Nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn lactic sinh tổng hợp gamma aminobutyric acid và ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------------TRẦN THỊ NGOAN

TRẦN THỊ NGOAN

CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VI KHUẨN LACTIC
SINH TỔNG HỢP GAMMA-AMINOBUTYRIC ACID VÀ ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
Ngành: Công nghệ thực phẩm

KHOÁ 2012B

Hà Nội – Năm 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

Trần Thị Ngoan

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VI KHUẨN LACTIC
SINH TỔNG HỢP GAMMA-AMINOBUTYRIC ACID VÀ ỨNG DỤNG

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Ngành : Công nghệ thực phẩm

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. TS. Nguyễn La Anh
2. PGS. TS. Hồ Phú Hà

Hà Nội – Năm 2014


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa học Thạc sĩ của mình, tơi vơ cùng biết ơn Tập thể các
ng nghệ Sinh học

thầy cô giáo trong Viện
Đại học

ch Kh

H N i

ng nghệ Th c h

- T ƣờng

nhiệt tình truyền ạt kiến thức quý báu và tạo mọi

iều kiện thuận lợi cho tơi trong q trình học tập.
Tơi xin gửi lời cả

ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn La Anh – Chủ nhiệm b môn

Công nghệ Sinh học Vi sinh, Viện Công nghiệp Th c ph m và cô giáo PGS.TS. Hồ
Phú Hà – T ƣờng Đại học Bách Khoa Hà N i, ngƣời

tận tình chỉ bả , hƣớng dẫn

tơi trong suốt q trình nghiên cứu và hồn thành luận văn. T i cũng xin gửi lời
cả

ơn tới các anh chị, cán b , nghiên cứu viên – B môn Công nghệ Sinh học Vi

sinh, Viện Công nghiệp Th c ph

giú

ỡ tôi trong suốt q trình nghiên cứu.
ơn gi

Cuối cùng tơi xin chân thành cả

ình, bạn bè v

ồng nghiệ

ng viên, khuyến khích tơi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Xin chân thành cả

ơn!

Hà Nội, ngày 25/8/2014

Trần Thị Ngoan

i


ỜI
T i xin c

M O N

n, uận văn n y

ết uả nghi n cứu v

c c n i dung nghiên cứu ết uả t ình b y t ng uận văn

t ung th c,

việc củ t i,
ng. Nếu

có bất kỳ vấn ề gì xảy ra, tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm.

Hà Nội, ngày 25 th ng 8 nă
T c giả uận văn

Trần Thị Ngoan

ii

2014


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... i
LỜI

M ĐO N .................................................................................................... ii

MỤC LỤC .............................................................................................................iii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH .................................................................................... viii
BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................... ix
LỜI MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
PHẦN I. TỔNG QUAN .......................................................................................... 3
1.1. Tổng u n về vi hu n ctic ......................................................................... 3
1.1.1. Lịch sử phát hiện .................................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hoá ....................................................................... 4
1.1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic ............ 5
1.1.4. Lợi ích của vi khuẩn lactic ...................................................................... 7
1.2. Tổng u n về

bi tic ................................................................................. 7

1.2.1. Định nghĩa.............................................................................................. 7
1.2.2. Cơ chế tác dụng và vai trò của probiotic ................................................ 8
1.2.3. Tiêu chuẩn lựa chọn chủng probiotic ...................................................... 9
1.3. Tổng u n về G

- Aminobutyric Acid ................................................ 11

1.3.1. Định nghĩa............................................................................................ 11
1.3.2. Hình dạng và cấu trúc của GABA ......................................................... 11
1.3.3. Quá trình tổng hợp GABA trong não .................................................... 12
1.3.4. Cơ chế hoạt động của GABA ................................................................ 13
1.3.5. Chức năng của GABA ........................................................................... 13

iii


1.3.6. Các nguồn sinh tổng hợp GABA ........................................................... 14
1.3.7. Sinh tổng hợp GABA từ vi khuẩn .......................................................... 15
1.4.

gạ ...................................................................................................... 16

1.4.1. Giới thiệu về cám gạo ........................................................................... 16
1.4.2. Lên men vi khuẩn trên mơi trường cám gạo .......................................... 17
PHẦN 2. MƠI TRƢỜNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU .......................... 19
2.1. M i t ƣờng .................................................................................................. 19
2.1.1. Môi trường MRS ................................................................................... 19
2.1.2. Môi trường sinh tổng hợp GABA: Môi trường MRSS ............................ 19
2.1.3. Môi trường nutrient broth ..................................................................... 20
2.2. hủng vi sinh vật ........................................................................................ 20
2.3. Phƣơng h

nghi n cứu ............................................................................. 21

2.3.1. Phương pháp xác định GABA bằng TLC (Thin layer chrotomagraphy) 21

2.3.2. Phương pháp xác định hình thái tế bào bằng soi kính hiển vi ............... 22
2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram ................................................................... 22
2.3.4. Phương pháp xác định kiểu hình lên men.............................................. 22
2.3.5. Phương pháp xác định khả năng lên men ở phổ pH , nhiệt độ............... 22
2.3.6. Kiểm tra khả năng sử dụng đường ........................................................ 23
2.3.7. Phương pháp xác định tên loài bằng trình tự 16S rDNA ....................... 24
2.3.8. Phương pháp xác định khả năng sống trong môi trường dịch dạ dày và
dịch ruột giả lập ............................................................................................. 24
2.3.9. Phương pháp xác định khả năng bám dính ........................................... 25
2.3.10. Xác định phổ tương tác với một số kháng sinh .................................... 26
2.3.11. Kiểm tra khả năng ức chế một số chủng vi sinh vật gây bệnh.............. 28
2.3.12. Phương pháp thu nhận dịch chiết cám gạo (Rice bran extract – RBE) 29

iv


2.3.13. Phương pháp lên men lỏng môi trường MRSS RBE quy mơ phịng thí
nghiệm ........................................................................................................... 29
2.3.14. Xác định GABA bằng phương pháp HPLC ......................................... 29
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 31
3.1. L

