Tiểu luận: Công nghệ sản xuất enzyme amylase và ứng dụng của enzyme amylase trong sản xuất maltodextrin

BỘ CÔNG THƯƠNG
ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI TIỂU LUẬN
MÔN: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG
CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
VÀ ỨNG DỤNG CỦA ENZYME AMYLASE TRONG
SẢN XUẤT MALTODEXTRIN
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà
SVTH: Nhóm 7
1.
2.
3.
4.

Nguyễn Thị Cẩm Nguyên
Nguyễn Cẩm Tiên
Nguyễn Lê Thảo Ngân
Phan Thị Mai Lưu
Thứ 4, tiết 123

2005140359
2005140611
2005140325
2005140296

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 3/2017

MỤC LỤC

11


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

LỜI MỞ ĐẦU
Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật
và trong đời sống con người. Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai
tây, lúa mì, ngơ (sắn) , cịn riêng nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột
chủ yếu. Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh
bột thành các loại đường đơn giản. Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ quá trình
lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như : rượu cồn, rượu vang,
bia, các loại acid hữu cơ, amino acid…..
Quá trình thuỷ phân tinh tinh bột gồm hai giai đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hố và
đường hố. Để thực hiện hai cơng đoạn nói trên, trong thực tế sản xuất người ta sử dụng
hai cách: thuỷ phân tinh bột bằng acid và bằng enzyme. Để thuỷ phân tinh bột từ lâu
người ta đã sử dụng các acid vô cơ như acid HCl và H 2SO4. Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ
phân bằng acid rất khó kiểm sốt và tạo nhiều sản phẩm khơng mong muốn, không đáp
2


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Do vậy, việc thay thế và ứng dụng enzyme để thuỷ
phân tinh bột là một kết quả tất yếu của sự phát triển.
Enzyme amylase được tìm ra đã góp phần quan trọng trong nhiều ngành cơng
nghiệp chế biến thực phẩm. Enzyme amylase có thể tìm thấy trong nhiều nguồn khá nhau
như: động vật, thực vật và vi sinh vật. Amylase ngày càng được thay thế acid trong sản
xuất ở quy mô công nghiệp. Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase ở nhiệt độ
cao mà khơng bị mất đi hoạt tính…….
Bài báo cáo “Công nghệ sản xuất enzyme amylase và ứng dụng của enzyme
amylase trong sản xuất maltodextrin” sẽ giúp các bạn có cái nhìn tổng quan hơn về
enzyme amylase, quy trình sản xuất cũng như ứng dụng của nó.
Trong q trình làm bài khơng tránh khỏi sai sót, mong nhận được sự góp ý của cơ
và các bạn để bài báo cáo của nhóm được hồn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!

NỘI DUNG ĐỀ TÀI
Chương 1: Tổng quan về tài liệu
1.1 Tổng quan về sản phẩm
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu, định nghĩa
Vào đầu thế kỉ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được chất gây ra quá trình lên
men. Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước chiết của mầm đại
mạch có khả năng chuyển hố tinh bột thành đường ở nhiệt độ thường. Năm 1833, hai
nhà khoa học người Pháp là Payen và Persor đã chứng minh chất có hoạt động phân giải
tinh bột thành đường có thể tách được ở dạng bột. Thí nghiệm này được tiến hành bằng
cách cho etanol vào dịch chiết của lúa đại mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa này
chuyển hoá. Danh từ diastase là do Payen và Persor dùng để gọi enzyme lúc bây giờ

3

Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

Enzyme amylase đã được tìm ra góp phần quan trọng cho nhiều ngành cơng
nghiệp chế biến thực phẩm. Enzyme amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau
như động vật, thực vật và vi sinh vật. Enzyme amylase được sử dụng nhiều trong sản xuất
là do khả năng chịu nhiệt cao, năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử
dụng, giảm chi phí cho q trình tinh sạch đường.
Các enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thuỷ phân, xúc tác phân giải liên kết nội
phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:

1.1.2

Đặc điểm của sản phẩm

a. Phân loại
Có 6 loại enzyme được xếp vào hai nhóm lớn: Endoamylase và Exoamylase.
Enzyme amylase được phân loại theo sơ đồ sau:

4


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

 Endoamylase

Amylase có khả năng phân cắt liên kết 1,4- glucoside
của cơ chất một cách ngẫu nhiên và là enzyme nội
bào. -amylase khơng chỉ có khả năng phân huỷ hồ
tinh bột mà cịn có khả năng phân huỷ các hạt tinh
bột nguyên vẹn.

