Khảo sát tác dụng kháng u da của cao toàn phần ethanol từ lá tía tô perilla frutescens lamiaceae trên chuột nhắt trắng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VƯU THANH TÚ QUYÊN

KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG U DA CỦA CAO TOÀN
PHẦN ETHANOL TỪ LÁ TÍA TƠ PERILLA FRUTESCENS
LAMIACEAE TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2017


BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VƯU THANH TÚ QUYÊN

KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG U DA CỦA CAO TOÀN PHẦN
ETHANOL TỪ LÁ TÍA TƠ PERILLA FRUTESCENS LAMIACEAE
TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG
Chun ngành: Dược lý – Dược lâm sàng
Mã số: 60720402

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn: PGS.TS. Huỳnh Ngọc Trinh

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2017


Luận văn Thạc sỹ - Niên khóa: 2015 – 2017
Chuyên ngành: Dược lý – Dược lâm sàng
KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG U DA CỦA CAO TỒN PHẦN ETHANOL TỪ
LÁ TÍA TÔ PERILLA FRUTESCENS LAMIACEAE TRÊN CHUỘT NHẮT
TRẮNG

Vưu Thanh Tú Quyên
Người hướng dẫn: PGS.TS. Huỳnh Ngọc Trinh
Mục tiêu
Khảo sát tác dụng dự phịng và điều trị u da của cao tồn phần ethanol từ lá Tía tơ
trên mơ hình gây u da hai giai đoạn bằng hóa chất. Đồng thời tiến hành kiểm
nghiệm dược liệu Tía tơ bằng phương pháp vi học và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho
cao toàn phần Tía tơ.
Phương pháp nghiên cứu
Tồn thân cây Tía tơ được quan sát, phân tích đặc điểm và tiến hành vi phẫu các bộ
phận thân, lá và cuống lá. Cao tồn phần Tía tơ được chiết xuất từ bột lá với ethanol
50%. Flavonoid có trong cao Tía tơ được định tính bằng SKLM và định lượng bởi
HPLC pha đảo, đầu dị PDA tại bước sóng 300 nm. Khảo sát tác dụng dự phịng và
điều trị của cao Tía tơ 10% trên mơ hình chuột gây u bằng 7,12dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) và croton oi với DMBA được bôi 1 lần duy
nhất, croton oil được bơi cách đó 2 tuần với tần suất 2 lần/tuần trong thời gian 20
tuần.
Kết quả
Kết quả định tính SKLM cho thấy cao tồn phần Tía tơ có chứa acid rosmarinic và

luteolin. Bằng phương pháp định lượng HPLC với đầu dị PDA, tính được hàm
lượng acid rosmarinic và luteolin lần lượt là 1.178 ± 0.011 % (w/w) và 0.105 ±
0.001 % (w/w). Cao Tía tơ 10% đã khơng làm thay đổi tỷ lệ chuột u, số khối u trung
bình nhưng đã làm chậm sự xuất hiện khối u 2 tuần và làm giảm thể tích khối u có ý
nghĩa thống kê so với lô chứng glycerin 5%. Trong thử nghiệm đánh giá tác động
điều trị, cao Tía tơ 10% không làm giảm tỷ lệ chuột u, số khối u trung bình và thể
tích trung bình khối u so với lơ bệnh.
Kết luận
Cao tồn phần ethanol từ lá Tía tơ Perilla frutescens đã cho thấy hiệu quả dự phịng
nhưng khơng thể hiện được tác động điều trị u da trên chuột nhắt trắng.