chọn chủng vi hu n ctic sinh tổng hợ G

3.2. Đặc iể

hình th i, sinh ý, sinh h

v

................................. 31

ịnh t n chủng N D 3................. 33

3.2.1. Đặc điểm hình thái ............................................................................... 33
3.2.2. Các đặc điểm sinh lý của chủng ............................................................ 33
3.2.3. Khả năng sử dụng các nguồn đường ..................................................... 34
3.2.4. Định tên chủng NCDC3 ........................................................................ 35
3.3. Đ nh gi

hả năng

bi tic củ chủng N D 3 ......................................... 36

3.3.1. Khả năng sống sót trong dịch dạ dày và dịch ruột giả lập .................... 36
3.3.2. Khả năng bám dính trên màng nhầy ruột .............................................. 37
3.3.3. Phổ tương tác với một số kháng sinh .................................................... 39
3.3.4. Xác định khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh .......................... 40
3.4. Ứng dụng chủng Lactobacillus plantarum N D 3 t ng sản xuất th c h
n

en từ dịch chiết c

gạ gi u G

........................................................ 41

3.4.1. Xác định thành phần MRSS thích hợp cho sự sinh tổng hợp GABA....... 41
3.4.2. Lựa chọn mơi trường cám gạo thích hợp cho q trình lên men ........... 43
3.4.3. Ảnh hưởng của Vitamin B6 đến khả năng sinh tổng hợp GABA ............ 44

3.4.4. Xác định pH thích hợp cho q trình lên men ....................................... 45
3.4.5. Xác định nhiệt độ thích hợp cho q trình lên men ............................... 46
3.4.6. Xác định nồng độ MSG thích hợp cho quá trình lên men ...................... 47
3.4.7. Xác định thời gian thích hợp cho q trình lên men .............................. 48

v


3.4.8. Sơ đồ quy trình lên men chủng NCDC3 trên môi trường dịch cám gạo
giàu GABA ..................................................................................................... 50
3.4.9. Xác định GABA trong dịch lên men bằng HPLC ................................... 52
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 56

vi


D NH MỤ BẢNG BIỂU
ảng 2.1. D nh s ch chủng vi hu n ctic nghi n cứu hả năng sinh G
ảng 2.2. Phƣơng h

....... 20

h ng sinh ồ ................................................................... 27

ảng 3.1. Kết uả s ng ọc chủng vi hu n ctic về hả năng sinh GABA ........... 31
ảng 3.2. M t số ặc iể

sinh ý củ chủng N D 3 .......................................... 34

ảng 3.3. Khả năng sử dụng c c nguồn ƣờng h c nh u củ chủng NCDC3 ....... 34
ảng 3.4. Kết uả t ình t gen 16S DN củ chủng N D 3 ............................... 35
ảng 3.5. Khả năng sống sót t ng dịch dạ d y v dịch u t giả ậ ....................... 37
ảng 3.6. Khả năng b

dính t n

ng nhầy u t củ chủng N D 3 ................. 38

ảng 3.7. Phổ tƣơng t c với

t số h ng sinh củ chủng N D 3 ....................... 39

ảng 3.8. Khả năng ức chế

t số vi sinh vật gây bệnh củ chủng N D 3 .......... 40

ảng 3.9. Nồng

MSG v G

t ng dịch lên men ......................................... 54

vii


D NH MỤ HÌNH ẢNH
Hình 1.1. ấu t úc hân tử củ G

.................................................................. 11

Hình 1.2.

.................................................................. 12

n ƣờng tổng hợ G

Hình 3.1. Hình ảnh TL

chọn chủng sinh G

............................................ 32

Hình 3.2. Hình th i chủng N D 3 chụ bằng ính hiển vi iện tử u ng học SEM
.............................................................................................................................. 33
Hình 3.3. Hình ảnh b

dính tế b

N D 3t n

ng nhầy u t in vit

Hình 3.4. Hình ảnh hổ tƣơng t c chủng N D 3 với

t số

............ 38

ại h ng sinh ........ 40

Hình 3.5. Hình ảnh TL dịch n

en t n

Hình 3.6. Hình ảnh TL dịch n

en t n c c

Hình 3.7. Hình ảnh TL dịch n

en hi bổ sung vit

Hình 3.8. Hình ảnh TL dịch n

en tại c c H h c nh u.................................. 46

Hình 3.9. Hình ảnh TL dịch n

en tại c c nhiệt

h c nh u .......................... 47

Hình 3.10. Hình ảnh TL dịch n

en ở c c nồng

MSG ................................. 48

Hình 3.11. Hình ảnh TL dịch n

en ở c c thời gi n. ........................................ 49

Hình 3.12. Mật

tế b

chủng N D 3 t n

Hình 3.13. Sơ ồ uy t ình

n

i t ƣờng MRSS hả s t ................. 42
i t ƣờng c

gạ ...................... 43

in 6 .............................. 44

i t ƣờng MRSS R E .................. 49

en chủng Lb. plantarum N D 3 từ dịch c

gạ

.............................................................................................................................. 51
Hình 3.14. Sắc ý ồ củ G
Hình 3.15. Sắc ý ồ củ

v MSG chu n ................................................... 52
ẫu dịch n

en .......................................................... 53

viii


BẢNG Á

HỮ VIẾT TẮT

DNA

Deoxyribo nucleic Acid

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations

GABA

Gamma - aminobutyric acid

GAD

Glutamic acid decarboxylase

GRAS

Generally Recognized as Safe

HPLC

High performance liquid chromatography

LAB

Lactic acid bacteria

MSG

Monosodium glutamate

MRS

De Man, RoGoSa and Sharbe (Medium for LAB)