Enzyme khử nhánh
5


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

-

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

Khử trực tiếp
Pullulanase là một trong các enzyme quan trọng
nhất trong chế biến tinh bột. Enzyme này được sử
dụng trên một quy mô lớn trong glucose và các
ngành công nghiệp sirô maltose. Pulluanase là một
lạo enzyme rất mạnh cho sự thoái hoá tinh bột
thành glucose hoặc maltose. Pullulanase thuỷ phân
, 6-glycosidic liên kết của chuỗi phân nhánh và .

-

Khử gián tiếp
Transglucosylase

(oligo-1,6-glucosidase)

và

Maylo-1,6-glucoside: Enzyme này thuỷ phân liên
kết trong isomaltose, panose và các dextrin tới
hạn có thể chuyển hố đường và có thể lên men
được.

-

 Exoamylase
– amylase

6


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

– amylase xúc tác từ sự thuỷ phân các liên
kết 1,4- glucan trong tinh bột, glucogen và

polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose
từ đầu khơng khử của mạch. Maltose được
hình thành do sự xúc tác của – amylase có
cấu hình .
Cịn gọi là glucose amylase. Có khả năng thuỷ phân liên kết -1,4 lẫn -1,6glucoside, ngồi ra cịn có khả năng thuỷ
phân liên kết -1,2 và -1,3-glucoside.
Glucose amylase có khả năng thuỷ phân
hồn tồn tinh bột, glucogen, amylopectin,
dextrin….thành glucose mà khơng cần có
sự tham gia của các loại enzyme khác.

-

b. Đặc tính
 Đặc tính chung:
Khả năng dextrin hố: thuỷ phân tinh bột  dextrin +một ít maltoza. Dextrin có

-

khả năng hoạt hố cao, đặc trưng cho tính chất của enzyme này.
Tính bền nhiệt: Phân tử có 1-6 nguyên tử C, tham gia vào sự hình thành ổn định

-

cấu trúc bậc 3 của enzyme.
Tính tan: amylase dễ dàng tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu laongx.
Các amylase bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu 2+ , Ag+ , Hg2+ .
Cơ chất tác dụng: của enzyme amylase là tinh bột và glycogen.
 Đặc tính riêng

có những đặc tính rất đặc trung về cơ chế tác động, chuyển hoá tinh bột, khả năng chịu
nhiệt:
-

Thể hiện hoạt tính trong vùng acid yếu
của nấm mốc có khả năng dextrin hố cao tạo ra một lượng glucose và maltose.
Độ bền đồi với tác dụng của acid cũng khác nhau
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của từ các nguồn khác nhau cũng không
đồng nhất.
7


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

c. Cơ chế tác dụng

có khả năng phân cắt liên kết -1,4-glucoside nằm ở phía trong phần tử cơ chất (tinh bột
hoặc glycogen) một các ngẫu nhiên. Nó khơng chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà nó thuỷ phân
cả hạt tinh bột nhưng với tốc độ rất chậm. quá trình thuỷ phân tinh bột bởi enzyme

là

quá trình đa giai đoạn:
Giai đoạn 1 (dextrin hoá): tinh bột dextrin phân tử lượng thấp

8

Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

Chỉ có một số phân tử cơ chssta bị thuỷ phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử
thấp (), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hoá
nhanh).
Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hoá)
-

Dextrin phân tử thấp bị thuỷ phân  tetra và trimaltose (không cho màu với iod)

-

thuỷ phân rất chậm  disaccharide và monosaccharide.
Amylose phân giải nhanh oligosaccharide  poliglucose (gồm 6-7 gốc glucose)

-

bị phân cách  mạch polyglucose colagen ngắn  maltose  maltotriose.
Tác dụng của enzyme lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì khơng
phân cắt được liên kết ở chỗ mạch nhánh trong phân tử .
1.1.3
Mục đích sử dụng của sản phẩm
Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh trên

quy mơ cơng nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế
giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu
chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Chế phẩm enzme không chỉ được ứng dụng trong y học
mà còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực cơng nghiệp khác nhau, trong nơng nghiệp,
trong hóa học...
“Ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lĩnh vực thực tế không kém so
với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử”.
Theo thời gian, enzyme công nghiệp ngày càng được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực
khác nhau, trong đó những enzyme ứng dụng nhiều nhất là amylase, cellulose, ligase,
amylase,... và một số enzyme đặc biệt khác đã thu được rất nhiều lợi nhuận từ ngành này.
Dưới đây là một vài ứng dụng thực tế:
1.1.3.1

