Bước đầu xác định một số hợp chất isoflavone có trong củ sắn dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hplc

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA HÓA HỌC

THƯỢNG THỊ KIM PHƯỢNG

Bước đầu xác định một số hợp chất isoflavone có
trong củ sắn dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao - HPLC

Ngành đào tạo: Cử nhân Hoá phân tích – Mơi trường
Trình độ đào tạo: Đại học

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÀ NẴNG, NĂM 2019


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA HÓA HỌC

THƯỢNG THỊ KIM PHƯỢNG

Bước đầu xác định một số hợp chất isoflavone có
trong củ sắn dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao - HPLC

Ngành đào tạo: Cử nhân Hoá phân tích – Mơi trường
Trình độ đào tạo: Đại học

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP

Giảng viên hướng dẫn:
TS. BÙI XUÂN VỮNG

ĐÀ NẴNG, NĂM 2019


LỜI CẢM ƠN
Trải qua một chặng đường nghiên cứu với rất nhiều khó khăn và thử thách ngồi nổ
lực bản thân thì chắc chắn em sẽ khơng thể hồn thành khóa luận nếu khơng được sự chỉ
bảo, động viên, giúp đỡ dù ít hay nhiều, trực tiếp hay gián tiếp của thầy cơ, gia đình, bạn
bè.
Với lịng biết ơn sâu sắc nhất em xin gửi lời cảm ơn đến thầy TS. Bùi Xuân Vững,
đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình viết báo cáo tốt nghiệp.
Em chân thành cảm ơn q thầy, cơ trong khoa Hóa học, Trường Đại Học Sư PhạmĐại học Đà Nẵng đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm em học tập. Với vốn
kiến thức được tiếp thu trong quá trình học khơng chỉ là nền tảng cho q trình nghiên
cứu khóa luận mà cịn là hành trang q báu để em bước vào đời một cách vững chắc và
tự tin.
Cuối cùng, cho em gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong hội đồng bảo vệ tốt nghiệp
đã dành thời gian q báu của mình để đọc và nhận xét khóa luận của em.Trong q trình
làm bài báo cáo khó tránh khỏi sai sót, rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy, cơ
để bài báo cáo của em được hoàn thiện hơn.
Đà Nẵng, ngày….tháng ….năm 2019
Sinh viên thực hiện

1


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

HPLC

High-performance liquid chromatography (Sắc ký
lỏng hiệu năng cao)

DMSO

Dimethyl sulfoxit có cơng thức (CH3)2SO.

PTFE

Polytetrafloetylen (nhựa teflon)
Association of Official Analytical Chemists có

AOAC

CHD

nghĩa là Hiệp hội các nhà hố phân tích chính thống.
Coronary heart disease (bệnh động mạch vành )

MeCN

Acetonitrile có cơng thức hóa học CH3CN.

EtOH

Etanol, ancol etylic

MeOH

Metanol, ancol metylic

CAN

Acetonitrile có cơng thức hóa học CH3CN.

STD

Standard có nghĩa là dung dịch chuẩn

SD

Standard deviation (độ lệch chuẩn)
Relative standard deviation (độ lệch chuẩn tương

RSD

đối)

LOD

Giới hạn phát hiện (limit of detector)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

2

DANH MỤC HÌNH BẢNG BIỂU
Bảng 1. 1. Danh sách của các isoflavones. .............................................................................. 15
Bảng 1. 2. Lực rửa giải của một số dung môi .......................................................................... 30
Bảng 2. 1. Nồng độ các chất chuẩn làm việc (µg/ml). ............................................................. 39
Bảng 3. 1. Kết quả đo chuẩn STD1 .......................................................................................... 42
Bảng 3. 2. Kết quả đo chuẩn STD ............................................................................................ 42
Bảng 3. 3. Kết quả đo chuẩn STD3

Bảng 3. 4. Kết quả đo chuẩn STD4 ....................... 42

Bảng 3. 5. Kết quả đo chuẩn STD5

Bảng 3. 6. Kết quả đo chuẩn STD0 ................ 43

Bảng 3. 7. Tóm tắt kết quả đường chuẩn của 6 hợp chất isoflavone ....................................... 46
Bảng 3. 8. Độ lặp lại của đối với Daidzin

Bảng 3. 9 Độ lặp lại đối với Glycitin ............ 47

Bảng 3. 10 Độ lặp lại đối với Genistin..................................................................................... 47
Bảng 3. 11Độ lặp lại đối với Glycitein .................................................................................... 47
Bảng 3. 12 Độ lặp lại đối với Glycitein