Master’s thesis – Academic course: 2015 – 2017
Speciality: Pharmacology – Clinical Pharmacology
ANTI-TUMOR EFFECT OF ETHANOLIC EXTRACT FROM LEAVES OF
PERILLA FRUTESCENS LAMIACEAE IN MOUSE SKIN

Vuu Thanh Tu Quyen
Supervisor: Assoc Prof. Dr. Huynh Ngoc Trinh
Background
This study aimed to investigate the antitumor effects of Perilla leaf extract (PLE) in
a two-stage chemical carcinogenesis protocol in mice. We also evaluates the effect
of PLE on normal mouse skin. Morevoer, we analysed perilla plant by microscopic
method and formed pharmacopoeial standards of PLE.
Methods
A whole plant of perilla was observed, analysed by microscopic method. Total
extract of Perilla leaves was obtained by percolation method using 50% ethanol.
The identification of PLE was performed by thin layer chromatography (TLC) with
normal phase of silica gel F254 and HPLC-PDA with reversed phase of C18 column
at UV 300 nm. The cutaneous tumors were initiated by the a single application by

7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) on the dorsal shaved skin, then promoted
by repeated applications of croton oil during 20 weeks
Results
The TLC chromatogram for the studied extract highlighted the presence of
rosmarinic acid and luteolin. By means of HPLC-PDA analysis, the content of
rosmarinic acid and luteolin were found in amounts of 1.178 ± 0.011 % (w/w) and
0.105 ± 0.001 % (w/w), respectively. In the preventing effect experiment, the PLEtreated group prolonged the latency period of tumor appearance up to 2 weeks and
also significantly reduced average tumor volume in dorsal skin of mice compared
with untreated group. In the treated effect experiment, PLE did not change the
tumor incidence, tumor burden and average tumor volume.
Conclusion
The ethanol extract from leaves of Perilla frutescens demonstrated promising
antitumor-promotion in preventing activity but it did not show the prevented antitumor effect on mouse skin.


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả trong luận văn đều trung thực và chưa từng được công bố
trong bất kỳ cơng trình nào trước đây.

Vưu Thanh Tú Qun


i

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... viii
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 2
1.1. Ung thư da .............................................................................................. 2
1.1.1. Sự hình thành và phát triển ung thư da ........................................... 2
1.1.2. Tác nhân gây ung thư da ................................................................. 2
1.1.3. Phân loại ung thư da ........................................................................ 3
1.2. Mơ hình gây u da 2 giai đoạn bằng hóa chất trên chuột thực nghiệm ... 5
1.2.1. Cơ chế tác động của các tác nhân gây u qua các giai đoạn thử
nghiệm ....................................................................................................... 5
1.2.2. Tác nhân hóa học chính trong mơ hình gây u hai giai đoạn ........... 6
1.2.3. Các mơ hình gây u da hai giai đoạn bằng hóa chất trong các nghiên
cứu trên thế giới ........................................................................................ 7
1.2.4. Đặc điểm mô học khối u trên da chuột ......................................... 10
1.3. Hoạt chất có tác dụng kháng u được nghiên cứu ................................. 14
1.3.1. Imiquimod ..................................................................................... 14
1.3.2. Curcumin ....................................................................................... 14
1.3.3. Tía tơ ............................................................................................. 16
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 18
2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 18
2.1.1. Dược liệu Tía tơ ............................................................................ 18
2.1.2. Động vật thí nghiệm ...................................................................... 18


ii

2.1.3. Hóa chất, thuốc thử ....................................................................... 18
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ ........................................................................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 20
2.2.1. Kiểm nghiệm dược liệu Tía tơ bằng phương pháp vi học ............ 20
2.2.2 Chiết xuất cao tồn phần từ lá Tía tơ ............................................. 20
2.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn cao tồn phần Tía tơ ................................... 21