Ứng dụng amylase

trong sản xuất bia
Trong công nghiệp sản xuất bia
truyền thống, các nước phương tây chủ
yếu sử dụng enzyme amylase của malt để
9


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

thủy phân tinh bột trong malt, sau đó đến giai đoạn rượu hóa bởi nấm men
Saccharomyces sp. Cơ sở khoa học của việc sử dụng amylase của malt ở chỗ khi đại

mạch chuyển từ trạng thái hạt sang trạng thái nảy mầm (malt), enzyme amylase sẽ được
tổng hợp và khi đó enzyme này sẽ thủy phân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng và
vật chất cho sự tạo thành mầm. Như vậy việc đường hóa tinh bột trong hạt nhờ enzyme
của chính nó. Khi đó hạt chỉ tổng hợp ra năng lượng enzyme amylase vừa đủ để phân hủy
lượng tinh bột có trong hạt. Như thế cần rất nhiều mầm đại mạch để sản xuất bia ở quy
mô lớn, dẫn đến chi phí cao cho sản xuất và sản phẩm.
Để khắc phục điều này, trong quá trình lên men tạo bia thì nhà sản xt khơng sử
dụng hồn tồn 100% nguyên liệu là malt đại mạch mà có sự pha trộn theo một cơng thức
nào đó để thay thế malt và còn bổ sung nguồn tinh bột cho quá trình lên men. Lý do là
một phần để tạo hương vị cho bia, màu sắc, độ cồn phù hợp cho người tiêu dùng và một
phần là làm giảm giá thành cho sản phẩm bia nhưng vẫn giữ được đặc trưng cho bia.
Chính vì điều này, các nhà sản xuất bia quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm enzyme
amylase cung cấp cho quá trình thủy phân tinh bột. Enzyme này có ý nghĩa rất lớn trong
việc làm bia, giúp sản xuất bia ở qui mơ cơng nghiệp.
Ngồi ra, trong sản xuất bia, người ta còn sử dụng chế phẩm enzyme cellulose có
tác dụng phá vỡ thành tế bào, tạo điều kiện để các thành phần có trong tế bào hạt thốt ra
phía ngồi nhờ đó chất lượng bia được nâng cao hơn. Một loại enzyme khác cũng được
sử dụng khá rộng rãi đó là gluco amylase, enzyme này được sử dụng để loại trừ O 2 có
trong bia, giúp quá trình bảo quản bia kéo dài hơn rất nhiều.
1.1.3.2

Ứng dụng amylase trong sản xuất rượu
Để sản xuất cồn từ nguồn tinh liệu tinh bột, mỗi nước
sử dụng các loại nguyên liệu khác nhau. Ví dụ, ở Mỹ
người ta sử dụng ngun liệu từ bột ngơ để sản xuất cồn,
cịn ở Brazin lại sử dụng khoai mì, các nước khác sử

10

Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

dụng gạo hoặc tấm từ gạo. Quá trình sản xuất cồn trải quá hai giai đoạn: giai đoạn đường
hóa, giai đoạn rượu hóa.
Giai đoạn đường hóa: người ta bắt buộc phải sử dụng enzyme amylase (không thể
sử dụng phương pháp thủy phân tinh bột bằng acid). Người Nhật đã biết sử dụng enzyme
của nấm mốc trong q trình đường hóa để sản xuất rượu Sake từ cách đây hơn 1700
năm. Người Trung Quốc thì đã sử dụng nhiều loại nấm mốc để đường hóa rượu trong sản
xuất rượu cách đây 4000 năm. Còn người Việt Nam đã biết sản xuất rượu từ gạo hàng
ngày năm.
Riêng ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nấm mốc
Aspergillus sang mới biết sử dụng enzyme này thay amylase của malt để sản xuất cồn.
Chính vì thế mới có phương pháp Micomalt (mầm mốc) trong sản xuất cồn và rượu. Nhờ
sự du nhập từ Nhật mà người Mỹ tiết kiệm được một khối lượng malt khổng lồ trong sản
xuất rượu.
Giai đoạn rượu hóa: Nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae, cũng có thể xem
đây là một quá trình áp dụng enzyme. Quá trình rượu hóa là q trình hết sức phức tạp,
trải qua rất nhiều giai đoạn chuyển hóa từ đường thành cồn nhờ sự tham gia của nhiều
enzyme khác nhau. Điểm khác với enzyme amylase là ở chỗ các enzyme tham gia quá
trình rượu hóa nằm trong tế bào nấm men. Việc điều khiển các q trình chuyển hóa bởi
enzyme trong tế bào thực chất là quá trình trao đổi chất của nấm men trong môi trường
chứa đường.
1.1.3.3