Bảng 3. 13 Độ lặp lại đối với Genistein ............. 48

Bảng 3. 14 Kết quả LOD và LOQ ............................................................................................ 49

3

DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1. 1. Cây sắn dây ............................................................................................................. 10
Hình 1. 2. Hình ảnh quy trình trồng củ sắn dây( nguồn: tác giả)............................................ 12
Hình 1. 3. Cấu trúc hóa học của íoflavones ............................................................................. 13
Hình 1. 4. Cấu trúc hóa học của các aglucon .......................................................................... 13
Hình 1. 5. Cấu trúc hóa học của các 𝛽- Glucozit .................................................................... 14
Hình 1. 6. Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải.................................................. 19
Hình 1. 7. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B. ........................................... 20
Hình 1. 8. Sắc ký đồ của chất A và chất B. .............................................................................. 21
Hình 1. 9. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách peak của hai chất A và B .............. 22
Hình 1. 10. Cách tính hệ số khơng đối xứng của peak. ............................................................ 24
Hình 1. 11. Các thiết bị trong hệ thống HPLC ........................................................................ 25
Hình 2. 1. Thiết bị khuấy và thiết bị li tâm ............................................................................... 34
Hình 2. 2. Thiết bị lọc chân không và thiết bị cơ quay chân khơng ......................................... 34
Hình 2. 3. Máy lắc và thiết bị sấy............................................................................................. 34
Hình 2. 4. Tủ lạnh và thiết bị cất nước..................................................................................... 34
Hình 2. 5. Thiết bị HPLC Agilent 1200. ................................................................................... 35
Hình 2. 6. Sơ đồ quy trình chiết lắc isoflavone dạng cao chiết từ sắn dây .............................. 36
Hình 3. 1. Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 1 .............................................................. 41
Hình 3. 2. Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 2 .............................................................. 41
Hình 3. 3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Daidzin. ...................... 43
Hình 3. 4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Glycitin. ...................... 44
Hình 3. 5. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ genistin. ...................... 44
Hình 3. 6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Daidzein ...................... 45
Hình 3. 7. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Glycitein. .................... 45
Hình 3. 8. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Genistein. .................... 46
Hình 3. 9. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi của thành phần pha động theo hệ . ............................ 49
Hình 3. 10. Sắc ký đồ mẫu bột sắn dây .................................................................................... 50

4


Hình 3. 11. Sắc ký đồ mẫu cao sắn dây tinh sạch .................................................................... 50
Hình 3. 12. Sắc ký đồ mẫu cao sắn dây thô ............................................................................. 51

5


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... 1
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT................................................................................... 2
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 8
1. Lý do chọn đề tài: ......................................................................................................8
2. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................ 8
3. Giới thiệu chung ...........................................................................................................9
3.1. Nội dung ................................................................................................................. 9
3.2. Mục đích đề tài ....................................................................................................... 9
3.3. Thời gian thực hiện ................................................................................................ 9
3.4. Phạm vi thực hiện................................................................................................... 9
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 10
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ SẮN DÂY. ..................................................................10
1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm ..................................................................................... 10
1.1.2. Thành phần hóa học trong sắn dây ................................................................... 12
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ISOFLAVONE ............................................................ 12
1.2.1. Nguồn gốc Isoflavone ........................................................................................ 12
1.2.2. Thành phần hóa học, tính chất, cấu trúc của isoflavone .................................. 13
1.2.3. Tác dụng của isoflavone trong phòng và điều trị bệnh .................................... 16
1.3. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ........................18

1.3.1. Khái niệm .......................................................................................................... 19
1.3.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc ký ................................................................. 19
1.3.3. Phân loại sắc ký hấp phụ .................................................................................. 20
1.3.4. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ ............................................................ 21
1.4.5. Hệ thống HPLC ................................................................................................. 24
1.4.6. Phương pháp chọn điều kiện sắc ký .................................................................. 28
1.4.7. Các bước tiến hành sắc ký ................................................................................ 31
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 33
2.1. Nguyên liệu .............................................................................................................33
2.2. Hóa chất và dụng cụ, thiết bị ..................................................................................33
2.2.1. Hóa chất ............................................................................................................ 33
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................ 33
6