2.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của cao tồn phần Tía tơ lên da chuột bình
thường...................................................................................................... 24
2.2.5. Khảo sát tác động kháng u của cao tồn phần Tía tơ lên mơ hình
gây u da trên chuột .................................................................................. 24
2.3. Đánh giá thử nghiệm ............................................................................ 25
2.3.1. Đánh giá trong quá trình thử nghiệm ............................................ 25
2.3.2. Đánh giá cuối thử nghiệm ............................................................. 26
2.4. Xử lý số liệu ......................................................................................... 26
Chương 3. KẾT QUẢ ..................................................................................... 27
3.1. Kiểm nghiêm dược liệu Tía tơ bằng phương pháp vi học ................... 27
3.1.1. Đặc điểm hình thái cây Tía tơ ....................................................... 27
3.1.2. Bóc tách biểu bì lá Tía tơ .............................................................. 29
3.1.3. Vi phẫu mơ thực vật cây Tía tơ ..................................................... 29
3.1.4. Khảo sát thành phần bột lá Tía tơ ................................................. 34
3.2. Chiết xuất cao tồn phần từ lá Tía tơ ................................................... 35
3.3. Xây dựng tiêu chuẩn cao tồn phần Tía tơ........................................... 35
3.3.1. Cảm quan ...................................................................................... 35
3.3.2. Thử tinh khiết ................................................................................ 35
3.3.3. Định tính........................................................................................ 36
3.3.4. Định lượng .................................................................................... 38


iii

3.4. Đánh giá sự ảnh hưởng của cao toàn phần Tía tơ 10% lên da chuột bình
thường.......................................................................................................... 39
3.5. Khảo sát tác động phòng ngừa và điều trị u da của cao tồn phần Tía tơ
..................................................................................................................... 40
3.5.1. Đánh giá sự ảnh hưởng của aceton và glycerin 5% đối với da chuột
................................................................................................................. 40

3.5.2. Đánh giá tác động phòng ngừa u da của cao tồn phần Tía tơ 10%
................................................................................................................. 47
3.5.3. Đánh giá tác động điều trị u da của cao TT 10% .......................... 57
Chương 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 64
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 68
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 73


iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

5-LOX

5-lipoxygenase

BCCs

Basel cell carcinomas

COX2

cyclooxygenase 2

DĐVN IV

Tiếng Việt
Ung thư tế bào đáy
Dược Điển Việt Nam IV

DMBA

7,12-dimethylbenzen[a]anthracen

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

FDA

Food and Drug Aministration

Cục quản lý thực phẩm và
dược phẩm Hoa Kỳ

HPLC

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography
NF-κB

Nuclear factor kappa B

PLA2

Phospholipase A2

RNA

Ribo Nucleic Acid

Yếu tố nhân kappa B

Sắc ký lớp mỏng

SKLM
SCCs

Squamous cell carcinomas

Ung thư tế bào gai

SEM

Standard Error of Means

Sai số chuẩn

TNF-a

Tumor necrosis factor alpha

Yếu tổ hoại tử khối u

TPA

12-O-tetradecanoylphorbol-13acetate
Tía tơ

TT
UV

Ultra violet

Tia cực tím


v

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các hình thái lâm sàng của BCCs ...............................................................4
Hình 1.2. Ung thư tế bào gai – SCCs ..........................................................................5
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của 7,12-dimethylbenzen[a]anthracen (DMBA) ............6
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) ........7
Hinh 1.5. Cấu trúc da người (a) và da chuột (b) .......................................................10
Hình 1.6. Cấu trúc lớp biểu bì của da .......................................................................11
Hình 1.7. Quá trình hình thành SCCs ở da chuột......................................................11
Hình 1.8. Hyperplasia ở da chuột .............................................................................12
Hình 1.9. Papilloma ở da chuột .................................................................................13
Hình 1.10. SCCs ở da chuột ......................................................................................13
Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của imiquimod ............................................................14
Hình 1.12. Cấu trúc hóa học các hợp chất curcuminoid ...........................................15
Hình 3.1. Đặc điểm hình thái thân và lá Tía tơ .........................................................27