Ứng dụng amylase trong sản xuất bánh mì
Một trong những u cầu cơ

bản chính của bánh mì là độ xốp nở.
Độ xốp nở của bánh mì phụ thuộc vào
sự tạo khí CO2 trong q trình lên men
bột nhào và khả năng giữ khí của bột,

11


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

hàm lượng đường, hoạt độ của amylase, hàm lượng và tính chất của gluten trong bột cũng
như hoạt tính của nấm men.
Trước đây, người ta sử dụng nguồn amylase của malt, nhưng đến những năm đầu
thế kỷ XX, người ta bắt đầu nghiên cứu sử dụng amylase của nấm mốc.
Các chế phẩm enzyme amylase dùng trong công nghiệp sản xuất bánh mì được sản
xuất từ canh trường nấm mốc như Asp.Oryzae, Asp.Awamori hoặc từ vi khuẩn, trong đó
chế phẩm amylase từ nấm mốc được sử dụng phổ biến nhất.
α_amylase của nấm mốc rất nhạy nhiệt nên dễ bị vô hoạt khi ta nâng nhiệt độ 65 –
800C. Và chịu được môi trường acid tốt nên phù hợp với điều kiện hoạt động của nấm
men trong bột nhào.
Nhờ hoạt tính mạnh nên trong thời gian ngắn, amylase của nấm mốc nhanh chóng
tạo đủ lượng đường cần thiết trong khối bột nhào, sau đó thì bị vơ hoạt ở nhiệt độ nướng
bánh nên có thể dùng lượng lớn mà khơng có hiện tượng dextrin hóa khi nướng.
Việc sử dụng chế phẩm enzyme amylase cịn cho phép ta dùng bột mì kém phẩm
chất để làm bánh mỳ và có thể giảm bớt được 50% lượng đường thêm vào bánh trong sản
xuất bành mì ngọt.

1.1.3.4

Ứng dụng amylase trong sản xuất glucose và các loại mật tinh bột

Đang được ứng dụng có hiệu quả trong cơng nghiệp sản xuất glucose thực phẩm,
glucose tinh thể, mật maltose và mật glucose...
Phương pháp này không tạo ra các sản phẩm phụ không mong muốn giúp chất
lượng đường tốt hơn.
1.1.3.5

Ứng dụng amylase trong chế biến thực phẩm gia súc

Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn.
Trong khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử dụng năng lượng
từ nguồn tinh bột, người ta thường cho thêm enzyme amylase vào. Enzyme amylase sẽ

12


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

tham gia phân giải tinh bột tạo thành đường, giúp cho q trình chuyển hóa tinh bột tốt
hơn.
Ngồi ra, enzyme amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất
đường bột, sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất
tương và nước chấm... ở quy mô công nghiệp.

1.2 Tổng quan về vi sinh vật
Nguồn thu amylase vi sinh vật chủ yếu là từ vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn. Trong
bài này, chúng ta sẽ tìm hiểu về Aspergillus oryzae
1.2.1.

Hình thái – Cấu tạo

Aspergillus gồm hơn 185 loài, trong số này, aspergillus fumigatus là phổ biến nhất,
tiếp theo là

Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus clavatus, Aspergillus

glaucus, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae,...
Aspergillus oryzae thuộc:
-

Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Lớp: Ascomycetes
Bộ: Plectasales
Họ: Aspergillaceae
Giống: Aspergillus
Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi
nấm phát triển rất mạnh (chiều ngang 57ϻm), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm đa bào), phát triển thành từng
đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty. A.oryzae sinh sản bằng bào tử đính (conidia) đây là
hình thức sinh sản vơ tính. Bào tử đính phát triển thành tế bào rất dày, bên trong hệ sợi
nấm gọi là tế bào chân đế. Nó tạo thành sợi cuống dài và kết thức là một cấu trúc phồng
hình củ hành gọi là bọng (túi).
1.2.2.