2.3. Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích .................................................................................35
2.4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 35
2.4.1. Khảo sát phương pháp trích ly isoflavone ....................................................... 35
2.4.2. Phương pháp định tính, định lượng isoflavone bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu
năng cao - HPLC ........................................................................................................ 37
2.4.3. Khảo sát độ lặp lại của phép đo ....................................................................... 40
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 41
3.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần pha động ............................................................. 41
3.2. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính theo hệ 2...........................................42
3.2.1. Kết quả đo dãy dung dịch chuẩn STD1- STD5 ................................................. 42
3.2.2. Xây dựng đường chuẩn ..................................................................................... 43
3.3. Khảo sát độ lặp lại của phép đo ...............................................................................47
3.4. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) ..........................................48
3.5. Kết quả khảo sát các mẫu củ sắn dây có isoflavone theo thành phần pha động của
hệ 2. ................................................................................................................................ 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 52
1. Kết luận.......................................................................................................................52
2. Đề xuất ........................................................................................................................53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 54

7


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài:
Sắn dây là cây trồng phổ biến ở Việt Nam, rể củ sắn dây đã được sử dụng lâu
đời trong y học cổ truyền với tên gọi Cát căn. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các
hoạt chất nhóm isoflavone (puerarin, daidzin, daidzein,…) là thành phần chính có
tác dụng sinh học.
Isoflavone rất nhiều chức năng có lợi cho cơ thể con người, duy trì tuổi thanh
xuân cho phụ nữ, giảm được ung thư vú, ung thư cổ tử cung, giảm được hàm lượng
cholesterol, phòng tránh được các bệnh về tim mạch, loãng xương, giảm được các
triệu chứng mãn kinh như bốc hỏa, đổ mồ hôi, trầm cảm...Cho nên isoflavone được
bổ sung vào trong các thực phẩm chức năng để cải thiện sức khỏe của con người.
2. Đối tượng nghiên cứu
Isoflavone là hợp chất polyphenolic, có nguồn gốc từ phytoestrogen thực
vật. Isoflavone là hoạt chất có cơ chế hoạt động và chức năng gần giống như nội
tiết tố nữ estrogen ở người, vì thế các nhà khoa học gọi là estrogen thảo mộc (plant
estrogen).
Nguồn nguyên liệu để sản xuất isoflavone rất phong phú như hạt ngũ cốc, rau
quả, nhưng sắn dây là nguồn nguyên liệu chủ yếu bởi vì hàm lượng isoflavone
trong sắn dây khá cao đặc biệt trong củ sắn dây nảy mầm. Cùng với hàng ngàn
dược liệu quý có ở Việt Nam, sắn dây là một trong những dược liệu quý, sắn dây đã
được biết đến là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao vì chứa hàm lượng protein
cao hơn bất kỳ loại nơng sản nào. Trong sắn dây cịn chứa rất nhiều khoáng chất,

các sinh tố B đặc biệt là các hóa chất thảo mộc có khả năng ngăn ngừa trị liệu bệnh
tật.
Điều này làm các nhà khoa học say mê nghiên cứu là khám phá ra các hóa thảo
mộc có trong sắn dây và những ứng dụng của chúng trong lĩnh vực y khoa trị liệu,
trong đó các isoflavones là loại hóa chất thảo mộc mang lại nhiều ứng dụng. Đồng
thời, với mong muốn đóng góp một phần vào kho tư liệu của nhà nước, chính vì
vậy mà em tiến hành thực hiện đề tài: “Bước đầu xác định một số hợp chất
isoflavone có trong củ sắn dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC”
8


3. Giới thiệu chung
3.1. Nội dung
“Bước đầu xác định một số hợp chất isoflavone có trong củ sắn dây bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC”
3.2. Mục đích đề tài
 Khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định một số hợp chất isoflavone từ
dịch chiết bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao -HPLC.
 Khảo sát các quy trình xử lý mẫu để xác định isoflavone bằng phương
pháp HPLC.
 Xác định một số hợp chất isoflavone trong củ sắn dây bằng phương pháp
HPLC.
3.3. Thời gian thực hiện
 Ngày nhận đề tài: 01 tháng 01 năm 2019.
 Ngày bảo vệ

: 26 tháng 04 năm 2019.