Hình 3.2. Đặc điểm hình thái hoa Tía tơ ...................................................................28
Hình 3.3. Đặc điểm biểu bì dưới lá Tía tơ.................................................................29
Hình 3.4. Cấu tạo vi phẫu thân Tía tơ .......................................................................30
Hình 3.5. Đặc điểm lỗ khí và lơng che chở ở thân Tía tơ .........................................30
Hình 3.6. Các kiểu lơng tiết ở thân Tía tơ .................................................................31
Hình 3.7. Cấu tạo vi phẫu gân lá ...............................................................................31
Hình 3.8. Đặc điểm lỗ khí và lơng tiết ở lá Tía tơ.....................................................32
Hình 3.9. Cấu tạo vi phẫu phiến lá Tía tơ .................................................................32


vi

Hình 3.10. Cấu tạo vi phẫu cuống lá Tía tơ ..............................................................33
Hình 3.11. Cấu tạo vi phẫu cánh lồi ở cuống lá Tía tơ .............................................33
Hình 3.12. Đặc điểm lơng tiết và lơng che chở cuống lá Tía tơ ...............................34
Hình 3.13. Đặc điểm lơng che chở có trong bột lá Tía tơ .........................................34
Hình 3.14. Lơng tiết và mảnh tế bào có trong bột lá Tía tơ ......................................34
Hình 3.15. Các loại mơ dẫn có trong bột lá Tía tơ ....................................................35
Hình 3.16. Định tính flavonoid trong cao tồn phần Tía tơ bằng các phản ứng hóa
học .............................................................................................................................37
Hình 3.17. Sắc ký đồ của dịch cao tồn phần Tía tơ, chuẩn luteolin và chuẩn acid
rosmarinic dưới UV 254 nm, UV 365 nm và thuốc thử VS .....................................37
Hình 3.18. Vùng da chuột lơ cao chứng ở tuần 1 (A) và tuần 20 (B) .......................39
Hình 3.19. Vi phẫu da chuột bình thường (A) và da chuột lơ cao chứng (B) ...........40
Hình 3.20. Vùng da chuột lơ aceton ở tuần 1 (A) và tuần 18 (B) .............................41
Hình 3.21. Vi phẫu da chuột bình thường (A) và da chuột lơ aceton (B) .................41
Hình 3.22. Trọng lượng trung bình (g) của lơ glycerin 5% và lơ bệnh ....................42
Hình 3.23. Tỷ lệ chuột bị u (%) ở lô glycerin 5% và lô bệnh ...................................43
Hình 3.24. Số khối u trung bình ở lơ glycerin 5% và lơ bệnh ..................................44
Hình 3.25. Thể tích trung bình khối u lơ glycerin 5% và lơ bệnh ............................45

Hình 3.26. Khối u tuần 20 lô glycerin 5% (A) và lơ bệnh (B)..................................46
Hình 3.27. Vi phẫu da chuột lơ glycerin 5% (A) và lơ bệnh (B) ..............................47
Hình 3.28. Hiện tượng viêm lt sau khi bơi DMBA ...............................................48
Hình 3.29. Trọng lượng chuột – Đánh giá tác động dự phòng của cao TT 10% .....49