NA

Nutrient agar

NB

Nutrient broth

PBS

Phosphate-buffered saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

rDNA

Ribosomal Deoxyribonucleic acid

RBE

Rice bran extract

SEM

Scanning electron microscope

TLC

Thin layer chromatography

WHO

World Health Organization

OD

Optical Density

ix

ỜI MỞ ẦU
Vi khu n

ctic ƣợc coi là an toàn, từ âu

ƣợc ứng dụng r ng rãi trong

nhiều ĩnh v c sản xuất và bảo quản th c ph
ph m lên men truyền thống nhƣ

n

ặc biệt trong sản xuất các sản

en sữa, thịt, rau quả. Hiện n y, c c hƣớng

nghiên cứu về vi khu n lactic ứng dụng cho sản xuất các loại sản ph m chức năng
ng ƣợc quan tâm r ng rãi trên thế

chứa các hợp chất có lợi cho sức khỏe ã và
giới. M t số chủng vi khu n lactic có khả năng

bi tic v sinh tổng hợp gamma-

amino butyric acid.
Hợp chất gamma-aminobutyric acid (GABA) là loại amino acid không tham
gia cấu tạ n n

tein. T ng cơ thể ngƣời GABA có tác dụng là chất iều hòa dẫn

truyền neuron (neurotransmitter) của hệ thống thần inh t ung ƣơng. D vậy các sản
ph m có chứa GABA có tác dụng bổ não và bổ thần kinh, cải thiện giấc ngủ, iều
chỉnh huyết áp, giảm mệt mỏi, tăng cƣờng thể trạng. Gần ây việc nghiên cứu vi
khu n lactic có khả năng sinh tổng hợp GABA

ng ƣợc quan tâm, ví dụ nhƣ m t

số chủng Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc… ƣợc phân lập từ nhiều loại
th c ph m lên men: kim chi Hàn Quốc, paocai và sữ tƣơi Trung Quốc, shochu của
Nhật Bản... Những sản ph m lên men chứa GABA t nhi n n y ƣợc x c ịnh là an
toàn và thân thiện với

i t ƣờng qua bề dầy lịch sử ƣợc sử dụng lâu ời của

chúng.
Vi khu n lactic sinh tổng hợp GABA còn có tác dụng là probiotic khi chúng
sống sót u

ƣờng dạ dày- ru t, và ở ây chúng có tác dụng h trợ hệ tiêu hóa và

sinh tổng hợp GABA in situ. Nhằm tạo ra các sản ph m th c ph m giàu GABA và
có chức năng probiotic, vi hu n ctic ƣợc sử dụng ể n
tiền

nguồn thức ăn, chẳng hạn nhƣ c c hụ h

h

. Mặc dù nhiều chủng vi

h

, tuy nhi n việc nghi n cứu c c
bi tic củ vi hu n

hu n

ctic
ặc

en c c nguy n iệu ẻ

t ng chế biến n ng sản th c

ƣợc hân ậ từ c c nguồn th c
iể

sinh ý sinh hó v

iều cần thiết, bởi vì hồ sơ chủng giống

1

hả năng

hần u n t ọng


t ng c ng nghệ

n

en th c h

cũng nhƣ hi c ng bố sản h

có ặc tính

probiotic. Trong nghiên cứu này, chủng vi khu n probiotic Lactobacillus plantarum
NCDC3 có khả năng sinh tổng hợ G

ƣợc ứng dụng ể thử nghiệm tạo th c

ph m lên men sử dụng nguyên liệu cám gạo. Các nghiên cứu về ặc iểm chủng
giống, khả năng

bi tic của chủng và khả năng sinh tổng hợp GABA trong mơi

t ƣờng dịch trích ly cám gạ

ƣợc khảo sát. Xuất phát từ các vấn ề nêu trên tôi

th c hiện ề tài: “Nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn lactic sinh tổng hợp Gammaaminobutyric acid và ứng dụng”
Mục đích và nội dung của nghiên cứu tập trung vào những vấn đề sau:
- Tuyển chọn chủng vi khu n lactic sinh tổng hợp gamma-aminobutyric acid
- Nghiên cứu ặc iểm chủng giống bao gồm: c c ặc iểm về hình th i, ịnh
tên chủng, ặc iểm sinh lý, sinh hóa của chủng
- Nghiên cứu ặc iểm probiotic của chủng
-

Ứng dụng chủng l a chọn ể

n

en

sản ph m giàu GABA

2

i t ƣờng dịch chiết từ cám gạo tạo


PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic
1.1.1. Lịch sử phát hiện
V

t ƣớc thế kỷ thứ 20 thuật ngữ vi khu n lactic sử dụng ể chỉ những vi

khu n làm sữa chua. Vi khu n lactic có m t vai trò to lớn trong t nhi n cũng nhƣ
t ng ời sống th c tiễn củ c n ngƣời. Th c ph
muối, sữ chu …)

n

en

ctic (dƣ

ƣợc sử dụng r ng rãi trong cu c sống, nhƣng

uối, cà
i ến nă

1780 nhà hóa học ngƣời Thụy iển Scheele mới lần ầu ti n t ch ƣợc lactic acid
(nguyên nhân chính làm chua th c ph m) từ sữa bị lên men chua. Gần m t thế kỷ
s uv

nă

1857 hiện tƣợng làm chua sữa mới ƣợc Pasteur chứng minh là do m t

nhóm vi khu n ặc biệt gọi là vi khu n lactic gây ra. V

nă

1873 Joseph Lister

lần ầu tiên phát hiện ƣợc m t loài vi khu n ặt tên là Bacterium lactic (hiện nay
gọi là Lactococcus lactic) là vi khu n lactic. Từ những nghiên cứu trên ngƣời t
ƣ

những iểm chung về vi khu n lactic: là những vi khu n G

dƣơng, bất

ng và không sinh bào tử, là loại vi khu n kị khí tùy nghi, có khả năng n
hí cũng nhƣ hiếu khí và có khả năng n

chịu

ng cao với

en ị

en ƣờng ể tạo acid lactic, có khả năng

i t ƣờng acid. Có hoạt tính protease thủy phân protein của sữa

thành peptide và acid amin, hoạt tính này ở các lồi là khác nhau, th ng thƣờng tr c
khu n là cao nhất. Đặc biệt có khả năng sinh chất h ng sinh ể ức chế vi sinh vật
gây bệnh. Từ ó ến nay hàng loạt các vi khu n

ctic

ƣợc phát hiện và những

ứng dụng củ chúng ng y c ng ƣợc mở r ng ra nhiều ĩnh v c [2, 4, 7].
Trong t nhiên, vi khu n lactic phân bố r ng rãi trong các sản ph m lên men
chua th c vật, sữa, thịt, ồ uống… Ngoài ra vi khu n

ctic cũng ƣợc tìm thấy

trong niêm mạc miệng, niêm mạc ru t của ngƣời, gia súc, gia cầm.
Ngày nay với kỹ thuật công nghệ hiện ại con ngừơi
hình d ng, ích thƣớc, cấu tạ v

i u tả

hơn về

ặc iểm sinh lý, sinh hóa của vi khu n lactic.

