Nghiên cứu thu nhận enzyme nattokinase bằng phương pháp lên men bề mặt từ phế liệu bã đậu nành

..

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---------------------------------------

VĂN THỊ DIỆU LINH

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME NATTOKINASE
BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT
TỪ PHẾ LIỆU BÃ ĐẬU NÀNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Công nghệ sinh học

Đà Nẵng – Năm 2017


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---------------------------------------

VĂN THỊ DIỆU LINH

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME NATTOKINASE
BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT
TỪ PHẾ LIỆU BÃ ĐẬU NÀNH

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trương Thị Minh Hạnh

Đà Nẵng – Năm 2017


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn
của PGS. TS. Trương Thị Minh Hạnh.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố
trong bất kỳ cơng trình khoa học nào khác.
Ngày 11 tháng 01 năm 2018

Văn Thị Diệu Linh


NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME NATTOKINASE
BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT TỪ PHẾ LIỆU BÃ ĐẬU NÀNH
Họ và tên: Văn Thị Diệu Linh
Mã số: 60.42.02.01

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Khóa: K32.CSH Trường Đại học Bách Khoa - ĐHĐN

Tóm tắt - Nattokinase là enzyme có khả năng làm tiêu huyết khối, giúp ngăn ngừa các
bệnh lý liên quan đến chứng huyết khối. Sản xuất enzyme nattokinase từ lên men phế liệu
bã đậu nành là một phương pháp chẳng những góp phần tăng cường hiệu quả kinh tế, mà

việc tận dụng phế phẩm bã đậu nành cịn có nhiều ý nghĩa về mặt bảo vệ môi trường.
Nghiên cứu này tiến hành khảo sát điều kiện thích hợp lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus
subtilis natto trên cơ chất bã đậu nành và thu nhận enzyme. Kết quả nghiên cứu cho thấy
quá trình lên men bã đậu nành với tỷ lệ giống 14% (v/w), có bổ sung 20% (w/w) bột đậu
nành, sau 24 giờ lên men thu được enzyme nattokinase với hoạt lực cao nhất là 11,67
đv/ml. Nghiên cứu cũng đã tiến hành kết tủa enzyme bằng dung dịch ethanol 96%, sau đó
sấy thăng hoa thu chế phẩm enzyme thơ có hoạt độ riêng 35,29đv/g. Các đề xuất về quy
trình sản xuất chế phẩm protease giàu enzyme nattokinase và sinh khối vi khuẩn Bacillus
subtilis natto, quy trình sản xuất chế phẩm enzyme nattokinase ở quy mơ phịng thí
nghiệm cũng được trình bày trong nghiên cứu này.
Từ khóa – nattokinase; bã đậu nành; Bacillus subtilis natto; lên men bề mặt; tiêu huyết
khối .
EXTRACTION ENZYME NATTOKINASE BY SOLID STATE FERMENTATION
SOYBEAN CURD RESIDUES
Abstract - Nattokinase is an enzyme with fibrinolytic activity that can be used for
preventing thrombolytic diseases. Production nattokinase enzyme by fermentation
soybean curd residues does not only increase economic value, but also brings many
enviromental benefits. In this study, I make survey the effect fermentation conditions to
Bacillus subtilis natto strain on the soybean curd residues substrate to enhance the
nattokinase activity and extraction nattokinase enzyme. It is showed that when ferment
conditions were involved with 14% (v/w) of Bacillus subtilis natto, 20% (w/w) soybean
power added, for 24 hours, the highest protease activity could reach 11,67 units/ml. I also
try to extract enzyme by ethanol 96% and create dried products by freeze drying process
and obtain nattokinase activity 35,29 units/g. Offerings of the process of receiving
nattokinase and Bacillus subtilis natto rich protease and receiving crude nattokinase
enzyme in laborary were showed in this research.
Key words – nattokinase; soybean curd residues; Bacillus subtilis natto; solid state
fermentation; fibrinolytic activity.

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .……………………………………………………………… ……..1
1. Tính cấp thiết của đề tài…………………………………………….................1
2. Mục tiêu nghiên cứu……………………………………………………. ........2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ………………………....................... .........3
4. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………… …...3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu…………………… ........4
6. Bố cục đề tài…………………………………………………………....... .......4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN……………….…....…………………………...5
1.1. TỔNG QUAN VỀ BÃ ĐẬU NÀNH..………………………………… …..5
1.1.1. Giới thiệu về bã đậu nành……………………………………………….5
1.1.2. Một số ứng dụng của bã đậu nành……………………...…….………...8
1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME NATTOKINASE…………………… …..10
1.2.1. Giới thiệu về nattokinase…………………………………………… …10
1.2.2. Cơ chế tác dụng của nattokinase………………………………………12
1.3. TỔNG QUAN VỀ BACILLUS SUBTILIS NATTO…….………… ……13
1.3.1. Giới thiệu về Bacillus subtilis natto……………………………….… ...13
1.3.2. Đặc điểm hình thái và sinh hóa của Bacillus subtilis natto …..…… ...15
1.3.3. Khả năng sinh tổng hợp enzyme của Bacillus subtilis natto
…………………………………………………………………………… …….16
1.3.3.1. Các enzyme nội bào Bacillus subtilis natto............................................16
1.3.3.2. Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis natto.......................... .......16
1.3.4. Các phương pháp lên men................................................................ ......16
1.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme của
vi khuẩn Bacillus subtilis natto..................................................................... ....17
1.3.5.1. Nhiệt độ............................................................................................. .....17
1.3.5.2. pH........................................................................................................ ...18
1.3.5.3. Thời gian nuôi cấy............................................................................. .....18
1.3.5.4. Thành phần mơi trường..................................................................... .....18

