Đồ án tổng hợp: Nghiên cứu kĩ thuật cố định vi khuẩn Streptococcus thermophillus và Lactobacillus bulgaricus trên cellulose sản xuất từ vi khuẩn Acetobacter xylinum

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ

PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
STT
1
2
3
4

Ký hiệu
BC
ST
LB
AX

Tên đầy dủ
Bacterial cellulose
Streptococcus thermophillus
Lactobacillus bulgaricus
Acetobacter xylinum

DANH MỤC BẢNG
STT
1
2

Số hiệu
1.1
3.1

Tên Bảng
Cấu trúc BC ở một số lồi vi khuẩn
Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của 2 vi khuẩn
LB và ST

Trang
3
31


DANH MỤC HÌNH
STT

Số
hiệu

Tên hình
Cấu trúc cellulose (a) của vi khuẩn (BC) ( × 20000 lần) và

1

1.1

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
1.10
1.11
2.1
2.2

14

3.1

16
17
18

3.2
3.3
3.4

19

3.5

20
21
22
23
24

3.6
3.7
3.8
3.9
3.10

25

3.11

26
27

3.12
3.13

mang BC
Khuẩn lạc của chế phẩm ST (1) và LB (2) sau hoạt hóa
Khả năng sinh acid lactic của mẫu 1 và mẫu 2
Đồ thị biểu diễn khả năng sống sót của vi khuẩn lactic

28

3.14

trên chất mang BC sau các mốc thời gian bảo quản là 1

29

3.15

Trang
5

(b) của thực vật (PC) ( × 200 lần)
Sơ đồ các con đường tổng hợp cellulose bởi AX
Màng BC ướt đang được gỡ bỏ từ môi trường nuôi cấy
Cấu tạo của AX được bao bọc bởi cellulose
Quy trình sản xuất thạch dừa
Trà túi lọc lipton

Đường saccharose
Streptococcus thermophillus
Lactobaccillus bulgaricus
Đông khô vi khuẩn
Bảo quản lạnh
Sơ đồ phân lập hai chủng vi khuẩn ST và LB
Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất sữa chua
Khuẩn lạc hỗn hợp hai vi khuẩn ST và LB từ sữa chua

7
10
11
12
13
13
14
14
16
16
24
28

vinamilk
Khuẩn lạc vi khuẩn ST (1) và LB (2) đã thuần khiết
Hình ảnh ống giống của chủng ST
Hình ảnh ống giống của chủng LB
Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng của 2 chủng LB

31
32

32

và ST trong 72 giờ
Thu nhận BC ướt từ môi trường nuôi cấy
Khối lượng BC tạo thành ở các mốc thời gian
BC sau khi sấy
BC trước khi ngâm (1) và sau khi ngâm dịch vi khuẩn (2)
Chế phẩm vi khuẩn lactic trên BC
Khả năng sống sót của chế phẩm vi khuẩn lactic trên chất

tháng và 2,5 tháng
Khả năng sinh acid lactic của chế phẩm vi khuẩn lactic
qua các mốc thời gian bảo quản

30

33
35
35
36
37
38
39
40
41
43

44

Đồ án tổng hợp

- 1-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay kĩ thuật cố định tế bào đang được đề cập và quan tâm rất nhiều, đặc
biệt trong q trình bảo quản, lưu thơng, cung cấp giống cho lĩnh vực lên men tạo
ra sản phẩm thực phẩm. Tế bào cố định có nhiều ưu điểm so với tế bào tự do: Tiện
lợi trong việc bảo quản, lưu thông và giúp giảm chi phí ở giai đoạn chuẩn bị giống.
Theo khảo sát những chất mang thường dùng để cố định tế bào vi sinh vật:
Aliganate, gelatin, xơ dừa, vỏ bưởi, táo, lê… Tuy nhiên những chất mang truyền
thống này kém bền hoặc giá thành đắt, vì vậy việc tìm kiếm một chất mang mới có
ưu thế hơn là cần thiết. Cellulose vi khuẩn hội đủ những điều kiện của một chất
mang trong cố định tế bào: Giá thành rẻ, độ tinh khiết cao, có khả năng hút nước và
giữ ẩm tốt nhờ cấu trúc mạng lưới cellulose, có thể bổ sung trực tiếp vào sản phẩm
thực phẩm mà không xảy ra bất kỳ phản ứng phụ nào, bên cạnh đó nó cịn rất tốt
cho hệ tiêu hóa bởi nó mang bản chất là cellulose giống như thạch dừa…nên được
chọn làm chất mang trong đề tài này.
Hiện nay trong các nhà máy sản xuất sữa chua người ta chỉ bảo quản giống
bằng phương pháp bảo quản lạnh, nhân giống cấy chuyền và hoạt hóa nhiều lần.
Tuy nhiên chi phí cho việc bảo quản lạnh và cấy chuyền rất tốn kém, bên canh đó
tiến hành hoạt hóa và cấy chuyền nhiều lần sẽ làm giảm hoạt lực của vi khuẩn lactic
sau 7 – 8 thế hệ. Vì vậy các nhà sản xuất phải tiến hành mua ống giống tinh khiết từ
các nhà cung cấp giống, chi phí cho việc mua ống giống tốn chi phí rất cao. Vì thế,
việc cố định hai chủng vi khuẩn ST và LB trên giá thể BC là điều cần thiết. Chế
phẩm vi khuẩn lactic trên chất mang BC mang lại rất nhiều thuận lợi: Điều kiện bảo
quản dễ dàng, lưu thông, cung cấp giống thuận tiện, chủ động trong việc sử dụng