vii

Hình 3.30. Tỷ lệ chuột u – Đánh giá tác động dự phịng của cao TT 10% ...............50
Hình 3.31. Số khối u trung bình – Đánh giá tác động dự phịng của cao TT 10% ...51
Hình 3.32. Thể tích u trung bình – Đánh giá tác động dự phịng của cao TT 10% ..52
Hình 3.33. Khối u vào tuần 20 của lơ cao TT dự phịng 10% (A), lơ glycerin 5% (B)
và lơ curcumin 4% (C) ..............................................................................................53
Hình 3.34. Quan sát vi phẫu papilloma da chuột của lô curcumin 4% (A), cao TT
10% dự phòng (B), bệnh (C) và glycerin 5% (D) .....................................................54
Hình 3.35. SCCs ở lơ curcumin 4% ..........................................................................55
Hình 3.36. SCCs ở lơ cao TT 10% dự phịng ...........................................................55
Hình 3.37. SCCs ở lơ glycerin 4% ............................................................................56
Hình 3.38. SCCs ở lơ bệnh ........................................................................................57
Hình 3.39. Trọng lượng chuột trung bình – Đánh giá tác động điều trị của cao TT
10%............................................................................................................................58
Hình 3.40. Tỷ lệ chuột bị u – Đánh giá tác động điều trị của cao TT 10% .............59
Hình 3.41. Số khối u trung bình – Đánh giá tác động điều trị của cao TT 10% ......60
Hình 3.42. Thể tích u trung bình – Đánh giá tác động điều trị của cao TT 10% .....61
Hình 3.43. Khối u tuần 20 ở lơ bệnh (A), lô imiquimod (B) và lô cao TT điều trị (C)
...................................................................................................................................62
Hình 3.44. Papilloma ở lơ imiquimod .......................................................................63
Hình 3.45. SCCs ở lô cao TT 10% điều trị ...............................................................63

viii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các mơ hình gây u da hai giai đoạn bằng hóa chất trên chuột ...................8
Bảng 3.1. Độ ẩm của cao tồn phần Tía tơ (%) ........................................................35
Bảng 3.2. Độ tro tồn phần của cao tồn phần Tía tơ (%) ........................................36
Bảng 3.3. Định tính flavonoid trong cao tồn phần Tía tơ bằng phản ứng hóa học .36
Bảng 3.4. Định lượng HPLC acid rosmarinic và luteolin (%) có trong cao tồn phần
Tía tơ .........................................................................................................................38
Bảng 3.5. Đánh giá sự ảnh hưởng của cao TT 10% lên da chuột bình thường .......39
Bảng 3.6. Kết quả vi phẫu mô học da lưng chuột ở lô cao chứng TT 10% ..............39
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của aceton lên da chuột bình thường .....................................40
Bảng 3.8. Kết quả vi phẫu mô học da lưng chuột ở lô aceton ..................................41
Bảng 3.9. Đánh giá sự ảnh hưởng của glycerin 5% lên sự tiến triển khối u .............42
Bảng 3.10. Đánh giá mức độ tiến triển khối u lô bệnh và lô glycerin 5% ................46
Bảng 3.11. Đánh giá tác động dự phòng u da của cao TT 10% ................................47
Bảng 3.12. Đánh giá tác động của cao TT 10% lên mức độ tiến triển khối u ..........53
Bảng 3.13. Đánh giá tác động điều trị u da của cao TT 10% ...................................58
Bảng 3.14. Đánh giá mức độ tiến triển khối u của kem bôi imiquimod 5% và cao TT
10% điều trị ...............................................................................................................62


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư ngày càng trở thành vấn nạn của xã hội với tỉ lệ bệnh nhân tăng mạnh ngay
cả ở những nước đang phát triển. Tại Hoa Kỳ, ung thư da là loại ung thư phổ biến
nhất với gần 5 triệu người mắc mỗi năm và tổng chi phí điều trị lên đến 8,1 triệu đơ
[51]. Ung thư da gồm hai dạng phổ biến là ung thư tế bào hắc sắc tố và ung thư
không do hắc sắc tố. Tuy ung thư da dễ điều trị nhưng nếu khơng phát hiện sớm và

