LUẬN văn THẠC sĩ SINH học (FULL) phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân keratin từ lông vũ gia cầm và thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện keratinase trong TBVK e coli

Luận văn Thạc sĩ khoa học

LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân và sâu sắc tới TS. Nguyễn Huy Hồng
– Phó trưởng Phịng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN
Việt Nam, là người thầy_người anh đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo mọi
điều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt q
trình nghiên cứu và hồn thành luận văn.
Trong q trình nghiên cứu vừa qua, em đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ
bảo tận tình của các cán bộ Phịng Vi sinh vật đất, đặc biệt là Th.S. Nguyễn
Quỳnh Mai, CN. Nguyễn Thu Hiền đã giúp đỡ em trong q trình tiến hành
thí nghiệm.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo tham gia giảng dạy tại
Khoa Sinh-KTNN Đại Học Thái Nguyên- ĐH Sư Phạm Thái Nguyên- Khoa
đào tạo sau đại học đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt 2
năm qua.
Bên cạnh đó, em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới BGH cùng tồn
thể cán bộ giáo viên trường THPT Điềm Thụy, Phịng ADT ứng dụng thuộc
Phịng thí nghiệm trọng điểm CNG đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em
trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường và Viện
Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ và những người thân trong gia đình
lịng biết ơn sâu sắc, cảm ơn những người bạn đã chia sẻ khó khăn thử thách
trong cuộc sống và cơng việc để em có được kết quả này.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 09 năm


MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

iv

Danh mục các bảng

v

Danh mục các hình

vi

MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................3
1.1. Keratin...................................................................................................3
1.2. Keratinase..............................................................................................6
1.3. Đa dạng vi sinh vật có khả năng sinh keratinase cao...............................8
1.4. Tình hình nghiên cứu..........................................................................12

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước.....................................................12
1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới...................................................13
1.5. Sản xuất và ứng dụng q trình thuỷ phân keratin trong lơng vũ..........14
1.5.1. Tăng hàm lượng chất dinh dưỡng trong thức ăn gia súc..................17
1.5.2. Tạo phân bón..................................................................................17
1.5.3. Tạo enzyme trong các ngành cơng nghiệp.....................................18
1.5.4. Cải tạo đất......................................................................................18
1.5.6. Tạo hợp chất màu...........................................................................19
1.5.7. Ứng dụng trong công nghiệp dược và sản xuất thực phẩm chức năng...
19
PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP.....................................20
2.1. Nguyên liệu.........................................................................................20
2.1.1. Nguyên liệu....................................................................................20
2.1.2. Hoá chất..........................................................................................20
2.1.3. Thiết bị...........................................................................................20

i


2.1.4. Môi trường nuôi cấy.......................................................................20
2.1.4.1. Môi trường Broth Peptone..........................................................20
2.1.4.2. Môi trường I................................................................................20
2.1.4.3. Môi trường II..............................................................................21
2.1.4.4. Môi trường III.............................................................................21
2.1.4.5. Môi trường để phân lập chủng Chryseobacterium......................21
2.1.4.6. Môi trường nuôi lắc lông vũ.......................................................21
2.1.4.7. Môi trường MPA.........................................................................21
2.2. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................22
2.2.1. Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao...............22
2.2.1.1. Lấy mẫu và đo pH đất................................................................. 22

2.2.1.2. Phân lập chủng vi khuẩn Chryseobacterium...............................22
2.2.1.3. Phân lập chủng vi khuẩn Vibrio.................................................. 23
2.2.1.4. Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus...............................................23
2.2.2. Xác định khả năng thuỷ phân lông vũ............................................23
2.2.2.1. Nuôi giống cấp 1 vào môi trường MPA......................................23
2.2.2.2. Xác định mật độ tế bào............................................................... 25
2.2.3. Lựa chọn mơi trường thích hợp cho các chủng vi khuẩn có khả
năng sinh keratinase cao.............................................................................25
2.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên khả năng sinh trưởng của vi
khuẩn thủy phân lơng vũ............................................................................26
2.2.5. Xác định đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn...................... 26
2.2.6. Xác định gram âm và gram dương của vi khuẩn.............................26
2.2.6.1. Phương pháp Hucker cải tiến......................................................26
2.2.6.2. Xác định bằng cách kiểm tra độ kết dính....................................27
2.2.7. Phương pháp phân loại vi khuẩn theo đặc tính sinh hố..................28
2.2.8. Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu hiện pET32a................30
2.2.8.1. Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn.............................30
2.2.8.2. Nhân bản đoạn DNA bằng PCR.................................................32
ii


2.2.9. Phân tích hoạt tính keratinase ngoại bào........................................38
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................41
3.1. Kết quả lấy mẫu ở các địa điểm............................................................41
3.2. Giá trị pH của các mẫu đất....................................................................41
3.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả thủy phân keratin. .42
3.4. Lựa chọn mơi trường thích hợp của các chủng được chọn lọc..............44
3.5. Tối ưu nhiệt độ của các chủng vi khuẩn chọn lọc.................................47
3.6. Đặc điểm hình thái nhóm vi khuẩn thuỷ phân lơng vũ..........................48
3.7. Kết quả xác định gram của các chủng vi khuẩn....................................49

