vius

<span class='text_page_counter'>(1)</span><div class='page_container' data-page=1>

Chủ đề: Tìm hiểu virus gây bệnh khảm vàng

và đốm vịng trên Lan

. Nhóm 9 : GVHD:Nguyễn Thị Kim Cúc
. Lê Thị Kim Chi

</div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>

Nội dung :



I. Giới thiệu chung.



II. Đặc điểm sinh học.



III.Cơ chế sao chép, cơ chế gây bệnh.



IV.Triệu chứng và ảnh hưởng.

</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3>

I. Giới thiệu chung.



Đối với việc trồng lan, khó khăn và nguy

hại nhất là các tác nhân gây bệnh gồm có:



Cơn trùng.



Nấm.

</div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>

 Tác hại do virus gây ra là nghiêm trọng nhất.

Trong đó hai loại virus chính gây hại nghiêm
trọng cho lan là:

 <i> Virus CymMV (Cymbidium mosaic virus): Gây </i>

bệnh khảm vàng

 <i>Virus Odontoglossum ringspot virus (ORSV): </i>

Gây bệnh đốm vòng.

 Do vậy, việc phát hiện sớm để ngăn ngừa và

</div>
<span class='text_page_counter'>(5)</span><div class='page_container' data-page=5>

II. Phân loại,đặc điểm hình thái, cấu

trúc bộ gen.

CymMV ORSV

Phân loại

Nhóm:Nhóm IV ((+)
ssRNA)
<i>Giống: Potexvirus </i>
<i>Họ: Flexiviridae </i>
Nhóm:Nhóm IV
((+) ssRNA)
Chi:Tobamovirus
Họ:Virgaviridae

Đặc điểm
hình thái

Dạng sợi, khơng
màng bao, dài 480
nm, rộng 13nm.

</div>
<span class='text_page_counter'>(6)</span><div class='page_container' data-page=6>

Đặc điểm hình thái.

CymMV

</div>
<span class='text_page_counter'>(7)</span><div class='page_container' data-page=7>

• Cấu trúc bộ gen

CymMV ORSV

- RNA mạch đơn, sợi

dương((+)ssRNA), có mũ chụp ở đầu
5’ và đi polyA ở đầu 3’.

- Gồm 3 vùng: RdRp, TGB và CP.
RNA bộ gen có chiều dài 6227

nucleotide khơng tính đi poly A ở
đầu tận cùng 3’, có 5 khung đọc mở
(ORFs 1-5) mã hóa cho ba loại

protein khác nhau: RdRp (160KDa),
TBG (26KDa/ 13 KDa/ 10 KDa) và
CP(24KDa).

- RNA mạch đơn, sợi dương
((+)ssRNA).

-Gồm 3 vùng: RdRp, MP và CP.

</div>
<span class='text_page_counter'>(8)</span><div class='page_container' data-page=8></div>
<span class='text_page_counter'>(9)</span><div class='page_container' data-page=9></div>
<span class='text_page_counter'>(10)</span><div class='page_container' data-page=10>

• Cơ chế sao chép

<b> RNA đơn(+)</b>

<b> </b>

<b> Protein RNA(-)</b>

<b> Cắt RNA(+)</b>

<b> </b>

</div>
<span class='text_page_counter'>(11)</span><div class='page_container' data-page=11></div>
<span class='text_page_counter'>(12)</span><div class='page_container' data-page=12>

IV. Triệu chứng.

 Virus CymMV:

- Hiện tượng ở lá :
+ Vàng

+ Thể khảm đi kèm
với sự hóa đen

+ Chết của những

vùng lá dọc theo gân
+ Có các đốm và vệt

mơ chết kéo dài, màu
nâu đến đen, không đều
trên cả hai mặt của các
lá già.

</div>
<span class='text_page_counter'>(13)</span><div class='page_container' data-page=13>

- Hiện tượng ở hoa:

<i> Ở các giống lan: Phalaenopsis, Cattleya, </i>

<i>Dendrobium và nhiều giống khác. Cụ thể: </i>

+ Gây các đốm hoại tử đen và các kiểu đường hoại
tử với các vết lõm xuống.

+ Tạo ra sự khảm màu (thường đậm hay nhạt hơn
<i>màu hoa) trên hoa Cattleya.</i>

+ Hoa có thể nở với hình dạng kém phát triển. Nếu lá
chết trước khi trưởng thành, hoa thường có kích
thước nhỏ và số lượng hoa ít.

<i>+ Biểu hiện sau khoảng 2 tuần (vd:hoa Cattleya </i>
trắng).