Điều kiện nuôi cấy

13


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

-

 Giống dùng để sản xuất phải thỏa mãn các yếu tố sau:
Cho năng suất sinh học cao, có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền
Giống phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản xuất

-

công nghiệp
Giống phải là vi sinh vật thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.
Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh các sản phẩm mong muốn, dễ dàng tách chiết,

-

tinh sạch. Dễ bảo quản và ổn định
 Điều kiện phát triển:
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử: 45%
Độ ẩm mơi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme: 55-58%
Độ ẩm khơng khí: 85-95%

pH mơi trường: 5,5-6,5
Nhiệt độ ni cấy: 27-300C
1.2.3.

Phân lập và nhân giống

Qui trình lấy mẫu: khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất.Sau 8 ngày lấy những
miếng khoai tây lên cho vào bao nilon và mang về phịng thí nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm: Mẫu khoai tây đã xay nhuyễn cho vào 90ml nước cất vô trùng
và trộn đều mẫu.Lấy pipet hút 10ml từ dung dịch ban đầu sang ống nghiệm khác chứa
90ml nước cất vô trùng. Tiếp tục pha loãng tới nồng độ 10-3, 10-4.
Hút 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha lỗng cho vào mơi trường PDA. Dùng que
trang trang đều mẫu trên bề mặt thạch. Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên
sẽ xuất hiện những quầng sáng quanh khuẩn lạc. Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào
trong môi trường trước khi cấy.
Cấy chuyền những mốc đặc trưng vào trong môi trường PDA trong ống thạch
nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong vòng 72h. Nhân giống vi sinh vật
trong bình tam giác: cho10ml nước cất vo trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử.
Lắc đều cho bào tử trộn lẫn với môi trường.
Hút 0,1ml dung dịch cho vào bình tam giác chứa mơi trường sinh trưởng của nấm
KH2PO4

1,4g

MgSo4

0,1g
14

Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

NH4NO3

10g

FeSo4

KCl

0,5

Hồ tinh bột 20g

0,01g
pH=6,5

Tiếp tục đem nhân giống cấp 2,3,... Sau khi nhân giống thành cơng có thể sử dụng
ngay hoặc mang đi bảo quản, dự trữ. Để có hiệu quả cao cần lựa chon các phương pháp
bảo quản thích hợp.

Hình 1.2.3.1 Đường cong sinh khối (ο) và hoạt động fructosyl tranferase (●) của
Aspergillus oryzae
Một đơn vị hoạt động fructosyltranferase được định nghĩa là lượng enzyme sản sinh
ra 1 mol FOS (fructooligosaccharides) mỗi phút trong điều kiện thí nghiệm được chọn.
1.3 Tổng quan về công nghệ lên men tạo enzyme amylase:

1.3.1
Phương pháp lên men bề mặt:
Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường là phương pháp nuôi cấy tạo điều
kiện cho VSV phát triển trên môi trường đặc (bán rắn) hoặc lỏng. Thích hợp ni cấy nấm
mốc, xạ khuẩn.
Mơi trường lỏng: Enzyme ngoại bào được tách từ sinh khối và hịa tan trong dịch
mơi trường; enzyme nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật.
Môi trường đặc: sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc làm môi trường, enzyme ngoại
bào sẽ thẩm thấu vào các hạt môi trường, enzyme nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật.

15


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

Đối với mơi trường rắn: pha khí là pha liên tục trong vùng không gian giữa những
hạt cơ chất. Phần lớn hàm lượng nước hấp thụ vài bên trong hạt cơ chất, tuy nhiên cũng có
thể xuất hiện những giọt nước trong vùng khơng gian tự do hoặc sẽ hình thành một lớp
nước mỏng trên bề mặt hạt cơ chất rắn.

Hạt cơ chất và pha khí phân bố trong hệ ni cấy bề mặt: nuôi cấy nấm sợi (trái) và vi
sinh vật đơn bào (phải)
Đối với kỹ thuật lên men, nếu ta phân loại quá trình lên men theo trạng thái vật lý
của mơi trường thì phương pháp ni cấy bề mặt là một cách thức thực hiện quá trình lên
men cơ chất rắn khơng có sự hiên diện của pha lỏng. Trong đó, cơ chất khơng những đóng
vai trị là nguồn dinh dưỡng mà còn là chất mang cho vi sinh vật.