3


1.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hoá
Vi khu n lactic là vi khu n G
chịu ƣợc axit, chuyển hó

dƣơng, h ng sinh bào tử, h ng di

ng,

ƣờng thành acid lactic. Chúng thu nhận năng ƣợng

nhờ phân giải carbohydrate và sinh ra acid lactic. Acid lactic sinh ra có thể ở dạng
D(-), L(+) hay DL. Khác với m t số vi khu n h c nhƣ vi hu n ƣờng ru t cũng
sinh ra acid lactic thì tất cả các vi khu n

ctic ều là vi khu n lên men bắt bu c

không chứa các cytochrome và enzyme catalase. Chúng là các vi khu n kị khí
khơng bắt bu c. Khu n lạc của vi khu n lactic trịn nhỏ, bóng, có
màu trắng

ục hoặc vàng kem. Vi khu n

ctic

u

i t ƣờng,

ƣợc xếp chung vào họ

Lactobacillaceae. Các chi chính bao gồm Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus,
Streptococcus, Lactococcus. Ng i
Enterococcus,

Vagococcus,

cịn có c c chi h c nhƣ Carnobacterium,

Aerococcus,

Alloiococcus,

Tetragenococcus,

Atopobium… [69].
Vi khu n lactic có khả năng sinh t ƣởng tốt t ng
hiếu hí. Năng ƣợng dùng ể t

i t ƣờng kị khí và vi

ổi chất có ƣợc là nhờ quá trình lên men các

carbohydrate. Acid lactic ln là sản ph m cuối cùng của q trình lên men. Ngoài

ra m t số loài của Lactobacillus, Leuconostoc hoặc Streptococcus có khả năng tạo
hƣơng, sinh

di xety h ặc acetoin. Ở phần lớn vi khu n, acetoin ƣợc sinh ra từ

pyruvate và vì vậy là sản ph m củ

u t ình t

ổi carbohydrate. Ở vi khu n

lactic rất ít t ƣờng hợp acet in ƣợc hình thành có nguồn gốc từ carbohydrate nếu
nhƣ h ng có nguồn pyruvate bổ sung. Thƣờng pyruvate này có nguồn gốc từ
citrate. Đây

u t ình

n

en ị khí citrate ở vi khu n lactic. Tuy gọi là lên men

nhƣng th c ra citrate h ng ƣợc sử dụng nhƣ
dùng

ể tạo ra các sản ph

Lactobacillus lên men dị hình t ng
diaxetyl mặc dù tr ng

t

t nguồn năng ƣợng mà chỉ

ổi chất. M t số loài Leuconostoc và
i t ƣờng trung tính khơng tạo ra acetoin hoặc

i t ƣờng này chúng vẫn sử dụng citrate. Tuy nhiên trong

i t ƣờng acid các loại này lại tạo ra m t ƣợng

ng ể acetoin [2, 4].

Mặc dù vi khu n lactic có thể phát triển ƣợc t n

i t ƣờng hiếu hí nhƣng

chúng khơng thu nhận năng ƣợng nhờ q trình hơ hấp. Chúng khơng tổng hợp
4


ƣợc nhân hem, do khơng có cytochrome hay những enzyme chứa nhân hem khác.
Chúng có thể tiến hành m t số phản ứng oxy hố m t số ít các hợp chất hữu cơ
khác nhờ flavoprotein. Các phản ứng này không kèm theo việc tổng hợp ATP.
Riêng ở vi khu n lactic tuy catalase âm tính song lại có m t enzyme khác là
peroxidase bản chất là flavoprotein. Enzyme này là trung gian xúc tác quá trình oxy
h

c c cơ chất hữu cơ dƣới tác dụng của H2O2. Nhờ ó vi hu n lactic vẫn có khả

năng sinh t ƣởng t ng

i t ƣờng hiếu hí. Đây cũng

dạng vi khu n lactic vì chúng gần nhƣ

ặc iể

uý b u ể nhận

những vi khu n catalase âm tính duy nhất

có khả năng sinh t ƣởng khi có mặt oxy.
Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khu n l ctic cũng ất phức tạp, tuỳ theo ặc iểm
từng

i

h c nh u. D

ó

i t ƣờng ể nuôi cấy vi khu n l ctic thƣờng chứa

pepton (cao thịt, cao nấm men) và các dịch chiết từ th c vật hoặc
M t số ặc iể

ng vật khác.

sinh ý iển hình nữa của vi khu n lactic là khả năng chống

chịu acid rất tốt. Những vi khu n lactic hình cầu có thể sinh t ƣởng trong mơi
t ƣờng pH trung tính hoặc hơi iềm, vi khu n hình que khơng có khả năng chịu mơi
t ƣờng có pH lớn hơn 6. Vi khu n lactic có khả năng chịu H

i t ƣờng ạt giá trị

5. Đặc tính sinh acid và chịu acid rất tốt giúp vi khu n lactic cạnh tranh với vi
khu n h c t ng

i t ƣờng gi u dinh dƣỡng v d

của nhóm vi khu n t ng gi i

ó chúng

ại diện tiêu biểu

ạn cuối của quá trình lên men [2, 4].

Tuỳ thu c phạm vi nhiệt

sinh t ƣởng của vi khu n

ctic, ngƣời ta chia

chúng thành hai loại:
- Vi khu n

ctic ƣ ấm (mesophile): có thể sinh t ƣởng trong khoảng nhiệt

10 - 350C.
- Vi khu n ctic ƣ nhiệt (thermophile): có thể chịu nhiệt

450C.