3.8. Phân loại các chủng phân lập theo phương pháp sinh hoá....................50
3.8.1. Phân loại theo kit API 50CHB của chủng vi khuẩn Đ.GT.2.2.........50
3.8.2. Phân loại theo kit API 20NE của chủng vi khuẩn L.SC.1.2............51
3.9. Phân loại theo kiểu gene........................................................................52
3.9.1. Tách DNA tổng số.........................................................................52
3.9.2. Nhân đoạn gene mã hóa 16S rARN bằng kỹ thuật PCR..................53
3.10. Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu hiện pET32a..................55
3.10.1. Nhân đoạn gene keratinase bằng kỹ thuật PCR...........................55
3.10.2. Gắn sản phẩm PCR đã thôi gel tinh sạch vào vector tách
dòng pET32a...........................................................................................56
3.10.3. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến DH10B....................58
3.10.4. Tách DNA plasmid tái tổ hợp......................................................59
3.11. Đánh giá hoạt tính ezyme dịch thơ của chủng chọn lọc....................60
3.11.1. Định lượng Protein bằng phương pháp Bradford........................60
3.11.2. Thử hoạt tính enzyme bằng azokeratin........................................62
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................64
4.1 Kết luận..................................................................................................64
4.2 Kiến nghị................................................................................................64
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................65

3


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

EtBr

Dung dịch Ethidium Bromide

BSA

Bovine serum albumin

DNA

Deoxyribonucleic axid

rARN

Ribosomal ribonucleic acid

LB

Luria-Bertani

Ker

Keratinase

bp

Base pair(cặp ba zơ)

E.coli

Escherichia coli.

µl

Microlit

EtOH

Ethanol

Primer-F

Mồi xi

Primer-R

Mồi ngược


DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Sự đa dạng của vi sinh vật có khả năng sinh

9

keratinase và các đặc tính hóa sinh của keratinase
1.2

Ứng dụng của enzyme

16

2.1

49 phép thử lên men API 50 CHB

28

2.2

50 phép thử sinh hóa API 20 CHB

31

3.1

Địa điểm lấy mẫu

41

3.2

Giá trị pH của các mẫu đất

41

3.3

Tỷ lệ thủy phân lông vũ của các chủng tuyển chọn

43

3.4

Mật độ tế bào và khả năng thủy phân 1 gam lông vũ

47

ở các nhiệt độ khác nhau(Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)
3.5

Kết quả xác định gram âm, gram dương

50

3.6

Kết quả phép thử sinh hóa theo kit API 50 CHB của

50

chủng Đ.G.T.2.2
3.7

Kết quả phép thử sinh hóa theo kit API 50 CHB của

52

chủng L.SC.1.2
3.8

Kết quả đo giá trị mật độ quang (OD) của BSA

61

3.9

Kết quả đo giá trị mật độ quang (OD) và hàm lượng

62

protein của dịch nổi vi khuẩn
3.10

Kết quả xác định hoạt tính enzyme keratinase

63


Luận văn Thạc sĩ khoa học

HVCH: Nguyễn Thị Minh

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Số hiệu hình vẽ

Tên hình vẽ

Trang

1.1

Một số hình dạng lơng vũ

3

1.2

Cấu tạo phân tử keratin

5

1.3

Ảnh dưới kính hiển vi các sợi bên trong tế bào

6

keratin
1.4

Cấu tạo phân tử enzyme keratinase

7

3.1

Khả năng thủy phân lông vũ của 4 chủng chọn lọc

44

(Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)
3.2

Khả năng sinh trưởng và thủy phân lông vũ của

46

các chủng vi khuẩn trên các môi trường khác nhau
(Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)
3.3

Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi

46

khuẩn trên các môi trường khác nhau (Sau 4 ngày
nuôi cấy lắc)
3.4

Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi

48

khuẩn các khung nhiệt độ khác nhau (Sau 4 ngày

ni cấy lắc)
3.5

Hình ảnh tế bào vi khuẩn với độ phóng đại 4800

49

lần
3.6

Ảnh điện di DNA tổng số

53

3.7

Sản phẩm PCR bằng mồi 16S

54

3.8

Cây phát sinh chủng loại của 2 chủng Đ.GT.2.2

55

và L.SC.1.2
3.9

Sản phẩm PCR bằng mồi ker F và ker R

56

3.10

Sản phẩm thôi gel tinh sạch gene ker

56

vi


Luận văn Thạc sĩ khoa học
3.11

Sản phẩm tinh sạch gene ker và vector

57

pET32asau khi xử lý bằng 2 enzyme cắt
3.12

Vector tái tổ hợp pET32a /ker

58

3.13

Sản phẩm biến nạp của 2 chủng vi khuẩn vào tế

58

bào khả biến E.coli DH10B
3.14

Ảnh điện di sản phẩm tách DNA plasmid tái tổ

59

hợp của các chủng sau biến nạp
3.15

Sản phẩm phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp

60

bằng 2 enzyme cắt XhoI và BamHI
3.16

Đường chuẩn Bradford

vii

61


MỞ ĐẦU
Lơng vũ có lượng protein keratin thơ rất cao (90 - 95%), nhưng phần lớn
protein trong lông vũ không hịa tan trong nước. Mặc dù rất khó bị phân hủy,
nhưng các chất thải keratin có thể bị phân hủy bởi các chủng vi khuẩn, xạ