Nhược điểm: tốn nhiều diện tích, khó cơ giới hóa, tự động hóa.
Ưu điểm: dễ thực hiện, dễ xử lý khi nhiễm vi sinh vật do nhiễm cục bộ.
1.3.2

Phương pháp ni cấy chìm (bề sâu):

16


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

Phương pháp ni cấy chìm thường sử dụng mơi trường lỏng thực hiện trong thùng lên
men (fermentor) trong đó lắp đặt các hệ thống điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp
oxi, điều chỉnh Ph, nồng độ chất dinh dưỡng...Thích hợp ni cấy vi khuẩn và nấm men.
Nhược điểm: khó xử lý khi nhiễm vi sinh vật lạ, phức tạp.
Ưu điểm: dễ dàng cơ giới hóa, tự động hóa, ít chiếm diện tích.
1.4 Tổng quan về nguyên sử dụng:
1.4.1
Nguyên liệu:
Trong thành phần của mơi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng
bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Các nguyên liệu thường được sử dụng
bao gồm: cám mì, bột hạt ngũ cốc, nước chiết ngô, dịch ép quả, rau, khô dầu, bã rượu, rỉ
đường, nấm, men bia, trấu, lõi ngơ.
Thành phần chính của mơi trường: C, H, O, N. Ngồi ra các chất vơ cơ: Mn, Ca, P, S,
Fe, K và các chất vi lượng khác.
Nguồn cacbon: hiện nay chúng ta có nhiều hợp chất cacbohydrat và các hợp chất

khác là nguồn cacbon thích hợp cho việc sinh trường của nấm mốc sinh ra enzyme
amylase có hoạt lực cao. Đặc biệt, tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi sinh tổng
hợp enzyme amylase. Nó là một nguồn nguyên liệu dễ kiếm và rẻ tiền.
Nguồn nitơ (vô cơ và hữu cơ): Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp
enzyme được nâng cao khi trong mơi trường có đồng thời có cả nguồn nito hữu cơ và nito
vô cơ.Trong số các nguồn nito vơ cơ thì NH4+, H2PO4- là tốt hơn cả.
Muối khống rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật. Ion Mg 2+ có tác dụng sinh tổng
hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao.
1.4.2

Chất dinh dưỡng:

Nguồn tinh bột cần cho mơi trường có chứa trong rất nhiều nguyên liệu như tinh bột
từ gạo, tinh bột sắn, tinh bột bắp,...Nhưng nếu sản xuất ở quy mô cơng nghiệp thì ta nên
17


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

chọn nguồn nguyên liệu dễ kiếm và rẻ tiền. Một số loại nguyên liệu dễ kiếm và rẻ tiền
như: gạo, ngô,...
Thành phần dinh dưỡng của gạo:

(Theo Viện Nghiên cứu dinh dưỡng thuộc Đại học Mahidol, Thái Lan, 1999)
Protein của gạo chiếm khoảng 8 – 9%, chủ yếu là glutelin và glubuline. Ngồi ra
cịn có lẫn ít: cozine và prolamin. Lượng protein thối hóa và biến tính dần trong q trình

bảo quản.
Glucid thì chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose và hemicellulose. Trong tinh bột
chủ yếu là amylopectin, có chứa một ít chất khống như: P, K, Mg,...Ngồi ra cịn một số
vitamin như: B1, B2, B6, PP, C, E...
Thành phần dinh dưỡng của ngô:

18


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những ngun liệu có
nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ
cốc khác. Trong các loại nguyên liệu trên, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả.
Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển.

Thành phần của cám mì và cám gạo

19


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

Chất lượng của cám gạo và cám mì có ảnh hưởng đến hoạt lực của amylase, nên dùng
cám tốt, mới, không có vị đắng, khơng hơi mùi mốc, cấu tử được đưa vào có thể là chất
làm giàu thêm các chất sinh trưởng mà cám khơng có đủ, thường là mầm mạch (15 –
20%), trấu (2 – 25%) để làm xốp môi trường , mùn cưa (5 – 10%),...