có những biện pháp ngăn chặn, khả năng gây tử vong cho bệnh nhân rất cao. Việc
điều trị cho những bệnh nhân bị ung thư da phụ thuộc vào tình trạng bệnh mà lựa
chọn giữa phẫu thuật hay điều trị dùng thuốc. Ngoài 35 thuốc đã được FDA chấp
thuận trong điều trị ung thư da [36], hiện nay việc sử dụng các thuốc từ dược liệu
đem lại tiềm năng to lớn khi đạt hiệu quả trị liệu tốt, giảm tác dụng phụ và hạ thấp
chi phí. Có rất nhiều dược liệu chứa các hoạt chất kháng ung thư đã được nghiên
cứu, trong đó dược liệu Tía tơ đang gây được sự chú ý vì chứa nhiều hoạt chất với
nhiều công dụng khác nhau như kháng ung thư, kháng viêm, chống oxy hóa,…Tác
động kháng ung thư của Tía tơ tuy đã được chứng minh trên in vitro ở các dòng tế
bào HepG2 (ung thư gan), dòng HL-60 (ung thư bạch cầu), dòng HTC116 (ung thư
đại tràng),…[25], [26], [40] nhưng vẫn cịn ít thử nghiệm in vivo. Việc nghiên cứu
tác dụng Tía tơ trên in vivo đóng vai trò quan trọng trong việc khẳng định tiềm năng
kháng ung thư của dược liệu này, qua đó tạo tiền đề để thực hiện các nghiên cứu
lâm sàng và sử dụng Tía tơ trong ngăn ngừa sớm hay điều trị trên những bệnh nhân
ung thư da. Vì những lý do trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Khảo sát tác dụng
kháng u da của cao toàn phần ethanol từ lá Tía tơ trên chuột nhắt trắng” với các mục
tiêu như sau:
- Kiểm nghiệm dược liệu Tía tơ bằng phương pháp vi học
- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao tồn phần ethanol từ lá Tía tơ.
- Khảo sát tác dụng của cao tồn phần Tía tơ trên da chuột bình thường.
- Khảo sát tác dụng phịng ngừa và điều trị u da của cao tồn phần Tía tơ.


2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Ung thư da
1.1.1. Sự hình thành và phát triển ung thư da
Ung thư da là biểu hiện của sự tăng trưởng khơng kiểm sốt của tế bào da bình
thường, được gây ra bởi các bất thường về DNA, làm tế bào da bị đột biến, tăng

sinh nhanh chóng và hình thành các khối u lành tính hay ác tính. Các gene tác động
lên sự phát triển của khối u gồm 2 loại: gene gây u (oncogene) và gene ức chế u
(tumor suppressor gene). Gene gây u là các gene mã hóa protein liên quan đến sự
tăng sinh và phân chia tế bào. Khi bị biến đổi, chúng sẽ hoạt hóa tín hiệu thúc đẩy
sự tăng trưởng làm tế bào tăng sinh quá mức và tạo thành các khối u. Ngược lại,
gene ức chế u mã hóa protein đóng vai trị kìm hãm sự tăng trưởng quá mức của tế
bào. Khi bị biến đổi, các gene này bị mất chức năng kiểm soát đối với sự tăng sinh
tế bào và dẫn đến ung thư da.
Ras là một trong những gene gây u đầu tiên được nhận diện trong bộ gene người.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự biến đổi gene ras, đặc biệt là gene Harvey ras và
Kristen ras, là nguyên nhân phổ biến trong bệnh lý ung thư không do hắc sắc tố.
Protein ras liên quan đến phần trong của màng tế bào và được cho là đóng một vai
trị quan trọng trong con đường dẫn truyền tín hiệu liên quan đến sự tăng trưởng và
biệt hóa [22]. P53 là gene ức chế u, mã hóa cho phosphoprotein 53-kDa, đảm
nhiệm vai trị kiểm soát sự phiên mã và chu kỳ tế bào. Gene p53 góp phần trong
việc bảo vệ DNA của tế bào khỏi những tổn thương từ tia UVB. Sự biến đổi gene
p53 được phát hiện trong hầu nhiều trường hợp mắc ung thư da tế bào đáy và ung
thư da tế bào gai [13].
1.1.2. Tác nhân gây ung thư da
Tia tử ngoại mặt trời: cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế, trực thuộc WHO, phân
loại tia tử ngoại mặt trời vào nhóm 1- nhóm các tác nhân gây ung thư trên người
[8]. Tia UV từ ánh nắng mặt trời có khả năng gây ra 90% trường hợp ung thư da
không do hắc sắc tố [9]. Các tác động của tia cực tím gây ra các đột biến gen, ung


3

thư hóa, cản trở hoặc ức chế sinh tổng hợp DNA, RNA, protein và ảnh hưởng tới
chức năng miễn dịch của cơ thể [3].
Các chất hóa học: đóng vai trị quan trọng trong việc khởi phát nguy cơ ung thư.