khuẩn và nấm có khả năng sinh tổng hợp keratinase. Vi sinh vật sinh tổng hợp
keratinase đã được phân lập từ nhiều vị trí địa lý khác nhau, từ đất Nam cực
đến suối nước nóng, kể cả ở điều kiện mơi trường hiếu khí và kỵ khí. Ðến
nay, các keratinase được nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn như
Bacillus, Chryseobacterium, Pseudomonas,…. Vì vậy, việc khai thác đa dạng
vi sinh vật sẽ cung cấp sản phẩm keratinase phù hợp với từng ứng dụng cụ
thể.
Keratinase phá vỡ cầu nối disunfua của keratin làm đứt liên kết của vòng
xoắn. Sau khi thủy phân hợp chất keratin trong lông vũ đã được phân huỷ và
chia nhỏ thành các axit amin và peptit ngắn. Như vậy, gia súc, gia cầm có thể
sử dụng lơng vũ sau khi bị thủy phân làm thức ăn. Chính vì vậy, keratinase đã
và đang được nghiên cứu ứng dụng trong các quá trình thủy phân lơng vũ để
tạo thành các hợp chất có thể bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm hoặc làm
phân bón hữu cơ,….
Ở Việt Nam hiện nay ngành cơng nghiệp tái tạo nguồn phế thải làm phân
bón và thức ăn cho gia súc vẫn còn non trẻ và đang trong giai đoạn tìm nguồn
nguyên liệu cũng như định hướng để phát triển. Phương pháp được ứng dụng
phổ biến hiện nay để xử lý phế thải lông vũ là sử dụng kiềm hoặc acid. Tuy
nhiên, phương pháp này còn nhiều hạn chế (giá thành cao, hiệu suất thấp…),
do vậy việc ứng dụng enzyme từ vi khuẩn để xử lý phế thải có nhiều ưu điểm
hơn như tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giá thành thấp, mặt khác cịn
rất thân thiện với mơi trường. Vì vậy, việc nghiên cứu enzyme từ vi khuẩn để
thủy phân lông vũ vừa có ý nghĩa khoa học, vừa có ý nghĩa thực tiễn.
1


Với những ưu điểm trên, để phục vụ cho việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật
đất và trên lông vũ có khả năng phân huỷ lơng vũ, chúng tơi đã tiến hành
nghiên cứu đề tài: Tên đề tài “Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có
khả năng thủy phân keratin từ lông vũ gia cầm và thiết kế vector tái tổ

hợp biểu hiện keratinase trong tế bào vi khuẩn E.Coli ”.
 Mục tiêu của đề tài:
- Tuyển chọn được bộ chủng vi sinh vật đất thuộc các nhóm vi sinh vật như
Bacillus, Chryseobacterium và Vibrio có hoạt tính thủy phân với hiệu suất 70
– 80% lượng keratin lông vũ trong môi trường nuôi cấy.
- Thiết kế được vector tái tổ hợp biểu hiện keratinase ở E.Coli.
 Ý nghĩa của đề tài:
Ứng dụng xử lý lông vũ trong sản xuất phân bón.
Thay thế hoặc tăng hàm lượng protein trong thức ăn gia súc gia cầm.
Ngoài ra, việc nghiên cứu của đề tài còn mang lại nhiều ý nghĩa thiết thực
trong đời sống như: Cải tạo đất trồng, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tạo
ra nguồn keratinnase vô cùng phong phú.
 Nội dung:
- Thu thập mẫu đất chăn nuôi gia cầm hoặc nơi giết mổ gia cầm.
- Tuyển chọn được các chủng Bacillus, Pseudomonas, Chryseobacterium trên
môi trường nuôi cấy.
- Nhận dạng về hình thái và đặc điểm hóa sinh của các chủng thu được có khả
năng phân giải mạnh keratin.
- Thiết kế và nhân đoạn gen keratinase từ chủng có hoạt tính mạnh.
- Chọn dịng keratinase trong vector biểu hiện pET32a để biểu hiện trong tế
bào vi khuẩn E. coli.
- Phân tích hoạt tính enzyme keratinase (enzyme ngoại bào).


PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Keratin
Keratin là một hợp chất sừng rất khó phân huỷ, là thành phần chủ yếu của
lớp biểu bì, tóc, lơng, móng chân móng tay và men răng. Keratin là một phức
chất hóa học có chứa một lượng lớn sulfua, các acid amin, đặc biệt là cystein.
Ngồi ra cịn có tyrosin, histidin, lysin, arginin, các muối: carbonat canxi,

phosphat canxi.

Hình 1.1: Một số hình dạng lơng vũ
Nhìn hình dạng bên ngồi của lơng vũ có thể thấy được lơng vũ bao gồm hai
thành phần chính đó là các sợi lơng và cuống lơng (Hình 1.1). Trong lông vũ
hàm lượng protein keratin chiếm tỉ lệ rất cao chiếm từ 90 – 95%. Từ các sợi
keratin có chứa hàm lượng lưu huỳnh lớn đã được ép thành các bó keratin lớn
hơn. Trên các sợi lơng, chất keratin rất mềm dẻo và dễ dàng bị phân cắt thành
những sợi nhỏ và tan hết vào môi trường. Tuy nhiên, trên cuống lơng thì
keratin lại có hàm lượng lưu huỳnh cao, tạo ra những hợp chất cứng, thơ nên
rất khó có thể thuỷ phân được. Khi cấy các vi khuẩn để thuỷ phân lơng vũ thì
tất cả các cuống lơng nhỏ đều được thuỷ phân hồn tồn nhưng các cuống
lơng to thì mới chỉ được phân cắt thành những đoạn và những sợi rất nhỏ


trong khoảng thời gian hơn từ 7- 10 ngày. Như vậy, hàm lượng hợp chất
keratin trong lông vũ là nguyên nhân gây nên mùi khét rất lớn khi đốt lông vũ
[13,14,15].
Keratin là thành phần chính của biểu bì và ở tóc, lơng vũ, sừng, móng,
len. Dựa trên xác định cấu trúc cơ bản bậc hai, keratin được phân thành α và β
(α-helix của tóc và len, β-sheets của lơng vũ) [33]. Các sợi keratin ở cả hai
dạng α-helix và β-sheets được xoắn song song với nhau để đảm bảo độ bền ổn
định của sợi [34,35]. Các keratin được chia thành keratin cứng và keratin
mềm tùy thuộc vào lượng sulfur. Keratin cứng ở lơng vũ, tóc, móng guốc,
móng có nhiều cầu nối disulfur và không thể kéo dài ra. Trong khi đó, keratin
mềm như da, chai ở da có ít cầu nối disulfur và mềm dẻo hơn. Các enzyme
được biết đến như trypsin, pepsin và papain có khả năng cắt các cầu nối trong
keratin để phân hủy [36]. Mặc dù rất khó phân hủy, nhưng các chất thải
keratin có thể bị phân hủy bởi vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm do chúng tạo ra các
protease – keratinase.