20


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học TrongNguyên
CNTP liệu

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

Chương 2: Quy trình cơng nghệ sản xuất enzyme amylase
2.1 Quy trình
nhận enzyme
Xửthu
lý nguyên
liệu
Hiện chúng ta sử dụng 3 nguồn sinh học cơ bản để thu nhận enzyme amylase

chẳng hạn như các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh
Giống VSV
Hấp thanh trùng
vật…Trong sản xuất các chế phẩm amylase, người ta thường chia làm hai giai
đoạn: Thu amylase thô và tinh sạch amylase.
Làm nguội

- Thu chế phẩm
amylase thô: Với nguồn động vật và thực vậtNhân
thì tagiống
nghiền ,

-

trích ly rồi ly tâm. Cịn với nguồn vi sinh vật thì ta ni cấy, phá vỡ tế bào rồi
đem lyTrộn
tâm. giống VSV
Giống cho sản xuất
Tinh sạch amylase: Sử dụng phương pháp hóa lý để loại dần các thành phần
không phảiNuôi
amylase.
cấy Sản phẩm cuối cùng là amylase tinh khiết.

Thu nhận phế phẩm enzyme thơ

Lọc

Nghiền mịn

Sấy

Trích ly
Lọc

Kết tủa enzyme
Thu nhận kết tủa

Hòa tan trong dịch đệm

Bã
Cồn hoặc Sulfat Amon

Chế phẩm enzym
bán tinh khiết

Sấy kết tủa

Sắc kí trao đổi ion
Sản phẩm

Tách rửa

rửa
2.2 Quy trình
nhận
enzyme
từ nấm mốcTách
Aspergillus
oryzae
Chếthu
phẩm
enzyme
tinh amylase
khiết

Siêu lọc
21

Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

2.3 Thuyết minh quy trình
2.3.1
Chuẩn bị mơi trường
Ở nước ta, nguồn ngun liệu chứa tinh bột thì vơ cùng đa dạng và phong phú. Ví
dụ như tinh bột từ gạo (gạo tẻ, gạo nếp…), ngô (bắp), sắn…. nhưng để phù hợp cho sản
xuất enzyme amylase ở quy mơ cơng nghiệp thì cần phải tính đến chi phí cho giá thành
sản phẩm. Do vậy, nguồn nguyên liệu cần được quan tâm và chú trọng về mức độ rẻ tiền
và dễ kiếm. Đây là một lợi thế rất quan trọng cho nhà sản xuất và cho cả người tiêu dùng
để có giá thành thấp và được sản xuất đại trà. Trong bài báo cáo, nhóm chọn nguồn
nguyên liệu là cám gạo có bổ sung thêm một số chất khác.

22


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

Nguồn tinh bột như cám gạo, chứa khoảng 20% tinh bột, 10- 20% chất béo, 10–
14% protein, 8 – 16% cellulose, các chất hịa tan khơng chứa nitơ 37– 59%.Cám gạo

khơng được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20%, khơng có vị chua hay đắng, không hôi
mùi mốc, độ ẩm không quá 15%. Cám được trộn với nước tới độ ẩm 55-58. Mơi trường
này có pH 5,5-6,5 phù hợp với Aspergillus oryzae nên khơng cần phải điều chỉnh pH.
Ngồi ra, ta có thể dùng đậu nành trộn lẫn cám gạo để nuôi cấy nấm mốc
Aspergillus oryzae. 60% đậu nành đã được ngâm trong nước trong 6-8 giờ sau đó được ủ
trong 121°C trong 40 phút. 40% cám gạo đã được nướng đến nâu đậm và bị vỡ.
Bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ từ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO) và hữu cơ từ như
malt, nước chiết ngơ, nước lọc bã rượu; photpho, muối khống và các phụ phẩm thêm
vào để thống khí, tạo độ xốp cho môi trường nuôi cấy như trấu, mùn cưa (chiếm khoảng
20-25%).
2.3.2

Hấp thanh trùng, làm nguội

Cám và các chất phụ gia chứa nhiều tế bào vi sinh vật khác nên cần phải hấp thanh
trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất khơng chứa
vi sinh vật ngoại lai, cần thanh trùng dưới áp suất 1-1,5 atm bằng hơi nóng ở nhiệt độ
120oC trong vịng 60 phút. Để thuận lợi cho việc thanh trùng có hiệu quả, cũng như tạo
điều kiện cho nấm sợi phát triển, trước khi thanh trùng người ta thường điều chỉnh pH
môi trường ( nếu sử dụng môi trường khác).
Môi trường phải đem đi hấp thanh trùng và làm nguội đến 30 oC và duy trì ở độ ẩm
55-65% trong suốt q trình ni cấy.
2.3.3

