Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm vân chi trametes versicolor

..

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA HÓA

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THU NHẬN VÀ TINH
SẠCH ENZYM LACCASE TỪ CANH TRƯỜNG NUÔI
CẤY NẤM VÂN CHI TRAMETES VERSICOLOR

Sinh viên thực hiện: Đoàn Thị Luyến
MSSV: 107150153
Lớp: 15H2B

Đà Nẵng – Năm 2019


TĨM TẮT
Tên đề tài: Nghiên cứu q trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh
trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor
Sinh viên thực hiện: Đoàn Thị Luyến
MSSV: 107150153

Lớp: 15H2B

GVHD: PGS.TS. Đặng Minh Nhật
ThS. Nguyễn Thị Bích Hằng
Nội dung đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:
Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị
Laccase là một enzym oxi hóa khử đa đồng có thể oxy hóa được nhiều loại cơ
chất bao gồm phenol, keton, phosphat, ascorbat, amin và lignin. Nghiên c ứu được
tiến hành nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng (thành phần môi trường nuôi cấy, thời
gian nuôi cấy và phương pháp nuôi cấy) đến hoạt độ enzym laccase thu từ canh trường
nuôi cấy nấm Vân Chi. Giống nấm Vân Chi được tiến hành nuôi cấy trên 5 công thức
môi trường khác nhau và kết quả cho thấy môi trường tốt nhất là môi trường bao gồm:
dịch khoai tây, glucose, KH2PO4, MgSO4 , NH4+, Cu 2+ và ABTS. Thời gian nuôi cấy
được khảo sát tử 7 – 11 ngày với môi trường trên đạt hoạt độ cao nhất là 2,858 U/ml
sau 8 ngày nuôi cấy. Nghiên cứu cũng đươc tiến hành để so sánh hiệu quả của các
phương pháp nuôi cấy dịch thể (lắc, sục khí và lên men tĩnh) và kết quả thu được là
phương pháp lắc có hiệu quả cao nhất.
Nghiên cứu còn nhằm xác định ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa đến hiệu quả
kết tủa enzym laccase. Tỷ lệ dung dịch enzym thô và dung môi hữu cơ (ethanol,
acetone) được thay đổi từ 1:1 đến 1:5 (v/v), tương tự nồng độ amonium sulfate bão
hòa trong dịch enzym cũng dao động từ 40% đến 100%. Thời gian kết tủa thích hợp
từ tác nhân được lựa chọn cũng được khảo sát. Kết quả cho thấy ethanol đạt hiệu quả
kết tủa enzym laccase cao nhất. Tỷ lệ dung dịch enzym thô/ethanol là 1:3 (v/v) và
thời gian kết tủa là 45 phút cho hiệu suất tủa đạt 78,12%. Khối lượng phân tử của
enzym laccase được xác định bằng điện di là xấp xỉ 100 kDa.

SVTH: Đoàn Thị Luyến

GVHD: Đặng Minh Nhật
Nguyễn Thị Bích Hằng

2


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA HĨA

CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Đoàn Thị Luyến
Lớp: 15H2B

Số thẻ sinh viên: 107150153

Khoa: Hóa

Ngành: Cơng nghệ thực phẩm

1. Tên đề tài đồ án: Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ
canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor
2. Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ đối với kết quả thực hiện
3. Các số liệu và dữ liệu ban đầu:
4. Nội dung các phần thuyết minh và tính tốn:
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
5. Các bảng, hình ảnh
6. Họ tên người hướng dẫn: PGS.TS. Đặng Minh Nhật, ThS. Nguyễn Thị Bích Hằng
7. Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 18/08/2019

8. Ngày hoàn thành đồ án: 09/12/2019
Đà Nẵng, ngày … tháng 12 năm 2019
Trưởng Bộ môn

Người hướng dẫn

Công nghệ thực phẩm

PGS.TS. Đặng Minh Nhật

PGS.TS. Đặng Minh Nhật


LỜI NÓI ĐẦU

Sau hơn 3 tháng thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch
enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor”, dưới sự
hướng dẫn của thầy Đặng Minh Nhật và cô Nguyễn Thị Bích Hằng, tơi đã hồn thành
xong đồ án tốt nghiệp của mình.
Đầu tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn đến q thầy cơ Khoa Hóa - Trường Đại học Bách
Khoa Đà Nẵng nói chung, bộ mơn Cơng nghệ thực phẩm nói riêng, đã tận tâm truyền
đạt những kiến thức nền tảng, nhiệt tình giúp đỡ chỉ bảo trong q trình học tập, nghiên
cứu để tơi có thể hồn thành chương trình học tập đúng với tiến độ.
Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến thầy Đặng Minh Nhật và
cơ Nguyễn Thị Bích Hằng đã ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, sát cánh cùng tơi trong
suốt q trình làm đồ án. Trong q trình thực hiện, dù bận nhiều cơng việc nhưng thầy
cô đã dành nhiều thời gian hướng dẫn, chỉ bảo tận tình từng bước, từ việc chọn đề tài,
thực hiện đề tài và báo cáo đề tài. Với những góp ý, sửa chữa của thầy cô, đã giúp tôi
nắm bắt chính xác hơn về những nội dung liên quan đến đồ án từ đó hồn thành đồ án
một cách tốt nhất có thể.

Bên cạnh đó, tơi cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô và các bạn sinh viên ở
các phịng thí nghiệm tại trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng đã giúp đỡ, tạo mọi điều
kiện thuận lợi, khích lệ và động viên tơi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp
của mình.
Cuối cùng, tơi xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Hội đồng bảo vệ đồ
án tốt nghiệp đã dành thời gian quý báu của mình để đọc và đưa ra ý kiến đóng góp cho
đồ án tốt nghiệp của tôi.

i


CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các số liệu sử dụng,
phân tích trong đồ án có nguồn gốc rõ ràng, đã cơng bố theo đúng quy định. Các kết quả
nghiên cứu trong đồ án do tơi tự thực hiện, phân tích một cách trung thực, khách quan.
Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác. Các số liệu
trích dẫn có ghi chú nguồn gốc rõ ràng

