
mỗi phản ứng PCR
- Kỹ thuật PCR:
Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Veriti 96well Thermal cycler. Tổng
dung dịch phản ứng là 15 µl bao gồm 5µl ADN, 0.15µM mồi, 0.2 mM dNTPs,
1X dịch đệm PCR, 2.5mM MgCl 2 và 0.25 đơn vị Taq TaKaRa.
Điều kiện phản ứng PCR như sau: 95 0C - 7 phút; 35 chu kỳ của: 94 0C - 15
giây, 550C - 30 giây, 720C - 1 phút; 720C - 5 phút; giữ mẫu ở 40C. Sản phẩm PCR
được phân giải trên gel agarose 3%.
- Phương pháp điện di trên gel agarose
Theo phương pháp của Khoa Genome thực vật, Trường Đại học công nghệ
Texas, Mỹ (2002) có cải tiến.
Chuẩn bị gel agarose:
- Bột Agarose được hòa tan trong dung dịch đệm TBE 0.5X với nồng đợ
3,0%.
- Đun sơi dung dịch agarose bằng lị vi sóng.
- Hạ nhiệt độ của gel agarose xuống khoảng 50 0C.

13

- Bổ sung Ethidium bromide (EtBr) với nồng đợ 0.5µg/ml.
- Chuẩn bị khay gel và lược.
- Rót hỗn hợp gel agarose EtBr vào khay gel và cắm lược. Thời gian chờ gel
đông là 45 - 60 phút.
- Tra sản phẩm PCR.
- Chuẩn bị dung dịch đệm TBE 0.5X cho vào bể chạy điện di.
- Chạy điện di tại 100mA trong 4 giờ.
- Rửa gel trong H2O, đặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh.
- Phân tích số liệu:
Những số liệu thống kê bao gồm số allen trên locus, tần số allele phổ biến
nhất, số allele độc nhất, chỉ số PIC (Polymorphism Information Content) được tính
toán sử dụng phần mềm Excel, trong đó:
- Chỉ số Tần số allele phổ biến nhất được tính bằng tỷ lệ % của số cá thể
xuất hiện allele phổ biến nhất trên tổng số allele xuất hiện ở từng locus nghiên cứu
- Allele độc nhất của từng chỉ thị SSR được xác định là allele xuất hiện duy
nhất ở 1 giống trong toàn bộ các giống lúa nghiên cứu.
- Đa dạng di truyền allele của các chỉ thị SSR được đánh giá thông qua hệ số
PIC (Botstein,1980) và được tính theo phương trình:

Trong đó:

Pij : là tần số xuất hiện của alelel thứ j tương ứng với mồi i.

Giá trị PIC càng lớn tức là mức đợ đa hình của locus do mồi i khuếch đại
càng lớn, tức là càng nhiều allen được sinh ra.
Sự có mặt hay vắng mặt của các allele của từng chỉ thị SSR được ghi nhận
cho tất cả các giống lúa nghiên cứu, trong đó 0 là không có băng ADN và 1 là có
băng ADN ở cùng một vị trí. Số liệu được nhập vào chương trình NTSYS-pc v. 2.1
(Rohlf, 1997) để xây dựng ma trận tương đồng di truyền sử dụng hệ số Dice (Dice,
1945; Nei and Li, 1979). Tiếp theo, sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền

14


giữa các giống lúa nghiên cứu được xây dựng bằng phương pháp phân nhóm
UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages).
III. KẾT QUA VÀ THAO LUẬN
3.1. Kết quả phân tích đa hình ADN bằng các chỉ thị phân tử SSR
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng tổng số 50 chỉ thị SSR để khảo
sát đa hình với mợt số giống lúa đại diện, kết quả thu được 27 chỉ thị cho đa hình,
số chỉ thị này tiếp tục được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền của toàn bợ 40
giống lúa trong nghiên cứu. Cịn lại 23 chỉ thị khơng cho đa hình giữa các giống
lúa hoặc cho băng sản phẩm mờ hoặc không cho sản phẩm PCR, nên đã bị loại bỏ
khỏi nghiên cứu này.
Một số hình ảnh minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 giống lúa
nghiên cứu với các chỉ thị SSR trên gel agarose 3.0% (Hình 1).