Ni cấy

Sau khi nhân giống cấp 1,2,3, Aspergillus oryzae được bổ sung và môi trường với
tỉ lệ 0.5-2% và trộn đều.
Môi trường được rải đều ra các khay với chiều dày 2 -3cm, rồi được đem vào phịng
ni cấy, đặt trên các giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng khơng khí được

23


Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Công
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

lưu thơng thường xun. Phịng ni cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm
khơng khí, nhiệt độ thích hợp cho sợi nấm phát triển là từ 28 oC – 32oC. Nhiệt độ quá cao
hoặc quá thấp đều ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm.
Trong quá trình ni cấy, ta hồn tồn khơng cần điều chỉnh pH. Mơi trường bán rắn
là mơi trường tình nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít ảnh hưởng đến tồn bộ khối
mơi trường.
Thời gian ni sợi nấm thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ
thuộc vào chủng mốc Asp. oryzae, điều kiện môi trường cùng như kĩ thuật ni cấy.

Hình ảnh: khay ni cấy bề mặt
Thông số kĩ thuật:

+ dày 4-5 cm
+ cao 1-1.2 m

Quá trình ủ sẽ xảy ra ba giai đoạn :
-

Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài từ 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai
đoạn này có những thay đổi sau như nhiệt độ tăng rất chậm, sợi nấm bắt đầu hình thành
24

Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong CNTP
Nghệ Sinh Học Trong CNTP

GVHD: Nguyễn Thuỷ HàỨng Dụng Cơng
GVHD: Nguyễn Thuỷ Hà

có màu trắng hoặc màu sữa, thành phần chất dinh dưỡng cũng bắt đầu thay đổi, khối mơi
trường cịn rời rạc, enzyme mới bắt đầu được hình thành. Trong giai đoạn này khơng
-

được đưa nhiệt độ cao q 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.
Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài từ 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi
cơ bản sau: Tồn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và phát triển mạnh tạo thành
những mạng chằng chịt bao quanh các hạt mơi trường, có thể nhìn rõ sợi nấm màu trắng
xám bằng mắt thường, môi trường kết lại khá chặt, độ ẩm môi trường giảm dần, nhiệt độ
môi trường có thể tăng nhanh lên 40-50 0C, các chất dinh dưỡng giảm nhanh do sự đồng
hóa của sợi nấm, enzyme amylase được tổng hợp mạnh, lượng O 2 trong không khí giảm
và lượng CO2 tăng dần, cần phải thơng khí mạnh và duy trì mức nhiệt độ từ 29-300C là tốt

-

nhất.
Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài từ 10-20 giờ. Trong giai đoạn này, quá trình trao đổi
chất yếu dần, do đó mức độ tiêu hao chất dinh dưỡng sẽ giảm lại, nhiệt độ của khối môi
trường cũng giảm. Bào tử được hình thành nhiều do đó lượng Enzyme amylase tạo ra sẽ
giảm xuống. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzyme rất cần
thiết.
2.3.4

Thu nhận chế phẩm enzyme thơ

Kết thúc q trình ni cấy ta thu được chế phẩm của enzyme amylase, chế phẩm
này được gọi là chế phẩm enzyme thơ (vì ngồi thành phần enzyme ra, chúng còn chứa
sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước trong môi trường).
Để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không bị mất hoạt tính, người ta thường
sấy khơ chế phẩm enzyme đế một độ ẩm thấp (thiết bị thường dùng ở đầu là máy sấy
chân không). Độ ẩm cần đạt được sau khi quá trình sấy kết thúc là nhỏ hơn 10% độ ẩm.
Để đảm bảo hoạt tính enzyme khơng thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38-40 oC.
Enzyme amylase ở nấm mốc Asp.oryzae sẽ bị bất hoạt nếu nhiệt độ lên đến 60-70oC.
Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ta có thể sử dụng ngay enzyme này mà không
cần phải tinh sạch. Trong những trường hợp khác ta phải tiến hành tinh sạch enzyme để
bảo quan lâu hơn.
25