1.1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic
 Ảnh hưởng của oxy
Vi khu n lactic thu c nhóm hơ hấp tuỳ tiện, từ kị hí ến vi hiếu hí. Đặc
iểm này bị uy ịnh bởi s khơng có mặt của hệ enzyme oxy hoá - khử cytochrome và
5


catalase trong tế bào. Q trình oxy hố ở vi khu n lactic xảy
thành H2O2. Ảnh hƣởng của oxy

thƣờng kèm theo s hình

i hi cịn hụ thu c cả vào nhiệt

.

 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt
v

t t ng những yếu tố u n t ọng ảnh hƣởng tởi s sinh t ƣởng

h t t iển củ vi hu n

enzyme t ng tế b

tăng nh nh, d

nh nh n. Mặt h c, c c
cả

với nhiệt

ctic. Khi nhiệt

c

gi tăng, làm cho c c hản ứng củ

ó s sinh t ƣởng củ vi sinh vật cũng tăng

tein, nuc eic cid v c c chất h c t ng tế b

v có thể t ở n n bất

ng. D

ó th ng thƣờng nếu nhiệt

tăng dần thì s tăng t ƣởng v biến dƣỡng củ vi sinh vật cũng tăng the
nhiệt

nhất ịnh thì tất cả dừng ại. Nếu nhiệt

củ vi sinh vật sẽ xuống ến

tăng c

ến

hơn nữ thì h ạt

t
ng

ức h ng.

có ảnh hƣởng rất lớn ến hoạt

Nhiệt

sẽ nhạy

ng của vi khu n lactic. Khoảng

phát triển của vi khu n lactic khá r ng: m t số lồi có thể phát triển ở 550C

nhiệt

trong khi m t số khác có thể phát triển ƣợc ở 50 . Nói chung
có thể phát triển trong khoảng nhiệt

từ 150

số vi khu n lactic

ến 400C.

 Ảnh hưởng của pH
ng của vi khu n

Hoạt
ng mạnh củ

H. D

ó

ctic, ặc biệt là hệ enzyme của chúng chịu tác

H ảnh hƣởng ến u t ình t

ổi chất của tế bào

vi khu n lactic. Mỗi giống vi khu n lactic khác nhau thì có pH tối thích khác nhau.
D a vào pH tối thích
nhó

ƣ

ngƣời ta chia vi khu n lactic thành hai nhóm sinh hố là

cid (acidophile) và nhóm kị acid (alkaliphile).

- H củ

i t ƣờng có ảnh hƣởng t c tiế

ến s

h t t iển v

sinh tổng hợ enzyme củ vi sinh vật bởi i n H+ và OH- t ng
t c tiế
ứng v

n
tế b

ng nguy n sinh chất
v vận chuyển enzy e

hả năng

i t ƣờng t c

ng

th y ổi s vận chuyển củ cơ chất cả
ng i

i t ƣờng.

- Mặt h c i n H+ và OH- cũng ảnh hƣởng ến hệ enzy e củ vi sinh vật,
th

gi v

h ạt

ng sống, sinh tổng hợ củ vi sinh vật. S

6

h t t iển củ vi sinh


vật chỉ có thể ất nghi

ngặt ở cid h y iề . Đối với vi khu n thuận ợi nhất

chúng h t t iển t ng

i t ƣờng t ung tính h ặc iề

yếu [2, 4, 7].

1.1.4. Lợi ích của vi khuẩn lactic
Vi hu n

ctic ƣợc ứng dụng

ng

i t ng ất nhiều ĩnh v c, ặc biệt

t ng c c ng nh nhƣ: c ng nghiệ chế biến sữ , c ng nghiệ sản xuất cid lactic,
c ng nghiệ chế biến bả

uản

u uả v thức ăn gi súc.

T ng c ng nghiệ chế biến sữ chu , h
u n t ọng v tạ hƣơng vị ch sản h

.

t, vi hu n

c chủng vi hu n n

xuất sữ chu nhƣ: Streptococcus, S. cremoris. Sữ
nhờ

ctic óng v i t ị

ƣợc

en ctic ể sản

chín tạ th nh h

t

t số chủng vi hu n nhƣ: Streptococcus lactic, S. cremoris, Lactococcus

casei. M t số vi hu n tạ hƣơng vị ch sản h

nhƣ: Streptococcus citrococcus, S.

parcitrovorus.
Vi hu n

ctic còn ƣợc ứng dụng t ng việc bả vệ sức hỏe c n ngƣời

nhƣ tăng cƣờng tính

iễn dịch,

giả

ƣợng ch este

t ng

u, chống ung

thƣ v tăng cƣờng cạnh t nh dinh dƣỡng với vi sinh vật gây bệnh. Ng i
hu n
G
bả

ctic cịn có hả năng sinh bacteriocin, có hả năng ức chế c c vi hu n
(+), nhờ ặc tính n y

uản th c h

vi hu n ctic ƣợc sử dụng ất hiệu uả t ng vi c

ể é d i thời gi n sử dụng [7].

hính vì có nhiều ợi ích n n vi hu n
tâ

vi

nghi n cứu v tì

hợ G

nhiều ặc tính

ctic ƣợc nhiều nh

ới nhƣ có hả năng

h

học u n

bi tic v sinh tổng

.