giống, đặc biệt chế phẩm vi khuẩn lactic trên chất mang BC vẫn ở thế hệ thứ nhất.
Từ thực tiễn yêu cầu em đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu kĩ thuật cố định vi
khuẩn Streptococcus thermophillus và Lactobacillus bulgaricus trên cellulose
sản xuất từ vi khuẩn Acetobacter xylinum” với mong muốn sẽ mang lại nhiều sự
thuận lợi hơn trong việc bảo quản, lưu thông, cung cấp giống, giải quyết được vấn
đề nan giải trong cung cấp và bảo quản giống cho các nhà máy sản xuất sữa chua
cũng như các lĩnh vực khác cần đến chế phẩm này. Trong phạm vi đề tài này em sẽ

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP


Đồ án tổng hợp

- 2-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

tiến hành nghiên cứu các điều kiện tối ưu để cố định 2 chủng vi khuẩn ST và LB
trên chất mang BC và khảo sát thời gian bảo quản, hoạt lực của chế phẩm vi khuẩn
lactic trên chất mang BC sau khi cố định và các mốc thời gian trong quá trình bảo
quản.
Sinh viên thực hiện

Lê Thị Bốn

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP


Đồ án tổng hợp

- 3-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về chất mang cellulose vi khuẩn (BC)
1.1.1. Khái quát chung về BC
1.1.1.1. Một số vi khuẩn sinh tổng hợp BC
BC được tổng hợp bởi một số vi khuẩn (bảng 1.1) (Theo Jonas và Farah,
1998). Con đường tổng hợp và cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở các lồi có kẽ giống
nhau, nhưng cấu trúc BC ở mỗi lồi thì khác nhau (Ross và cộng sự, 1991; Jonas và
Farah,1998). Có các điểm khác biệt đáng kể về thuộc tính vật lý của các sản phẩm
celluose, chủ yếu là chiều dài của chuỗi glucan (được đặc trưng bởi mức độ
polymer hóa), tính kết tinh và trạng thái tính chất của nó. Tùy thuộc vào mỗi loài
mà trạng thái kết tinh của cellulose khác nhau, từ đó xác định các tính chất vật lý
của sản phẩm như độ bền, độ hòa tan trong các dung mơi, tính chịu ảnh hưởng của
các tác nhân biến tính [2,3].
Bảng 1.1. Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn [2]
Giống
Acertobacter
Achromobacter
Aerobacter
Agrobacterium
Alcaligen
Pseudomonas
Rhizobium
Sarcina
Zoogloea

Cấu trúc cellulose

Lớp màng ngoại bào tạo thành các dãi
Sợi
Sợi
Sợi ngắn
Sợi
Các sợi khơng tách biệt
Sợi ngắn
Cellulose dị hình
Chưa xác định rõ cấu trúc

AX (A.aceti ssp. Xylinum, A.xylinus), là vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu nhất.
Gần đây nó đã được xếp vào giống mới Gluconacertobacter, bao gồm các loài là
G.xylinus (Yamada avf cộng sự, 1998,2000), G.hánenii, G.europaeus, G.oboediens
và G.intermedius [2,4].
1.1.1.2. Cấu trúc của BC
Cellulose là một polyme không phân nhánh bao gồm những gốc
glucopyranose nối với nhau bởi nối β – 1,4. Các nghiên cứu cơ bản về BC cho thấy
BC có cấu trúc hóa học giống y hệt PC (plant cellulose – cellulose thực vật). Tuy

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP


Đồ án tổng hợp

- 4-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

nhiên, cấu trúc đa phân và thuộc tính của BC khác với PC. Các sợi mới sinh ra của
BC kết lại với nhau để hình thành nên các sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng

khoảng 1,5 nm. Là những sợi mảnh nhất có nguồn gốc tự nhiên [Kudlicka, 1989].
Các vi sợi nằm trong các bó (budle), và cuối cùng hình thành các dải (ribbon)
(Yamanaka và cộng sự, 2000). Các dải có chiều dày 3 – 4 nm × chiều rộng 70 – 80
nm (Zarr,1977); 3,2 × 133 nm (Brown và cộng sự, 1976); 4,1 × 117 nm (Yumanaka
và cộng sự, 2000). Trong khi chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ
thông là 30.000 – 75.000 nm hay gỗ bulơ (Betula) là 14.000 – 40.000 nm (hình 1.1).
Những dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài thay đổi từ 1 – 9 µ m làm hình thành
nên cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các nối hydrogen. BC khác với PC về
chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa, thường BC có mức độ polymer hóa từ
2.000 – 6.000 (Jonas và Farah, 1998); một vài trường hợp đạt tới 16.000 – 20.000
(Watanabc và cộng sự 1998) trong khi mức polymer hóa ở thực vật là 13.000 –
14.000 (Teeri, 1997) [2,5].
Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy (Watanabe và cộng
sự, 1998a; Yamanaka và cộng sự, 2000). Ở điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn tổng
hợp những miếng cellulose trên bề mặt của dịch nuôi cấy, tại ranh giới giữa bề mặt
dịch lỏng và khơng khí giàu oxy. Các miếng BC này được gọi là BC trên môi
trường tĩnh ( S – BC: Static BC). Các sợi cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ
những lỗ được xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi,
và bị đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng. Các dải cellulose từ môi
trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song nhưng không tổ chức, có vai trị chống
đỡ cho quần thể tế bào AX (Jonas và Farah, 1998). Các sợi BC kế nhau được tạo ra
từ môi trường tĩnh nối với nhau và nhánh ít hơn các sợi BC được tạo từ môi trường
lắc (A – BC: Agitated – BC). A – BC được tạo ra dưới dạng các hạt nhỏ, các hạt
hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường (Vadamme và cộng
sự 1998). Các sợi đang lưới với nhau trong mơi trường lắc giống như mơ hình kẻ ơ,
có cả hai hướng song song và vng góc (Watanabe và cộng sự, 1998) [2,6].
Sự khác nhau về cấu trúc không gian ba chiều của hai dạng S – BC và A – BC
được quan sát rõ ràng hơn bằng kính hiển vi điện tử quét (scaning electron