3.4. Phạm vi thực hiện
Nghiên cứu tại phịng thí nghiệm trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng, địa chỉ:

459 Tôn Đức Thắng, phường Hòa Khánh Nam, quận Liên Chiểu, Tp. Đà Nẵng.

9


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ SẮN DÂY.[3]
1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm
1.1.1.1. Nguồn gốc
Tên khoa học: Pueraria thomsonii Benth
Giới (regnum)

Plantae

Lớp cao hơn: Chi Sắn dây
Phân họ (subfamilia): Faboideae
Họ (familia): Fabaceae
Hình 1. 1. Cây sắn dây
Bộ (ordo): Fabales
Chi (genus): Pueraria
-

Sắn dây là một loài dây leo nhiệt đới mọc nhiều nơi trên trái đất. Nó cịn gọi

là cát căn, cam cát căn, phấn cát căn, củ sắn dây, bạch cát, bẳn mắm kéo (cách gọi
của người Thái), và khau cát (cách gọi của người Tày). Nó sống lâu năm, có thể dài
tới 10 m. Rễ phát triển thành củ dài, to. Lá kép, mọc so le gồm 3 lá chét nguyên
hoặc xẻ thùy. Cụm hoa hình chùm mọc so le gồm 3 lá chét nguyên hoặc xẻ thùy.
Cụm hoa hình chùm mọc ở kẽ lá gồm nhiều loại hoa màu xanh tím, thơm.
1.1.1.2. Đặc điểm

-

Hình dạng: củ giáp dẹt màu vàng xám, lớn, vỏ ngồi có nhiều đường vân tròn
quanh củ, bần dày, một số chỗ bong ra, củ cắt ngang màu trắng, nhiều sợi, có vài
vòng nâu.

-

Màu sắc: loại củ sắn màu vàng xám là loại tốt nên thường được ưa chuộng.

-

Kích thước: Củ phát triển theo hướng nằm ngang hoặc chếch xuyên sâu vào đất.
Củ có thể dài tới 1 m (trung bình dài 30-60cm); đường kính củ có thể tới 14cm
(trung bình: 3-7cm);

-

Cân nặng: củ to và nặng, có thể lên tới 20kg, nhiều xơ.

-

Cấu trúc củ sắn dây gồm 4 thành phần:
10


+ Biểu bì (vỏ lụa): dày 0,2-0,3 mm, đơi khi có những vân thơ dài dọc theo
củ.
+ Tầng vỏ: dày khoảng 1,6-1,7mm, lớp trên thường màu đổ tía, trắng vàng...
(tùy theo giống) bao gồm:

 Lớp vỏ ngồi hóa gỗ
 Mơ mền amilic (cũng dự trữ tinh bột nhưng rất ít)
 Tế bào Libe
 Tầng sinh gỗ giới hạn trụ giữa của vỏ trong.
+ Tầng chất bột (ruột củ): Là bộ phận chủ yếu của củ có màu trắng, giịn (mơ
mềm cllulose là bộ phận chủ yếu tích lũy tinh bột).
+ Phần lõi (ở giữa củ): Là những bó mạch như trụ trung tâm (gỗ với những
mạch lớn có những tế bào hóa gỗ nhỏ bao quanh). Mỗi cây sắn thường có từ 23 củ đề nhau, nếu sắn dinh trưởng phát triển tốt có thể có đến 5-6 củ to. Củ to
có thể có cuống và phân nhánh.
+ Trong thực tiễn, người ta chia củ sắn ra làm 3 phần tách bạch nhau rõ ràng:
 Vỏ ngồi (vỏ gỗ) cịn gọi là là tầng mộc thiêm: Chiếm 0,5-2,0%
khối lượng củ.
 Vỏ trong (vỏ lụa): Chiếm 8-15% khối lượng củ (có thể bóc tách ra
được).
+ Thịt củ: Phần chủ yếu của củ, chứa nhiều tinh bột.
+ Lõi củ: Gồm các bó mạch gỗ ở trung tâm tạo thành.
1.1.1.3. Giống sắn dây xã Quang Trung, huyện Ngọc Lặc, Tỉnh Thanh Hóa.
-

Thời vụ trồng: Từ tháng 2 – tháng 4 (tốt nhất trong tháng 2).

-

Mật độ trồng: Tuỳ thuộc vào đất đai và trình độ thâm canh thơng thường
trồng với mật độ và khoảng cách 1.0 m ´ 0.8 - 1.0 m đảm bảo mật độ từ
10.000 - 11.000 hom/ha.

-

Trồng sắn dây bằng củ, đắp ụ và làm giàn leo bằng trụ xi măng. Với 100 gốc,

mỗi ụ sắn dây cho sản lượng củ từ 15-17 kg/ụ, hàm lượng bột trong củ cao
gấp đôi so với sắn trồng bằng dây.