Thủy phân keratin từ vi sinh vật đã được nghiên cứu từ năm 1959 [37],
tuy nhiên cơ chế thủy phân từ vi khuẩn vẫn chưa được nghiên cứu nhiều,
nhưng việc giảm cầu nối disulfur có thể có ảnh hưởng đáng kể đến sự phân
hủy keratin [38,39]. Keratinase [EC 3.4.21/24/99.11] là serine hay là các
metalloprotease có khả năng phân hủy cấu trúc protein keratin khó tan. Các
keratinase tham gia thủy phân các chất thải keratin từ lông vũ trong công
nghiệp chăn nuôi gia cầm đã tạo ra các sản phẩm có giá trị như thức ăn chăn
ni, phân bón, các polymer và các amino acid hiếm như serine, cysteine và
proline.
Trong móng chân tay và men răng thì hàm lượng keratin tồn tại ở dạng
cứng nên rất khó phân huỷ. Ngồi ra, keratin cịn tồn tại trong sừng và móng
của các lồi động vật có vú.Cịn ở 1 số động vật chân đốt, lớp giáp xác thường
có các bộ phận giống như chiếc áo giáp hoặc giống bộ xương ngoài làm


nhiệm vụ bảo vệ đều được cấu tạo bằng keratin, chỉ một phần rất nhỏ cấu tạo
từ chitin.
Tính chất
Keratin có cấu tạo hình sợi xoắn. Chúng xoắn xung quanh nhau tạo thành các
sợi trung gian, điều này đã tạo lên cầu nối disulfua, hình thành lên cấu trúc rất
bền vững. Trong phân tử của keratin có chứa tỉ lệ cao phân tử lưu huỳnh và
nhiều loại axit amin. Đặc biệt trong đó có một loại axit amin là cysteine, chính
điều này làm nổi bật tính chất của keratin là rất khó hịa tan (Hình 1.2).

Hình1.2: Cấu tạo phân tử keratin
Theo cấu tạo của keratin có 2 loại chính sau:
Anpha- keratin (α-keratin): Trong tóc (kể cả lơng cừu), sừng, móng tay, móng
chân, móng và móng guốc của động vật có vú. Cấu tạo là các sợi đơn protein
liên kết với nhau bằng liên kết hydro.
Beta keratin (β-keratin): Trong móng tay và móng vuốt của lồi bị sát, họ vỏ

chelonians (ba ba, rùa, …), và trong lơng, mỏ, móng vuốt của chim và nhím,
được hình thành chủ yếu trong các tấm β. Cấu trúc β cứng, chắc hơn cấu trúc
α do các tấm β được nối với nhau bằng các cầu nối disulfide.
Chuyên ngành Di truyền học
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5

Lớp Sinh K17



Keratin được tạo thành bởi keratinocytes, các tế bào sống tạo nên một
phần lớn của da, tóc, móng tay móng chân, và keratin khác có chứa trong các
bộ phận của cơ thể. Các tế bào từ từ đẩy lên trên bề mặt, cuối cùng chết và tạo
thành một lớp bảo vệ của các tế bào. Hàng ngàn các tế bào này có thể được
sản sinh ra trong các điều kiện khác nhau, chẳng hạn như bệnh vẩy nến. Do đó
gây hư hại cho các lớp bên ngoài của keratin, cho nên có thể làm, tóc, móng
tay móng chân hay gãy và da bong ra từng mảng (Hình 1.3).

Hình 1.3: Ảnh dƣới kính hiển vi các sợi bên trong tế bào keratin
1.2. Keratinase
Keratinase là một enzyme thuộc nhóm protease. Đây là enzyme có khả
năng thuỷ phân cấu trúc phức tạp của keratin lông. Keratinase được tạo ra từ
nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau thuộc nhóm vi sinh vật cổ, nhóm vi sinh
vật nhân thật và nấm. Keratinase thuộc nhóm enzyme protease, có khả năng
thủy phân protein keratin khơng tan. Các enzyme này được tạo ra trong sự quá
trình phân hủy các cơ chất như keratin trong tóc, lơng, sừng, … Các đặc tính
về hóa sinh và lý sinh của keratinase là rất đa dạng. Phần lớn keratinase hoạt
0

động ở điều kiện tối ưu là pH trung tính tới kiềm và nhiệt độ từ 30 C đến
0

60 C. Kerainase có tiềm năng ứng dụng lớn trong nông nghiệp, dược học và
các lĩnh vực y sinh học. Ngoài ra, sử dụng keratinase trong sinh khối sinh học


có thể giải quyết một phần nào đó về chuyển đổi năng lượng và tái sử dụng
các nhiên liệu.
Gần đây, một nghiên cứu đã công nhận và định nghĩa keratinase là
protease serine do hình dạng cấu tạo có tới 97% giống với protease kiềm và
nó cũng bị ức chế bởi các thuốc ức chế giống như ức chế protease serine [18].
Khối lượng phân tử tùy theo từng loại sinh vật có thể dao động từ 18 đến 35
kDa đối với protease serine có khối lượng phân tử nhỏ và lớn hơn 90 kDal đối
với protease serine có khối lượng lớn.