Các tác nhân này có thể là: hắc ín, bồ hóng, anthracene, arsenic,…[11].
Yếu tố nhân kappa B (NF-κB): NF-κB là yếu tố có khả năng gắn với một đoạn
intron của gene mã hóa cho chuỗi nhẹ kappa của immonoglobulin. Trong nhân, NFκB khởi động hay điều hịa q trình sao mã đáp ứng sớm bằng cách gắn vào vùng
khởi động hay vùng tăng cường của các gene đặc hiệu. Trong hầu hết các loại tế
bào, NF-κB có vai trị điều hịa các tín hiệu sống sót cho tế bào. Tuy nhiên, ở một số
trường hợp, yếu tố này lại gây nên chết tế bào theo chu trình. Q trình điều hịa bất
hợp lý NF-κB là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh lý trong đó có ung thư. NF-κB
được hoạt hóa bởi nhiều tác nhân khác nhau như bức xạ cực tím, các cytokine, bụi
công nghiệp, các thành phần của vi khuẩn và virus [24].
Ngồi ra cịn nhiều yếu tố khác như: yếu tố gen, yếu tố nội tiết, yếu tố màu da,…
1.1.3. Phân loại ung thư da
Ung thư da được chia làm hai nhóm chính: Ung thư da khơng do hắc sắc tố và ung
thư da hắc sắc tố. 90% các trường hợp ung thư da là loại ung thư không hắc sắc tố,
trong đó chủ yếu là ung thư tế bào đáy và ung thư tế bào gai. Ngoài ra cịn có dày
sừng quang hóa, bệnh Bowen, verrucas và acanthomas nhưng chiếm tỷ lệ rất nhỏ
[10].
1.1.3.1. Ung thư tế bào đáy – BCCs (Basel cell carcinomas)
Là loại chiếm phổ biến nhất trong hầu hết các trường hợp ung thư da, BCCs tiến
triển chậm, hiếm khi gây di căn. Bệnh gặp ở bất kì chỗ nào trên cơ thể, nhưng
thường thấy nhất ở vùng đầu, mặt, đôi khi ở cổ, thân mình; hiếm khi khu trú ở lịng
bàn tay, bàn chân; khơng bao giờ xuất hiện ở niêm mạc. BCCs có nhiều hình thái
lâm sàng khác nhau (Hình 1.1) [1].


4

Hình 1.1. Các hình thái lâm sàng của BCCs
(a) BCCs thể xơ cứng ; (b) BCCs thể nang ; (c) BCCs thể nhiễm sắc ;
(d) BCCs thể nốt ; (e) BCCs thể nông ; (f) BCCs thể loét
1.1.3.2. Ung thư tế bào gai – SCCs (Squamous cell carcinomas)