11


Hình 1. 2. Hình ảnh quy trình trồng củ sắn dây( nguồn: tác giả)
1.1.2. Thành phần hóa học trong sắn dây
(isoleucin, lysin, methionin,

-

8% nước

-

12-15% tinh bột

-

5% chất vô cơ

-

15-25% glucose

daidzein

-

15-20% chất béo

C21H20O9, tinh bột. Lá có các

-

Nhiều sinh tố, khống chất, Ca,

pheny

tryptophan,

valin)
-

Rễ củ chứa isoflavon: puerarin,
C15H10O4,

daidzin

acid amin: asparagin,...
-

Fe, Mg, P, K, Na, S
-

lalanin,

Các vitamin A, B1, B2, D, E, F,
các enzyme, sáp nhựa, cellulose.

35-45% chất đạm với đủ các
loại amino acid cần thiết

Củ sắn dây là thành phần có giá trị sử dụng cao nhất vì nó khơng những chứa
đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết mà còn tồn tại các hóa thảo mộc có tác dụng
phịng ngừa và điều trị bệnh đặc biệt là các căn bệnh thời đại như: bệnh ung thư, các
bệnh liên quan đến tim mạch.
Thành phần và cấu trúc của từng thành phần trong củ sắn dây phụ thuộc vào
nhiều yếu tố, bao gồm giống, mùa vụ, vùng địa lí, và mơi trường. Thành phần tổng
quát của sắn dây được trình bày trong bảng dưới đây.
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ISOFLAVONE
1.2.1. Nguồn gốc Isoflavone
Isoflavone có nguồn gốc phytoestrogen thực vật thuộc nhóm các hợp chất
flavonoid. Chúng là các hợp chất phenolic, có cấu trúc và sự vận hành giống như
12


estrogen ở người, vì thế cịn được gọi là estrogen thảo mộc. Trong tự nhiên, các
isoflavone được thấy có nhiều trong các loại thực vật như: các loại đậu khác nhau,
cỏ ba lá đỏ, cỏ linh lăng, củ sắn dây...[10].
Ở cây sắn dây, isoflavone có trong tồn bộ các phần: lá, cuống, mầm và củ.
Trong củ sắn dây thì phơi có hàm lượng isoflavone cao nhất.
1.2.2. Thành phần hóa học, tính chất, cấu trúc của isoflavone
Isoflavone là các chất hữu cơ thuộc nhóm polyphenolic (các chất có nhiều vịng
phenyl) có liên quan với các flavonoid (isoflavone và flavonoid khác nhau ở vị trí
gắn của vịng benzen) và nó có nhiều lợi ích cho sức khỏe.[10], [3].
Cấu trúc cơ bản của isoflavone gồm 2 vòng benzen: A và B nối với dị vịng
pyron C.

B
A

C

Hình 1. 3. Cấu trúc hóa học của íoflavones[1].
Isoflavone trong sắn dây tồn tại ở dạng tự do (aglucon) và dạng liên kết
(glucosid), bao gồm: daidzin, genistin, glycitin, daidzein, glycitein, genistein các
malonyl và axetyl tương ứng của chúng, trong một số trường hợp chúng có mặt ở
cả 4 dạng hóa học với mỗi dạng có chứa ba đồng phân và tạo nên 12 loại cụ thể:
1. Aglycones (daidzein, genistein và glycitein)

Hình 1. 4. Cấu trúc hóa học của các aglucon

13


R1

R2

R3

Daidzein

–H

–H

–OH

Genistein

–H

–OH

–OH

Glyxitein

–OCH3

–H

–OH

–H

–OCH3

–OH

–OCH3

Formononetin –H
BiochaninA

–H

2. -glycosides (daidzin, genistin và glycitin)

Hình 1. 5. Cấu trúc hóa học của các 𝛽- Glucozit
3. Các malonyl-glucosides (malonyl-daizin, malonyk-genistin và malonylglycitin)
4. Acetyl-glucosides (acetyl-daidzin, acetyl-genistin, và acetyl-glycitin)
Cấu trúc hóa học của các isoflavone của 4 nhóm trên được cho ở bảng 1.2 bởi
tác giả Mortensen cùng các cộng sự.