Hình 1.4: Cấu tạo phân tử của enzym Keratinase


Tính chất:
 Keratinase thuỷ phân thành các axit amin:
Với tính chất thuỷ phân của keratinase, nó phá vỡ cầu nối disunfua của
keratin làm đứt liên kết của vòng xoắn. Như vậy, sau khi thuỷ phân hợp chất
keratin trong lông vũ đã được phân huỷ và chia nhỏ thành các axit amin và
peptit ngắn. Khi đó protein keratin mang đầy đủ các tính chất của protein tan
như là: Tính hồ tan, kết tủa, điện ly lưỡng tính, thuỷ phân và phản ứng màu
đặc trưng.
Keratinase chủ yếu tấn công vào các liên kết disulfide (S-S), làm suy giảm
các protein dạng sợi fibrin, elastin, collagen và sợi protein khác.

 pH và nhiệt độ:
o

o

Keratinase chịu được ở nhiệt độ từ 30 C - 80 C nhưng nhiệt độ tối ưu là:
o

o

50 C và enzyme này được ổn định khi bảo quản ở -20 C [21]. Keratinase bền
vững trong khoảng pH từ 6,0 - 9,0 nhưng pH tối ưu là 7,5 [21].
 Chất kìm hãm:
Khi bổ sung đường sucrose và lactose làm ức chế sự tổng hợp keratinase
[21]. Chất nền có nồng độ và lượng cơ chất quá cao cũng sẽ làm ức chế sự
tổng hợp keratinase [21]. Khi bổ sung các chất có chứa các ion kim loại nặng
2+

2+

2+

2+

hoá trị hai như: Cu , Ag , Hg và Pb thì cũng làm ức chế sự hoạt động của
keratinase [22]. Một số hoá chất khác cũng ức chế phản ứng enzyme
keratinase như: EDTA,…[21].
 Chất hoạt hố:
Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới thì khi bổ sung các chất có chứa các
2+

2+

2+

ion kim loại hố trị hai như: Ca , Mg , Mn thì kích thích sự hoạt động của
keratinase [22].
1.3. Đa dạng vi sinh vật có khả năng sinh keratinase cao


Các keratinase là một dạng protease rất phổ biến trong thế giới vi sinh vật
và được phân lập từ nhiều vị trí địa lý khác nhau cả ở điều kiện mơi trường
hiếu khí và kỵ khí. Vì vậy, vi khuẩn tổng hợp keratinase có sự đa dạng rất lớn
về đặc tính hóa sinh và lý sinh. Các đặc tính của một số vi khuẩn tổng hợp
keratinase được tóm tắt trong bảng 1.1.
Bảng 1.1: Sự đa dạng vi sinh vật có khả năng sinh keratinase và các đặc
tính hóa sinh của keratianse

Vi sinh vật

Dạng xúc

Trọng

pH

tác

lƣợng

ƣu

tối Nhiệt
tối

độ Chích
ƣu dẫn

0

(0 C)

phân tử
(kDa)
Bacillus cereus
DCUW
Bacillus
licheniformis
K-508
Bacillus
licheniformis
PWD-1
Bacillus pumilis

Serine

80

8.5

50

[40]

Thiol

42

8.5

52

[41]

Serine

33

7.5

50

[42]

Serine

65

8.0

65

[43]

Bacillus subtilis
KS-1
Bacillus subtilis
MTCC (9102)
Bacillus subtilis
RM-01
Clostridiu
m
sporogenes
Chryseobacterium
indologenes
TKU014
Fervidobacterim
islandicum AW-1
Fervidobacterium
pennavorans

Serine

25.4

7.5

–

[44]

Metall
o
Serine

69

6

40

[45]

20.1

9

45

[46]

28.7

8

55

[47]

P1: 56

P1:10

P1:3050

[48]

–
Metall
o
Serine

>200

9

100

[49]

Serine

130

10

80

[50]

Kocuria rosea

Serine

240

10

40

[51]

Microbacterium
sp. kr10
Nesternkonia sp.
AL-20
Stenotrophomonas
maltophilia
Nocardiopsis sp.
TOA-1
Streptomyces
sp.S7

Metall
o
Serine

42

7.5

50

[52]

70

[53]

Serine

35.2

7.8

40

[54]

Serine

20

>12.5

60

[55]

Serine

44

11

45

[56]

Streptomyces sp.
strain 16

oS e r i n e

KI:

KI: 9

KI: 50

[57]

Streptomyces
albidoflavus
Streptomyces
pactum
Streptomyces
gulbagensis DAS
131

Streptomyces
thermoviolaceus
Thermoanaerobac
ter keratinophilus

Serine

18

6–9.5

40–70

[58]

Serine

30

7–10

40–75

[59]

–

46

9

45

[60]

–

40

8

55

[61]

Serine

135

8

85

[62]

23

10

-metall

203. 2

Ðến nay, keratinase được nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn, trong
đó Bacillus được nghiên cứu nhiều nhất. Nhiều chủng B. licheniformis và B.
subtilis được mơ tả có khả nãng thủy phân keratin [44, 63-66], những loài
khác như B. pumilus và B. cereus cũng có khả nãng tổng hợp keratinase [40,
43, 67, 68]. Các loài khác nhau của cùng một chi (chẳng hạn, Bacillus) có thể
tạo ra các keratinase khác nhau (Bảng 1.1).
Sinh tổng hợp keratinase cũng được nghiên cứu ở xạ khuẩn, chủ yếu là từ
các chi Streptomyces. Nhóm vi khuẩn này được phân lập từ các vùng đất khác
nhau, có khả năng thủy phân một loạt các chất chứa keratin như tóc, len và