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP

Đồ án tổng hợp

- 5-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

microscop). Những sợi BC kéo dài và chồng lên các sợi khác theo chiều đan chéo
nhau. Những sợi A – BC thì rối rắm và cong (Johnson và Neogi,1989) [2,6].
Ngồi ra, bề mặt cắt ngang của sợi A – BC (0,1 – 0,2 µ m) lớn hơn sợi S – BC
(0,05 – 0,10 µ m). Sự khác nhau về hình thái giữa hai loại BC này làm được mức
độ kết tinh, kích cỡ kết tinh của chúng khác nhau [2,7].
Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là Ι và ΙΙ , được phân
biệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ, và tia hồng ngoại ( Jonhson
và Neogi, 1989). Celluose Ι có thể chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II thì
khơng thể chuyển thành cellulose I [2,7].
M.J. Sheu & S.P. Tai, National Taiwan University đã nghiên cứu các tính chất
của BC như độ cứng, độ dính, độ dai, và ảnh hưởng của các dung dịch đường, muối,
và các chất gum (HM pectin, LM pectin) lên tính chất của BC. Các mảnh BC có độ
cứng là 3,68 kg, độ dính 0,37 kg, độ dai 0,36 kg (các chỉ số tương ứng theo thứ tự ở
mực tươi là 3,02 kg, 0,34 kg, 0,23 kg). Độ cứng của các miếng BC giảm khi chúng
được nhúng vào dung dịch đường, HM pectin, LM pectin, carrageenan, và độ cứng
tăng khi được nhúng vào dung dịch muối [2,8].

Hình 1.1. Cấu trúc cellulose (a) của vi khuẩn (BC) ( × 20000 lần) và (b) của thực
vật (PC) ( × 200 lần) [2,8].
1.1.1.3. Sinh tổng hợp BC
Sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hịa một
cách chuyên biệt và chính xác, liên quan đến một số lớn enzym, các phức hợp xúc

tác và các protein điều hịa. Tiến trình này bao gồm sự tổng hợp uridine

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP


Đồ án tổng hợp

- 6-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

diphosphoglucose (UDPClc), tiền chất của cellulose, tiếp đến là sự polymer hóa
glucose vào chuỗi β – 1,4 – glucan, và sự kết hợp các sợi mới vào dải (ribbon),
được hình thành từ hàng trăm, thậm chí hàng ngàn sợi cellulose riêng lẽ. Con đường
và cơ chế của sự tổng hợp UDPGlc tương đối được biết nhiều, trong khi đó cơ chế
phân tử của sự polymer hóa glucose vào mạch dài và các mạch nhánh, sự đẩy ra bên
ngoài tế bào của chúng, và sự kết hợp thành sợi cần được làm sáng tỏ hơn [2,9].
Cellulose được tổng hợp từ AX là sản phẩm cuối cùng của sự biến dưỡng
carbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý tế bào liên quan đến hoặc là chu trình
pentose phosphate hoặc là chu trình Krebs, đi kèm với quá trình sinh tạo glucose
(Ross và cộng sự, 1991; Tonouchi và cộng sự, 1996) (hình 1.2). Quá trình glycose
giải khơng hoạt động ở vi khuẩn acid acetic bởi vì nó khơng tổng hợp được enzym
quan trọng của con đường này đó là phosphofructose kinase (Ross và cộng sự,
1991). Ở AX, sự tổng hợp cellulose liên hệ chặt chẽ với tiến trình dị hóa oxit hóa và
tiêu thụ khoảng 10% năng lượng có nguồn gốc từ những phản ứng dị dưỡng
(Weinhouse, 1977). Sự tổng hợp BC không gây trở ngại cho các q trình đồng hóa
khác, bao gồm sự tổng hợp protein. (Ross và cộng sự, 1991) [2,10].
AX chuyển nhiều phức hợp carbon như: hexose, glycerol, dihydroxyacetone,
pyruvate, và các dicarboxylic acid thành cellulose, thường có hiệu suất 50%.
Dicsarboxylic acid đi vào chu trình Krebs nhờ vào quá trình decarboxyl hóa để