14


Bảng 1. 1. Danh sách của các isoflavones.
Tên

R1

R2

R3

Daidzein

H

H

H

Glycitein

H

OCH3

H

Genistein

OH

H

H

Daidzin

H

H

Glucosyl

Glycitin

H

OCH3

Glucosyl

Genistin

OH

H

Glucosyl

H

H

H

OCH3

OH

H

Acetyl hoặc
Manolyl daidzin
Acetyl hoặc
Manolyl glycitin
Acetyl hoặc
Manolyl genistin

Glucosyl-COCH3 hoặc
Glucosyl-COCH2COOH
Glucosyl-COCH3 hoặc

Glucosyl-COCH2COOH
Glucosyl-COCH3 hoặc
Glucosyl-COCH2COOH

Có hai loại isoflavone quan trọng trong sắn dây là daidzein và genistein, hợp
chất này có cấu trúc hóa học gần giống kích thích tố nữ estrogen. Còn được gọi là
estrogen thực vật (phytoestrogen). Estrogen thực vật có tác dụng tương tự như
estrogen tự nhiên nhưng yếu hơn.
Genistin và daidzin là những phân tử tương đối lớn, tan tốt trong nước, tính
phân cực cao, nên khó hấp thu qua ống tiêu hóa. Muốn cho dễ hấp thu và trở nên có
giá trị sinh học, phải thủy phân chúng thành các aglycon, tức làm mất thành phần
glycozit trong phân tử. Muốn vậy, cần có xúc tác các enzym đặc hiệu là
glycosidase. Ống tiêu hóa của người không tạo được glycosidase, nên cơ thể không
thể thủy phân được isoflavone và isoflavone chưa có giá trị sinh học.
Ngược lại, một số tạp khuẩn định cư trong ruột sẽ tạo glycosidase cần cho quá
trình thủy phân nêu trên, giúp cho sự hấp thụ các isoflavone.Các aglycon sẽ hấp thu
ở ruột non. Nồng độ đỉnh của aglycon trong máu chỉ đạt được 4-6 giờ sau khi uống
15


chất chiết xuất từ sắn dây, tức là khi các glycozit đã được thủy phân qua xúc tác
enzym của tạp khuẩn tại ruột.
Lactobacillus sporogenes là vi khuẩn chính sản xuất glycosidase giúp cân bằng
tạp khuẩn ruột, xúc tác cho thủy phân daidzin và genistin sang daidzein và
genistein có hoạt tính “phytoestrogen”.
Cùng với tác dụng hiệu quả tổng hợp của các hợp chất trong sắn dây khi dùng
làm thực phẩm, người ta cho rằng isoflavone giúp làm giảm nguy cơ ung thư ngực,
ung thư ruột, các nghiên cứu trên động vật đã chứng minh sử dụng các sản phẩm
đậu tương đã ức chế được ít nhất 5% khả năng ung thư.
Nhiều nghiên cứu cho thấy sắn dây chứa nhiều isoflavone và được coi là thực

phẩm gia tăng nữ tính và bảo vệ phụ nữ giảm chứng bệnh như: tim mạch, rối loạn
tiền mãn kinh, ung thư và loãng xương...
1.2.3. Tác dụng của isoflavone trong phòng và điều trị bệnh [3], [5].
Nghiên cứu cho thấy những tác dụng có lợi của isoflavone có trong sắn dây
trên các triệu chứng vận mạch ở tuổi mãn kinh: isoflavone trong sắn dây làm giảm
cường độ bốc hóa, giảm số lần làm đổ mồ hơi đêm, mang lại lợi ích hiển nhiên
nâng cao chất lượng sống của phụ nữ mãn kinh. Isoflavone sắn dây không gây thay
đổi có ý nghĩa về FSH hoặc về độ dày của màng trong tử cung, không thấy tăng các
tác dụng phụ estrogen khơng mong muốn.
1.2.3.1. Tác dụng trên chuyển hóa của xương
Nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ gãy xương do loãng xương ở phụ nữ châu Á
thấp hơn hẳn so với ở các nước phương Tây. Sự khác biệt này có liên quan tới sử
dụng nhiều thức ăn chế từ sắn dây. Hiệu lực của isoflavone sắn dây trên quá trình
dinh dưỡng của xương ở phụ nữ sau mãn kinh đã cho thấy tăng có ý nghĩa về mật
độ khống ở xương.
Hiệu lực isoflavone sắn dây trên chuyển hóa của xương cũng được khẳng định
trong các nghiên cứu lâm sàng khác.
Isoflavone cịn làm giảm nguy cơ lỗng xương nhờ ức chế được hoạt tính của
hủy cốt bào, nên có tác dụng hiệp đồng chống tiêu xương nhờ hoạt tính estrogen
của thuốc này.
16