1.2. Tổng quan về probiotic
1.2.1. Định nghĩa
Theo ngôn ngữ Hi Lạ ,
bi tic ƣợc P

e

bi tic có nghĩ

ề nghị sử dụng lần ầu tiên v

“vì s
nă

sống”. Thuật ngữ

1974 ể chỉ “những vi

sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ƣờng ru t” [20]. Từ ó ến nay
thuật ngữ

bi tic

ƣợc cả thế giới sử dụng ể chỉ những chế ph m vi sinh vật

sống hữu ích hi ƣợc ƣ v

cơ thể

ng vật thông qua thức ăn h ặc nƣớc uống

7


tạo nên những ảnh hƣởng có lợi cho vật chủ. Kể từ khi xuất hiện, khái niệm
probiotic vẫn chƣ có

t ịnh nghĩ thống nhất. Tuy nhiên, hiện có h i ịnh nghĩ

ƣợc cho là phản nh h

ầy ủ bản chất củ

bi tic v

trong các ấn ph m khoa học: (i) theo Fuller 1989 [20],

ƣợc sử dụng nhiều

bi tic

“chất bổ sung vi

sinh vật sống vào thức ăn giú cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ƣờng tiêu hóa theo
hƣớng có lợi cho vật chủ”; (ii) the tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là
“các vi sinh vật sống hi ƣ v
e

cơ thể the

ƣờng tiêu hoá với m t số ƣợng ủ sẽ

ại sức khoẻ tốt cho vật chủ” [17].

1.2.2. Cơ chế tác dụng và vai trò của probiotic
Để hiểu ƣợc về lý do tại sao probiotic lại có tác dụng ối với sức khỏe,
t ƣớc hết phải hiểu về sinh lý, vi sinh vật ƣờng dạ dày - ru t và q trình tiêu hóa.
Q trình tiêu hóa bắt ầu ngay lập thức khi thức ăn i v

iệng rồi tới dạ dày;

còn vi sinh vật ƣờng dạ dày - ru t (gastrointestine- GI) có thể là có lợi, có hại và
trung tính.
Vi sinh vật trong ru t non và ru t già hồn thành nốt q trình tiêu hóa. M t
số vi sinh vật có khả năng sản xuất vitamin và chúng là vi khu n có ích. S t

ổi

chất của chúng khơng phải là q trình làm thối rữa, s có mặt của chúng liên hệ
mật thiết với hệ vi sinh vật ƣờng ru t khỏe mạnh. Việc duy trì ổn ịnh hệ vi khu n
ƣờng ru t có vai trị quan trọng trong bảo vệ sức khỏe, phịng ngừa bệnh tật. Vai
trị chính của hệ vi sinh vật ƣờng ru t khỏe mạnh

: ngăn cản s thâm nhập và

phát triển vi sinh vật gây bệnh, tăng sức ề kháng t nhiên với các bệnh truyền
nhiễm củ

ƣờng tiêu hóa. Những sản ph m củ

u t ình t

ổi chất (acid lactic,

acid acetic và các acid béo mạch ngắn dễ b y hơi) có t c dụng giả
do vậy tạ

H ƣờng ru t,

iều kiện không thuận lợi cho vi khu n gây hại. Probiotic cịn có vai trị

bảo vệ chất nhầy ƣờng ru t nhờ s tổng hợp và tiết ra các peptide có tính kháng
khu n,

ucins, d

ó ngăn chặn s bám dính của vi sinh vật gây bệnh với biểu bì

ru t.

8


Đƣờng dạ dày- ru t có bề mặt lớn phủ chất nhầy, óng v i t ị

cầu nối

giữ “n i cơ thể” v “ng ại cơ thể”. Nhƣng vi sinh vật cƣ t ú bình thƣờng trong
ƣờng dạ dày - ru t

tăng cƣờng vai trò cản lọc củ

ƣờng dạ dày - ru t, làm

giảm s di chuyển ến bề mặt ƣờng dạ dày- ru t cũng nhƣ s

i qua của vi khu n,

kháng nguyên từ ru t vào máu. Vai trị này có tác dụng làm giảm nhiễm trùng và
giảm dị ứng với kháng nguyên trong th c ph m.
Các vi sinh vật v c c h ng nguy n cƣ t ú t n bề mặt nhầy củ
dày - ru t, hoặc i u

ƣờng dạ

ƣờng dạ dày- ru t ể tƣơng t c với các thành phần của hệ

miễn dịch. S tƣơng t c n y óng v i t ị ti n uyết ể kích thích hệ miễn dịch hoạt
ng tối thích. Hệ vi sinh vật ru t ổn ịnh có tác dụng tăng cƣờng sức ề kháng của
hệ dạ dày - ru t, kích thích sản xuất IgA dạng nhầy, kích thích việc sản sinh tại chỗ
các cytokines chống viêm nhiễm và giảm s sản sinh ra loại cytokines tiền viêm,
ặc t ƣng ch

u t ình vi

nhiễm dị ứng [57]. Qua cu c khảo sát về những

nghiên cứu i n u n ến việc sử dụng probiotic trong dị ứng thức ăn, vi

d di

truyền (atopic dermatitis), và phòng ngừa tiền khởi trong dị ứng di truyền (atopy),
kết quả cho thấy iều trị bằng probiotic làm giảm s viêm dị ứng cũng nhƣ có t c
dụng phịng ngừa tiền khởi trong dị ứng di truyền d a trên những triệu chứng lâm
sàng; làm giảm những dấu hiệu viêm tại chỗ cũng nhƣ t n t n cơ thể [50].
Qu t ình t

ổi chất của vi sinh vật ƣờng ru t cung cấp nguồn năng

ƣợng quan trọng cho thành ru t, cung cấ

ến 50% năng ƣợng hàng ngày cho tế

bào biểu mô ru t kết (colonocytes) bằng cách lên men carbohydrate thành acid hữu
cơ, chủ yếu

buty te, t ng t ƣờng hợp trẻ em bú mẹ là lactate. Những ích lợi rõ

ng ối với sức khỏe do probiotic mang lại là giảm các triệu chứng về suy hấp thụ
lactose, kích thích tiêu hóa, kìm hãm chất gây ung thƣ v giả

h

ƣợng

cholesterol trong máu [14].
1.2.3. Tiêu chuẩn lựa chọn chủng probiotic
Việc

chọn c c chủng vi sinh vật với ti u chu n ầu ti n

hải n t n

ch sản xuất v ứng dụng, có hả năng sống sót v tồn tại ƣợc t ng ƣờng ti u

9


hó vật chủ.