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC...…… ……18
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới……………………………… ……18
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước………………………………… …..19


CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

…………………………………………...……………………… …..21
2.1. NGUN LIỆU, HĨA CHẤT….………………………………… …….21
2.1.1. Ngun liệu……………………………………………………………...21
2.1.2. Thiết bị…………………………………………………………………..21
2.1.3. Hóa chất………...……………………………………………………….22
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………… ….23
2.2.1. Phương pháp xác định một số thành phần hóa học của bã đậu
nành………………………………………………………………...….…… …24
2.2.2. Phương pháp hoạt hóa và giữ giống ............................................... ......24
2.2.3. Phương pháp nhân giống …………................................................. ......24
2.2.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào …………………………… …...24
2.2.5. Phương pháp lên men .......................................................................... ...25
2.2.5.1. Khảo sát thời gian lên men……… ……………...……………………..26
2.2.5.2. Khảo sát tỷ lệ giống……………………………………… ……………26
2.2.5.3. Khảo sát tỷ lệ bột đậu nành được bổ sung……………………………..26
2.2.6. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô………… ……….........26
2.2.7. Phương pháp kết tủa enzyme nattokinase bằng dung môi ethanol
96%............................................................................................... .....................27
2.2.8. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease ............... ..................27
3.2.9. Phương pháp sấy thăng hoa…………… ……………………………...29
2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu…..…………… ………………………......30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN… ………………………........30
3.1. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÃ ĐẬU

NÀNH………...….......................................... ....................................................31
3.2. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN TYROSIN.… ……………………........32
3.3. KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG… ...…………………..........32
3.4. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG QUÁ TRÌNH LÊN MEN.34
3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men … ……….........................34
3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống……………...................................36
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bột đậu nành bổ sung vào môi trường lên
men........................................................... ..... .....................................................38


3.5. KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÀM TAN HUYẾT KHỐI CỦA ENZYME
NATTOKINASE................................................................................................41
3.6. KHẢO SÁT TỶ LỆ ETHANOL 96% TRÊN DỊCH CHIẾT ENZYME
THÔ THU NHẬN KẾT TỦA ENZYME… ……............................................42
3.7. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROTEASE GIÀU
ENZYME NATTOKINASE VÀ SINH KHỐI VI KHUẨN BACILLUS
SUBTILIS NATTO.................................... . .......................................................45
3.8. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME
NATTOKINASE THƠ QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM.. .......................48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………… ...............................51
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO……… ……………………...52
PHỤ LỤC
BIÊN BẢN HỌP HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN VĂN THẠC SỸ (bản sao)
NHẬN XÉT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỦA CÁC PHẢN BIỆN (bản sao)
QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (bản sao)


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA

CFU

Analysis of Variance
Colony Forming Unit


DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu
bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Thành phần acid amin trong bã đậu nành

6

1.2

Thành phần khống chất có trong bã đậu nành

7

1.3

Các sản phẩm lên men từ bã đậu nành

9

2.1

Các thiết bị và dụng cụ chính được sử dụng trong
nghiên cứu

21

2.2

Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

22

2.3

Bảng pha dung dịch xây dựng đường chuẩn tyrosine

28

3.1

Một số thành phần hóa học của bã đậu nành

30

3.2

Kết quả lên men thu nhận enzyme

38

3.3

Kết quả thử khả năng làm tan huyết khối của dịch chiết
enzyme

40


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Số
hiệu
hình
vẽ

Tên hình vẽ

Trang

1.1.

Bã đậu nành

5

1.2.

Quy trình thu nhận bã đậu nành của các cơ sở sản xuất đậu phụ

8

1.3.

Cấu trúc bậc 3 của nattokinase

10

1.4

Một số sản phẩm thương mại chứa nattokinase

12

1.5

Cơ chế tác dụng của enzyme nattokinase

12

1.6

Các sản phẩm natto truyền thống (C) và natto hiện đại (A, B)

14

1.7.

Vi khuẩn Bacillus subtilis natto

15

1.8.

Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis natto

15

2.1.

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

23

2.2.