thành pyruvate, chuyển thành hexose thơng qua con đường sinh tạo glucose, tương
tự đối với glycerol, dihydroxyacetone, và các hợp chất trung gian của chu trình
pentose phosphate [2,10].
Tiền chất trực tiếp của cellulose là UDPGlc (uridine diphosphoglucose), là
sản phẩm của con đường phổ biến ở các sinh vật , bao gồm cả thực vật, liên quan
đến sự phosphoryl hóa glucose thành glucose – 6 – phosphate, được xúc tác bởi
glucokinase, tiếp đến là q trình đồng phân hóa hợp chất này thành glucose – α – 1
– phosphate, được xúc tác bởi phosphoglucomutase, và cuối cùng chuyển thành
UDPGlc bởi enzym UDPGlc pyrophosphorylase. Enzym cuối cùng này dường như
quan trọng liên quan đến quá trình tổng hợp BC, bởi vì một vài đột biến khơng tổng
hợp cellulose (Cel) thiếu enzym này (Valla và cộng sự, 1989). Hơn nữa, hoạt động

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP


Đồ án tổng hợp

- 7-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

của pyrophosphorylase thay đổi ở những chủng AX khác nhau và hoạt động cao
nhất được phát hiện ở các sinh vật tổng hợp cellulose hữu hiệu nhất, như là AX ssp.
Sucrofermentans BPR 2001. Chủng này thích sử dụng frutose hơn, biểu lộ sự hoạt
động cao của phosphoglucomerase, và có một hệ thống phosphotransferase. Hệ
thống này chuyển fructose thành frutose – 1 – phosphate và tiếp đến là fructose –
1,6 – biphosphate (hình 1.2) [2,11].

Hình 1.2. Sơ đồ các con đường tổng hợp cellulose bởi AX [2,12]
CS: Cell lulose synthase

FK: Fructokinase
FBP: Fructose – 1,6 – biphosphate G6PDH: Glucose – 6 – phosphate
phosphatase
GK: Glucokinase
PGM: Phosphoglucomutase
PTS: Hệ thống của phosphotransferase
Fru – bi – P: Fructose

dehydrogenase
IPFK: Frutose – 1 – phosphate kinase
PGI: Phosphoglucoisomerase
UGP: UDP – glucose

pyrophosphorylase
– 1,6 – bi – Glc – 6 – P: Glucose – 6 – phosphate

phosphate
Fru – 6 – P: Fructose – 6 – phosphate
Glu – 1 – P: Glucose – 1 – phosphate
PGA: Phosphogluconic acid
UDPGlc: Uridine diphosphoglucose
1.1.1.4. Các ứng dụng của BC và triển vọng

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP


Đồ án tổng hợp

- 8-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

Trong thực phẩm:
Sản phẩm được sử dụng trong nước ép trái cây và những thuốc uống khác,
trong mứt kẹo, kem, yoghurt, salad, thức ăn tráng miệng. BC có tác dụng như chất
làm đặc, vật liệu ổn định dịch huyền phù, vật liệu làm vỏ bọc thực phẩm [2,20].
F.Yoshinaga và cộng sự (1997) so sánh tác động giữ ổn định dịch huyền phù
của BC với các vật liệu khác như xanhangum, sorbtol monolaurate, MCC
(microcystalline cellulose) và FMC (microfibrilated). MCC và MFC là các celluose
có nguồn gốc từ celluose thực vật. Họ nhận thấy rằng, BC có tác dụng giữ ổn định
dịch huyền phù ở các nồng độ muối khác nhau. Trong khi đó sorbitan mơnlaurate
khơng giữ được dịch huyền phù ở pH = 2 hoặc dịch huyền phù ở 20 0C. Xanthangum
không ổn định được dịch huyền phù sau khi được hấp vơ trùng ở 1200C trong 20
phút. Với đặc tính ổn định dịch hyền phù, BC có triển vọng là một vật liệu công
nghệ mới triển vọng cho tương lai [2,20].
Đề tài do tác giả Nguyễn Thúy Hương (Đại học Bách khoa TP.HCM) thực
hiện nhằm thử nghiệm cố định tế bào vi khuẩn AX trên giá thể cellulose vi khuẩn
do chính nó sản sinh ra để tạo chế phẩm phục vụ nhân giống nhanh và hiệu quả.
Với việc tạo màng thực phẩm, tác giả lên men bề mặt, thu hoạch màng sau 1
ngày nuôi cấy. Qua thực nghiệm cho thấy, nồng độ chế phẩm giống là 2% có thể tái
sử dụng lên men thu nhận cellulose vi khuẩn 7 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời
gian, sản lượng, chất lượng BC và hồn tồn khơng có sự khác biệt so với chế phẩm
dịch giống truyền thống. Ở Việt Nam, chế phẩm giống AX có ý nghĩa đối với các cơ
sở sản xuất thạch dừa trong việc chủ động nguồn giống, hạ giá thành do chế phẩm
có khả năng tái sử dụng 7 lần. Màng BC thu nhận bằng phương pháp lên men bề
mặt, 1 ngày. Sau khi xử lý màng thực phẩm BC đạt giá trị cảm quan, có độ chịu lực
cao và khơng bị biến tính khi xử lý nhiệt. Sử dụng màng BC làm màng bao xúc xích
được đánh giá tốt. Dùng BC làm màng bảo quản dừa tươi giữ nguyên chất lượng
sau 2 tuần bảo quản ở nhiệt độ phòng và 4 tuần bảo quản ở nhiệt độ mát.
Sử dụng màng BC hấp phụ Bacterionic 200Au/ml có thể bảo quản 3 ngày

thịt tươi sơ chế tối thiểu ở nhiệt độ mát. Sản phẩm sữa chua uống với nồng độ bột