Sinh viên thực hiện

Đoàn Thị Luyến

ii


MỤC LỤC

Tóm tắt
Nhiệm vụ đồ án tốt nghiệp

Lời nói đầu .................................................................................................................................i
Cam đoan.................................................................................................................................. ii
Mục lục .................................................................................................................................... iii
Danh sách các bảng..................................................................................................................v
Danh sách các hình................................................................................................................. vi
Danh sách các chữ viết tắt................................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................................4
1.1. Tổng quan về nấm Vân Chi..........................................................................................4
1.1.1. Nguồn gốc, vị trí phân loại...........................................................................................4
1.1.2. Đặc điểm hình thái nấm Vân Chi ................................................................................5
1.1.3. Chu trình phát triển của nấm Vân Chi ........................................................................5
1.1.4. Giá trị dược học của nấm Vân Chi ..............................................................................6
1.1.5. Tổng quan về tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm............................................. 10
1.2. Tổng quan về enzym laccase ..................................................................................... 11
1.2.1. Giới thiệu chung về laccase ...................................................................................... 11
1.2.2. Cấu trúc phân tử của laccase ..................................................................................... 12
1.2.3. Cơ chế xúc tác của laccase ........................................................................................ 13
1.2.4. Nguồn thu nhận laccase ............................................................................................. 15
1.2.5. Ứng dụng của laccase ................................................................................................ 17
1.2.6. Tình hình nghiên cứu về laccase .............................................................................. 19
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 22
2.1. Vật liệu nghiên cứu...................................................................................................... 22
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ............................................................... 22
2.2.1. Hóa chất ....................................................................................................................... 22
2.2.2. Dụng cụ thí nghiệm .................................................................................................... 23
2.2.3. Thiết bị thí nghiệm ..................................................................................................... 23
2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 23
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy dịch thể................................................................................. 23

iii


2.3.2. Phương pháp thu dịch nuôi cấy .................................................................................24
2.3.3. Phương pháp tinh sạch ................................................................................................25
2.3.4. Phương pháp xác định hoạt độ laccase .................................................................... 27
2.3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................................. 28
2.3.6. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu..................................................................... 31
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 32
3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt độ enzym laccase từ canh
trường nuôi cấy nấm Vân Chi .......................................................................................... 32
3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ enzym laccase từ canh trường
nuôi cấy nấm Vân Chi ........................................................................................................ 34
3.3. Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy đến hoạt độ enzym laccase từ canh
trường nuôi cấy nấm Vân Chi .......................................................................................... 36
3.4. Hiệu quả kết tủa của (NH4 )2SO4 đối với dịch enzym laccase thô thu từ canh
trường nuôi cấy nấm Vân Chi .......................................................................................... 39
3.5. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ trong kết tủa enzym laccase thu từ canh
trường nuôi cấy nấm Vân Chi .......................................................................................... 42
3.5.1. Khả năng kết tủa enzym laccase thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi bằng
dung môi ethanol ................................................................................................................... 42
3.5.2. Khả năng kết tủa enzym laccase thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi bằng
dung môi acetone................................................................................................................... 43
3.6. So sánh, lựa chọn chất kết tủa enzym laccase tốt nhất ....................................... 45
3.7. Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hiệu suất kết tủa enzym laccase từ canh
trường nuôi cấy nấm Vân Chi .......................................................................................... 46
3.8. Xác định khối lượng phân tử của enzym laccase ................................................. 47
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 49
4.1. Kết luận ...........................................................................................................................49
4.2. Kiến nghị.........................................................................................................................49

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 51

iv


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Số hiệu bảng

Tên bảng

Trang

2.1.

Thành phần môi trường nuôi cấy

22

2.2.

Thành phần các môi trường khác nhau được sử dụng để
sản xuất laccase

29

3.1.

Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt độ enzym
laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi

32

3.2.

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lắc đến hoạt độ enzym
laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi

35

3.3.

Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy đến hoạt độ
enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi

36

3.4.

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tĩnh đến hoạt độ
enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi

38

3.5.

Hiệu quả kết tủa enzym laccase với muối (NH4)2 SO4

40

3.6.

Hiệu quả kết tủa enzym laccase với dung môi ethanol

42

3.7.

Hiệu quả kết tủa enzym laccase với dung môi acetone

44

3.8.

So sánh hiệu quả kết tủa enzym laccase bằng các tác
nhân tủa khác nhau

45

3.9.

Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hiệu suất tủa của
enzym laccase

46

v


DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH

Số hiệu hình

Tên hình

Trang

1.1.

Nấm Vân Chi

5

1.2.

Chu trình phát triển của nấm Vân Chi

6

1.3.

Cấu trúc ba chiều của enzym laccase từ Melanocarpus
albomyces

12

1.4.

Trung tâm hoạt động của laccase

13

1.5.

Cơ chế xúc tác của laccase

14

1.6.

Q trình oxy hóa các tiểu đơn vị phenol của lignin bằng
laccase

14

1.7.

Các kiểu xúc tác của laccase

15

1.8.

Q trình oxy hóa phần khơng phenol của lignin bởi laccase

15

và các hợp chất trung gian
2.1.

Hiệu quả nhân giống dịch thể so với nhân giống truyền

24

thống
2.2.

Cơ chế phản ứng oxy hóa ABTS bởi enzym laccase

27

3.1.

Hoạt độ enzym laccase thu từ mơi trường ni cấy khác

33

nhau
3.2.

Hình ảnh ni cấy nấm Vân Chi trên môi trường lỏng sau:

34

a) 7 ngày; b) 9 ngày; c) 11 ngày
3.3.

Hoạt độ enzym laccase thu được ở thời gian ni cấy khác

35

nhau trong điều kiện ni lắc
3.4.

Hình ảnh ni sục khí sau a) 6 ngày; b) 7 ngày; c) 8 ngày

37

ni cấy
3.5.

Hình ảnh ni cấy tĩnh sau a) 8 ngày, b) 14 ngày, c)22 ngày

38

3.6.

Hoạt độ enzym laccase thu được ở các thời gian nuôi cấy

39

tĩnh khác nhau
3.7.

Hiệu suất tủa enzym laccase ở các nồng độ muối (NH4 )2SO4
bão hòa khác nhau

vi

41

3.8.

Hiệu suất kết tủa enzym laccase ở các tỷ lệ ethanol khác

43

nhau
3.9.

Hiệu suất kết tủa enzym laccase ở các tỷ lệ acetone khác

44

nhau
3.10.

Hiệu suất kết tủa enzym laccase bằng ethanol ở các thời gian

47

tủa khác nhau
3.11.