Quy trình lên men bã đậu nành bằng phương pháp lên men bề
mặt

25

2.3.

Sơ đồ quy trình thu nhận dịch chiết enzym nattokinase thô

27

3.1

Đồ thị đường chuẩn tyrosine

31

3.2.

Đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis natto

32

3.3

Dịch tăng sinh 24 giờ

33

3.4

Ảnh hưởng của thời gian lên men đối với quá trình lên men bã
đậu nành thu nhận enzyme nattokinase

34

3.5

Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đối với quá trình lên men bã đậu
nành thu nhận enzyme nattokinase

35

3.6

Ảnh hưởng của tỷ lệ bột đậu nành bổ sung đối với quá trình lên
men bã đậu nành thu nhận enzyme nattokinase

37

3.7

Bã đậu nành lên men không bổ sung bột đậu nành

38

3.8

Bã đậu nành lên men có bổ sung 20% bột đậu nành

39

3.9

Dịch chiết enzyme nattokinase thơ

39

3.10

Thí nghiệm kiểm tra khả năng làm tan huyết khối của dịch chiết
enzyme

40

3.11

Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol 96% đối với quá trình kết
tủa enzyme nattokinase

42

3.12

Kết tủa enzyme bằng ethanol 96%

42

3.13

Sơ đồ qui trình sản xuất chế phẩm protease giàu enzyme
nattokinase và sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis natto

44

3.14

Chế phẩm protease giàu enzyme nattokinase và sinh khối vi
khuẩn Bacillus subtilis natto

45

3.15

Sơ đồ qui trình sản xuất chế phẩm enzyme nattokinase thơ ở
quy mơ phịng thí nghiệm

47

3.16

Chế phẩm thơ enzyme nattokinase

48


1

MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, các bệnh liên quan đến tim mạch như: nhồi máu
cơ tim, suy tim, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, đột quỵ,…đang gia tăng một cách báo
động. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), mỗi năm có khoảng 17,5 triệu
người tử vong do các bệnh liên quan đến tim mạch. Trong khi đó tại Việt Nam, theo số
liệu của Hội Tim mạch, hàng năm, các bệnh lý về tim mạch cướp đi sinh mạng của
200.000 người, chiếm ¼ tổng số trường hợp tử vong của cả nước. Bên cạnh đó, số ca tử
vong do bệnh lý tim mạch có xu hướng ngày càng tăng và trẻ hóa [39]. Song song với đó,
chi phí điều trị, chăm sóc, phục hồi chức năng cho các bệnh nhân cũng là gánh nặng lớn
cho các quốc gia, trong đó có Việt Nam.
Theo các nghiên cứu, nguyên nhân chính gây ra các bệnh lý tim mạch là do sự hình
thành các cục máu đơng hay cịn gọi là huyết khối. Các cục máu đông gây tắc nghẽn các
mạch máu, gây tổn hại đến các cơ quan trong cơ thể và là nguyên nhân trực tiếp gây ra

các bệnh nguy hiểm như: tai biến do tăng huyết áp, nhồi máu cơ tim, nhồi máu não, suy
tim, thuyên tắc phổi,…Nhiều phương pháp đã được áp dụng để điều trị huyết khối như: sử
dụng các chất chống đông như heparin, coumarin; sử dụng các enzyme làm tan huyết khối
như: streptokinase, urokinase,…thậm chí là phương pháp phẫu thuật. Tuy nhiên, chi phí
điều trị bằng các biện pháp trên rất cao, ngồi ra các loại thuốc điều trị chỉ có tác dụng
trong thời gian ngắn, khơng có tác dụng phịng ngừa, đồng thời gây ra các tác dụng phụ
như xuất huyết tồn thân, dị ứng [22, 37]. Do đó, việc tìm kiếm các phương pháp có giá
thành rẻ và an tồn hơn thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong những năm qua.
Việc phát hiện nattokinase mở ra một triển vọng mới cho việc điều trị và phòng
ngừa chứng huyết khối. Nattokinase được thu nhận từ các thực phẩm lên men truyền
thống như: natto Nhật Bản, douche Hàn Quốc, nước tương Chung kook-jang Hàn Quốc
và Thua nao từ phía Bắc Thái Lan. So với các loại thuốc tan huyết khối sẵn có hiện nay,
nattokinase có nhiều ưu thế như an toàn, giá thành thấp hơn, hiệu quả, tác dụng kéo dài,
sử dụng phòng ngừa và sử dụng qua đường ăn uống dễ dàng [16, 21].
Hiện nay, enzyme nattokinase chủ yếu được thu nhận từ quá trình lên men với cơ
chất là hạt đậu nành. Một số nghiên cứu đã đề cập đến các nguồn nguyên liệu khác thay
thế như: gạo lức, cao ngơ, bã đậu nành,…Trong đó, bã đậu nành từ các nhà máy sản xuất
đậu phụ là nguồn nguyên liệu rẻ tiền cần được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng vào sản
xuất.