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP


Đồ án tổng hợp

- 9-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

BC 0,5% đạt chất lượng về chỉ tiêu cảm quan, không tách lớp, dung dịch đồng nhất
trong thời gian bảo quản [Theo Tạp chí Sinh học, số 1/08].
Trong y học:
Màng BC thu được từ q trình ni cấy tĩnh được nghiên cứu và sử dụng
làm da nhân tạo nhờ đặc tính thấm cao từ lớp màng có độ kết lớp chặt chẽ. Sau khi
thanh trùng, tẩm vào lớp màng BC một số thuốc và hóa chất, lúc này BC là một lớp
da nhân tạo dùng đắp vết thương [2,20].
Bộ môn Vi sinh – Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, đã thử nghiệm
thành công một loại màng sinh học trị bỏng từ vi khuẩn AX, được phân lập trong
nước sản xuất thạch dừa và nhiều loại nước trái cây khác. Với màng trị bỏng này,
thời gian liền vết thương chỉ còn 2 – 3 ngày so với 7 ngày khi dùng băng gạc tẩm
thuốc. Nhóm nghiên cứu đã sản xuất thành công những tấm màng sinh học dai, khô
ráo, mỏng 1 – 1,5 mm, diện tích 10 cm x 10 cm, với khả năng chống nhiễm khuẩn
và thoát nước tốt. Để kiểm tra tác dụng của màng này, người ta đã gây bỏng độ 2
(với nhiệt độ khô) trên lưng thỏ, sau đó đắp màng sinh học lên vết thương và thay
băng hằng ngày. Kết quả rất bất ngờ: Ngày thứ ba vết thương không phồng nước,
ngày thứ năm vết thương khơ ráo và đến ngày thứ 9 thì vết bỏng co lại đáng kể,
khơng có mùi hơi, khơng nhiễm trùng. Điều này thực sự mang lại hy vọng cho bệnh
nhân bỏng [19].

Trong công nghiệp dệt: BC dùng trong việc dệt vải cao cấp [13].
Trong phịng thí nghiệm: Mơi trường nuôi cấy mô, cố định các vi sinh vật,
một số loại enzym [2,22].
Trong công nghệ gỗ: Gỗ nhân tạo (gỗ ván dát mỏng), thay thế các sản phẩm
của rừng [2,21].
Trong sản xuất giấy đặc biệt: Sử dụng trong sản xuất một số loại giấy đặc
biệt nhờ tính hút và giữ mực cao (Jonhsons & cộng sự). Mitsubishi Paper Mils
(Nhật Bản) liên kết với Ajinomoto Co. để phát triển sản phẩm giấy từ cellulose vi
sinh vật (patent JP63295793). Ngoài ra BC cịn được sử dụng trong vẽ, in, chất
dính, và chất xơ trên trang vẽ như giấy phủ làm bề mặt láng trong công nghệ in
(Connon & Anderson, 1991) [2,21].

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP


Đồ án tổng hợp

- 10-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

1.1.1.5. Đặc tính của chất mang BC
BC là chất mang truyền thống trong kĩ thuật cố định tế bào, nó có nhiều ứng
dụng trong các lĩnh vực như: Y học, môi trường và một số ngành công nghiệp khác
(Yoshinaga et, al, 1997). BC có nhiều đặc tính tốt của một chất mang trong cố định
tế bào vi sinh vật như: độ tinh khiết cao, có khả năng hút giữ ẩm tốt nhờ cấu trúc
mạng lưới cellulose, khả năng đàn hồi tốt, có tính chất cơ lý bền, dễ dàng phù hợp
với thiết bị phản ứng sinh học, có hả năng tái sử dụng và an toàn sinh học
(Krystynowicz, craja, 2002). So sánh với nhiều chất khác trong kĩ thuật cố định tế
bào vi sinh vật cho thấy BC phù hợp với các tiêu chuẩn cơ bản và BC có chức năng

bảo vệ tế bào ( Yoshinaga,et, at 1997). Ở Việt Nam tính chất đặc trưng của BC đã
được áp dụng để cố định tế bào vi sinh vật rất hiệu quả [4].

Hình 1.3. Màng BC ướt đang được gỡ bỏ từ môi trường nuôi cấy [12]
1.1.2. Nguyên liệu sản xuất BC
– Giống vi khuẩn: AX
Sơ lược về AX

 Lớp

: Shizomycetes

 Bộ

: Pseudomonadales

 Bộ phụ : Pseudomonadieae
 Họ

: Pseudomonadaceae [2,4].

AX có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc không di động
và không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn gram âm, nhưng gram của chúng có thể
biến đổi do tế bào già đi, hay do điều kiện môi trường AX thuộc loại vi khuẩn hiếu

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP


Đồ án tổng hợp

- 11-

GVHD: ThS. Ngơ Thị Minh Phương

khí bắt buộc, nên chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa mơi trường lỏng và mơi
trường khí [2,4].
Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của AX : (1) phản ứng catalase dương tính, (2)
oxy hóa ethanol thành CO2 và H2O, (3) không tăng trưởng trên môi trường Hoyer,
(4) không tạo sắc tố nâu, (5) tổng hợp cellulose [2,4].