Diện di đồ PAGE

48

vii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PSP

Polysaccharide peptide

PSK

Polysaccharide krestin

HIV

Human immuno deficiency virus

AIDS

Acquired immune seficiency syndrome

HAART

Highly-active anti-retroviral therapy

ABTS

2,2'-azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid

PAH

Polycyclic Aromatic Hyrocarbons

PCB

Polychlorinated biphenyls

DDT

Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane

2,4-D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

2,4,5-T

2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid

OD

Mật độ quang (Optical Density)

TN

Thí nghiệm

MT

Mơi trường

PDA

Potato dextrose agar

RBBR

Remazol brilliant blue R

KLC

Khuẩn lạc cầu

viii


Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi
Trametes versicolor

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Ngành sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu đã hình thành và phát triển trên thế giới
cách đây hàng trăm năm. Hiện nay, nghề trồng nấm đang được phát triển cả về sản xuất
lẫn tiêu thụ vì nấm là một sản phẩm sạch có giá trị dinh dưỡng và giá trị dược liệu cao
[1].
Nấm Vân Chi (Trametes versicolor) là một loại nấm có giá trị dược liệu tốt, đã và
đang được người tiêu dùng ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, các nước Châu Âu,
châu Mỹ... ưa chuộng. Trong nấm Vân Chi có chứa các hợp chất polysaccharid liên kết
với protein, gồm hai loại chính: PSP (Polysaccharide peptide) và PSK (Polysaccharide
krestin). PSP và PSK có tác dụng ức chế nhiều loại tế bào ung thư như các tế bào ung

thư biểu mô, các tế bào ung thư máu. Các chất này được coi là có khả năng chữa trị ung
thư, tăng miễn dịch cơ thể, chống các phản ứng phụ của xạ trị và hoá trị, ức chế sự nhân
lên của HIV [2]. Tại Việt Nam, gần đây ngành trồng nấm nói chung và nấm Vân Chi
nói riêng đã và đang được quan tâm và phát triển, góp phần nâng cao sản lượng nấm
hàng năm.
Nuôi trồng nấm trên chất nền rắn đã được nghiên cứu rộng rãi vì đó là phương
pháp ni trồng nấm truyền thống ở khắp các vùng miền. Nhưng để rút ngắn thời gian,
tiết kiệm diện tích và kinh phí trong sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu thì hiện nay
người ta đã áp dụng công nghệ nuôi cấy lỏng (lên men) trong công nghệ nhân giống
nấm. Nuôi cấy lỏng là phương pháp nuôi cấy cho khả năng sản xuất sinh khối cao với
thời gian rút ngắn và tỷ lệ nhiễm thấp hơn so với nuôi cấy môi trường rắn truyền thống.
Do đó trong ni trồng nấm Vân Chi hiện nay, công nghệ lên men này được áp dụng rất
nhiều. Sản phẩm sau khi lên men bao gồm sinh khối sợi nấm Vân Chi và dịch nuôi cấy.
Sinh khối sợi nấm dùng để làm giống cấp 1, giống cấp 2, đồng thời có thể trực tiếp làm
giống ni trồng (giống cấp 3). Cịn dịch lên men thì ít có ứng dụng đem lại hiệu quả
kinh tế. Tuy nhiên trong thành phần của dịch ni cấy có chứa enzym laccase.
Enzym laccase là một enzym thuộc nhóm oxidoreductase, xúc tác quá trình oxy
hóa một electron của nhiều loại chất hữu cơ và vơ cơ, bao gồm các hợp chất thơm có
chứa các nhóm hydroxyl như mono-, di-, poly-, và methoxy-phenol và các amin thơm,
hydroxyindoles, benzenethiols, carbohydrate và cả các hợp chất vô cơ như iot [2],[3].
Một đặc điểm nổi bật của enzym laccase là nó oxy hóa cả các chất độc và khơng độc
SVTH: Đồn Thị Luyến

GVHD: Đặng Minh Nhật
Nguyễn Thị Bích Hằng

1


Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi

Trametes versicolor

hại. Nó được sử dụng để loại bỏ các gốc lignin giúp tẩy trắng bột giấy hoặc để xử lý
dịch lỏng độc hại sau quá trình tẩy trắng giấy bằng các hợp chất chlorine và các oxid
chlorine để tẩy trắng bột giấy trong ngành công nghiệp giấy. Trong công nghiệp chế
biến thực phẩm, laccase được sử dụng để loại bỏ các hợp chất phenol không mong muốn
trong nấu nướng, chế biến nước trái cây, ổn định rượu vang và nước giải khát. Trong
công nghiệp dệt may, enzym laccase được sử dụng để cải thiện độ trắng của bơng, giúp
tiết kiệm hóa chất, năng lượng và nước. Ngồi ra, enzym laccase cịn được ứng dụng
trong xử lý sinh học của nước thải công nghiệp, phân hủy các hợp chất phenol là chất
thải của các q trình sản xuất khác nhau như hóa dầu, sản xuất các hợp chất hữu cơ, xử
lý đất bị ơ nhiễm. Laccase có thể được sử dụng trong quá trình tổng hợp các hợp chất y
tế phức tạp như thuốc gây mê, thuốc chống viêm, thuốc kháng sinh, thuốc an thần, …
và hiện nay còn được ứng dụng trong mỹ phẩm.
2. Mục tiêu đề tài
Đề tài: “ Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường
ni cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor” có 3 mục đích chính:
- Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym laccase từ nấm
Vân Chi nuôi cấy trong môi trường lỏng
- Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu nhận enzym laccase từ canh
trường nuôi cấy nấm Vân Chi
- Xác định khối lượng phân tử của enzym laccase từ nấm Vân Chi.
3. Đối tượng nghiên cứu
Giống nấm Vân Chi được lấy từ phịng cơng nghệ sinh học Nấm, khoa Sinh – Môi
trường, trường Đại học Sư phạm, đại học Đà Nẵng.
4. Phạm vi nghiên cứu
Các nghiên cứu của đề tài “Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym
laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor” được thực hiện tại
phịng cơng nghệ sinh học Nấm, khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm, đại
học Đà Nẵng.

5. Nội dung bài báo cáo
Gồm 4 chương:
❖ Chương 1: Tổng quan
-

Tổng quan về nấm Vân Chi (nguồn gốc, đặc điểm hình thái, chu trình phát triển,
giá trị dược học).

SVTH: Đồn Thị Luyến

GVHD: Đặng Minh Nhật
Nguyễn Thị Bích Hằng

2


Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi
Trametes versicolor

-

Tổng quan về enzym laccase (giới thiệu chung, cấu trúc và cơ chế xúc tác của
enzym laccase, các nguồn thu nhận enzym, ứng dụng và tình hình nghiên cứu về
enzym laccase).

❖ Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
-

Vật liệu nghiên cứu.

-

Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm.

-

Phương pháp nghiên cứu (bố trí thí nghiệm, phương pháp ni cấy dịch thể,
phương pháp thu dịch enzym, phương pháp làm sạch và tinh chế, phương
pháp xác định hoạt độ, phương pháp thu thập và xử lý số liệu).