1.2.3.2. Tác dụng trên tim mạch[5]
Chế độ dinh dưỡng giàu sắn dây sẽ làm giảm nguy cơ bệnh động mạch vành
(CHD). Isoflavone sắn dây có những tác dụng khác nhau chống rối loạn lipit- máu
ở người mãn kinh, có thể cắt nghĩa được sự giảm các nguy cơ tim mạch. Sắn dây và
chiết xuất của sắn dây cũng có những tác dụng khác có lợi cho tim mạch, đã được
sơ kết bởi nhóm các chuyên gia Hội Mãn kinh Bắc Mỹ:
 Làm giảm huyết áp tâm trương

 Làm giảm cholesteron toàn phần, giảm cholesteron “xấu”, giảm triglyserid...
 Chống tiểu cầu
 Ngăn chặn sự tiến triển của các mảng vữa xơ
 Cải thiện tính đàn hồi động mạch
 Chống oxy hóa, loại bỏ các gốc tự do, đối kháng với tác hại của sự
lipoperoxy hóa của lecithin và của LDl- cholesterol sản sinh ra các sản phẩm
cuối cùng có hại, vì các sản phẩm có ái lực rất cao với thành động mạch và
gây ra những mảng vữa xơ.
Ngoài ra isofalvone cịn có các tác dụng trên các chức năng nhận thức có tác
dụng thuận lợi trong điều trị sự suy giảm nhận thức và sa sút trí tuệ ở phụ nữ cao
tuổi.Vì vậy có thể suy ra là phytoestrogen cũng có thể có các lợi ích tương tự.
1.2.3.3. Nâng cao chất lượng cuộc sống của phụ nữ
Làm giảm cường độ bốc hỏa, mất ngủ, trầm cảm, khô âm đạo trong thời kì mãn
kinh. Giảm số lần đổ mồ hơi đêm, giảm tích mỡ bụng, chống da nhăn, sạm, giảm
khơ xơ tóc.
Nâng cao chất lượng của da: chống oxy hóa, làm làn da mịn màng, mềm mại,
linh hoạt. Chống lão hóa: isoflavone sắn dây ngăn ngừa sự suy giảm chức năng
buồng trứng sớm của phụ nữ, do đó trì hồn sự xuất hiện của mãn kinh, làm chậm
q trình lão hóa. Ngăn ngừa được ung thư vú ở phụ nữ.
1.2.3.4. Tác dụng đối với tuần hồn não
Thử nghiệm trên chó gây mê, flavon toàn phần của sắn dây bằng đường tiêm
động mạch cánh với liều 0,1-5,0 mg/kg làm lưu lượng máu qua não tăng 87,7-134 %,
nếu cho thuốc bằng đường tiêm tĩnh mạch flavon toàn phần với liều 10-30 mg/kg chỉ
17


làm lưu lượng máu qua não tăng 20%. Trên bệnh nhân cao huyết áp, flavon toàn phần
tiêm bắp với liều 200mg có 53% bệnh nhân tuần hồn não được cải thiện, làm giảm
trợ lực mạch máu não.
1.2.3.5. Tác dụng phụ có thể gặp với isoflavone sắn dây

Sắn dây và isoflavone của sắn dây dung nạp tốt, loại trừ một vài trường hợp
hiếm gây rối loạn nhẹ đường tiêu hóa. Người dị ứng với rau đậu cũng có thể bị dị
ứng với thức ăn chế biến từ sắn dây (bột sắn dây,...)
1.2.3.6. Ứng dụng của isoflavone
Isoflavone được bổ sung dùng làm dược phẩm chức năng để chống lão hóa,
chống ung thư, làm đẹp, cân bằng nội tiết tố nữ thời mãn kinh...
Một số thực phẩm chức năng như:
-Lindens Isoflavone One A Day Formula (Soya +) Viên chứa Redlover & Kudzu,
phổ biến với phụ nữ trong và sau khi mãn kinh
-Zestlife Soya Isoflavones Rễ Kudzu & Cỏ ba lá đỏ: Thực phẩm bổ sung, thích hợp
cho người ăn chay
- KUDZU ROOT Extract- 500 mg 40% isoflavones
Lợi ích sức khỏe:
Có thể giúp điều trị chứng nghiện rượu, Giảm viêm, Làm đau dạ dày, Có thể ngừng
nóng và đổ mồ hơi đêm
Thành phần:
Chiết xuất từ rễ Kudzu (Pueraria lobate) được chuẩn hóa đến 40% isoflavone, viên
nang Gelatin
1.3. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là
sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).
Phương pháp này ra đời năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ
phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển
và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích.