c ti u chu n

chọn n y ƣợc hợ

ý hó th ng u c c thí nghiệ

in vitro, từ ó sẽ tuyển chọn ƣợc c c chủng có tiề
c chủng vi sinh vật
• Tính b
chủng

bi tic ƣợc

dính t n bề

bi tic hải b

năng

bi tic [18].

chọn the c c ti u chu n chủ yếu s u:

ặt ƣờng ti u hó h ặc c c tế b

dính ƣợc v

biểu

:

c

th nh u t n n, hƣ t ú tốt v sinh s i n y

nở t ng ƣờng ti u h . Khả năng b

dính ƣợc xe

t y u cầu u n t ọng

ể tăng hả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, bả vệ biểu
iễn dịch củ vật chủ. Đặc tính n y

v tăng hả năng

tăng hả năng cạnh t nh củ c c chủng

bi tic với c c vi sinh vật bất ợi h c.
• H ạt tính h ng hu n chống ại c c vi hu n gây bệnh: L
c c chủng có hả năng sản sinh c c chất h ng hu n

t ng h t t iển

bi tic.

c chủng

chọn ƣợc

ặc tính u n t ọng nhất

bi tic cần có h ạt tính ức chế vi hu n gây

bệnh nhƣ E. coli, Salmonella và Campylobacteria….. H ạt tính h ng hu n củ
chúng có thể the nhiều cơ chế h c nh u nhƣ:
+ Sản sinh
+L
+ Tạ
+L

c c chất b cte i cin

giả

H bởi tạ

cid ctic

H 2 O2
giả

c tố the c c cơ chế h c nh u

+ Khả năng

giả

s b

dính củ c c vi hu n gây bệnh t n bề

ặt

+ ạnh t nh dinh dƣỡng với c c vi hu n gây bệnh.
• Khả năng tồn tại t ng
củ vật chủ
(

y se,

nơi có

i t ƣờng cid dạ d y: Kh ng

i t ƣờng cid H từ 2-3 v có

te se, ys zy e…).

iệng v dạ d y

ặt c c enzy e ti u h

c chủng vi sinh vật ƣợc c i nhƣ

probiotic phải tồn tại ƣợc t ng iều iện n y. Hiện n y c c c ng ty
dùng vỏ bọc ( ic c su e) với chế h
vi hu n

bi tic hi i u

• Khả năng chịu
ng vật d

uối

h ng

bi tic nhằ

huyến c

tăng hả năng sống củ

iệng v dạ d y.

ật: Th ng thƣờng,

ng 1-3% [53]. Để tồn tại v

hả năng tồn tại v

nguồn

h t t iển với nồng

ật t ng dịch ti u h

h t t iển, c c chủng
uối

10

uối

ật ≥ 2%, ng i

củ

bi tic hải có
t số chủng


bi tic h c nhƣ Bacillus, Lactobacillus cũng có hả năng sinh enzy e tiêu hoá
nhƣ:

y se, ce u se v

chủ ti u h

te se, i se v

hyt se, chúng có hả năng hỗ t ợ vật

thức ăn v hấ thu chất dinh dƣỡng.

1.3. Tổng quan về Gamma - Aminobutyric Acid
1.3.1. Định nghĩa
Gamma - aminobutyric acid, viết tắt là GABA, là m t amino acid không
tham gia cấu tạ n n

tein v

ƣợc phân bố r ng rãi trong t nhiên [66].

Tên IUPAC: 4-aminobutanoic acid
Công thức phân tử: C4H9NO2
Khối ƣợng phân tử: 103,12 g/mol
Điểm nóng chảy: 203,70C (4770K, 3990F)

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của GABA
GABA là chất ức chế dẫn truyền thần kinh chính trong hệ thống thần kinh
t ung ƣơng ở

ng vật có vú [68]. Là m t loại amino acid không thể thiếu ối với

cơ thể ể ảm bảo duy trì s hoạt

ng bình thƣờng của não b

ặc biệt là các

neuron thần kinh [35].
1.3.2. Hình dạng và cấu trúc của GABA
GABA có cấu trúc gồm 4 cacbon. Nhóm cacbon cho proton và nhóm amin
nhận proton (hình 1.1). Hình dạng của GABA phụ thu c nhiều vào iều kiện mơi
t ƣờng. Trong trạng thái khí, GABA cu n lại nhiều lần thành hình gấp húc ể tạo
ra l c hút tĩnh iện giữa hai nhóm chức amin và carbon. The tính t n ƣợng tử
hóa học thì ể phá vỡ cấu trúc này cần m t năng ƣợng khoảng 50 kcal/mol. Ở trạng
11


thái rắn, GABA có hình dạng mạch thẳng, với m t cấu trúc dạng trans ở nhóm amin
cuối và dạng cis ở nhóm carboxyl kết thúc. Ở dạng lỏng GABA tồn tại ở nhiều dạng
cấu trúc khác bao gồm dạng gấp khúc, dạng mạch thẳng. Chính nhờ khả năng tồn
tại ở nhiều dạng cấu trúc khác nhau này tạo cho GABA có nhiều chức năng sinh
học quan trọng [35, 37].
1.3.3. Quá trình tổng hợp GABA trong não
G

ƣợc tổng hợp từ acid L-glutamic nhờ hoạt

ng của enzyme glutamic

acid decarboxylase (GAD) và pyridoxal phosphate (dạng hoạt
thông qua m t c n ƣờng t

ng của vitamin B6)

ổi chất ƣợc gọi là GABA shunt.

Hình 1.2.

n ƣờng tổng hợp GABA

GABA shunt là m t nhánh tắt của chu trình Krebs. Các GABA shunt là m t
q trình khép kín với hai mục ích sản xuất và bảo tồn nguồn cung cấp GABA.
Glucose là tiền chất chính ể sản xuất G
cid

in cũng h ạt

ng nhƣ

t ng cơ thể, mặc dù pyruvate và các

tiền chất.