15


16


17


Hình 1: Kết quả phân tích đa dạng di truyền 40 giống lúa sử dụng chỉ thị phân
tử SSR trên gel agarose 3.0%

18

Bảng 3: Các chỉ tiêu về allele, chi sô đa dang PIC cua cac locus SSR nhân biêt trên 40 giơng lua
nghiên cứu

TT

Chỉ thị SSR NST

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21

22
23
24
25
26
27

RM145
RM152
RM267
RM566
RM1155
RM1364
RM1367
RM3288
RM3431
RM3455
RM3467
RM3468
RM3476
RM3483
RM3515
RM3534
RM5599
RM5811
RM6051
RM6648
RM7003
RM7372
RM7419

RM7654
RM8214
RM25271
RM25319
Tống số
Trung bình
Min
Max

2
8
5
9
4
7
2
4
6
12
3
1
5
12
2
4
11
1
9
1
12

9
1
11
12
10
10

Số
allele
8
9
6
8
11
9
8
6
7
5
11
9
9
5
10
6
7
5
7
6
6

5
5
5
6
7
7
193
7,1
5
11

Tần số allele
phở biến nhất
39,024
43,636
38,235
48,718
46,154
44,444
61,111
34,375
56,757
31,476
17,500
31,707
20,000
35,294
24,390
27,027
23,684

43,590
24,390
57,107
32,500
32,500
29,723
38,182
25,324
39,024
35,000
36,329
17,500
61,111

Số allele
đợc nhất
1
2
0
1
2
3
1
0
3
2
2
1
0
1

2
2
0
2
0
3
2
0
0
0
2
1
0
33
1,2
0
3

PIC
0,778
0,727
0,765
0,721
0,753
0,748
0,562
0,777
0,627
0,791
0,881

0,827
0,865
0,732
0,846
0,761
0,838
0,644
0,815
0,762
0,769
0,756
0,714
0,709
0,772
0,760
0,779
0,759
0,562
0,881

Kết quả phân tích đa hình các chỉ thị SSR trong nghiên cứu của chúng tôi
được tổng hợp trong Bảng 3. Với tổng số 27 locus SSR được phân tích, chúng tơi
thu nhận được 193 allele, số allele/locus nằm trong khoảng từ 5 - 11, trung bình 7
allele/locus. Các locus cho ít allele nhất (5 allele) bao gồm các chỉ thị RM3455,
19


RM3483, RM5811, RM7372, RM7654, RM7419; hai locus cho nhiều allele nhất
(11 allele), đó là RM3467 và RM1155.
Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành đánh giá và phân tích mợt số chỉ số

như tần số allele phổ biến nhất, số allele độc nhất tại mỗi locus và chỉ số đa dạng
PIC của từng locus SSR. Kết quả phân tích cho thấy, tần số allele phổ biến nhất
giao động trong khoảng từ 17,5% đến 61,1%, tương ứng với chỉ thị RM3467 và
RM1367. Số allele độc nhất cũng thay đổi từ 0 - 3 allele, trong đó một số chỉ thị
không cho allele độc nhất, đó là các chỉ thị RM267, RM3288, RM3476, RM5599,
RM6051, RM7372, RM7419, RM7654 và RM25319, có ba chỉ thị cho 3 allele độc
nhất, là các chỉ thị RM1364, RM3431 và RM6648. Chỉ số đa dạng PIC của các
locus trong nghiên cứu thay đổi từ 0,562 - 0,881, với giá trị trung bình đạt 0,759.
So sánh kết quả của nghiên cứu của chúng tôi với một số kết quả đã được
công bố trong nước và trên thế giới (Bảng 4), chúng tơi nhận thấy số allele trung
bình trong nghiên cứu thu được khá cao - là7,1 - trong khi mợt số nghiên cứu chỉ
thu được số allele trung bình dưới 7 (Wong, 2009, Nagaraju, 2002; Alvarez, 2007,
T.H. Herrera , 2008, S. B. Yu , 2003). Đặc biệt, khi so sánh về chỉ số đa dạng PIC
giữa các nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy chỉ số PIC thu được trong nghiên cứu
này có giá trị trung bình cao nhất (0,76), trong khi các nghiên cứu tương tự có giá
trị PIC trung bình giao đợng từ 0,52 đến 0,74. Giá trị PIC trung bình phản ánh mức
đợ đa dạng chung cho tất cả các locus nghiên cứu. Điều này chứng tỏ những chỉ thị
SSR được sử dụng trong nghiên cứu này đã cho kết quả đa dạng cao giữa các
giống lúa nghiên cứu.