Nguyên liệu
Hình 1.4. Cấu tạo của AX được bao bọc bởi cellulose [18]
Nhiệt độ tối ưu để AX phát triển là từ 25 – 300C và pH từ 5,4 – 6,3. Theo
Hestrin (1947), pH tối ưu của AXLọc
là 5,5 và chúng khôg phát triển ở nhiệt độ 37 0C
ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Còn theo Maccomide (1996), AX có
thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 – 8, nhiệt độ từ 12 – 350C và nồng độ ethanol
Nước trong
DAP, SA
Trộn đều
có thể tới 10% [2,5].
Khi ni trên mơi trường đặc, lúc tế bào cịn non, khuẩn lạc mọc riêng rẽ,
nhầy và trong suốt, xuất hiện
3 ––515phút
ngày. Khi già, tế bào mọc dính nhau thành
Đun sau
sơi 10
từng cụm và khuẩn lạc mọc theo đường nuôi cấy [2,5].
– Môi trường lên men:
Đểdừa

nguội
Nguyên liệu cổ điển: Nước
già.
Quá trình tiến hành lên men theo quy trình tham khảo sau:
Cho axit acetic

Giống

Cấy giống

Nhân giống

Lên men 28 – 300C
trong 9 – 15 ngày
SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP
Thạch dừa thô


Đồ án tổng hợp

- 12-

GVHD: ThS. Ngơ Thị Minh Phương

Hình 1.5. Quy trình sản xuất thạch dừa [19]
Nguồn nguyên liệu chính sản xuất thạch dừa là nước dừa già (dừa khô) vào
khoảng từ 10 – 12 tháng tuổi. Đây là phế phẩm của các nhà máy cơm dừa nạo sấy,
cơ sở sản xuất kẹo dừa, kẹo chuối, mứt, bánh phồng… Q trình sản xuất thạch dừa
góp phần giải quyết ơ nhiễm môi trường của các nhà máy, doanh nghiệp trên [13].
Nguyên liệu phụ là các chất bổ sung dinh dưỡng như đường (saccharose),

dấm (acid acetic), Sunfat Amon (S.A), DiAmonPhotphat (DAP). Không thể thiếu
dung dịch nước giống thạch dừa được nhân ra từ ống nghiệm [13].
Hiện nay BC đã được nghiên cứu sản xuất từ các nguồn khác nhau như: Từ rỉ
đường, nước mía, dịch thải trái cây để cải thiện tình trạng thiếu nguyên liệu do

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP


Đồ án tổng hợp

- 13-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

khoảng cách về mặt địa lý, tận dụng nguồn phế phẩm, giải quyết được vấn đề ô
nhiễm môi trường [3].
Trong đề tài này tôi sử dụng các nguyên liệu sau: Đường saccharose, trà túi
lọc lipton, nước, giống vi khuẩn Acetobacter xylinum trong bộ sưu tập giống của
trường Cao đẳng Công nghệ – Đại học Đà Nẵng. Theo tỷ lệ như sau: Cứ ½ kg
đường tơi nấu với 4 lít nước, và kèm theo một gói trà túi lọc lipton nhãn vàng.

Hình 1.6. Trà túi lọc lipton

Hình 1.7. Đường saccharose

1.2. Giới thiệu về vi khuẩn ST và LB
1.2.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Streptococcus thermophillus và
Lactobacillus bulgaricus
1.2.1.1. Streptococcus thermophillus (ST)
Là vi khuẩn có tế bào gram (+), có khả năng bắt màu thuốc nhuộm, hình cầu

đơn hoặc đơi hoặc xếp đi nhau tạo thành chuỗi, khơng di động.

Hình 1.8. Streptococcus thermophillus

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP


Đồ án tổng hợp

- 14-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

1.2.1.2. Lactobacillus bulgaricus (LB)
Là vi khuẩn có tế bào gram (+), có khả năng bắt màu thuốc nhuộm, hình que,
khơng di động.

Hình 1.9. Lactobacillus bulgaricus
1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Streptococcus thermophillus và
Lactobacillus bulgaricus
Hai chủng vi khuẩn trên đều là vi khuẩn hiếu khí, lên men đồng hình và chịu
được nồng độ acid thấp (pH = 4 – 4,5). Cả hai sống cộng sinh với nhau và hỗ trợ lẫn
nhau [11,5].
 Streptococcus thermophillus
Phát triển tốt ở nhiệt độ 500C và sinh sản tốt ở nhiệt độ 37 – 40 0C, đây là vi
khuẩn chịu nhiệt lên men điển hình, có thể chịu được nhiệt độ đun nóng ở 65 0C
trong 30 phút, nhưng chỉ có thể phát triển được trong môi trường acid thấp hơn
LB [11,4].
 Lactobacillus bulgaricus
LB cũng là vi khuẩn lên men điển hình, phát triển tốt ở nhiệt độ 40 – 50 0C,

trong mơi trường có độ acid cao. Lồi này có khả năng tạo ra khối sữa chua 2,7%
acid lactic từ đường lactose. Loài LB có khả năng thủy phân casein thành một số
acid amin, trong đó việc tạo thành valin là quan trọng nhất, nó như một chất kích
thích cho lồi ST phát triển. Vì thế trong quá trình lên men sữa chua, việc cấy hỗn
hợp hai loài này cho kết quả sinh acid lactic tốt hơn khi cấy riêng từng loài [11,4].
1.3. Các phương pháp bảo quản vi sinh vật