2

Bã đậu nành hiện được sử dụng làm thức ăn gia súc hoặc đạm đậu tương dùng cho
người. Một số nghiên cứu đề cập sử dụng bã đậu nành làm cơ chất cho các quá trình lên
men ethanol, methanol, axit xitric; xử lý kỹ thuật để thay thế một phần bột mì trong sản
xuất bánh mì, bánh cookie, cracker.
Mặc dù bã đậu nành đã được nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nhưng
lượng bã đậu nành chưa được xử lý trên thế giới vẫn chiếm lượng lớn. Tại các nước Châu
Á, các sản phẩm thực phẩm làm từ đậu nành như đậu phụ, sữa đậu nành, nước tương, dầu

đậu nành, tempeh,...được sử dụng phổ biến rộng rãi. Do đó, lượng phế liệu bã đậu nành
phát sinh ra tại khu vực này là khá lớn. Thống kê trên toàn thế giới, hàng năm xấp xỉ 14
triệu tấn phế liệu bã đậu nành được thải ra chủ yếu từ các nước Châu Á và Châu Mỹ [34].
Riêng tại Nhật Bản, lượng bã đậu nành được xử lý là 800.000 tấn với chi phí xử lý lên
đến 16 tỷ yên mỗi năm, số còn lại được sử dụng làm thức ăn chăn ni, phân bón và
lượng lớn trở thành rác thải được xử lý bằng cách đốt hoặc chôn lấp. Đây cũng là thực
trạng chung của các nước còn lại trong khu vực. Những vấn đề môi trường phát sinh từ
nguồn phế phẩm khổng lồ này đã đặt ra nhiều thách thức cho các nhà quản lý và các nhà
khoa học [32].
Trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi ước tính có khoảng hơn 100 cơ sở sản xuất đậu phụ.
Tuy nhiên, hiện nay phần lớn bã đậu nành được bán cho các hộ gia đình nhỏ lẻ làm thức
ăn chăn ni ở dạng thơ chưa qua xử lý, số lượng cịn lại tạo thành rác thải dẫn đến nguy
cơ gây ô nhiễm môi trường.
Trong sản xuất công nghiệp, bên cạnh việc sản xuất ra các chính phẩm, việc tận
dụng các phụ phẩm, phế phẩm là rất cần thiết. Ngoài ý nghĩa về mặt tăng cường hiệu quả
kinh tế, việc tận dụng các phụ phẩm, phế phẩm cịn có nhiều ý nghĩa về mặt bảo vệ mơi
trường.
Từ u cầu thực tiễn đó, tơi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme
nattokinase bằng phương pháp lên men bề mặt từ phế liệu bã đậu nành”

2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Xác định điều kiện thích hợp lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus subtilis natto thu
nhận enzyme nattokinase trên bã đậu nành.
- Xác định tỷ lệ thích hợp ethanol 96% trên dịch chiết enzyme thơ trong q trình
thu nhận enzyme nattokinase.
- Thu nhận chế phẩm enzyme thô.


3

3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
* Đối tượng nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis natto do phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc trường
Đại học Bách khoa Đà Nẵng cung cấp.
- Bã đậu nành lấy từ 03 cơ sở sản xuất đậu phụ trên địa bàn thành phố Quảng Ngãi.
* Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase trên chủng vi khuẩn
Bacillus subtilis natto với cơ chất là bã đậu nành ở quy mô phịng thí nghiệm.

4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
* Nghiên cứu lý thuyết
Trên cơ sở tìm hiểu thơng tin khoa học về bã đậu nành, vi khuẩn Bacillus subtilis
natto, natto, enzyme nattokinase, những nghiên cứu về tổng hợp thu nhận enzyme
nattokinase trong nước và trên thế giới, tiến hành tổng hợp, phân tích các cơng trình
nghiên cứu, các tài liệu khoa học nhằm định hướng và thực hiện đề tài.
* Nghiên cứu thực nghiệm
Phương pháp hóa học
- Phân tích một số thành phần hóa học của bã đậu nành.
- Xác định hoạt lực enzyme bằng phương pháp Amano.
Phương pháp vi sinh
- Nhân giống và hoạt hóa vi khuẩn Bacillus subtilis natto
- Khảo sát quá trình nhân giống và xây dựng đường cong sinh trưởng.
- Thực hiện lên men bằng phương pháp lên men bề mặt.
Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu thí nghiệm bằng phần mềm ANOVA trên Excel 2016. Kết quả thí
nghiệm là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại thí nghiệm.