18


1.3.1. Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là
chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu
phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được
biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Q trình sắc ký lỏng dựa
trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử).
1.3.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc ký[4].
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và
loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ. Nếu pha tĩnh là
chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc
ký phân bố hay sắc ký chiết. Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử.
Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một pha
động. Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B,
C… vào cột phân tích, kết quả là các chất A, B, C… sẽ được tách ra khỏi nhau sau
khi đi qua cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương
tác.

Hình 1. 6. Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên
khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại. Đối với mỗi chất, sự lưu giữ
được quy định bởi ba lực F1, F2, F3. Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn
F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn. Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là
lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy với các chất khác
nhau thì F1 và F2 là khác nhau. Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột
với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột như hình 1.11

19


Hình 1. 7. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B.
1.3.3. Phân loại sắc ký hấp phụ

Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với
các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột.
Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ. Trong loại
này có hai kiểu hấp phụ:
+ Sắc ký hấp phụ pha thường (NP): pha tĩnh phân cực, pha động không phân
cực.
+ Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP): pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực.
Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi, thành cơng để tách các hỗn hợp các
chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay
trung bình... Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP).
Một số loại cột như: cột C18, cột C8, cột Diol –Si-(CH2)2-O-CH2-CH(OH)CH2OH, cột aminopropyl –Si-(CH2)3- NH2, cột cyanopropyl –Si(CH3)2-(CH2)3CN…

20


1.3.4. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ
mV
trB
trA
t’rA
t’rB

to

Hình 1. 8. Sắc ký đồ của chất A và chất B.
Chất A

Chất B

thời gian

 t0 : thời gian lưu chết.
 trA: thời gian lưu chất A.

trB: thời gian lưu chất B.

 t’rA: thời gian lưu thực chất A.

t’rB: thời gian lưu thực chất B.

1.4.4.1. Thời gian lưu thực t’R
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi
chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại. Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và
các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã
chọn. Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất. Thời gian
lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
+ Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
+ Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
+ Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
+ Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động
Trong một phép phân tích nếu tR’ nhỏ q thì sự tách kém. Cịn nếu tR’ q lớn
thì peak bị dỗng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng
thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung mơi, hố chất, độ chính xác của
phép phân tích kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố đã trình
21


bày ở trên.
1.4.4.2. Hệ số dung lượng K’
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai

pha động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng
chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.
𝐾′ =

𝑡′𝑅 𝑡𝑅 − 𝑡0
=
𝑡0
𝑡0

Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu K’ lớn thì peak bị dỗng.
Trong thực tế K’ từ 1 - 5 là tối ưu.
1.4.4.3. Độ chọn lọc α
Độ chọn lọc

cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất A và B

có K’A và K’B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn
lọc . (với K’B > K’A).
𝜶=

𝒌′ 𝑩
𝒌′ 𝑨

( với

càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng)

Hình 1. 9. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách peak của hai chất A và B
1.4.4.4. Số đĩa lý thuyết
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc

ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống như là một lớp pha tĩnh có
chiều cao là H. Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân
tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung
bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
+ Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh
+ Tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động

22


+ Hệ số khuếch tán của các chất trong cột.
Vì vậy với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối
với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định.
Số đĩa lý thuyết được tính theo cơng thức sau:

Trong đó,

- tR là thời gian lưu của chất phân tích.
- W0,5 là độ rộng tại ½ của peak. Trong thực tế N nằm trong

khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ.
1.4.4.5. Độ phân giải
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một
điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của hai peak cạnh nhau phải được tính theo
cơng thức sau:

Trong thực tế nếu các peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu để hai peak tách
nhau là R = 1,0. Trong phép định lượng R = 1,5 là phù hợp.
 Nếu R nhỏ thì các peak chưa tách hẳn, việc tính tốn diện tích peak sẽ khơng

chính xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo ba cách sau:
 Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động (thay đổi độ
phân cực nếu là RP - HPLC, thay đổi cường độ ion nếu là IE – HPLC ...)
 Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột có
kích thước nhỏ hơn.
 Làm tăng độ chọn lọc

bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với quá trình

tách hoặc thay đổi thành phần pha động .
 Nếu R lớn q thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ
kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình gradient
dung mơi. Tuy nhiên trong q trình chạy sắc ký nếu dùng chương trình dung mơi
thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh
hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích của các peak ta phân tích.
Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình gradient dung môi mà chủ
23