20


Bảng 4: Mợt số kết quả phân tích đa dạng di truyền SSR trên cây lúa
đã được công bố

T
T

Số

Tác giả

Số
chỉ
giống

thị

Tổng
số
allele

1
2
3
4
5
6
7
8

Trung bình
Số
allele
Số
PIC
đợc
allele
nhất

(allele
hiếm*)
8,4
0,69
1,7
2,6
0,52
3,8
6,6
0,74
1,4
13,1
0,66
9*
4,23
0,52
6,2
0,68
-

L.E.Giarrocco, 2007
69
26
219
S.C. Wong, 2009
8
12
31
J. Nagaraju, 2002
24

19
70
Alba Alvarez, 2007
50
10
66
J. Thomson, 2007
330
30
394
T.H. Herrera , 2008
18
48
203
S. B. Yu , 2003
193
101 628
B.K.
Chakravarthi, 15
30
462
2006
9 Nghiên cứu này
40
27
193
7,1
(*): allele hiếm là allele có tần số xuất hiện dưới 5%

0,76

1,2

3.2. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các giống lúa nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền của 40 giống lúa thông
qua ma trận tương đồng (Bảng 5) và sơ đồ hình cây đã được thiết lập bằng phương
pháp UPGMA thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa (Hình 2). Kết quả
cho thấy đợ tương đồng di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu giao động từ 0,00
đến 0,78 với giá trị trung bình là 0,22, điều này cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa về
mặt di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu. Trong đó, hai giống lúa Khẩu sán Khẩu đó đón (H37 - H38) có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,78.
Ở mức độ tương đồng di truyền khoảng 0,14, tổng số 40 giống lúa trong
nghiên cứu đã phân tách thành 4 nhóm riêng biệt:
- Nhóm I: Bao gồm 10 giống lúa với hệ số tương đồng Dice giao động trong
khoảng 0,15 - 0,73 là H1, H9, H10, H11, H12, H14, H15, H19, H23, H24.

21


- Nhóm II: Gồm 24 giống lúa với hệ số tương đồng giao động từ 0,15 - 0,70.
Tại hệ số tương đồng khoảng 0,23, các giống lúa thuộc nhóm này đã phân thành 3
phân nhóm chính:
 Phân nhóm 1: Gồm 2 giống H2 và H3 với hệ số tương đồng 0,44
 Phân nhóm 2: Gồm 8 giống là H6, H7, H8, H32, H33, H34, H35, H36 với
hệ số tương đồng giao động từ 0,30 - 0,67
 Phân nhóm 3: Gồm 14 giống là H13, H16, H17, H18, H20, H21, H22,
H25, H26, H27, H28, H29, H30, H31 với hệ số tương đồng giao động từ
0,34 - 0,71.
- Nhóm III: Gồm 4 giống lúa với hệ số tương đồng di truyền từ 0,23 - 0,64 là
H4, H5, H39, H40.
- Nhóm IV: Gồm 2 giống H37 và H38 với hệ số tương đồng di truyền là 0,78.

Kết hợp kết quả phân nhóm di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR với những
thông tin liên quan đến khả năng chịu hạn cũng như nguồn gốc của các giống lúa,
chúng tôi đã chọn 8 giống lúa đại diện cho các nhóm di truyền đồng thời có kiểu
hình chịu hạn tốt và có nguồn gốc khác nhau (Bảng 6). Đây sẽ là những giống lúa
được chúng tôi sử dụng làm nguồn vật liệu cho nghiên cứu tiếp theo về tạo lập cơ
sở dữ liệu cho nguồn gen cây lúa địa phương Việt Nam.

22


Bảng 5. Mối quan hệ di truyền giữa 40 giống lúa nghiên cứu

23


H1
H9
H11
H12
H10
H19
H23
H24
H14
H15
H2
H3
H6
H7
H8

H32
H33
H34
H35
H36
H13
H20
H21
H22
H31
H18
H17
H25
H26
H27
H28
H29
H30
H16
H4
H5
H39
H40
H37
H38

H10MW

0.10

0.27

0.44

Dice coefficient

0.61

Hình 4. Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa 40 giống lúa địa phương chịu hạn
(Ký hiệu mũi tên đỏ chỉ những giống dùng để giải trình tự)
24

0.78


Bảng 6. Danh sách những giống lúa sử dụng để giải trình tự DNA

Ký
hiệu

Nguồn
gốc

TGST

Năng
śt

Phẩm
chất

Kháng
Đạo
Bạc lá
rầy
ơn

Chịu Chịu Chịu Chịu Đặc điểm
hạn mặn rét
ngập chính

Nếp bồ hóng
Hải Dương

H1

Hải
Dương

145

39,47

Kthơm

NC

Ktb

K

Tốt

-

930

Lia tón

H2

-

123

47,04

Kthơm

NC

N

NC

Tốt

-

3

3429

Chiêm đỏ

H14

x

x

3525

Ba chơ K'tê

H16

5

3588

Tan ngần

H18

Quảng
Trị
Bình
Định
Yên

Bái

4

6

4806

Blào sinh sái

H32

7

5018

Khẩu sán

H37

Nàng quớt
biển

H39

TT

SĐK

Tên giống

1

412

2

8

x
ngon

25

x

Cứng cây
yếu, đẻ
nhánh
mạnh
Cây trung
bình, đẻ
nhánh
mạnh
x