lông. Gushterova và cộng sự [69] đã phân lập hai chủng xạ khuẩn chịu nhiệt
có hoạt tính thủy phân keratin cao là Streptomyces flavis 2BG và
Microbispora aerata IMBAS-11A. Các loài chịu nhiệt như Streptomyces
gulbarguensis [60], Streptomyces thermoviolaceus [61] và Streptomyces
thermonitrificans [70] cũng đã được phân lập từ đất. Ngoài những chủng ưa
nhiệt, một số Streptomyces kém bền nhiệt đã được phân lập như Streptomyces
pactum DSM 40.530 [59], Streptomyces graminofaciens [39] và Streptomyces
albidoflavus K1-02 [58].
Ngoài các chủng thuộc Bacillus sp. và xạ khuẩn, một số chủng vi khuẩn có
khả năng thủy phân keratin diễn ra ở nhiệt độ cao, pH và kiềm nhiệt hóa đã
được cơng bố như Fervidobacterium pennavorans [50], Fervidobacterium
islandicum [49], Meiothermus ruber H328 [72], Clostridium sporogenes [47]
và các chủng Thermoanaerobacter sp. [62] được phân lập từ các môi trường
khắc nghiệt như suối nước nóng, lỗ thơng hơi nhiệt, và khu vực núi lửa. Một
số vi sinh vật hoạt động ở môi trường kiềm như Nesternkonia sp. [73] và
Nocardiopsis sp. TOA-1 [54] cũng có khả nãng thuỷ phân keratin.
Đặc tính hóa sinh của keratinase

Các đặc tính của enzyme được tạo ra từ vi khuẩn là rất đa dạng, tùy thuộc
vào loại vi sinh vật sản xuất ra keratinase. Các enzyme này chủ yếu là enzyme
ngoại bào được tiết ra từ vi sinh vật. Một số đặc điểm sinh hóa của keratinase
đã được trình bày ở bảng 1.1. Phần lớn các keratinase được tiết ra từ vi khuẩn
có pH là kiềm hoặc trung tính, pH tối ưu từ 7,5-9,0. Tuy nhiên, một số
keratinase khác được tối ưu hoạt động ngoài phạm vi này, pH hoạt động ở
kiềm hóa [74] hoặc pH là axít [75,76]. Một số keratinase ổn định trên một
khoảng pH rộng. Ví dụ như keratinase của chủng Nocardiopsis TOA-1, được
ổn định trong khoảng pH từ 1,5-12, trong 24 h ở 30°C [54].


Điều kiện hoạt động tối ưu của keratinase rất thay đổi, thường phụ thuộc vào
nơi và nguồn gốc phân lập (bảng 1.1). Keratinase từ chủng chịu nhiệt F.
pennavorans có nhiệt độ tối ưu ở 80°C [50] trong khi keratinase từ chủng
nhiệt độ thường Stenotrophomonas maltophila DHHJ có hoạt động tối ưu ở
40°C [55]. Nam và công sự [49] đã chứng minh được F. islandicum AW-1 có
nhiệt độ tối ưu ở 100°C. Trọng lượng phân tử keratinase đã được xác định.
Mặc dù trọng lượng phân tử các enzyme từ 18 kDa (S. albidoflavus [58]) đến
240 kDa (K. rosea [51]) nhưng phần lớn keratinase có trọng lượng phân tử
thấp hơn 50 kDa (bảng 1.1). Phần lớn các keratinase là các đơn enzyme, tuy
nhiên phân lớp đa enzyme cũng đã được ghi nhận [57]. Trọng lượng phân tử
cao thường kết hợp với các keratinase với các đặc tính của metalloprotease
hoặc chúng có nguồn gốc từ chịu nhiệt (bảng 1.1).
Ảnh hưởng của các ion kim loại và các bất hoạt hoạt tính keratinase đã và
đang được nghiên cứu. Gần đây các nghiên cứu của Gupta và Ramnani [77]
2+

2+

2+

cho thấy các ion kim loại hóa trị 2 như Ca , Mg và Mn có xu hướng kích
thích hoạt tính enzyme keratinase. Ảnh hưởng này có thể liên quan tới việc
duy trì hoạt tính của enzyme và tạo ra sự ổn định phức hợp giữa cơ chất và
enzyme. Ngồi ra các ion kim loại có thể bảo vệ cho enzyme chống lại biến
tính về nhiệt độ [53, 58]. Ngược lại, sự chuyển trạng thái và các kim loại nặng
2+

+

2+

2+

khác như Cu , Ag , Hg và Pb là nguyên nhân của sự bất hoạt các enzyme
keratinase. Các keratinase thường ổn định trong sự hiện diện của dung mơi
hữu cơ như DMSO, Triton X-100.
1.4. Tình hình nghiên cứu
1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Việt Nam là nước sản xuất gia cầm chủ yếu ở quy mô nhỏ tiêu thụ ngay
trên thị trường địa phương hoặc các tỉnh lân cận, nhưng đến nay đã có nhiều
hộ gia đình bắt đầu sản xuất gia cầm ở quy mô công nghiệp như các trại gà


lạnh khép kín theo dây truyền sản xuất của Cộng Hồ Liên Bang Đức. Nhiều
cơng ty cũng bắt đầu tập trung vào đầu tư chế biến sản xuất gia cầm như công
ty CP dự định xây dựng thêm 2 nhà máy chế biến gia cầm mới ở ngoại ô Hà
Nội với công suất 50.000 con gia cầm/tuần và một nhà máy sẽ được đặt tại
Đồng Nai. Theo tổng cục thống kê, năm 2003 tổng gia cầm của Việt Nam lên
tới 250 triệu con và cho ra sản lượng thịt gia cầm đạt tới 371 ngàn tấn [27].