❖ Chương 3: Kết quả và thảo luận
-

Kết quả thí nghiệm.

- Nhận xét, giải thích và kết luận.
❖ Chương 4: Kết luận và kiến nghị
-

Kết luận về kết quả nghiên cứu.

-

Đề xuất hướng nghiên cứu mới.

SVTH: Đoàn Thị Luyến

GVHD: Đặng Minh Nhật
Nguyễn Thị Bích Hằng

3


Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi
Trametes versicolor

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về nấm Vân Chi
1.1.1. Nguồn gốc, vị trí phân loại
Nấm Vân Chi là loại nấm dược liệu đã và đang được sử dụng ở nhiều nước châu
Á và là loài sinh trưởng khắp nơi trên thế giới đã được y học cổ truyền phương Đông sử
dụng từ lâu. Vân Chi có nhiều tên gọi khác nhau. Vân Chi có tên tiếng Anh là “Turkey
tails” (đi gà tây) do nó có nhiều màu sắc khác nhau: màu cam, nâu, xanh dương và
xanh lá cây giống với chùm lông của gà tây [4],[3]. Ở Trung Quốc, người ta gọi là
“Yunzhi” (nấm đám mây) vì nấm có hình dạng như mây. Cịn ở Nhật Bản thì gọi là
“Karawatake” do người ta hay tìm thấy chúng ở những nơi gần bờ sơng.
Vân Chi có tên khoa học phổ biến hiện nay là Trametes versicolor sau một thời
gian dài được nghiên cứu và đặt tên khác nhau. Trametes versicolor được chính Carl
von Linnaeus tìm ra và đặt tên đầu tiên là Boletus versicoler L. (1753). Sau đó Christiaan
Hendrik Persoon (1805) lại xác định với tên Boletus vulutinus Pers., và Elias Magnus
Fries (1821) đưa chúng vào chi Polyporus (với hai loài: Polyporus versicoler Fr và
Polyporus Vulutinus Fr) nhưng Lucien Quesslet (1886) lại đưa vào chi Coriolus
(Coriolus versicolor). Sau 50 năm, Abert Pilát (1936) đề nghị và được đa số các nhà
nấm học thống nhất xếp vào chi Trametes, họ Polyporacea. Các hệ thống phân loại về
sau cũng phù hợp với quan điểm trên, nên hầu hết những tác giả gần đây đều sử dụng
danh pháp đã chỉnh lý là Trametes versiclor [5].
Vân Chi là một loài nấm lớn thuộc phân lớp Basidiomycetes gồm 22000 loài đã
biết. Nấm Vân Chi thường mọc trên những thân cây khô đã chết, thuộc loại nấm gây
mục trắng mạnh nhất, có thể phá hủy đồng thời tất cả các cấu tử gỗ (hemicellulose,

cellulose và lignin).
Vị trí phân loại nấm Vân Chi [6]
Giới nấm

: Fungi

Ngành nấm thật

: Eumycota

Ngành phụ nấm đảm

: Basidiomycotina

Lớp nấm đảm

: Basisiomycetes

Phân lớp nấm đảm đơn bào

: Holobasidiomycetidae

Nhóm bộ

: Hymenomycetes

Bộ nấm lỗ

: Aphyllophorales

SVTH: Đồn Thị Luyến

GVHD: Đặng Minh Nhật
Nguyễn Thị Bích Hằng

4


Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi
Trametes versicolor

Họ nấm nhiều lỗ

: Polyporaceae

Chi

: Trametes

Lồi

: Trametes versicolor

1.1.2. Đặc điểm hình thái nấm Vân Chi
Vân Chi là loại nấm hàng năm, mũ nấm
khơng có cuống, dai, phẳng hay hơi quăn,
hình bán nguyệt, mọc thành cụm. Nấm
thường mọc thành tán dạng ngói lợp. Mặt trên
tán phủ lông dày, mịn, dễ thay đổi về màu sắc,
đặc trưng bởi những vòng đồng tâm với màu

sắc khác nhau, màu sắc từ trắng đến vàng
nhạt, nâu nhạt, nâu rỉ có sắc thái xanh đến đen.
Đảm quả khi non dạng u lồi trịn, sau phân hóa
thành dạng bán cầu, khi già đảm quả có dạng
thận, dạng quạt, thót dần lại ở phần gốc hay
cũng có khi trải sát giá thể hay trải cuộn lại
thành dạng vành với mép tán màu trắng đến

Hình 1.1. Nấm Vân Chi [8]

trắng kem [7].
Kích thước thay đổi với đường kính tán trung bình cỡ 2 – 7 cm, dày cỡ 2,5 – 4 mm.
Thịt nấm mỏng, màu kem đến hơi vàng, dày 0,6 – 2,5 mm, trên lát cắt hiển vi thấy rõ
lớp sắc tố đen xanh đặc trưng bên dưới lớp lông. Tiếp xuống dưới là lớp bào tầng gồm
các ống nấm dày cỡ 0,6 – 1,8 mm, miệng ống tròn, xẻ răng cưa, đơi khi có dạng nhiều
gốc, có các gờ nổi gân, có 3 – 7 ống/mm, bề mặt phủ lông tơ rất mịn với đảm và bào tử
dày đặc, màu trắng hơi vàng. Hệ sợi trimitic, sợi dinh dưỡng trong suốt, vách mỏng có
khóa rõ ràng, đường kính cỡ 2,5 – 3,5 µm; sợi cứng ở vùng thịt nấm có vách rất dày,
khơng thấy có vách ngăn tế bào, đường kính tới 6 – 12 µm, rất hiếm khi thấy phân nhánh,
sợi bện cũng có vách dày, phân nhánh rõ rệt, khơng thấy có vách ngăn ngang, đường
kính nhỏ hơn 5,0 – 5,5 µm, khơng thấy có liệt bào. Đảm bào hình chùy, có 4 tiểu bính
(nơi đính của 4 bào tử), có khóa ở phần gốc. Bào tử đảm hình trụ, hơi cong hình quả dưa
gang, trong suốt, nhẵn, kích thước 5,5 x 2,5 µm [9].
1.1.3. Chu trình phát triển của nấm Vân Chi
Đảm bào tử nảy mầm cho hệ sợi sơ cấp. Hai sợi sơ cấp khác phối hợp cho hệ sợi
thứ cấp. Hệ sợi thứ cấp phát triển thành mạng hệ sợi. Trong điều kiện thuận lợi mạng
hệ sợi sẽ kết hạch tạo tiền quả thể (nụ nấm). Nụ nấm tiếp tục lớn dần cho tai nấm

SVTH: Đồn Thị Luyến

GVHD: Đặng Minh Nhật
Nguyễn Thị Bích Hằng

5


Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi
Trametes versicolor

trưởng thành, các phiến dưới mũ mang các đảm và sinh ra bào tử. Đảm bào tử được
phóng thích và chu trình lại tiếp tục.