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP


Đồ án tổng hợp

- 15-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

Mục đích của bảo quản giống vi sinh vật là sau q trình bảo quản các tính
trạng quan trọng của giống khơng bị mất hoặc bị giảm.
Để làm được điều đó, người ta tiến hành các biện pháp dựa trên nguyên tắc
làm giảm quá trình trao đổi chất và làm giảm q trình hơ hấp của vi sinh vật, người
ta chú ý đến tác động mạnh lên hai quá trình này, trong đó ba yếu tố được quan tâm
nhiều nhất là: Nhiệt độ, độ ẩm, lượng khơng khí tiếp xúc trực tiếp. Ngồi ra cịn một
số yếu tố khác cũng được quan tâm đúng mức.
Để bảo quản vi khuẩn ST và LB người ta thường dùng một trong các số
phương pháp sau:
1.3.1. Phương pháp cấy chuyền và bảo quản lạnh
Hầu hết các cơ sở sản xuất và nghiên cứu rất nhiều phương pháp này trong
giữ giống vi sinh vật. Nguyên tắc này là dựa trên sự trao đổi chất theo một khoảng
thời gian nhất định. Sau một khoảng thời gian lặp lại công việc trên. Cách này tỏ ra
hiệu quả đối với nhiều vi sinh vật [18].

Trước khi đem bảo quản, người ta thường cấy truyền giống vi sinh vật vào 3
– 5 ống nghiệm thạch nghiêng, nuôi chúng ở nhiệt độ thích hợp (thường ni ở
nhiệt độ 370C) cho đến khi tạo được lượng sinh khối lớn nhất, sau đó bảo quản ở
nhiệt độ lạnh khoảng 40C. Sau một tháng cấy truyền và lặp lại như trên. Nếu kéo
dài, giống dễ bị thối hóa vì độ ẩm mơi trường thạch rất dễ bị giảm trong quá trinh
bảo quản lạnh [18].

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP


Đồ án tổng hợp

- 16-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

1.3.2. Phương pháp bảo quản đơng khơ
Đơng khơ là q trình mà nước được lấy
ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh
sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong mơi
trường thích hợp và được làm lạnh trong môi
trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút
nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức
nhất định. Mẫu được hàn kín để cho mơi trường
chứa mẫu là chân khơng [18].

Hình 1.10. Đơng khơ vi khuẩn

Ngồi phương pháp đơng khơ như mơ tả ở trên, cịn có phương pháp đông
khô trực tiếp. Khác biệt với phương pháp trên ở chỗ dịch huyền phù vi sinh vật

được làm khô nhanh ở chế độ chân khơng thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ
trước. Phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với nhóm vi khuẩn khơng có khả
năng sống trong nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông. Các thông số quan trọng cần
được quan tâm khi thực hiện phương pháp này là:
– Tuổi của vi sinh vật bảo quản.
– Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật.
– Tốc độ đông khô.
– Nhiệt độ đông khô thấp nhất.
– Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu [18].
1.3.3. Phương pháp bảo quản lạnh sâu
Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi
sinh vật được bảo quản trong mơi trường dịch thể và
nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt
ở nhiệt độ lạnh sâu (–196°C đến –800C). Với phương
pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và
làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là
Hình
1.11.các
Bảo
quản
việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình
thành
tinh
thể lạnh
nướcsâu
trong tế bào [18].

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP

Đồ án tổng hợp

- 17-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

1.3.4. Phương pháp cố định trên chất mang
Các tế bào vi sinh vật được bám dính trên chất mang bằng nhiều phương
pháp, sau đó mẫu được mang đi sấy khơ ở nhiệt độ thích hợp sao cho khơng làm
chết lượng vi sinh vật đã được cố định trên chất mang. Sau đây là một số ví dụ cụ
thể:
Trên đất, cát và silicagel: Các nghiên cứu cho thấy là bào tử nấm có thể sống
4 – 5 năm khi bị làm khơ trong đất mà khơng bị thay đổi các đặc tính sinh học.
Ngày nay silicagel là chất mang được dùng phổ biến và có hiệu quả đối với bảo
quản nấm men, nấm sợi [18].
Bảo quản trên giấy: Các chủng nấm men và nấm sợi được làm khơ trên giấy
và sau đó được bọc bằng giấy bạc và đựng trong hộp kín. Ưu thế của phương pháp
này là bảo quản được lượng mẫu lớn [18].
Bảo quản trên gelatin: Để thực hiện phương pháp này, người ta tạo dịch
huyền phù chủng vi sinh vật trong mơi trường có gelatin. Sau đó các giọt mẫu được
làm khơ trong đĩa petri. Phương pháp này có thể bảo quản được vi khuẩn trong vài
năm [18].
Bảo quản trên BC: Để thực hiện phương pháp này, người ta tạo dịch huyền
phù chủng vi sinh vật trong môi trường ni cấy vi sinh vật thích hợp. Sau đó bằng
phương pháp bẫy – hấp phụ, người ta nhốt vi sinh vật vào trong giá thể BC. Sau đó
sấy khơ mẫu ở nhiệt độ thích hợp cho từng lồi vi khuẩn. Đối với phương pháp bảo
quản trên chất mang BC, vi sinh vật được cố định có khả năng bám dính rất cao và
nó thích hợp với nhiều loại vi sinh vật như nhiều loài vi khuẩn lactic, nấm men
Saccharomyces cerevisae N28 [5].
1.3.4.1. Các nguyên liệu thường dùng làm chất mang