4

5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
* Ý nghĩa khoa học
- Đóng góp thơng tin khoa học về bã đậu nành và làm phong phú thêm những
nghiên cứu về ứng dụng của bã đậu nành, cung cấp thêm giải pháp xử lý và tận dụng
nguồn phế liệu bã đậu nành.
- Đóng góp thơng tin khoa học về điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis natto
thu nhận enzyme nattokinase bằng phương pháp lên men bề mặt với cơ chất là bã đậu
nành.
* Ý nghĩa thực tiễn
Cung cấp thơng tin cơng nghệ của q trình lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus
subtilis natto trên bã đậu nành thu enzyme nattokinase nhằm ứng dụng vào quy mơ sản
xuất cơng nghiệp, tạo ra sản phẩm có khả năng ứng dụng trong dược phẩm và thực phẩm
chức năng, cải thiện sức khỏe người tiêu dùng. Góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm môi
trường do tận dụng phế thải bã đậu nành.

6. BỐ CỤC ĐỀ TÀI
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và bàn luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
Danh mục tài liệu tham khảo
Phụ lục


5

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ BÃ ĐẬU NÀNH
1.1.1. Giới thiệu về bã đậu nành (okara)
Bã đậu nành (okara) là phần phế phẩm dạng rắn thu được sau quá trình lọc thu dịch
sữa đậu nành trong quá trình sản xuất sữa đậu nành, đậu phụ (đậu khuôn) và các sản phẩm
khác từ đậu nành.
Bã đậu nành (Hình 1.1.) có màu trắng ngà hoặc vàng nhạt, dạng rắn tơi hơi ướt, như
mùn cưa ướt, chủ yếu chứa nước (60-80%), protein (4-25%), chất xơ và các thành phần
khác như lipit, khoáng chất, các vitamin [34].

Hình 1.1. Bã đậu nành [40]
Bã đậu nành có chứa 6.99% H, 46.34% C, 3.99% N, 0.25% S, và 3.59% oxit kim
loại. Thành phần bã đậu nành phụ thuộc vào giống đậu nành, thổ nhưỡng canh tác và
công nghệ sản xuất.
Phế phẩm bã đậu nành có protein chất lượng cao, đặc biệt là acid amin thiết yếu
như: aspartic acid, threonine, serine, glutamic acid, glycine, alanine, cysteine, methionine,
valine, isoleucine, leucine, tyrosine, ... (Bảng 1.1.)


6

Bảng 1.1. Thành phần acid amin trong bã đậu nành [32]
TT

Acid amin

1
2
3
4
5

6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Aspartic acid
Threonine
Serine
Glutamic acid
Glycine
Alanine
Cysteine + methionine
Valine
Isoleucine
Leucine
Tyrosine + phenylalanine
Lysine
Histidine
Arginine
Proline

Khối lượng
(mg/g protein)
117

41
50
195
46
46
26
51
51
81
95
65
28
75
36

Chất xơ đậu nành rất giàu xenlulose, chiếm khoảng 50% trọng lượng khơ. Đây là
một chất xơ ăn kiêng tốt, có lợi cho sức khoẻ liên quan đến chức năng tiêu hóa.
Một số nghiên cứu cho thấy chất xơ trong bã đậu nành có thể làm giảm lượng mỡ
trong máu và huyết áp, hạ thấp mức cholesterol trong máu, bảo vệ chống lại bệnh mạch
vành, ngăn ngừa sự xuất hiện táo bón, ung thư ruột kết và điều chỉnh mức đường trong
máu của bệnh nhân tiểu đường.
Các thành phần khác trong bã đậu nành bao gồm khoáng chất (Bảng 1.2.), lignan,
phytosterols, coumantans và phytates. Các hợp chất này có nhiều chức năng sinh lý và
điều trị như chất chống oxy hoá, phòng chống các bệnh tim mạch và ngăn ngừa các tác
nhân gây ung thư đối với một số loại ung thư [32].


7

Bảng 1.2. Thành phần khống chất có trong bã đậu nành [32]

TT
1
2
3
4
5
6
7
8

Khống chất
P
Na
Ca
Mg
Fe
Cu
Mn
Zn

Khối lượng
(mg/100g khối lượng khơ)
1.35 ± 0.1
0.03 ± 0.0
0.32 ± 0.0
0.13 ± 0.0
0.62 ± 0.1
0.10 ± 0.0
0.21 ± 0.1
0.29 ± 0.1