ƣớc ầu tiên trong GABA shunt là

chuyển hóa amin củ α- et g ut

te ( ƣợc hình thành từ s chuyển hóa glucose

trong chu trình Krebs) nhờ G

α-oxoglutarate transaminase (GABA-T) thành

acid L-glutamic. Tiếp theo GAD xúc tác chuyển hóa acid L-glutamic thành GABA.
G

ƣợc chuyển hóa bởi GABA-T ể tạ th nh se i dehyde succinic. Để bảo

12


tồn nguồn cung cấp sẵn của GABA, quá trình chuyển hó

in thƣờng xảy ra khi

hợp chất b n ầu α-ketoglutarate chấp nhận các nhóm amin tách ra từ G
hình thành lại acid glutamic. Vì vậy, m t phân tử G

ể

ƣợc hình thành chỉ khi

m t phân tử tiền thân ƣợc hình thành. Succinic semialdehyde có thể bị oxy hóa bởi
Succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH) th nh succinic cid v s u ó có
thể tái nhập lại chu trình Krebs hồn thành các vòng lặp [37, 62].
1.3.4. Cơ chế hoạt động của GABA
Khi ức chế dẫn truyền thần kinh t ng n , G

t c

ng ảnh hƣởng của

nó bằng cách gắn vào hai thụ thể riêng biệt, GABAA và GABAB. Các thụ thể
GABAA thu c họ thụ thể i n dinh dƣỡng có m t phần vai trị trong việc sát nhập
các protein. Khi GABA gắn vào thụ thể GABAA trên màng tế bào thần kinh kích
hoạt mở kênh ion Cl- ƣ

ến s c c màng gây ức chế. Các loại thuốc chống lo âu

của họ benzodiazepine, gây hiệu ứng nhẹ nhàng bằng c ch tăng i

c giữa thụ thể

GABAA và GABA. Các thụ thể GABAB thu c họ thụ thể chuyển hó dinh dƣỡng,
có cấu trúc gần giống cấu trúc thụ thể chuyển hóa glutamate. Thụ thể GABAB trú tại
tiền synap và hậu synap dẫn tới mở
iv

t ng tế b ,

nh

nh i n ch

ng iện tích dƣơng

hé

nh i n

ng iện tích âm

ng i tế bào. Quá trình này tạo ra

iện thế âm ở trên màng tế bào dẫn tới vị t í n y thƣờng xuyên ở trạng thái phân c c
rất mạnh [35, 37].
1.3.5. Chức năng của GABA
GABA là m t loại amino acid không thể thiếu ối với cơ thể ể ảm bảo duy

trì s hoạt
cản s hoạt

ng bình thƣờng của não b

ặc biệt là các neuron thần inh. Nó ngăn

ng thái quá của những neuron thần kinh nhất ịnh tại hệ thống thần

kinh t ung ƣơng v ức chế s lan truyền của các tế bào dẫn truyền ể tăng cƣờng
cả

gi c thƣ th i t ng hệ thần kinh. Chất ức chế dẫn truyền n y thƣờng ƣợc biết

ến nhƣ

t liều thuốc an thần t nhi n d cơ thể t sản sinh giú thƣ gi n thần

kinh và có giấc ngủ ngon. Cùng với ni cin

ide v in sit , G

ngăn căn cản

các truyền dẫn căng thẳng và bất n ến vùng thần inh t ung ƣơng bằng việc chiếm

13


giữ các vùng tiếp nhận tin của các tế bào này, khống chế các vùng tiếp nhận tin. Vì

thế, G

giú ch cơ thể ƣợc cả

gi c thƣ gi n, giú ngủ ngon, giảm huyết áp

và an thần [26, 56, 68].
1.3.6. Các nguồn sinh tổng hợp GABA
G
củ c c

ƣợc phân bố r ng rãi trong t nhiên. GABA có nhiều nhất trong não
ng vật có vú. Các thụ thể G

ƣợc tìm thấy t ng cơ thể c n ngƣời,

bao gồm cả não, hệ thống thần inh t ung ƣơng, hổi, g n, ƣờng tiêu hóa, tinh
trùng, tinh hồn, tuyến vú, và các tế bào khối u gan [40]. Ngoài ra GABA còn tồn
tại với m t ƣợng thấp trong m t số loại th c vật, ngũ cốc nhƣ mầm cám gạo, giá
ỗ, ậu tƣơng, cà chua, chuối,

u bin ,

chè x nh… G

cũng ƣợc tìm thấy ở

m t số vi sinh vật nhƣ m t số chủng vi khu n lactic, nấm men, nấm mốc [39, 49,
54, 66].
Sau khi phát hiện ra các chức năng u n t ọng của GABA thì việc nghiên

cứu ứng dụng sản xuất GABA rất ƣợc quan tâm. Mặc dù G
h

ƣợng lớn t ng n

trong sản xuất. H

ƣợc tìm thấy với

ng vật có vú, những nguồn này không thể áp dụng ƣợc

ƣợng GABA sinh tổng hợ

ƣợc trong th c vật thì thấp. Vì

vậy nguồn sinh tổng hợp GABA từ vi sinh vật chiếm nhiều ƣu iể
là vi sinh vật ầu ti n ƣợc ứng dụng trong sản xuất G

hơn cả. E. coli

, nhƣng có u nhiều

hó hăn v nguy hiểm tồn tại trong quá trình lên men bởi E. coli. M t số chất

c

trong quá trình tổng hợp GABA bởi chủng E. coli là nguyên nhân gây m t số bệnh
ở ngƣời [49]. Do vậy, các nhà nghiên cứu
khác có khả năng sinh tổng hợ G

nỗ l c tìm kiếm ra nguồn vi sinh vật

n t n hơn. ụ thể là m t số chủng vi sinh

vật phổ biến và an toàn bao gồm các chủng vi khu n lactic (LAB). Chúng ƣợc
nghiên cứu r ng rãi và ứng dụng trong sản xuất GABA trong những nă

gần ây.

T ng ó Lactobacillus brevis, Lb. paracasei, Lb. plantarum, Lc. lactis là những
chủng vi khu n lactic ƣợc nghiên cứu và ứng dụng ể sản xuất th c ph m giàu
G

v dƣợc ph m tổng hợp GABA.

14