Do lông tạo nên 5% trọng lượng cơ thể gia cầm do đó lượng lơng vũ từ gia
cầm có thể là 18,6 ngàn tấn năm, đây có thể là nguồn nguyên liệu lớn làm
phân bón hữu cơ và thức ăn gia súc cho ngành nông nghiệp. Năm 1993, Văn
Thị Hạnh cùng cộng sự đã nghiên cứu tạo protein hịa tan từ lơng vũ phế thải
bằng phương pháp kiềm để thủy phân [3]. Hiện nay, tại Phịng Vi sinh vật đất,
Viện Cơng nghệ Sinh học đã và đang tiếp tục phân lập các chủng vi khuẩn có
thể thuỷ phân lơng vũ. Sau khi tìm ra những điều kiện tối ưu cho các chủng có
khả năng thuỷ phân tốt sẽ tiến hành định tên chủng bằng các phương pháp hoá
sinh (API 20 NE và API 50 CHB) cũng như định loại bằng phương pháp sinh
học phân tử. Sau khi phân lập và tuyển chọn các chủng tốt, nhóm nghiên cứu
đang tìm ra những ứng dụng hữu ích và thiết thực nhất đối với vật nuôi và cây
trồng.
1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay trên thế giới, các kết quả nghiên cứu về keratinase cho thấy
nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau có khả năng thủy phân lơng vũ, chẳng hạn
các chủng thuộc các nhóm Bacillus, Chryseobacterium, Actinomycetes, Vibrio
và nấm [18, 19, 20]. Sử dụng vi sinh vật và keratinase nhằm nâng cao chất
lượng sản phẩm dinh dưỡng từ bột lông vũ đã và đang được quan tâm. Bột
lông vũ thủy phân bằng Bacillus licheniformis có bổ sung amino acid làm
thức ăn cho gà đã tạo ra sự tăng trưởng của gà tương tự như gà sử dụng nguồn
thức ăn ở đậu tương [22]. Sử dụng keratinase thô từ chủng Bacillus
licheniformis làm tăng khả năng phân giải nguồn lông vũ thô cũng như là bột


lông vũ. Enzyme thủy phân này sẽ làm tăng khả năng tiêu hóa lơng vũ tới
82% và có thể thay thế tới 7% protein ăn cho gà [24].
Mỗi năm trên thế giới có 24 tỷ gà bị chết tạo ra khoảng 9 tỉ tấn lông gia
cầm. Thời gian cần thiết để một chiếc lơng thực hiện q trình phân hủy tự
nhiên của mình là 5-7 năm, dẫn đến hậu quả ô nhiễm môi trường.
Một số nghiên cứu đã chứng minh được rằng vi sinh vật thủy phân keratin

có thể tồn tại trong lơng, móng, guốc.... Chính sự xuất hiện của vi sinh vật này
đã làm tăng khả năng xử lý chất thải, giảm thiểu gây ô nhiễm môi trường. Đặc
biệt keratinase của chủng vi sinh vật là thành phần quan trọng trong công
nghệ sinh học liên quan tới nguồn chất thải công nghiệp lông vũ và trong chăn
nuôi [24].
Đối với phân bón, keratin sau khi bị thủy phân thành các amino acid, các
peptide hòa tan sẽ cung cấp dinh dinh dưỡng cho cây trồng. Các dạng phân
hữu cơ này có thể được bón qua lá với một lượng nhỏ nhưng có tác dụng làm
tăng q trình phát triển của cây, giảm được lượng phân bón hố học vào đất
và có khả năng tăng chất lượng cho sản phẩm. Nhiều nghiên cứu trên thế giới
cũng đã chỉ ra rằng phun qua lá tăng hiệu quả hơn bón qua gốc từ 8-10 lần.
1.5. Sản xuất và ứng dụng quá trình thuỷ phân keratin trong lông vũ
Keratinase đã được sản xuất và bán trên thị trường với nhiều mục đích
khác nhau. Sinh tổng hợp keratinase thường được cảm ứng bởi keratin. Do đó,
cơ chất keratin (lơng gà, bột lơng vũ, tóc) thường được bổ sung vào môi
trường nuôi cấy. Tuy nhiên, việc bổ sung cơ chất keratin không phải nhất thiết
cho sản xuất keratinase. Các chất không phải là keratin, như bột đậu nành
[78], đậu nành [79], sữa tách kem [54], bột tôm [48], gelatin [52], casein và


phomat lỏng [80], đã được chứng minh là những chất cảm ứng của sinh tổng
hợp keratinase.
Bổ sung vào môi trường keratin với các nguồn carbon hoặc các nguồn
nitơ khác nhau có thể làm tăng sinh tổng hợp keratinase. Ví dụ, bổ sung
glucose, sucrose, tinh bột, mật đường, và thêm các nguồn nitơ, chẳng hạn như
urê, dung dịch peptone, tryptone, men chiết xuất, amoni clorua và nitrat natri
đã nâng cao sản lượng enzyme [39, 47, 51, 81]. Tuy nhiên ở một số vi sinh vật
nhất định lại giảm sản xuất enzyme do bị ức chế quá trình trao đổi chất
[82,83]. Do đó, hiệu quả của sinh tổng hợp keratinase có sự biến động lớn,
phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, chất cảm ứng và nồng độ nguồn carbon và