Hình 1.2. Chu trình phát triển của nấm Vân Chi [9]
1. Tầng đảm; 2. Đảm; 3. Kết hợp nhân ở đảm; 4. Hình thành bào tử
đảm, 5. Bào tử đảm nảy mầm; 6. Sự kết hợp sợi sơ cấp; 7. Sợi nấm
song nhân; 8. Quả thể
1.1.4. Giá trị dược học của nấm Vân Chi
1.1.4.1. Thành phần dược tính chính trích từ nấm Vân Chi
Theo các kết quả nghiên cứu, hai thành phần chính trích từ nấm Vân Chi có giá
trị dược liệu quan trọng là hợp chất PSK (polysaccharide krestin) và PSP
(polysaccharide peptide). Vào khoảng năm 1965, ở Nhật, một kỹ sư hoá học đã khám
phá ra PSK. Sau đó, hợp chất PSP cũng đã được phân lập lần đầu tiên tại Trung Quốc
năm 1983. PSK và PSP có cấu trúc hố học cũng như các tính chất khá tương đồng.
Chúng đều là các hợp chất polysaccharid liên kết với protein. Dịch trích PSP từ nấm
(thuật ngữ gọi là proteoglycan) là những chuỗi polypeptide hay những phân tử protein
nhỏ gắn kết chặt với các chuỗi polysaccharide β-D-glucan, là thành phần hiệu quả
trong chữa trị các bệnh ung thư: dạ dày, thực quản, ruột kết và ung thư ngực… Thành
phần các yếu tố có trong dịch trích: cacbon: 40,5%; hydrogen: 60,2%; nitrogen: 5,2%;
oxygen: 47,5%. Cả hai đều có trọng lượng phân tử khoảng 100 kDa và các chuỗi
polypeptid trong phân tử của chúng đều chứa một số lượng lớn các acid amin aspartic

và glutamic. Tác dụng chung của PSP và PSK là hoạt hóa, tăng cường sự sản sinh và
bảo vệ các tế bào của hệ miễn dịch.
SVTH: Đồn Thị Luyến

GVHD: Đặng Minh Nhật
Nguyễn Thị Bích Hằng

6


Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi
Trametes versicolor

a) Hiệu quả của PSP chiết tách từ nấm Vân Chi
Các nghiên cứu về dược lý đã chứng minh rằng PSP ảnh hưởng mạnh mẽ đến
sức khỏe và năng lượng. PSP là loại chất cảm ứng, kích thích làm tăng các yếu tố
hoại tử u và có tác dụng điều hịa hoạt động của các cytokine, là thành phần rất quan
trọng để ngăn ngừa sự hình thành và phát triển các khối u. Đồng thời, PSP còn ức chế
sự phát triển của tế bào ung thư ở người và động vật, thúc đẩy sự sản xuất các tế bào
miễn dịch chính (các đại thực bào và tế bào Lymphocyte) có tác dụng chống lại các
tác nhân gây độc xâm nhập từ ngồi vào [10].
PSP khơng gây hại đối với các tế bào bình thường, có khả năng phân biệt giữa
tế bào thường và tế bào ung thư và tiêu diệt chúng mà không gây bất cứ sự thay đổi
hay tạo độc tố trên tế bào. Tỉ lệ phần trăm bệnh nhân trải qua thử nghiệm hiệu quả
của PSP trong các giai đoạn 2 và 3 cho thấy tỉ lệ sống còn gia tăng đáng kể so với
nhóm đối chứng: 90 – 97% đối với ung thư dạ dày, 82 – 87% đối với ung thư thực
quản, 70 – 86% đối với ung thư phổi. PSP là chất đầy tiềm năng và hiệu quả trong
điều trị ung thư.
Ngồi ra PSP cịn có một số công dụng khác:
- PSP gia tăng chức năng miễn dịch của cơ thể bình thường.

- PSP trung hồ quá trình ức chế miễn dịch do khối u gây ra ở động vật.
- PSP còn được ứng dụng trong chữa trị các bệnh viêm nhiễm virus và bệnh gan.
b) Hiệu quả của PSK chiết tách từ nấm Vân Chi
Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản, PSK là liệu pháp chữa trị tốt nhất trong số
các dược chất hoá lý có khả năng kháng khối u. PSK bảo vệ hệ miễn dịch bằng cách
trung hồ các thuốc hố trị và các quá trình gây độc của tế bào ung thư.
Một số công dụng của PSK là:
- PSK phục hồi lại các thông số miễn dịch bị suy yếu, đồng thời ức chế các hợp
chất gây ức chế miễn dịch.
- PSK ngăn chặn các phản ứng phụ khi dùng kết hợp với các tác nhân hoá trị để
chữa trị ung thư, gia tăng khả năng sống của các bệnh nhân ung thư dạ dày ở các giai
đoạn 3 và 4.
- Có tác dụng ngăn chặn sự phát triển khối u.
- PSK có khả năng ngăn chặn bệnh AIDS. PSK đã góp phần ngăn chặn sự nhân
lên của virus HIV trong tế bào, hạn chế phần nào sự phá hỏng hệ thống miễn dịch do
virus HIV gây ra, gây ức chế enzym phiên mã ngược. Do đó PSK đã góp phần ngăn

SVTH: Đồn Thị Luyến

GVHD: Đặng Minh Nhật
Nguyễn Thị Bích Hằng

7


Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi
Trametes versicolor

chặn giai đoạn nhiễm HIV dương tính sang giai đoạn mắc bệnh AIDS, và kéo dài thời
gian sống cho những bệnh nhân này.