Nguyên liệu tự nhiên: Xơ dừa, vỏ bưởi, táo, cát, đất sét vô trùng, các loại hạt
ngũ cốc…
Nguyên liệu đã qua xử lý: Aliganate, pectin, kết hợp trên phức chất mang
Aliganate – BC, gelatin…

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP


Đồ án tổng hợp

- 18-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

1.3.4.2. Ưu điểm của vi sinh vật cố định so với vi sinh vật tự do
Tế bào sau khi cố định có thể tái sử dụng nhiều lần, khơng lẫn vào sản phẩm
và có thể ngừng phản ứng theo ý muốn [6].
Có thể vận chuyển và lưu thơng dễ dàng, mỗi lần sử dụng khơng cần phải
hoạt hóa lại khi tiến hành lên men sản phẩm.
1.3.4.3. Ưu điểm nổi trội của chất mang BC khi dùng cố định vi khuẩn
 BC là nguồn nguyên liệu rẻ tiền, độ tinh khiết cao và rất chủ động
được nguyên liệu để sản xuất BC, lên men từ nhiều cơ chất khác nhau
[3].
 BC hội đủ những điều kiện cần thiết mà một chất mang cần: Khơng
độc, an tồn vệ sinh thực phẩm, đàn hồi, cấu trúc sợi rất phù hợp để vi
sinh vật bám trên hệ thống sợi này, BC có khả năng hút ẩm và trữ môi
trường tốt nên rất thuận tiện để làm giá thể cho vi khuẩn cố định trên
chất mang này [4].
1.4. Tình hình nghiên cứu và cố định vi khuẩn trên chất mang BC trong và
ngồi nước

Tình hình nghiên cứu cố định vi sinh vật trên chất mang BC tại Việt Nam
ngày càng nhân rộng trên nhiều đối tượng vi sinh vật, hiện tại đã có nhiều đề tài
nghiên cứu rất thành công:
Đề tài “Một số ứng dụng của cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose – BC)
trong lĩnh vực thực phẩm” do tác giả Nguyễn Thúy Hương (Đại học Bách Khoa
TP.HCM) thực hiện nhằm cố định tế bào vi khuẩn AX trên giá thể cellulose vi khuẩn
do chính nó sản xuất ra để chế tạo chế phẩm phục vụ nhân giống nhanh và hiệu quả.
“Thu nhận Bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococus
lactic cố định trên chất mang BC và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tối
thiểu” (Nguyễn Thúy Hương – Trần Thị Tưởng An) trường Đại học Bách Khoa,
ĐHQG – HCM).
Cố định vi khuẩn Oenococcus oeni bằng phức chất mang alginate – bacterial
cellulose để ứng dụng lên men malolactic” (Nguyễn Thúy Hương – Thái Thịnh
Thượng Trí), Đại học Bách khoa, ĐHQG – HCM.

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP


Đồ án tổng hợp

- 19-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

“Nghiên cứu cố định nấm men Saccharomyces cerevisae N28 bằng chất
mang BC và bước đầu ứng dụng trong lên men rượu vang” (Nguyễn Thúy Hương –
Bùi Thị Thanh Hương), Đại học Bách khoa, ĐHQG – HCM.

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP

Đồ án tổng hợp

- 20-

GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu hóa chất
 Nguyên liệu
– Chủng vi khuẩn lactic: Streptococcus thermophillus và Lactobaccillus
bulgaricus được phân lập từ canh trường sữa chua vinamilk.
–

Chất mang BC sản xuất từ vi khuẩn Acetobacter xylinum.

– Môi trường tuyển chọn để hoạt hóa hai chủng vi khuẩn lactic trên trong
bảng 1.1 phụ lục.
– Sữa đặc có đường, nước giếng tốt.
 Hóa chất
NaOH 10%, NaOH 0,1N, HCl, thuốc nhuộm xanh metylen, cồn 96 0, giấy
pH, phenolphtalein, giấy lọc, nước cất, bông thấm nước và không thấm nước.
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị thường dùng
– Các dụng cụ thường dùng như: Ống nghiệm, đĩa petri, pipet, bình tam giác,
que gạt, ống thủy tinh, ống cao su, buret 25ml, cốc thủy tinh…
tủ sấy ở 120 – 1600C.
– Bếp điện, đèn cồn, que cấy, lưới amiăng, tủ sấy, nồi hấp vơ trùng.
– Cân phân tích và cân kỹ thuật.
– Tủ ấm: Có khả năng duy trì nhiệt độ ổn định trong suốt thời gian nuôi cấy

khoảng 25 – 280C và 370C, thường dùng để nuôi dưỡng các chủng vi sinh vật làm
giống trong sản xuất, kiểm tra vô trùng và kiểm tra các loại vi sinh vật tạp nhiễm.
– Tủ lạnh: Để giữ giống, giữ các dung dịch nuôi cấy chưa các kịp kiểm tra, giữ
các mẫu sản phẩm…
Chú ý các thiết bị và dụng cụ cần phải được khử trùng. Các dụng cụ sau khi
rửa sạch. Phương pháp khử trùng các dụng cụ này là bằng khơng khí nóng trong các
tủ sấy ở 120 – 1600C.

SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP