Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lên men LACTIC từ rễ cây lúa hỗ trợ tăng trưởng cây trồng và kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa (ORYZA SATIVA)

......

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC TỪ RỄ CÂY
LÚA HỖ TRỢ TĂNG TRƢỞNG CÂY TRỒNG VÀ KHÁNG NẤM GÂY
BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA (ORYZA SATIVA)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện:
Hồ Thị Dưỡng

MSSV: 1611100273

Lớp: 16DSHA1

Trần Quang

MSSV: 1611100041

Lớp: 16DSHA2

TP. Hồ Chí Minh, 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC TỪ RỄ CÂY
LÚA HỖ TRỢ TĂNG TRƢỞNG CÂY TRỒNG VÀ KHÁNG NẤM GÂY
BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA (ORYZA SATIVA)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện:
Hồ Thị Dưỡng

MSSV: 1611100273

Lớp: 16DSHA1

Trần Quang

MSSV: 1611100041

Lớp: 16DSHA2

TP. Hồ Chí Minh, 2020


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Người thực hiện đề tài xin cam đoan: Đồ án này là cơng trình nghiên cứu
thực sự của nhóm thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoài
Hương. Các số liệu thu thập và phân tích trong đề tài là trung thực, nghiêm túc và
không trùng lặp với bất kỳ đề tài nghiên cứu nào. Những thơng tin tham khảo đều
được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng. Nếu có gì sai sót chúng tơi xin chịu hồn tồn
trách nhiệm.
Tp. HCM, Ngày 30 tháng 09 năm 2020
Sinh viên thực hiện

HỒ THỊ DƯỠNG

TRẦN QUANG


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu Trường Đại
học Cơng nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và
hoàn thành tốt khóa học 2016 – 2020.
Em xin cảm ơn thầy cơ trong Viện Khoa học Ứng dụng đã tận tình chỉ dạy
và truyền đạt cho em những kiến thức quan trọng tạo nền tảng kiến thức vững chắc

để hoàn thành tốt Đồ án và sau này có thể ứng dụng vào công việc thực tiễn.
Em xin cảm ơn thầy cô phụ trách phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học,
Viện Khoa học Ứng dụng, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi
điều kiện tốt nhất giúp cho em thực hiện và hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hồi Hương đã tận tình
hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt q trình thực hiện để em hồn thành tốt Đồ án
tốt nghiệp này.
Và em cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khóa đã tận tình hỗ trợ, giúp
đỡ, động viên khích lệ tinh thần, cùng trải qua những khó khăn trong suốt q trình
thực hiện Đồ án tốt nghiệp của mình.
Cuối cùng, con xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, gia đình đã luôn
bên cạnh, cổ vũ động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để con có thể hồn thành tốt
Đồ án tốt nghiệp này.
Tp. HCM, Ngày 30 tháng 09 năm 2020
Sinh viên thực hiện

HỒ THỊ DƯỠNG

TRẦN QUANG


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH..............................v
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài.....................................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu .........................................................................................2

2.1.

Ngồi nước ....................................................................................................2

2.2.

Trong nước ....................................................................................................2

3. Mục tiêu nghiên cứu ...........................................................................................2
4. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................2
5. Phƣơng pháp luận ..............................................................................................3
6. Phƣơng pháp xử lý số liệu .................................................................................3
7. Kết quả đạt đƣợc ................................................................................................3
8. Kết cấu đồ án ......................................................................................................3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................5
1.1.

Các vi sinh vật và khả năng hỗ trợ tăng trưởng cây trồng .............................5

1.1.1.

Khả năng phân giải lân .........................................................................5

1.1.2.

Khả năng sinh Indole-3-acetic acid (IAA)............................................7

1.1.3.

Khả năng tạo màng sinh học biofilm ....................................................8

1.2.

Giới thiệu chung về nấm đạo ôn hại lúa ......................................................10

1.2.1.

Triệu chứng bệnh trên lúa ..................................................................10

1.2.2.

Nguyên nhân gây bệnh đạo ôn............................................................11

1.2.3.

Giới thiệu chung về Pyricularia oryzae ..............................................13

1.2.4.

Cơ chế xâm nhiễm của nấm Pyricularia oryzae ................................15

1.2.5.

Biện pháp phịng trị bệnh đạo ơn trên lá lúa......................................18

1.3.

Tổng quan về vi khuẩn lactic nội sinh .........................................................21

1.3.1.

Giới thiệu vi khuẩn lactic nội sinh ......................................................21

1.3.2.

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic nội sinh .............................25

i


Đồ án tốt nghiệp

1.3.3.

Quá trình trao đổi chất ........................................................................26

1.3.4.

Khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm ....................29

1.3.5.

Ứng dụng của vi khuẩn lactic nội sinh ...............................................32

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................35
2.1.

Địa điểm nghiên cứu....................................................................................35

2.2.

Thời gian thực hiện ......................................................................................35

2.3.

Vật liệu nghiên cứu......................................................................................35

2.3.1.

Vật liệu .................................................................................................35

2.3.2.

Hóa chất sử dụng .................................................................................35

2.3.3.

Thiết bị ..................................................................................................36

2.3.4.

Dụng cụ ................................................................................................36

2.4.

Phương pháp nghiên cứu .............................................................................37

2.4.1. Phân lập, khảo sát các chủng vi khuẩn lactic nội sinh rễ lúa và sống
trên bề mặt rễ lúa ...............................................................................................38
2.4.2. Khảo sát hoạt tính sinh học hỗ trợ tăng trưởng cây trồng của các

chủng phân lập ..................................................................................................43
2.4.3. Xác định khả năng gây bệnh đạo ôn của nấm chỉ thị và sàng lọc hoạt
tính kháng nấm in vitro cùa các chủng phân lập ............................................47
2.4.4.

Tuyển chọn hoạt tính kháng nấm in vivo ...........................................49

2.4.5.

Ứng dụng các chủng tuyển chọn xử lý hạt giống lúa ........................49

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...........................................................52
3.1. Phân lập, khảo sát các chủng vi khuẩn lactic nội sinh rễ lúa và sống trên bề
mặt rễ lúa ...............................................................................................................52
3.1.1.

Phân lập chủng LAB nội sinh và sống trên bề mặt rễ lúa .................52

3.1.2.

Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ..................................53

3.2. Khảo sát hoạt tính sinh học hỗ trợ tăng trưởng cây trồng của các chủng
phân lập ..................................................................................................................59
3.2.1.

Khảo sát khả năng lên men lactic và tăng trưởng sinh khối .............60

3.2.2.

Khả năng tổng hợp sinh khối ..............................................................61

3.2.3.

Khảo sát khả năng phân giải lân ........................................................63

3.2.4.

Khảo sát khả năng sinh IAA ...............................................................65
ii


Đồ án tốt nghiệp

3.2.5.

Khả năng tạo màng biofilm .................................................................66

3.2.6.

Khả năng sinh enzyme ngoại bào .......................................................67

3.3. Xác định khả năng gây bệnh đạo ôn của nấm chỉ thị và sàng lọc hoạt tính
kháng nấm in vitro cùa các chủng phân lập ...........................................................69
3.3.1.

Tái nhiễm theo quy tắc Koch ...............................................................70

3.3.2.

Định danh nấm chỉ thị bằng phương pháp giải trình tự vùng ITS...72

3.3.3.

Khảo sát khả năng kháng nấm gây bệnh đạo ôn in vitro ..................74

3.4.

Tuyển chọn hoạt tính kháng nấm in vivo ....................................................75

3.4.1. Khảo sát khả năng kháng nấm gây bệnh đạo ôn in vivo của 3 chủng
RL1T, RL, L5 ở mật độ 108, 107, 106 (cfu/ml) sau 5 ngày ...............................75
3.4.2.
3.5.

Định danh các chủng tuyển chọn .......................................................77

Ứng dụng các chủng vi khuẩn lactic hỗ trợ tăng trưởng cây trồng .............79

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................83
4.1.

Kết luận........................................................................................................83

4.2.

Kiến nghị .....................................................................................................84

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................85
A. PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MƠI TRƢỜNG SỬ DỤNG TRONG THÍ

NGHIỆM ....................................................................................................................1
B. PHỤ LỤC PHƢƠNG PHÁP .............................................................................6
C. PHỤ LỤC HÌNH ẢNH.....................................................................................15
D. PHỤ LỤC XỬ LÝ THỐNG KÊ ......................................................................28

iii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
BCP: Bromocresol purple
DNA: Deoxyribonucleotide Acid
ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long
EFSA: Cơ quan Tiêu chuẩn Thực phẩm Châu Âu
EPSs: Extracellular Polymeric Substance
FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations.
Fw: Forward primer (Mồi ngược)
GRAS: Generally Recognized As Safe
IAA: Indole Acetic Acid
IAM: Indole-3-acetamide
IPA: Indole-3-pyruvate
ITS: Internal transcribed spacer
LAB: Lactic acid bacteria
MRS: de Man, Rogosa and Sharpe
NA: Nutrient Agar
NB: Nutriend broth
NMSL: Nước muối sinh lý
NSAPs: Non – specific acid phosphatases
OD: optical density (Mật độ quang)

PGPR: vi khuẩn hỗ trợ tăng trưởng cây trồng
PHL: Post Harvest Losses
PSA: Potato Sucrose Agar
PSB: Potato Sucrose Broth
PSM: Phosphate Solubilizing Microorganisms
RNA: Ribonucleic Acid
Rv: Reverse primer (Mồi xuôi)
SHPT: Sinh học phân tử
TCA: Trichloroacetic acid

iv


Đồ án tốt nghiệp

Tm: Melting Tempereture
UV: Ultraviolet
VK: Vi khuẩn
VSV: vi sinh vật
WA: Water agar

v


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Phân loại khoa học của nấm bệnh đạo ôn ................................................. 12
Bảng 1.2 Độc tố của nấm đạo ôn .............................................................................. 15
Bảng 1.3 Các loại thuốc hóa học trừ nấm bệnh đạo ơn ............................................ 18