- PSK cũng có tính kháng sinh mạnh, đặc biệt hiệu quả trên Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Cryptococcus neoformans, Psedomonas aeruginosa,
Candida albicans và một số loại vi trùng khác gây bệnh ở người [11].
1.1.4.2. Cơng dụng chính của nấm Vân Chi
Nấm Vân Chi là một loại nấm dược liệu đã được y học cổ truyền phương Đông
sử dụng từ lâu. Sở dĩ như vậy vì nấm này có rất nhiều đặc tính dược lý và trong vài
thập kỷ gần đây đã có hàng ngàn cơng trình nghiên cứu về tác dụng dược lý của nấm
Vân Chi. Theo kinh nghiệm cổ truyền ở Trung Quốc thì nấm Vân Chi có tính hàn, vị
ngọt, giúp thanh nhiệt, tiêu viêm, nâng cao miễn dịch của cơ thể, có tác dụng tốt trong
điều trị ung thư, viêm gan, HIV,… [9]
Nổi bật nhất là tác dụng phòng chống và điều trị ung thư. Ở Nhật Bản, vào
những năm 1980, nấm Vân Chi đã được công nhận là một chất chống ung thư. Dịch
trích từ nấm được sử dụng với hóa trị liệu làm tăng thời gian sống và giảm các tác
dụng phụ đối với các bệnh nhân ung thư trong các nghiên cứu ngẫu nhiên với các
dạng ung thư sau: ung thư dạ dày, ung thư đại tràng, ung thư vòm họng, ung thư thực
quản, ung thư phổi và ung thư vú [4]. Một nghiên cứu khác với các bệnh nhân ung
thư dạ dày, thực quản, phổi, ung thư buồng trứng và cổ tử cung thì PSP cũng có tác
dụng cải thiện chất lượng cuộc sống, làm giảm đau và tăng cường khả năng miễn dịch
ở 70 – 97% bệnh nhân [12]. Tại Trung Quốc có rất nhiều nghiên cứu chứng minh
dịch chiết xuất nấm Vân Chi có tác dụng ức chế 40 – 95% đối với sự tăng trưởng của
tế bào ung thư, trong khi đó lại khơng thấy có tác dụng phụ nào đáng kể. Tại Anh,
kết quả nghiên cứu do nhóm của tiến sĩ Kenyon ở trung tâm nghiên cứu điều trị lâm
sàng Dove (Winchester, London) trên 30 bệnh nhân ung thư thuộc nhiều dạng khác
nhau chỉ ra rằng điều trị bằng bột nghiền từ sinh khối nấm Vân Chi làm giảm mạnh
mẽ hoạt độ của enzym telomerase (một enzym thiết yếu giúp các tế bào ung thư chống
lại quá trình “tự chết”), đồng thời tăng cường đáng kể các phản ứng miễn dịch chống
lại các khối u. Vì vậy, nghiên cứu cho thấy điều trị bằng nấm Vân Chi vẫn có tác
dụng với các trường hợp ung thư giai đoạn 3 và 4, khi mà các liệu pháp hố học và
phóng xạ đã khơng cịn tác dụng. Các hợp chất trích từ Vân Chi rất an tồn khi sử
dụng, khơng có phản ứng phụ, không độc [13].

Một tác dụng dược lý quan trọng nữa của nấm Vân Chi là khả năng kiềm chế
virus HIV. Năm 1997, R.A. Collins thuộc Đại học Hồng Kông công bố kết quả nghiên
cứu về tác dụng chống lại virus HIV typ 1 của các polysaccharid từ nấm Vân Chi.
SVTH: Đoàn Thị Luyến

GVHD: Đặng Minh Nhật
Nguyễn Thị Bích Hằng

8


Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi
Trametes versicolor

Ngay sau đó, nhiều nhà nghiên cứu khác đã tiến hành các thử nghiệm sử dụng nấm
Vân Chi trong điều trị bệnh nhân AIDS. Tiêu biểu phải kể đến là nghiên cứu của
Marijke Pfeiffer trên một nhóm bệnh nhân HIV dương tính ( M.Pfeiffer, 2001). Các
bệnh nhân này được điều trị bằng Coriolus MRL, một dược phẩm chế xuất từ nấm
Vân Chi, kết hợp với liệu pháp châm cứu và dùng thảo dược; một số có dùng thêm
HAART, một loại thuốc chống AIDS. Kết quả nghiên cứu cho thấy sau 3 – 4 tháng
điều trị, sức khỏe của các bệnh nhân đều được cải thiện, biểu hiện như tăng cân, cảm
thấy khỏe khoắn hơn, giải tỏa ức chế tâm lý. Đặc biệt số lượng virus trong cơ thể họ
đều giảm một cách đáng kinh ngạc (từ vài chục nghìn xuống vài nghìn) và số lượng
các tế bào kháng thể CD – 4 đều tăng. Sau thời gian điều trị các bệnh nhân đều khỏi
hoặc thuyên giảm hẳn các triệu chứng hệ quả của AIDS như ỉa chảy, viêm phế quản,
đau tim, viêm dây thần kinh, nhiễm khuẩn,… Một nghiên cứu đáng lưu ý khác do
nhóm của G. Rotolo (1999) thực hiện cũng chứng minh tác dụng điều trị các biểu
hiện thứ cấp trong sự phát triển bệnh ở các bệnh nhân AIDS. Các bệnh nhân đều trên
35 tuổi, HIV dương tính, được điều trị bổ sung bằng chế phẩm từ nấm Vân Chi. Kết
quả cho thấy sau 15 ngày điều trị với hàm lượng chế phẩm sử dụng là 3g/ngày, số

lượng các tế bào bạch cầu trong cơ thể các bệnh nhân đều tăng lên khoảng 27 so với
các trường hợp không được điều trị, và con số này giảm xuống còn 14,1 nếu lượng
chế phẩm sử dụng cho điều trị được giảm đi một nửa. Sau 45 ngày điều trị kết hợp cả
hai chế độ, số lượng bạch cầu trong cơ thể các bệnh nhân tăng 45,2. Từ các kết quả
này tác giả khuyến cáo việc sử dụng chế phẩm từ nấm Vân Chi như một liệu pháp
chống bệnh AIDS và đề nghị nghiên cứu sâu hơn về bản chất tác dụng của nấm đối
với sự tăng số lượng bạch cầu. Nấm Vân Chi cịn được phát hiện là có khả năng điều
trị bệnh viêm gan B mãn tính và làm tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể.
Bên cạnh những công dụng tuyệt vời của nấm Vân Chi trong y học, hiện nay
nấm Vân Chi ngày càng được sử dụng nhiều trong ngành mỹ phẩm giúp cải thiện làn
da cho người sử dụng. Một ví dụ về sản phẩm mỹ phẩm từ nấm Vân Chi là gel rửa
mặt nấm Vân Chi và kem nám nấm Vân Chi của công ty mỹ phẩm Lan Hảo [14]. Sản
phẩm có tác dụng phục hồi và làm trẻ hóa da, giảm q trình lão hóa da và ngăn ngừa
các tác hại của ánh nắng mặt trời, làm mờ dần các mảng da bị nám và tàn nhang.
Ngồi ra nấm Vân Chi cịn sản xuất ra các enzym phân hủy lignin bao gồm
laccaza, mangan peroxidaze (MnP), lignin peroxidaze (LiP). Trong đó, laccase là
enzym có ưu điểm vượt trội là có tính oxy hóa mạnh và chỉ sử dụng oxy phân tử làm
chất nhận điện tử trong khi LiP và MnP xúc tác phản ứng dưới sự có mặt của H2O2.