</div>
<span class='text_page_counter'>(14)</span><div class='page_container' data-page=14>



Virus ORSV

- Hiện tượng trên lá:
+ Gây các đốm vòng

vàng trên lá lan

<i>Odontoglossum </i>
<i>grande Lindl. </i>

+ Phổ biến là vàng lá

dạng hình thoi kèm
với các vệt vàng ở
trên lá lan

</div>
<span class='text_page_counter'>(15)</span><div class='page_container' data-page=15>

- Hiện tượng trên hoa:

+ Tạo ra sự khảm màu . Các
vệt màu đen thường được
nhận thấy trên cây lan có
hoa từ màu hồng đến xanh
nhạt pha đỏ (lavender)

+ Trước đây chỉ xảy ra ở

<i>Cattleya, hiện nay đã hiện </i>

diện ở các giống lan như

<i>Odontoglossum, </i>

<i>Cymbidium, Vanilla và </i>

nhiều giống lan khác.

</div>
<span class='text_page_counter'>(16)</span><div class='page_container' data-page=16>



Triệu chứng khi nhiễm cả hai loại virus

- Những sọc ngắn màu vàng
nhạt trên bản lá non và

trưởng thành, làm lá nhỏ

dựng đứng, phát hoa ngắn.
- Bệnh xuất hiện cả trên cây

con và cây nhiều tuổi,

</div>
<span class='text_page_counter'>(17)</span><div class='page_container' data-page=17>



_{Ảnh hưởng tới cây trồng.}

<b>- Làm thay đổi hình thức và dáng vẻ từ chóp </b>

rễ đến đỉnh ngọn, chỉ gây bệnh ở điểm bị

thủng, các tế bào ở gần vết thương. Phần

nhiều các virus gây bệnh theo cách lưu

dẫn.

- Virus tấn công cây chủ và tồn tại ở đó suốt

đời. Ở cây sinh sản dinh dưỡng, thì tồn tại

dai dẳng.

- Các triệu chứng tùy thuộc: Loại cây chủ, loại

virus và điều kiện môi trường như ánh

</div>
<span class='text_page_counter'>(18)</span><div class='page_container' data-page=18>



<b> Ảnh hưởng tới kinh tế. </b>

- Lan nhiễm virus thường lây lan rất nhanh,

gây chết số lương lớn , và không chữa

triệt để bằng cách cắt bỏ mô hư hỏng hay

dùng các phương pháp như đối với lan

</div>
<span class='text_page_counter'>(19)</span><div class='page_container' data-page=19>

V. Hình thức lan truyền.

 <b>Lan truyền cơ học:</b>

- Lan truyền qua nhựa cây,
khi dùng các dụng cụ cắt
mang mầm bệnh để tách
cây hoặc thu hoạch hoa.
- Lan truyền từ bề mặt các

chậu mang mầm bệnh và
qua nước tưới.

- Qua sự nhân giống dinh
dưỡng thông thường và
qua cấy mơ.

</div>
<span class='text_page_counter'>(20)</span><div class='page_container' data-page=20>

<b> Kiểm sốt bằng biện pháp vệ sinh</b>

- Sử dụng dụng cụ sạch. Xử lý bằng nhiệt là

cách an toàn và hiệu quả nhất để khử trùng

dụng cụ.

- ORSV có thể vơ hiệu hóa ở 100

0

C sau 10

phút. Các dụng cụ thường được nhúng trong

cồn trước khi đốt. Mặt cắt nên đưa vào lửa

trong nhiều giây.

</div>
<span class='text_page_counter'>(21)</span><div class='page_container' data-page=21>

VI. Phương pháp phát hiện.

<b>1. Phát hiện virus gây hại lan bằng cách </b>

<b>test thử nhanh </b>

</div>
<span class='text_page_counter'>(22)</span><div class='page_container' data-page=22>

• Nguyên tắc của test thử nhanh



Dựa vào phản ứng tạo màu khi có sự hiện

diện của 1 kháng nguyên (protein màng

bao của virus), kết hợp chuyên biệt với

</div>
<span class='text_page_counter'>(23)</span><div class='page_container' data-page=23>

Test thử nhanh

 Ưu điểm:

- Đơn giản.

- Không cần đầu tư
trang thiết bị.

- Tiện lợi.

- Giá thành rẻ

 Nhược điểm:

- Chỉ dùng để sàng lọc
và phát hiện sớm các
mẫu nghi ngờ bị

</div>
<span class='text_page_counter'>(24)</span><div class='page_container' data-page=24>

<b>- </b>

<b>Pocket Diagnostics Orchid virus screen - </b>

<b>Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum </b>
<b>ringspot virus</b>

</div>
<span class='text_page_counter'>(25)</span><div class='page_container' data-page=25>

Phát hiện bằng RT-PCR.

<b>Mẫu( Lá/Hoa Lan)</b>

<b> Chuẩn bị mẫu</b>

<b>Tách chiết RNA</b>

<b>Monoplex RT-PCR</b> <b>Multiplex RT-PCR: </b>

<b>Điện di</b>

</div>
<span class='text_page_counter'>(26)</span><div class='page_container' data-page=26>

Phương pháp RT-PCR

 Ưu điểm:

- Có độ tin cậy cao hơn

các phương pháp
khác

 Nhược điểm:

- Đòi hỏi phòng thí
nghiệm hiện đại.

- u cầu trình độ

chun mơn, kỹ thuật
cao.