nitơ. Vì vậy, thành phần môi trường phải được xác định theo từng trường hợp
cụ thể. Bên cạnh thành phần môi trường nuôi cấy, các điều kiện khác như
nhiệt độ, pH, và sục khí cũng là những yếu tố quan trọng để có được sản
lượng keratinase cao.
Bài tiết keratinase thường đạt được cao nhất trong pha log hoặc pha sinh
trưởng cân bằng của tế bào. Tuy nhiên, chủng Serratia sp. HPC 1383 có hoạt
tính cao nhất trong giai đoạn sinh trýởng (24 h đầu tiên) trên môi trường bột
lông vũ, trong khi nhiên liệu sinh học tối đa được đạt được ở 96 h [84].
Ðể tăng cường khả năng sinh tổng hợp keratinase và thủy phân keratin các kỹ
thuật sinh học phân tử đã được sử dụng trong nghiên cứu phát triển các chủng
đột biến và tái tổ hợp. Bằng kỹ thuật chọn dòng và biểu hiện gen tái tổ hợp,
sinh tổng hợp keratinase tái tổ hợp trong tế bào vi sinh vật không gây hại với
thông tin di truyền từ vi sinh vật có nguồn bệnh tới sức khỏe cũng đã được
nghiên cứu. Gen kerA, mã hóa keratinse của chủng B. licheniformis, được
biểu hiện cùng với lông vũ (lông vũ là nguồn cacbon và nitơ) trong môi
trường nuôi cấy dẫn đến sự biểu hiện mạnh của protease thủy phân keratin.
Ngoài ra, tăng năng suất keratinase đã được nghiên cứu bằng cách tích hợp


nhiễm sắc thể với nhiều bản sao của gen kerA ở B. licheniformis và B. subtilis
[85].
Phần lớn các báo cáo nghiên cứu sản xuất keratinase đều ở dịch lỏng, gần
đây sản xuất các enzyme thủy phân keratin qua quy trình sử dụng môi trường
rắn cũng đã được nghiên cứu [86]. Parkash và cộng sự [87] đã nghiên cứu sản
xuất keratinase bằng các vi sinh vật lên men tĩnh.
Keratinase vi sinh vật được coi là chất xúc tác sinh học đầy hứa hẹn cho
các mục đích khác nhau, bao gồm các ứng dụng trong thức ăn chăn ni, phân
bón, chất tẩy rửa, thuộc da, và các ngành cơng nghiệp dệt, ngồi ra còn ứng
dụng trong dược phẩm và ứng dụng y sinh học [77, 88]. Mặc dù vậy, so với
các ngành cơng nghiệp sản xuất enzyme khác thì keratinase vẫn cịn trong giai

đoạn non trẻ. Bảng 1.2 đưa ra các ứng dụng hiện tại và tiềm năng của
keratinase.
Bảng1.2: Ứng dụng của keratinse
Lĩnh vực

Các ứng dụng

Sản xuất thức ăn chăn nuôi
Bổ sung thức ăn
Sản xuất phân bón
Dược và y sinh
Thủy phân thơ
Tăng khả năng dẫn truyền thuốc
Điều trị da liễu
Mỹ phẩm
- Thuộc da
- Biến đổi sợi (ngành dệt)
- Chất tẩy rửa
- Biến đổi chức năng của protein
Công nghiệp
- Màng sinh học (film, lớp phủ
ngoài, keo)
- Sử lý nước thải và quản lý chấ
tthải
Năng lượn
- Chuyển hóa chất thải keratin cho
gsinh học
các sản xuất tiếp theo của methane
hoặc hydro sinh học
Chăn nuôi

trồng trọt

-


Các keratinase có giá trị phân hủy protein keratin khó tan. Chính vì vậy, sự
hiểu biết về vi sinh vật sản xuất keratinase và các đặc tính hóa sinh của
keratinase sẽ góp phần trong việc quản lý nguồn chất thải keratin trong nông
nghiệp một cách hợp lý và hiệu quả. Ngoài ra, sử dụng các kerainase làm tăng
đường dẫn thuốc, q trình hydroxyl hóa, sản xuất các film thủy phân bằng
sinh học, và sản xuất các nguyên liệu sinh học, đã và đang làm tăng lên các
ứng dụng của keratinase, cụ thể như sau:
1.5.1. Tăng hàm lƣợng chất dinh dƣỡng trong thức ăn gia súc
Khi bổ sung các vi khuẩn đã được phân lập và tuyển chọn vào các loại
thức ăn thì làm cho thức ăn của gia súc bảo quản được lâu hơn, khi gia súc ăn
sẽ dễ tiêu hố hơn [3, 24].Trong cơng nghiệp, phế liệu lơng được biến đổi
thành lông bị thuỷ phân sử dụng nhiệt độ và áp suất cao. Tuy nhiên sử dụng
bột lông đã thuỷ phân để thay thế protein có một số giới hạn. Khi thêm 6% bột
lông đã thuỷ phân vào bữa ăn của gà con làm giảm trọng lượng cơ thể của
chúng. Tuy nhiên, sử dụng thuỷ phân bột lông bằng vi khuẩn có thể tạo ra sản
phẩm thay thế đến 15% protein trong thức ăn gia cầm [26].
Thí nghiệm trên gà, người ta nhận thấy rằng feather lysate, được cân bằng với
một số axit amin, có thể thay thế đậu nành như là một nguồn protein tới 70%
trong khẩu phần. Trong các nghiên cứu khác, bột lông thương mại được ủ qua
đêm với Keratinase để tạo ra một phần bột lơng thuỷ phân. Khả năng tiêu hố
amino acid của bột lông thủy phân với Keratinase ở gà trưởng thành là 82%
cao hơn so với bột lông thủy phân thương mại, 60%.
Vậy có thể kết luận rằng keratinase có khả năng thuỷ phân và biến đổi bột
lông vũ thành nguồn protein có thể tiêu hố ở mức tối đa là 70% protein khẩu
phần trong thức ăn.

1.5.2. Tạo phân bón
Với tác dụng của các chủng vi khuẩn này chúng có thể sử dụng làm các
loại phân bón vi sinh như: phân vi sinh vật cố định đạm, phân vi sinh vật phân