SVTH: Đồn Thị Luyến

GVHD: Đặng Minh Nhật
Nguyễn Thị Bích Hằng

9


Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi
Trametes versicolor

1.1.5. Tổng quan về tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm
Nuôi trồng nấm trên chất rắn đã được nghiên cứu rộng rãi vì đó là phương
pháp ni trồng nấm truyền thống ở khắp các vùng miền. Nhưng để rút ngắn thời
gian, tiết kiệm diện tích và kinh phí trong sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu thì hiện
nay người ta đã áp dụng công nghệ lên men trong công nghệ nhân giống nấm. Công
nghệ này cho phép thu được lượng sinh khối sợi nấm lớn hơn phương pháp truyền
thống.
Trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu và sản xuất giống nấm dịch thể.
Liu và cộng sự (2010) đã có kết luận rằng ni cấy nấm trong mơi trường dịch thể có
thể sản xuất ra giống nấm cao hơn trong thời gian ngắn hơn và với mức độ nhiễm
bệnh ít hơn so với phương pháp ni cấy nấm truyền thống trên nền cơ chất rắn truyền
thống. Theo Sukamar và cộng sự (2008), ở Ấn Độ đã có nghiên cứu về ảnh hưởng
điều kiện pH và nhiệt độ tới sự phát triển của Vân Chi trong môi trường dịch thể. Kết
quả là sinh khối sợi nấm Vân Chi thu được khi môi trường pH 5 và pH 6 là 2,99 g/l
và 4,28 g/l. Trong khi đó nếu pH 8 thì sinh khối sợi giảm chỉ cịn 1,97g/l. Cịn với
điều kiện nhiệt độ thì tại nhiệt độ 300 C, sinh khối sợi đạt được 4,32 g/l, tại 40 0C sinh
khối sợi ghi nhận là thấp nhất đạt 1,72 g/l. Tuy việc nghiên cứu và nuôi trồng giống
nấm Vân Chi dịch thể trên thế giới đã có rất nhiều nhưng hầu như chỉ với mục đích
thu sinh khối sợi và tách chiết các hoạt chất sinh học của nó cịn việc ni trồng để
thu quả thể ở lồi nấm này rất ít được nghiên cứu.
Ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt ở Trung Quốc và Nhật Bản đã có nhiều sản
phẩm nổi tiếng từ nấm Vân Chi. Sản phẩm Vân Chi Can Thái của xí nghiệp dược
phẩm Trường Xn có tác dụng rõ rệt trong việc điều trị bệnh viêm gan mãn tính do
virus HBV; thuốc Vân Tinh của Viện nghiên cứu kháng sinh Tứ Xuyên kết hợp với
xí nghiệp Dược phẩm Trùng Khánh dùng để điều trị viêm gan do virus HBV và ung
thư gan đã đạt được hiệu quả tốt; viên nang Vân Chi đa đường của xí nghiệp Dược
phẩm Lão Sơn (Nam Kinh) cũng dùng để điều trị viêm gan B mãn tính và ung thư
gan; Vân Chi khuẩn do xưởng Đông dược Thượng Hải nghiên cứu và ni trồng nấm
từ bã mía và chiết xuất ra polysaccharide để điều trị bệnh viêm gan B mãn tính,…
[15].

Cịn ở Việt Nam, việc nghiên cứu và nuôi trồng nấm Vân Chi cũng đang ngày
càng được quan tâm hơn nhờ các giá trị dược lý của nó. Lê Thị Hồng Yến và cộng
sự (2003) đã phân lập quả thể Vân Chi từ Trung Quốc, sau đó thử nghiệm trên mơi
trường lỏng cho kết quả thu được nấm Vân Chi sinh trưởng tốt nhất trên môi trường
20g bột đậu tương; 20g đường kính; 2,5g (NH4 )2SO4; 2g CaCO3; 1g MgSO4; sinh
SVTH: Đồn Thị Luyến

GVHD: Đặng Minh Nhật
Nguyễn Thị Bích Hằng

10


Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi
Trametes versicolor

khối đạt 16,68 g/l. Tác giả cũng nghiên cứu khả năng sinh trưởng của nấm Vân Chi
trên môi trường xốp, kết quả chỉ ra nấm Vân Chi sinh trưởng tốt trên môi trường 80g
bã rượu; 1g cám gạo; 1 g thạch cao; 1g CaCO3, sau 10 ngày hệ sợi Vân Chi đã sinh
trưởng kín bình ngun liệu, nhanh hơn so với môi trường khác từ 1 – 10 ngày. Ở
Việt Nam cũng có một số sản phẩm từ Vân Chi như bột sinh khối sợi nấm Vân Chi;
quả thể nấm Vân Chi; thực phẩm chức năng Vân Chi Fusi được sản xuất từ bột sợi
nấm Vân Chi; Vân Chi AK từ cao khô nấm Vân Chi và lactose; Vân Chi Tiên Thảo;
Mộc Vân Chi;…với nhiều công dụng khác nhau như hỗ trợ điều trị viêm gan B, hạn
chế quá trình phát triển ung thư gan; hỗ trợ điều trị ung thư vú, ung thư tử cung, u
nang buồng trứng; bồi bổ sức khỏe, tăng cường sức đề kháng của cơ thể,…
1.2. Tổng quan về enzym laccase
1.2.1. Giới thiệu chung về laccase
Laccase (EC 1.10.3.2) là một enzym thuộc nhóm enzym oxy hóa khử, chứa các
nguyên tử đồng (Cu) xúc tác quá trình oxy hóa nhiều hợp chất hữu cơ và vơ cơ khác