Bảng 1.4 Các giống lúa có khả năng kháng bệnh đạo ôn ......................................... 20
Bảng 1.5 Cơ chế hoạt động của các chủng vi khuẩn ................................................ 21
Bảng 1.6 Phân loại vi khuẩn lên men lactic ............................................................. 23
Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch và quan sát bằng kính hiển vi............. 54
Bảng 3.2 Hình thái tế bào của các chủng khảo sát ................................................... 55
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khả năng lên men các loại đường .................................. 60
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên % acid tổng số của các chủng phân lập
nuôi cấy trong môi trường MRS ............................................................................... 61
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên mật độ các chủng phân lập nuôi cấy
trong môi trường MRS (Log(cfu/ml)) ....................................................................... 63
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên đường kính vịng hịa tan lân vơ cơ khó
tan (D – d) của các chủng phân lập ni cấy trong môi trường Pikovskaya‟s ......... 65
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên đường kính vịng IAA của các chủng
phân lập nuôi cấy trong môi trường Trypton water bổ sung cao nấm men .............. 66
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng tạo màng biofilm của 4 chủng
vi khuẩn phân lập đo ở OD550nm ............................................................................... 67
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh enzyme ngoại bào của
chủng phân lập .......................................................................................................... 69
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên tỷ lệ ức chế nấm Pyricularia oryzae
(%) ............................................................................................................................. 75
Bảng 3.11 Tỷ lệ nảy mầm và độ khỏe mầm của các nghiệm thức (P < 0.05, Duncan
test) ............................................................................................................................ 82
Bảng 3.12 Chiều cao, cân nặng của thân và rễ cây non (P < 0.05, Duncan test) ..... 83

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Con đường sinh tổng hợp IAA phụ thuộc Trp (Yunde Zhao, 2010) ........... 8
Hình 1.2 Các giai đoạn hình thành màng sinh học (Jean – Christophe Piard và
Romain Briandet, 2016) .............................................................................................. 9
Hình 1.3 Bệnh đạo ôn trên lá lúa .............................................................................. 11
Hình 1.4 Bào tử nấm Pyricularia oryzae ( ... 13
Hình 1.5 Sơ đồ cơ chế xâm nhiễm của nấm bệnh đạo ôn (Lê Hà, 2018) ................. 14
Hình 1.6 Nấm đạo ơn................................................................................................ 17
Hình 1.7 Con đường lên men Glucose ..................................................................... 29
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ....................................................................... 38
Hình 2.2 Sơ đồ phân lập vi khuẩn bề mặt rễ lúa ...................................................... 39
Hình 2.3 Sơ đồ phân lập vi khuẩn nội sinh .............................................................. 41
Hình 2.4 Sơ đồ khảo sát vi khuẩn lactic ................................................................... 43
Hình 2.5 Sơ đồ khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào ...................................... 47
Hình 2.6 Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp............................................. 49
Hình 2.7 Sơ đồ ứng dụng các chủng vi khuẩn lactic hỗ trợ tăng trưởng cây trồng . 51
Hình 3.1 Chứng minh các chủng phân lập là vi khuẩn nội sinh. Rễ lúa sau khi được
khử trùng bề mặt, đặt vào môi trường NA, ủ 24 h nhiệt độ phòng (trái); nước rửa rễ
lần cuối cấy ria trên mơi trường NA ủ 24 giờ ở nhiệt độ phịng (phải) .................... 53
Hình 3.2 Nhuộm bào tử của chủng Bacillus sp. (trái) và Enterococcus sp. RL1T
(phải) ......................................................................................................................... 57
Hình 3.3 Thử nghiệm catalase các chủng vi khuẩn khảo sát RL1T, RL1V, RL2, RL
và đối chứng dương (Bacillus sp.) ............................................................................ 57
Hình 3.4 Thử nghiệm di động của các chủng vi khuẩn khảo sát RL1T, RL1V, RL2,
RL (trái) và đối chứng dương Bacillus sp. (phải) ..................................................... 58
Hình 3.5 Vi khuẩn lactic chuyển màu mơi trường MRS có bổ sung chất chỉ thị .... 59
Hình 3.6 Canh trường ni cấy vi khuẩn đổi màu với thuốc thử so với đối chứng . 59
Hình 3.7 Acid tổng (% acid lactic) của các chủng phân lập ni cấy trong mơi
trường MRS khơng và có bổ sung NaCl ................................................................... 61

v

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.8 Log mật độ tế bào của các chủng phân lập nuôi cấy trong môi trường
MRS khơng và có bổ sung NaCl ............................................................................... 63
Hình 3.9 Vịng hào quang Phosphate hòa tan của đối chứng (trái) và Enterococcus
sp. RL (phải).............................................................................................................. 64
Hình 3.10 Đường kính vịng hịa tan của các chủng phân lập ở các nồng độ muối . 65
Hình 3.11 Đường kính vịng IAA của các chủng phân lập ...................................... 66
Hình 3.12 Khả năng tạo màng biofilm của 4 chủng vi khuẩn phân lập ................... 67
Hình 3.13 Khả năng sinh enzyme caseinase của các chủng vi khuẩn lactic ............ 69
Hình 3.14 Hình thái nấm chỉ thị (trái) dưới kính hiển vi và sau 9 ngày ni cấy nấm
chỉ thị trên mơi trường PSA (phải)............................................................................ 71
Hình 3.15 Hình thái nấm chỉ thị dưới kính hiển vi (trái) và hình tái nhiễm nấm chỉ
thị trên lá lúa (phải) ................................................................................................... 72
Hình 3.16 Kết quả tái phân lập từ lá lúa đã được chích bào tử nấm chỉ thị, hình soi
vết bệnh dưới vật kính 4X (A), lấy ranh giới mơ bệnh và mô khỏe tái phân lập trên
môi trường WA (B), nấm bệnh được cấy chuyền từ môi trường WA sang PSA trong
5 ngày (C) .................................................................................................................. 72
Hình 3.17 Kết quả tra cứu genbank NCBI ............................................................... 73
Hình 3.18 Khoảng cách di truyền từ chủng nấm chỉ thị (Rice blast fungus CM) đến
các chủng so sánh ...................................................................................................... 74
Hình 3.19 Cây phát sinh lồi cho thấy vị trí của nấm chỉ thị với các lồi thuộc
Pyricularia oryzae xây dựng dựa trên trình tự ITS của các chủng. Chủng
Aspergillus flavus UPMZ02 là một chủng ngoài chi Pyricularia được sử dụng so
sánh. Giá trị phần trăm Bootstrap (lặp lại 1000) được hiện tại lại vị trí nhánh phát
sinh ............................................................................................................................ 74
Hình 3.20 Tỷ lệ ức chế nấm Pyricularia oryzae (%) ở các nồng độ muối .............. 75
Hình 3.21 Ức chế nấm Pyricularia oryzae trên lá lúa ở mật độ tế bào vi khuẩn 106

cfu/ml sau 5 ngày ...................................................................................................... 76
Hình 3.22 Cây phát sinh lồi cho thấy vị trí của 2 chửng vi khuẩn RL và RL1T với
các lồi thuộc chi Enterococcus, xây dựng dựa trên trình tự 16SrRNA của các

vi


Đồ án tốt nghiệp

chủng. Giá trị phần trăm Bootstrap (lặp lại 1000) được hiện tại lại vị trí nhánh phát
sinh ............................................................................................................................ 79
Hình 3.23 Khoảng cách di truyền các chủng RL1T và RL so với các chủng tham
chiếu (MEGA X – so sánh cặp đơi) .......................................................................... 80
Hình 3.24 Thân và rễ cây lúa sau 7 ngày trồng ........................................................ 81
Hình 3.25 Tỷ lệ nảy mầm và độ khỏe mầm của các nghiệm thức ........................... 81
Hình 3.26 Chiều cao, cân nặng của thân và rễ giữa các nghiệm thức ...................... 82

vii


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh đạo ôn trên lúa do nấm Pyricularia grisea Sacc. gây ra là một trong
những dịch bệnh có lịch sử lâu đời nhất với địa bàn phân bố rộng nhất và tác hại
nghiêm trọng đối với tất cả các quốc gia trồng lúa trên thế giới [59]. Tuy nhiên cho
đến nay, bệnh đạo ôn vẫn là nỗi ám ảnh nặng nề nhất đối với người trồng lúa, tính
kháng bệnh của giống liên tục bị phá vỡ do độc tính của nấm gây bệnh. Do vậy,
người trồng lúa chủ yếu sử dụng thuốc hóa học để đối phó với dịch hại này. Với

thực trạng trên cần có giải pháp cho cây lúa nói riêng hay cho sản xuất nơng nghiệp
hướng tới nền nơng nghiệp an tồn. Hiện nay, biện pháp phịng trừ bệnh đạo ơn phổ
biến là dùng thuốc hóa học. Tuy nhiên, thuốc hóa học là tác nhân gây ơ nhiễm môi
trường và ảnh hưởng sức khoẻ con người. Do đó, việc hạn chế khả năng phát tán và
gây bệnh của nấm Pyricularia oryzae dựa vào khả năng đối kháng của các vi sinh
vật (VSV) như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, … nhằm đưa ra phương pháp tối ưu phòng
trừ bệnh đạo ôn lúa bằng chế phẩm VSV là công việc cấp bách của các nhà khoa
học.
Đặc biệt ở các nước Đông Nam Á, lúa là cây lương thực đứng vị trí hàng
đầu do có giá trị dinh dưỡng cao và nhiều công dụng khác, về giá trị kinh tế lúa gạo
là mặt hàng xuất khẩu của một số nước trong khu vực.
Cây lúa đã và đang là cây trồng số một của nền sản xuất nông nghiệp Việt
Nam, là cây lương thực quan trọng nhất đối với vấn đề an ninh lương thực ở nước
ta.
Diện tích trồng lúa của nước ta hiện nay hơn 3,123,9 nghìn ha (Tổng cục
thống kê, 6/2019) nhưng nhìn chung năng suất và sản lượng lúa vẫn còn thấp. Một
trong những nguyên nhân chủ yếu làm cho năng suất và chất lượng lúa thấp là nấm
bệnh.
Từ thực tiễn cấp thiết trên đây sinh viên tiến hành đề tài: “Phân lập tuyển
chọn vi khuẩn lên men lactic từ rễ cây lúa hỗ trợ tăng trƣởng cây trồng và
kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa (Oryza sativa)” nhằm góp phần vào xu

1


Đồ án tốt nghiệp

hướng phịng trừ bệnh đạo ơn lúa bằng chế phẩm VSV, tiến tới một nền nông
nghiệp sạch và bền vững hiện nay.
2. Tình hình nghiên cứu

Ngồi nƣớc

2.1.

Hajano và cộng sự (2011). Nghiên cứu về đặc tính, triệu chứng của một số
loại nấm gây bệnh trên lúa được phân lập từ hạt và lá lúa.
Trong nƣớc

2.2.

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp “Nghiên cứu bệnh đạo ôn trên một số dòng,
giống lúa của viện cây lương thực và cây thực phẩm, vụ xuân 2010” (Phạm Tự Bắc,
2010). Mục đích của đề tài này nhằm nắm được tác hại và đặc điểm phát sinh, phát
triển của bệnh đạo ôn trên một số giống lúa tại Viện Cây lương thực.
Cây thực phẩm trong vụ xuân 2010, xác định sinh lý chủng nấm đạo ơn và
nghiên cứu một số đặc tính của chúng.
3. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn được vi khuẩn có khả năng đối kháng nấm
Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ơn trên cây lúa và có hoạt tính hỗ trợ tăng trưởng
cây trồng.
4. Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập, khảo sát các chủng vi khuẩn lactic nội sinh rễ lúa và sống trên
bề mặt rễ lúa.
2. Khảo sát hoạt tính sinh học hỗ trợ tăng trưởng cây trồng của các chủng
phân lập: Khả năng tăng sinh khối, khả năng sinh acid lactic, phân giải lân, sinh
IAA, tạo màng sinh học biofilm, khả năng sinh enzyme protease, amylase, cellulase,
chitinase.
3. Xác định khả năng gây bệnh đạo ôn của nấm chỉ thị và sàng lọc hoạt tính
kháng nấm in vitro cùa các chủng phân lập.
4. Tuyển chọn hoạt tính kháng nấm in vivo.

5. Ứng dụng các chủng tuyển chọn xử lý hạt giống lúa.

2


Đồ án tốt nghiệp

5. Phƣơng pháp luận
Các hoạt tính sinh học như phân giải lân, sinh IAA, tạo biofilm, sinh enzyme,
chịu mặn và ức chế các vi sinh vật gây hư hỏng hạt giống và ảnh hưởng đến sự phát
triển của cây là những đặc tính quan trọng của một chế phẩm sinh học hỗ trợ tăng
trưởng cây trồng, bảo quản hạt giống. Những đặc tính này của vi khuẩn acid lactic
nội sinh, được sàng lọc tuyển chọn in vitro và kiểm tra hoạt tính kháng nấm in vivo
khi cảm nhiễm với nấm Pyricularia oryzae.
6. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lặp lại ba lần và xử lý bằng phần
mềm thống kê SAS 9.4 với P < 0,05 tương đương độ tin cậy 95%.
7. Kết quả đạt đƣợc
Xác định đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng phân lập
RL1T, RL1V, RL2, RL.
Khảo sát hoạt tính sinh học với các nồng độ 0%, 1%, 2%, 3% NaCl của
chủng phân lập: khả năng tăng sinh khối, sinh acid lactic, phân giải lân, sinh IAA,
tạo màng sinh học biofilm, khả năng sinh enzyme protease, amylase, cellulase,
chitinase.
Xác định được tác nhân gây bệnh của nấm chỉ thị, khả năng đối kháng nấm
với các chủng vi khuẩn lactic ở các nồng độ 0%, 1%, 2%, 3% NaCl qua thí nghiệm
đối kháng nấm in vitro.
Xác định được khả năng đối kháng nấm trên lá lúa in vivo của chủng vi
khuẩn phân lập ở mật độ sinh khối 106, 107, 108 cfu/ml.
Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn lactic ứng dụng vào nảy mầm hạt.

Định danh nấm chỉ thị là tác nhân gây bệnh đạo ôn trên cây lúa. Định danh chủng
RL1T và RL thuộc bộ sưu tập LAB.
8. Kết cấu đồ án
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung
liên quan đến tài liệu nghiên cứu.

3


Đồ án tốt nghiệp

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập
đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà
đề tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được.

4


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Các vi sinh vật và khả năng hỗ trợ tăng trƣởng cây trồng
1.1.1. Khả năng phân giải lân
Phân lân hóa học là nguồn chủ yếu cung cấp lân cho đất nông nghiệp với ưu
điểm là tiện lợi, dễ sử dụng, giá cả phải chăng. Tuy nhiên, khoảng 75 – 90 % tổng
số lượng phân lân hóa học bón vào đất bị kết tủa thành dạng khó tan cây trồng
khơng hấp thu được bởi các nguyên tố sắt, nhôm, magie hoặc các hợp chất calci có
trong đất. Sự tích lũy kết tủa này làm cho đất trở nên chai cứng, làm giảm độ phì

nhiêu tự nhiên của đất. Mặt khác, một phần lân từ phân hóa học có thể bị rửa trơi
hoặc thấm xuống mực nước ngầm gây ô nhiễm môi trường nước [29].
Vi sinh vật (VSV) phân giải lân khó tan đã được sử dụng như phân bón sinh
học thương mại để cải thiện tình trạng nơng nghiệp. VSV phân giải lân là các VSV
có khả năng chuyển hóa hợp chất phosphor khó tan thành dễ tiêu đối với cây trồng.
Hoạt tính phân giải lân được xác định định tính thơng qua vịng phân giải lân trên
môi trường nuôi cấy đặc chứa hợp chất phosphor khó tan hoặc định lượng thơng
qua lượng lân hịa tan được hình thành trong mơi trường ni cấy lỏng. Kết quả
nghiên cứu xác định một số VSV có khả năng hịa tan nhiều hợp chất phosphor khó
tan khác nhau, có tác dụng nâng cao hiệu quả sử dụng lân khống cho cây trồng.
Nhiều VSV phân giải lân có khả năng tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật,
một số khác có khả năng đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng. VSV phân
giải lân có ảnh hưởng tốt hơn đến khả năng sử dụng dinh dưỡng nitơ, phosphor của
cây trồng trong điều kiện hỗn hợp với VSV cố định nitơ. Phân bón VSV phân giải
lân đã được nghiên cứu sản xuất, ứng dụng tại một số cơ sở sản xuất và mang lại
hiệu quả kinh tế được người sử dụng đánh giá cao [7].
Nhiều loại vi sinh vật gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn và tảo đã được ghi nhận
là thể hiện khả năng phân giải và khoáng hoá chẳng hạn: Pseudomonas spp.,
Agrobacterium spp., Bacillus circulans. Các chủng thuộc các loài Azotobacter,
Paenibacillus, Rhizobium, Serratia... và nhiều chủng nấm cũng đã được ghi nhận

5


Đồ án tốt nghiệp

khả

năng

này

như:

Aspergillus,

Paecilomyces,

Penicillium,

Rhizopus,

Saccharomyces, Trichoderma... [22].
1.1.1.1.

Cơ chế q trình hịa tan lân vô cơ

Lân vô cơ tồn tại ở dạng muối phosphate của những nguyên tố Ca, Fe, Al,
Mg… Trong thực tế, lân dạng H2PO4- là dạng cây trồng dễ hấp thu nhất. Phosphate
calci dễ được huy động để làm thức ăn cho cây hơn là phosphate sắt, phosphate
nhôm, các muối phosphate trong đất ít hịa tan. Vì vậy, nồng độ lân hịa tan trong
dung dịch đất thường rất ít. Các dạng phosphate cịn lại thường là những loại khó
hịa tan mà cây trồng khơng thể đồng hóa được, muốn cây trồng sử dụng được phải
qua quá trình biến đổi thành dạng dễ tan.
Có nhiều lý thuyết về cơ chế hồ tan phosphate vơ cơ. Theo nhiều thí
nghiệm cho thấy, cơ chế chính là q trình tạo ra các hợp chất khoáng tan như acid
hữu cơ, siderophores, protons, hydroxyl ions và CO2. Các acid hữu cơ được tạo ra ở
chu chất bằng cách con đường oxi hoá trực tiếp, quá trình này làm pH giảm và dẫn
đến quá trình acid hố các tế bào vi sinh vật và mơi trường xung quanh, chính vì
vậy mà các ion P được giải phóng bằng việc thay thế H+ bằng Ca2+. Một cơ chế

khác của việc tạo ra các acid hữu cơ chính là giải phóng H+ ra ngồi để hấp thu
cation. [22].
1.1.1.2.

Cơ chế khống hóa lân hữu cơ

Nguồn phosphor hữu cơ chính trong đất là các chất hữu cơ. Hàm lượng
phosphor hữu cơ trong đất có thể lên đến 30 – 50 % và dạng phổ biến nhất là
inositol phosphate (phytate). Các hợp chất phosphor hữu cơ khác có thể là:
Phosphomonoesters, phosphodiesters, phospholipids, nucleic acids và
phosphotriesters [22].
Khoáng hoá phosphor liên quan đến sự hoà tan phosphor hữu cơ và sự mất
đi của phần còn lại của phân tử. Lý thuyết quan trọng và phổ biến nhất chính là “Lý
thuyết loại bỏ” (sink theory), đề cập đến việc việc P liên tục mất đi sẽ dẫn đến việc
hoà tan các hợp chất Ca – P, chính vì vậy mà hàm lượng P bị mất đi sẽ tương ứng
với hàm lượng P có trong mật độ sinh khối của các chủng vi khuẩn có khả năng
phân giải lân (Phosphate Solubilizing Microorganisms – PSM). Quá trình sinh học

6


Đồ án tốt nghiệp

này đóng vai trị quan trọng trong q trình chuyển hố Phosphor, nhiều nhóm
enzyme tham gia vào q trình này. Nhóm đầu tiên là nhóm khử phosphor hoá liên
kết của phosphor – ester hay phospho – anhydride của các hợp chất hữu cơ. Chúng
là các acid phosphatases không đặc hiệu (NSAPs) và enzyme được nghiên cứu
nhiều nhất từ các PSM là phosphomonoesterases (còn gọi là phosphatases). Các
enzyme này có thể là acid hay alkaline phosphomonoesterases. Một loại enzyme
khác được tạo ra bởi PSM là phytase, enzyme này chịu trách nhiệm cho việc giải

phóng phosphor từ hợp chất hữu cơ trong đất bằng cách giữ nó dưới dạng inositol
phosphate (phytate). Sự phân giải phytate bởi phytase giúp giải phóng phosphor
thành dạng thực vật có thể sử dụng. [22].
1.1.2. Khả năng sinh Indole-3-acetic acid (IAA)
IAA (Indole-3-Acetic Acid) là chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc
nhóm Auxin đầu tiên được xác định giữ vai trò trung tâm trong sự tăng trưởng ở
thực vật. IAA thường được dùng như một chất điều hịa q trình sinh học, giúp
kích thích kéo dài tế bào bằng cách thay đổi các điều kiện nhất định như tính thấm
lọc, tăng tính thấm nước, giảm áp lực thành tế bào và tăng tổng hợp thành tế bào.
IAA cịn ngăn chặn và trì hỗn hiện tượng sinh lý của lá, thúc đẩy sự ra hoa, tạo quả
[9].
Auxin là những hợp chất có nhân Indol, được tổng hợp từ Tryptophan trong
mơ phân sinh (ngọn, lóng) và lá non. Sau đó, Auxin sẽ di chuyễn đến rễ và tích tụ
trong rễ.
Có nhiều loại Auxin khác nhau với cấu trúc hoá học khác nhau. Loại Auxin
quan trọng nhất là β-indol-acetic acid (IAA), ngoài ra một số Auxin khác cũng khá
phổ biến là napthalen-acetic acid (NAA), phenyl-acetic acid (PAA).
Quá trình sinh tổng hợp Auxin là một quá trình phức tạp, có khả năng nhiều
con đường cùng liên quan đến quá trình này. IAA có thể được sinh tổng hợp từ Trp
thông qua con đường Indole-3-pyruvate (IPA). Enzyme IPA decarboxylase xúc tác
chuyển đổi IPA thành Indole-3-acetaldehyde, nghiên cứu được thực hiện trên
Arabidopsis cho thấy enzyme chịu trách nhiệm chuyển hoá Trp thành IPA là TAA1

7


Đồ án tốt nghiệp

(Tryptophan Aminotransferase of Arabidopsis) và TAA1 mã hoá hiện diện ở trong
thân và rễ, cho thấy cả thân và rễ của cây đều có khả năng sinh tổng hợp Auxin

[80].

Hình 1.1 Con đường sinh tổng hợp IAA phụ thuộc Trp (Yunde Zhao, 2010).
1.1.3. Khả năng tạo màng sinh học biofilm
Màng sinh học (biofilm) được tạo nên bởi sự liên kết của các vi khuẩn với
bề mặt bám thông qua một ma trận kết nối được tạo nên từ các cơ chất ngoại bào
(Extracellular Polymeric Substance - EPS) như protein, DNA hay polysaccharides
[40]. Đối với tế bào vi khuẩn, biofilm là nơi giúp các vi khuẩn chống chọi lại với
tác động từ môi trường hay biến động môi trường như pH, sự thay đổi về oxy, chất
dinh dưỡng, hoặc sự có mặt của kháng sinh.

8


Đồ án tốt nghiệp

Các tế bào vi khuẩn sinh sống nếu khơng chịu một sự tác động di chuyển,
q trình sinh trưởng vẫn cứ tiếp tục, dần sẽ hình thành một kiểu khuẩn lạc trên bề
mặt đó, đây là giai đoạn I của sự hình thành màng sinh học. Ở giai đoạn II, vi khuẩn
sẽ bắt đầu thay đổi kiểu hình, khả năng sinh hóa mới để thuận lợi hơn trong việc
tổng hợp nên cơ chất ngoại bào - Extracellular Polymeric Substance (EPS). Giai
đoạn III của sự hình thành màng sinh học, các tế bào tách ra khỏi màng sinh học để
tìm địa điểm khác, giai đoạn này gọi là giai đoạn phát tán. Khả năng tạo màng sinh
học như là một cách thức tồn tại, phát triển của vi sinh vật trong những điều kiện
dinh dưỡng thấp của môi trường.

Hình 1.2 Các giai đoạn hình thành màng sinh học (Jean – Christophe Piard và
Romain Briandet, 2016).
Các vi khuẩn có khả năng kích thích tăng trưởng cây trồng (PGPR) sẽ biểu
hiện tốt hơn dưới dạng màng sinh học khi mà chúng làm tăng khả năng cạnh tranh

với các vi khuẩn khác, hấp thu chất dinh dưỡng nhanh hơn và phản ứng nhanh với
những thay đổi trong môi trường. Ảnh hưởng của màng sinh học khi liên kết với rễ
cây đã được nghiên cứu cho thấy giúp cho sự phát triển của cây trồng, tăng sản
lượng và chất lượng. Sự hình thành màng sinh học ở rễ phụ thuộc vào nguồn dinh
dưỡng và các chất từ cây trồng. Mặc dù hàm lượng các chất hữu cơ từ rễ cây là
không lớn, chỉ khoảng 0,4 % từ quang hợp nhưng lại mang lại sự ảnh hưởng rất lớn
đến hệ vi sinh vật đất. Bằng cách cung cấp các hợp chất hữu cơ như là một nguồn
dinh dưỡng, rễ đóng vai trị trung tâm trong việc thu hút các vi khuẩn cộng sinh với
rễ cây [27].

9


Đồ án tốt nghiệp

Hầu hết các chủng vi khuẩn đều sử dụng quorum sensing như một hình thức
giao tiếp giúp điều chỉnh, phối hợp và tương tác của vi khuẩn với thực vật. Đây là
một trong những yếu tố chính cho việc hình thành màng sinh học và hầu hết các
PGPR đều sử dụng phương thức này [27].
Trong số các chủng vi khuẩn được nghiên cứu về khả năng tạo màng sinh
học, vi khuẩn sinh lactic được quan tâm vì chúng là nhóm vi khuẩn an tồn GRAS
và đã có nhiều nghiên cứu cho thấy tiềm năng của chúng trong phát triển cây trồng.
Màng sinh học của LAB được xem là có lợi và là một trong những yếu tố chính
được xác định như là một rào cản để chúng chống lại sự phát triển của hư hỏng và
mầm bệnh và đã được ghi nhận trong nhiều nghiên cứu [40]; [57].
1.2.

Giới thiệu chung về nấm đạo ôn hại lúa
1.2.1. Triệu chứng bệnh trên lúa
Bệnh đạo ơn (cháy lá) có thể phát sinh ở hầu hết các giai đoạn sinh trưởng

của lúa và có thể gây hại ở cổ lá, lá, lóng thân, cổ bơng, gié và hạt.
Trên lá: Bệnh gây hại chủ yếu ở giai đoạn mạ - đẻ nhánh. Lúc đầu vết bệnh
chỉ nhỏ như đầu mũi kim, màu xám xanh giống như bị nước sơi, sau đó chuyển sang
màu nâu, rồi lan rộng dần ra thành hình thoi, xung quanh màu nâu đậm, giữa màu
xám trắng. Nếu nặng, nhiều vết bệnh liên kết lại với nhau làm lá bị cháy khô, cây
lúa bị lụi xuống, ruộng lúa sẽ bị thất thu nghiêm trọng.
Trên cổ lá, thân và cổ bơng: triệu chứng ban đầu cũng có màu xám xanh sau
chuyển sang nâu, do nấm tấn công vào mạch dẫn gây cản trở việc vận chuyển các
chất dinh dưỡng nuôi lá, thân và hạt làm cho lá, thân dễ gãy, hạt bị lép, lửng
Trên hạt: bệnh xảy ra vào giai đoạn trổ, vết bệnh trên hạt cũng có dạng mắt
én, viền nâu, tâm xám trắng. Nếu bệnh tấn công sớm sẽ làm hạt bị lép, lửng. Nếu
ẩm độ khơng khí cao, chỗ vết bệnh sẽ mọc một lớp nấm mốc màu xám xanh, dễ bị
gãy, làm ruộng lúa trở nên xơ xác. Lúa sẽ bị cháy rụi hoàn toàn nếu bị nhiễm bệnh ở
giai đoạn đẻ nhánh, nhất là khi gặp điều kiện thời tiết thuận lợi cho bệnh và bón
phân khơng hợp lý [6].

10


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3 Bệnh đạo ơn trên lá lúa.
Ở Nhật Bản, từ năm 1953 – 1960, thất thu sản lượng lúa do bệnh cháy lá
hằng năm trung bình là 2,98%. Riêng trong năm 1960, thất thu do bệnh cháy lá
chiếm 24,8% trong tổng thiệt hại. Đối với bệnh thối cổ gié, nếu vượt 10% gié bị
nhiễm bệnh sẽ thất thu năng suất 6% và 5% hạt sẽ có phẩm chất kém. Theo ước tính
của FAO thiệt hại do bệnh này gây ra làm giảm năng suất lúa trung bình từ 0,7% –
17,5%, những nơi thiệt hại nặng có thể làm giảm đến 80%.
Ở Việt Nam, theo thống kê của Viện Bảo vệ thực vật trên toàn quốc thiệt

hại do nấm bệnh đạo ôn gây ra đối với cây lúa hàng năm mất khoảng 10% – 25%. Ở
các tỉnh phía Nam, diện tích nhiễm đạo ơn trên lá là 16773 hecta, trong đó diện tích
nhiễm nặng là 10 hecta. Bệnh đạo ôn hại cổ bông nhiễm 5847 hecta (Bộ Nông
Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2014).
1.2.2. Nguyên nhân gây bệnh đạo ôn
Tác nhân gây hại là nấm Pyricularia oryzae thuộc họ Moniliales, lớp nấm
Bất Toàn.

11


Đồ án tốt nghiệp

Bảng1.1 Phân loại khoa học của nấm bệnh đạo ôn
Phân loại khoa học
Kingdom

Fungi

Division

Ascomycota

Subdivision

Pezizomycotina

Class

Sordariomycetes

Subclass

Sordariomycetidae

Order

Magnaporthales

Genus

Pyricularia

Abe (1911) và Kinishi (1933) cho rằng nấm đạo ơn sinh trưởng thích hợp ở
nhiệt độ 25 – 28oC và ẩm độ khơng khí là 93% trở lên. Bào tử của nấm rất nhỏ, có
thể phát tán và bay cao đến 24 m, thậm chí đến 10000 m dễ lây lan cho các ruộng
lân cận trong khu vực. Nấm phát triển tốt trong điều kiện mát từ 24 – 28oC, ẩm độ
cao >80%, biên độ nhiệt giữa ngày và đêm cao sẽ dễ phát sinh thành dịch. Cây lúa
là ký chủ chính, bệnh có thể lưu tồn trên các cây ký chủ phụ mọc quanh ruộng như
các lồi cỏ [4]. Quan sát trên kính hiển vi cho thấy cành bào tử phân sinh hình trụ,
đa bào, đầu cành thon và hơi gấp khúc. Nấm thường sinh ra các cụm cành từ 3 – 5
chiếc. Bào tử có hình quả lê hoặc hình nụ sen, thường có từ 2 – 3 ngăn ngang, bào
tử khơng màu như hình 1.4.

12