</div>
<span class='text_page_counter'>(27)</span><div class='page_container' data-page=27>

<b>2. Phát hiện virus gây hại lan bằng RT-PCR</b>

<b> a. Thực hiện phản ứng Monoplex RT-PCR:</b>

<b>Chuẩn bị phản ứng RT: </b>

<b>- Đối với mẫu phân tích: (Chuẩn bị mẫu đối chứng ). </b>

 Trộn từng loại 2µl RNA tổng số đã tách chiết tương ứng với từng loại

0.5µl primer ngược (nồng độ 5µM):

+ RNA của virus CymMV: sử dụng primer CymMV CP-R1.
+ RNA của virus ORSV: sử dụng primer ORSV CP-R1.
+ RNA của thực vật: sử dụng primer mt-R1.

 Tiếp tục trộn hỗn hợp trên với 5µl nước cất 2 lần. Đun 10 phút ở

70oC, làm lạnh ngay trên đá trong 5 phút. Tiếp tục bổ sung vào hỗn hợp

RT gồm:

+ Nước cất 2 lần 3.25µl
+ Buffer (5x, Promega) 2.5µl

+ dNTPs (10mM) 1.25µl
+ RNasin (40 U/µl, Promega) 0.25µl

</div>
<span class='text_page_counter'>(28)</span><div class='page_container' data-page=28>

- Ủ phản ứng trên ở 420C trong 60 phút. Tiếp tục bổ sung
các hóa chất sau để tiến hành phản ứng PCR: (sử dụng
mỗi cặp primer cho từng mẫu RNA tương ứng):

- Sản phẩm của phản ứng RT
2µl

- DyNAzyme™ II DNA polymerase buffer (10x, Finnzymes
Inc.) 2µl

- 1 cặp Primer xi và ngược

(5µM) 2µl

- dNTPs (2 mM)
2µl

- DyNAzyme™ II DNA polymerase enzyme (2 U/ µl,
Finnzymes Inc.) 0.4µl

</div>
<span class='text_page_counter'>(29)</span><div class='page_container' data-page=29>

 Sau khi đã chuẩn bị, tiếp theo là đặt các phản ứng vào
máy PCR và thiết lập chương trình phản ứng như sau:
Bước 1: biến tính ở 960C trong 5 phút.

Bước 2: 960C trong 30 giây.

Bước 3: 520C trong 30 giây.

Bước 4: 720C trong 30 giây.

Lặp lại 30 chu kỳ từ Bước 2 đến Bước 4.
Bước 5: 720C trong 7 phút.

 Cuối cùng là phân tích sản phẩm khuếch đại trên gel

</div>
<span class='text_page_counter'>(30)</span><div class='page_container' data-page=30>

<b> b. Thực hiện phản ứng Multiplex RT-PCR:</b>

 Chuẩn bị và thực hiện tương tự như Monoplex

RT-PCR. Tuy nhiên, có vài điều khác biệt:

<b> Phản ứng RT:</b>

 Được chuẩn bị và thực hiện tương tự như phản

ứng Monoplex RT-PCR, ngoại trừ 3 primer

ngược (primer reverse CymMV CP-R1, ORSV
CP-R1 và mt-R1) là được cho vào đồng thời

</div>
<span class='text_page_counter'>(31)</span><div class='page_container' data-page=31></div>
<span class='text_page_counter'>(32)</span><div class='page_container' data-page=32>

<b>VII. Ứng dụng khác</b>

 <b>Chiến lược chuyển gen kháng Cymbidium mosaic virus </b>

</div>
<span class='text_page_counter'>(33)</span><div class='page_container' data-page=33>

- Đầu tiên phải thu nhận toàn bộ gen của virus từ lá
của cây lan

- Tồn bộ RNA sau ly trích sẽ dùng làm vật liệu tổng
hợp cDNA của gen mã hoá protein vỏ virus (CP)
nhờ phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu.

- Sản phẩm của phản ứng RT-PCR sau đó được gắn
vào vector, tạo thành plasmid chứa tồn bộ trình tự
gen Cp của virus.

- Kết quả đựơc xác nhận bằng cách giải trình tự: gen
có chứa vùng mã hố protein vỏ đặc trưng cho

virus.

- Gen CP tiếp tục đựơc tinh sạch và chèn vào

</div>
<span class='text_page_counter'>(34)</span><div class='page_container' data-page=34>

- Protector chuyển gen phát triển thành cây trên môi
trường chứa hygromycin là tác nhân chọn lọc

dòng chuyển gen sau 6 tháng . Hiệu quả chuyển
là 0.5 %. Cây con đủ rễ được chuyển ra trồng

trong phòng tăng trưởng (Hình D).

- Để nghiên cứu tính kháng virus, cả cây chuyển
gen và không chuyển gen điều ủ với virion virus.
Sau 1, 2, 4 tháng gây nhiễm lá của chúng sẽ được
kiểm tra bằng ELISA để đo lường mức độ tích tụ
của virus.

</div>
<span class='text_page_counter'>(35)</span><div class='page_container' data-page=35></div>

<!--links-->