nhau. Laccase được mô tả lần đầu tiên bởi Yoshida vào năm 1883 khi ông chiết xuất
từ các dịch tiết của cây sơn mài Nhật Bản Rhus vernicifera. Năm 1896 laccase được
tìm thấy trong nấm bởi Bertrand và Laborde [16].
Enzym laccase xúc tác q trình oxy hóa một electron của nhiều loại chất hữu
cơ và vô cơ, bao gồm diphenol, polyphenol, phenol thay thế methoxy, amin thơm,
ascorbate và cả các hợp chất vơ cơ như iot. Laccase có tính đặc hiệu cơ chất rộng đối
với các hợp chất thơm có chứa các nhóm hydroxyl như mono-, di-, poly-, và methoxyphenol và các amin thơm và béo, hydroxyindoles, benzenethiols, carbohydrat và kim
loại vơ cơ [2],[3]. Do đó laccase có khả năng xúc tác phản ứng chuyển hóa hợp chất
phenol thành các gốc quinin và sau đó oxy hóa chúng thành quinon, ph ản ứng oxy
hóa gắn liền với sự khử phân tử oxy tạo thành nước.
Laccase là một enzym thân thiện với môi trường do trong phản ứng chỉ lấy oxy
từ khơng khí và sản phẩm phụ tạo thành chỉ có nước. Hơn nữa, laccase có hiệu quả
oxy hóa với phổ cơ chất rộng. Do vậy nên nó được áp dụng trong nhiều ngành cơng
nghiệp với những mục đích khác nhau như dệt nhuộm, chế biến thức ăn, nhiên liệu
sinh học, tổng hợp hữu cơ, dược phẩm, công nghiệp mỹ phẩm và xử lý phụ phẩm và
nước thải cơng nghiệp.
Laccase có thể thu nhận từ vi khuẩn, thực vật và côn trùng nhưng với hoạt độ
hạn chế. Các laccase trong nấm được quan tâm nhiều hơn do khả năng xúc tác của
chúng [1]. Các loại laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau rất khác nhau về mức
độ glycosyl hóa, khối lượng phân tử và tính chất động học.
SVTH: Đồn Thị Luyến

GVHD: Đặng Minh Nhật
Nguyễn Thị Bích Hằng

11


Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi
Trametes versicolor

1.2.2. Cấu trúc phân tử của laccase
Vị trí hoạt động của laccase có chứa 4 nguyên tử đồng trong 3 nhóm là T1 (đồng
đơn nhân), T2 (đồng thường) và T3 (đồng nhị nhân). Chúng khác nhau về tính chất
hấp thụ ánh sáng và thế điện tử. Đồng loại 1 (T1) có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh
ở khoảng 600nm tạo màu xanh điển hình của các phản ứng oxy hóa đồng, đồng loại
2 (T2) bình thường chỉ có sự hấp thụ yếu trong vùng ánh sáng khả kiến, trong khi cặp
nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử và có thể được hoạt hóa khi
liên kết với anion mạnh [2].
Hầu hết các laccase từ nấm có bản chất là glucoprotein chứa khoảng 10 – 25%
carbohydrate. Khối lượng phân tử laccase dao động trong khoảng 50 – 100 kDa do
thành phần glycoprotein nấm có thể thay đổi theo thành phần môi trường tăng trưởng
[3].
Cấu trúc không gian ba chiều của phân tử laccase

Hình 1.3. Cấu trúc 3 chiều của laccase từ Melanocarpus albomyces
Các tiểu phần (vùng A: màu đỏ, vùng B: màu vàng và vùng C: màu xanh lá
cây)
Phân tử laccase thông thường bao gồm ba tiểu phần (vùng) chính: A, B và C có
khối lượng tương đối bằng nhau và cả 3 đều đóng vai trị trong q trình xúc tác của
laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và C, trung tâm một nguyên
tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng còn lại nằm ở bề mặt chung
của vùng A và C (Hình 1.3). Trung tâm đồng một chỉ chứa một đồng loại 1 (T1) được
liên kết với một đoạn peptit có hai gốc histidin và một gốc cystein. Sự liên kết giữa
nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cystein (S-Cys) là liên kết cộng hóa trị bền
SVTH: Đồn Thị Luyến

GVHD: Đặng Minh Nhật
Nguyễn Thị Bích Hằng

12


Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi
Trametes versicolor

và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, do đó tạo màu xanh đặc trưng cho enzym
laccase. Trong khi đó, cụm trung tâm ba nguyên tử đồng chứa một nguyên tử đồng
loại 2 (T2) và một cặp đồng loại 3 (T3). Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc
histidin bảo thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin
bảo thủ (Hình 1.4).
1.2.3. Cơ chế xúc tác của laccase
Cơ chế của phản ứng oxy hóa nhờ enzym laccase tương đối đơn giản. Có thể
coi enzym laccase hoạt động như một cục pin, nó lưu trữ các electron từ các phản ứng
oxy hóa riêng lẻ để khử oxy phân tử. Do vậy để khử hồn tồn phân tử oxy thành
nước thì cần phải oxy hóa 4 phân tử cơ chất. Do đó để khử hồn tồn oxy phân tử
thành nước thì q trình oxy hóa bốn phân tử cơ chất khử là cần thiết [3].

Hình 1.4. Trung tâm hoạt động của laccase [17]
Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa
cơ chất. Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1
(Cu 2+) trở thành dạng Cu +, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở
trạng thái khử (Cu +). Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời các
điện tử từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptide bảo
thủ His-Cys-His. Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất
trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nước (Hình 1.5).

SVTH: Đồn Thị Luyến

GVHD: Đặng Minh Nhật

Nguyễn Thị Bích Hằng

13


Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường ni cấy nấm Vân Chi
Trametes versicolor

Hình 1.5. Cơ chế xúc tác của laccase
Cơ chế xúc tác của laccase vẫn có thể xảy ra theo cơ chế đơn giản nhất là cơ
chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm.
Tuy nhiên sản phẩm ban đầu thường không ổn định và có thể bị oxy hóa bởi một
enzym khác hoặc xảy ra phản ứng phi enzym như là phản ứng trùng hợp, phản ứng
hydrat hóa. Ví dụ các liên kết của lignin được phân tách bởi laccase bao gồm q
trình oxy hóa cacbon Cα, phân tách Cα-Cβ và phân tách aryl-alkyl (Hình 1.6)

Hình 1.6. Q trình oxy hóa các tiểu đơn vị phenol của lignin bằng laccase [3]
Tuy nhiên, các phần tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế khử
q lớn, vì vậy chúng khơng thể tiếp cận được trung tâm phản ứng của phân tử
laccase. Trong trường hợp này cần một hợp chất hóa học trung gian. Hợp chất hóa
học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase và bị laccase oxy hóa
thành dạng gốc tự do. Sau đó hợp chất hóa học trung gian ở dạng oxy hóa nhận một
điện tử của cơ chất và trở thành khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác. Ngược lại,
laccase sau khi cho hợp chất hóa học trung gian một điện tử thì trở thành dạng khử
SVTH: Đồn Thị Luyến

GVHD: Đặng Minh Nhật
Nguyễn Thị Bích Hằng

14