Trong nghiên cứu này, tôi sử dụng bã đậu nành từ các cơ sở sản xuất đậu phụ được
sản xuất theo sơ đồ hình 1.2.
Đậu nành được làm sạch loại bỏ tạp chất, cho vào ngâm với nước nhằm mục đích
làm cho hạt đậu mềm hơn, dễ tách vỏ, loại bỏ các oligosaccharide (nguyên nhân gây khó
tiêu). Sau đó, đậu nành đã tách vỏ được xay và lọc thu dịch sữa đậu nành. Phần bã loại bỏ
sau quá trình lọc gọi là bã đậu nành, đây chính là đối tượng nghiên cứu của đề tài. Dịch
sữa đậu nành được nấu chín và đơng tụ, tạo hình thu được sản phẩm đậu phụ. Trung bình
cứ 1kg đậu nành sản xuất sẽ phát sinh ra 1,1kg bã đậu nành [18]
Hiện nay, phần lớn bã đậu nành được bán cho các cơ sở chăn nuôi để làm thức ăn
gia súc, gia cầm ở dạng thô. Tuy nhiên, đây là một phụ phẩm giàu dinh dưỡng có tiềm
năng lớn trong ứng dụng sản xuất thực phẩm, chế phẩm sinh học,... bên cạnh việc sử dụng
làm thức ăn chăn nuôi.
Bã đậu nành được chọn là cơ chất lên men cho nghiên cứu này vì đây là nguồn
nguyên liệu rẻ tiền, phong phú, dễ kiếm, có thành phần dinh dưỡng đa dạng phù hợp cho
q trình lên men. Bên cạnh đó, việc tận dụng nguồn phế phẩm bã đậu nành là một giải
pháp hữu ích trong việc giải quyết vấn đề môi trường do các hoạt động sản xuất các sản
phẩm thực phẩm từ đậu nành.


8

Đậu nành
Loại bỏ tạp chất
Ngâm, tách vỏ

Xay
Bã đậu nành – Đối
tượng nghiên cứu

Lọc
Nấu dịch lọc

Tác nhân đông tụ

Đông tụ

Ép khuôn, tạo hình

Đậu phụ
Hình 1.2. Quy trình thu nhận bã đậu nành của các cơ sở sản xuất đậu phụ [41]

1.1.2. Một số ứng dụng của bã đậu nành [18, 19, 32]
Bã đậu nành là một phế phẩm có hàm lượng dinh dưỡng khá cao, đặc biệt là hàm
lượng protein cao tùy thuộc vào giống và công nghệ sản xuất. Đây là nguồn nguyên liệu
rẻ tiền cho ngành chăn nuôi và công nghệ sinh học.
Một số ứng dụng của bã đậu nành:
- Làm thức ăn chăn nuôi: phần lớn bã đậu nành được sử dụng làm thức ăn cho gia
súc, gia cầm tại các cơ sở, trang trại chăn nuôi gần cơ sở, nhà máy sản xuất, đặc biệt là


9

làm thức ăn cho tằm vì bã đậu nành cung cấp nhiều chất dinh dưỡng, tận dụng nguồn
nguyên liệu tại chỗ, giảm chi phí mua thức ăn.
- Làm phân bón: bã đậu nành được sử dụng làm phân bón sinh học cung cấp dinh
dưỡng cho đất phục vụ hoạt động trồng trọt.
- Làm bao bì: với hàm lượng chất xơ cao, bã đậu nành đã được sử dụng làm nguyên
liệu sản xuất giấy gói thực phẩm.
- Làm vật liệu xây dựng: bã đậu nành là thành phần chính phối hợp với đất sét và

một số phụ gia để sản xuất gạch gia cố được cấp bằng sáng chế tại Nhật Bản, bã đậu nành
còn được dùng làm phụ gia trong sản xuất gốm.
- Làm thức ăn cho thú cưng: bã đậu nành được xử lý sấy khô và tạo thành dạng hạt,
đóng gói để thuận lợi dùng làm thức ăn cho động vật nuôi cảnh.
- Làm cơ chất cho quá trình lên men: bã đậu nành là nguồn cơ chất dinh dưỡng và rẻ
tiền cho các quá trình lên men như lên men ethanol, methan, axit xitric, surfactin, iturin
(thuốc diệt nấm), thuốc trừ sâu,...( Bảng 1.3.). Một số nghiên cứu sử dụng bã đậu nành là
cơ chất lên men vi khuẩn Bacillus subtilis natto nhằm sản xuất enzyme nattokinase [24,
36]. Đây cũng là một hướng đi mới trong việc ứng dụng bã đậu nành.
Bảng 1.3. Các sản phẩm lên men từ bã đậu nành [32]
TT
Vi sinh vật
Sản phẩm
1
Aspergillus japonicus MU-2
β-Fructofuranosidase
2
NRRL 330 + NCIM 653
Citric acid
3
Bacillus natto
Chất chống oxy hóa
4
Bacillus subtilis NB22
Iturin A
5
Methanogens I and II
Methane
6
Lactobacillus paracasei

Hydrogen
7
Lactobacillus paracasei
Lactic acid
8
Bacillus subtilis B2
Chất chống oxy hóa
9
Bùn lắng
Methane
10 B. subtilis
Các hợp chất Phenolic
11 Flammulina velutipes
Polysaccharides
- Làm thực phẩm: bã đậu nành được xử lý làm thực phẩm hoặc làm nguyên liệu thay
thế một số nguyên liệu truyền thống trong sản xuất thực phẩm.
Bã đậu nành được sử dụng làm tương xay do thành phần dinh dưỡng cao. Bã đậu
nành còn được xử lý tạo thành thực phẩm giàu chất xơ hoặc bổ sung vào các loại thực
phẩm khác nhau nhờ vào đặc điểm có hàm lượng chất xơ cao và có giá trị trong hỗ trợ
ngăn ngừa các bệnh khác nhau ở người.


10

Bã đậu nành được xử lý kỹ thuật có thể thay thế 10-17% bột mì trong sản xuất bánh
mì, cracker và cookie; đồng thời tăng hàm lượng chất xơ cho bánh, là thành phần dinh
dưỡng hữu ích cho cơ thể.
Bã đậu nành chứa nhiều thành phần cellulose, hemicellulose và lignin, nên phù hợp
làm phụ gia bổ sung trong các sản phẩm ăn kiêng như bánh quy và đồ ăn nhẹ vì có khả
năng làm giảm lượng calo và tăng lượng chất xơ.

1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME NATTOKINASE
1.2.1. Giới thiệu về nattokinase
Nattokinase hay còn gọi là subtilisin NAT (ký hiệu EC 3.4.21.62) là một protease
serine, có cấu trúc là một chuỗi polypeptide đơn gồm 275 gốc acid amin, khối lượng phân
tử là 27,728 kDa và pI=8,6. Là một protease không chứa cysteine, nattokinase khơng có
cầu nối disulfua trong phân tử [2, 23].

Hình 1.3. Cấu trúc bậc 3 của nattokinase [2]
Enzyme nattokinase ổn định trong khoảng pH 6-10, nhiệt độ < 500C; hoạt tính tăng
lên một phần khi có mặt H2O2, HgCl2. Nattokinase bị bất hoạt ở nhiệt độ > 700C, pH < 5
và sự có mặt của các ion Fe3+, Al3+. Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Ser, His và
Asp.
Nattokinase là một trong các enzyme ngoại bào được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn
Bacillus subtilis Natto.


11

Nattokinase được tiến sỹ Hyroyuki Sumi phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 trong
natto - một loại thực phẩm truyền thống từ đậu tương lên men của Nhật Bản. Nhiều
nghiên cứu đã chứng minh: nattokinase có khả năng trực tiếp làm tiêu huyết khối, khơng
những thế nó cịn tăng khả năng sản sinh ra plasmin, một loại enzyme nội sinh có khả
năng làm tan huyết khối của cơ thể. Nattokinase được ghi nhận có khả năng phân giải
fibrin mạnh hơn gấp 4-5 lần so với plasmin. Ngoài ra, nattokinase cịn có khả năng hỗ trợ
điều trị tăng huyết áp, bệnh alzheimer [15].
Trong các nghiên cứu lâm sàng ở người được thực hiện bởi các cơ quan quản lý và
các cơng ty dược phẩm, ghi nhận khơng có tác dụng phụ được tìm thấy khi tình nguyện
viên người khỏe mạnh bình thường uống nattokinase (10 mg/kg) mỗi ngày trong 28 ngày.
Những người tham gia trong nghiên cứu khơng có thay đổi đáng kể về nước tiểu, huyết

áp, hoặc xung. Các dữ liệu trong các nghiên cứu về độc tính đã cung cấp một đánh giá an
toàn mạnh mẽ cho việc sử dụng nattokinase an tồn ở người [37].
Nattokinase có khả năng phá vỡ thrombi và fibrin. Nattokinase, không giống như
hầu hết các protein, có khả năng chống lại chất dịch dạ dày có tính axit cao trong dạ dày
và có thể hấp thu vào các phần sau của đường tiêu hóa. Điều này chắc chắn góp phần làm
cho khả năng của enzym này cịn ngun vẹn trong đường tiêu hóa.
So với các loại thuốc điều trị đông máu khác, nattokinase có nhiều ưu điểm như hiệu
quả, an tồn, tác dụng lâu dài, sử dụng phòng ngừa, sử dụng dễ dàng qua đường ăn uống
và bền vững trong hệ tiêu hóa của người [38].
Hiện nay, với những ưu điểm vượt trội trên, các sản phẩm enzyme nattokinase
thương mại (Hình 1.4) được sử dụng rộng rãi ở Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Liên
minh châu Âu, Canada và Hoa Kỳ như một chất bổ sung ngăn ngừa đông máu và cải thiện
lưu thông máu. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng nattokinase có thể cải thiện các bệnh
khác như cao huyết áp, đột quị, bệnh Alzheimer và xơ vữa động mạch. Khả năng sử dụng
enzyme nattokinase để giảm nguy cơ huyết khối và làm chậm sự tiến triển của xơ vữa
động mạch cũng như suy giảm nhận thức hiện đang trong quá trình đánh giá thử nghiệm
lâm sàng ở người.


12

Hình 1.4. Một số sản phẩm thương mại chứa nattokinase
1.2.2. Cơ chế tác dụng của nattokinase
Fibrinogen là một loại glycoprotein tồn tại trong máu và là nhân tố cần thiết cho q
trình đơng máu bằng cách chuyển đổi thành fibrin tạo thành cục máu đông hoặc dạng gel
không tan nhằm giúp cơ thể ngăn ngừa sự chảy máu khi bị tổn thương.

Ức chế

Hình 1.5. Cơ chế tác dụng của enzyme nattokinase[38]

Ở điều kiện bình thường, ln có sự cân bằng động giữa q trình đơng máu và q
trình giảm fibrin để tránh hiện tượng xuất huyết hoặc đông tụ gây tắc nghẽn quá trình lưu


13

thông máu. Các tế bào nội bào của thành động mạch có cơ chế ngăn chặn sự dính kết gây
đơng tụ máu. Tình trạng tăng đơng máu ở cơ thể xảy ra khi có sự mất cân bằng giữa hệ
thống hoạt hóa và ức chế đơng máu mà ngun nhân là do giảm các yếu tố ức chế đông
máu hoặc tăng hoạt hóa đơng máu dẫn đến hình thành huyết khối nhiều quá mức cần
thiết, gây tắc nghẽn cục bộ hoặc tồn bộ trong cơ thể. Đây chính là ngun nhân chính
gây ra các bệnh như: bệnh suy tim, động mạch vành, xơ vữa động mạnh, cao huyết áp,...
Nattokinase có khả năng tiêu fibrin bằng cách trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua các
con đường khác nhau như mô tả Hình 1.5:
Thứ nhất, nattokinase trực tiếp phân giải các sợi fibrin từ dạng polymer khơng tan
thành các sản phẩm có trọng lượng phân tử thấp, hịa tan, giải phóng các tiểu cầu, dẫn đến
làm tan các cục máu đông.
Thứ hai, nattokinase có khả năng hoạt hóa plasminogen tạo thành plasmin - một loại
enzyme tiêu fibrin nội sinh trong cơ thể bằng 02 cách: hoạt hóa pro-urokinase sinh
urokinase từ đó hoạt hóa plasminogen tạo thành plasmin; tăng lượng plasminogen mơ (tPA)- đây là yếu tố hoạt hóa plasminogen tạo thành plasmin, đồng thời nattokinase cũng
ức chế enzyme plasminogen activator inhibitor -1( PAI -1) – đây là enzyme ức chế tác
dụng hoạt hóa của plasminogen mơ t-PA [15].
Như vậy có thể thấy rằng: enzyme nattokinase không chỉ làm tan huyết khối mà cịn
có tác dụng phịng ngừa sự hình thành huyết khối. Ngồi ra, enzyme nattokinase khơng
ảnh hưởng đến sự hình thành fibrin từ fibrinogen nên không làm suy giảm khả năng đơng
máu tự nhiên của cơ thể. Đây chính là ưu điểm vượt trội của enzyme nattokinase.

1.3. TỔNG QUAN VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS NATTO
1.3.1. Giới thiệu về Bacillus subtilis natto
Bacillus subtilis natto được phân lập lần đầu tiên vào năm 1906 từ natto bởi tiến sỹ

Shin Sawamura, thuộc trường Đại học Tokyo, Nhật Bản. Bacillus subtilis natto được biết
đến là loại vi khuẩn lên men hạt đậu nành tạo mùi hương đặc biệt cho natto. Tên gọi
Bacillus subtilis natto được xem là tên khơng chính thức, tuy nhiên nó vẫn được dùng phổ
biến trong ngành công nghệ thực phẩm và trong các báo cáo khoa học nhằm phân biệt với
Bacillus subtilis về khả năng lên men natto [36].
Từ khi Bacillus subtilis natto được phân lập bởi tiến sỹ Shin Sawamura, các sản
phẩm natto thương mại bắt đầu được phát triển ở dạng sản phẩm truyền thống – natto lên
men trong rơm khơ (hình 1.6C) và sản phẩm natto lên men trong các bao bì polystyrene
(hình 1.6A, B).


14

Hình 1.6. Các sản phẩm natto truyền thống (C) và natto hiện đại(A, B) [33]
Từ những năm 1920, các nhà khoa học cũng quan tâm nghiên cứu tìm cách sản xuất
natto từ môi trường lên men Bacillus subtilis natto thay vì lên men hạt đậu nành và đánh
giá sự an toàn của Bacillus subtilis natto.
Bacillus subtilis natto (1.51 x 109 CFU / ml) được tiêm cho chuột không gây ra bất
kỳ dấu hiệu độc tính. 14 ngày sau khi tiêm, khơng có tế bào Bacillus subtilis natto sống
cịn được quan sát thấy ở phổi, gan, não hoặc thận thông qua kiểm tra mô bệnh học[38]
Như vậy, cùng với nhiều nghiên cứu lâm sàng khác đã chứng minh rằng Bacillus
subtilis natto là sinh vật an tồn, có thể được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu khoa học
và sản xuất công nghiệp, với nhiều ưu điểm như môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ
nuôi cấy, sinh trưởng tốt, phát triển nhanh, khơng sinh độc tố và an tồn.