Ở người, đây là loại ung thư da phổ biến thứ hai sau ung thư tế bào đáy (BCCs).
Khác với BCCs, SCCs được hình thành ở phần phía trên của biểu bì, trong lớp tế
bào gai. SCCs luôn luôn xuất hiện trên những thương tổn đã có từ trước, nhất là trên
nhóm bệnh da tiền ung thư (Bowen, Paget), hiếm hơn là trên những vùng da có sẹo,
viêm mạn hoặc dày sừng ở người già. Bệnh xuất hiện tự nhiên, sau sang chấn nhiều
lần lập đi lập lại hoặc sau khi điều trị khơng thích hợp. Thương tổn lớn lên, lan rộng
ra, lớp sừng dày lên, trên bề mặt bị loét, thâm nhiễm sâu xuống dưới, bờ nổi cao lên
(những nụ thịt), có quầng đỏ bao bọc xung quanh, có khi xuất hiện dạng như nhú
sừng. Tế bào SCCs điển hình là tế bào hình đa giác giới hạn rõ, nhiều nguyên sinh
chất, nhiều ty lạp thể, nhiều tổ chức sợi. Có một, hai nhân bắt màu rõ và có mảng
nhiễm sắc. Các tế bào u xếp chồng chất lên nhau tạo thành dạng tế bào lát nối với
nhau bằng một cầu nối liên bào. SCCs có khuynh hướng lan rộng và xâm lấn hệ
thống bạch huyết, xâm lấn vào tổ chức lân cận, loét phá hủy phần mềm, sụn xương,
mạch máu lớn và các dây thần kinh, nhiễm khuẩn phụ [1].


5

Hình 1.2. Ung thư tế bào gai - SCCs
1.2. Mơ hình gây u da 2 giai đoạn bằng hóa chất trên chuột thực nghiệm
1.2.1. Cơ chế tác động của các tác nhân gây u qua các giai đoạn thử nghiệm
1.2.1.1. Giai đoạn khởi phát (initiation)
Là giai đoạn cảm ứng bởi một gen đột biến quan trọng liên quan đến sự kiểm soát
tăng sinh tế bào. Các chất gây ung thư gây ra lỗi di truyền bằng cách thay đổi cấu
trúc phân tử DNA, dẫn đến đột biến trong phân chia và tổng hợp DNA. Các chất
hóa học này được chia thành 2 nhóm:
- Nhóm tác động trực tiếp có khả năng tạo u, không cần thông qua các biến đổi hóa
học: β-propiolacton, N-methyl-N-nitroso guanin,…
- Nhóm tác động gián tiếp (cịn gọi là các chất tiền ung thư) cần có các biến đổi
chuyển hóa để tạo thành các yếu tố mang khả năng tạo u thực sự: benzo[a]pyren;

7,12-dimethylbenzen[a]anthracen (DMBA)…
Giai đoạn khởi phát mang tính chất khơng thể hồi phục và cộng dồn. Vì vậy , ở giai
đoạn này, chất gây ung thư được bôi nhiều lần hay một lần duy nhất đều cho hiệu
quả như nhau [28], [46].
1.2.1.2. Giai đoạn tăng hoạt (promotion)
Các tế bào ở giai đoạn khởi phát cần được tác động gây tăng sinh và xáo trộn hơn
nữa để có thể hình thành khối u. Vì vậy, các chất tăng hoạt ở giai đoạn này sẽ kích
thích vào tế bào nhiều hơn với tần suất lặp đi lặp lại và kéo dài, giúp các khối u phát
triển hơn hoặc làm tăng số lượng khối u. [38] Các chất tăng hoạt hầu hết chỉ làm
thay đổi biểu hiện gen mà không làm biến đổi cấu trúc DNA, dẫn đến việc kích


6

thích các tế bào tăng sinh, làm tái cấu trúc các mô và gây viêm nhiễm. Kết thúc của
giai đoạn này là sự hình thành papilloma [48].
Croton oil và 12-O-tetradecanolphorbol-13-acetat (TPA) là những chất tăng hoạt
mạnh nhất và đã được sử dụng rộng rãi trong các mơ hình gây u da trên chuột.
Ngồi ra cịn có tween 60, iodo acetic acid,…[46].
Các biến đổi được gây ra ở giai đoạn tăng hoạt mang tính hồi phục, vì thế việc bơi
lặp lại hóa chất trên da là cần thiết. Nếu giảm tần suất bôi, hiệu quả gây u sẽ giảm
hoặc mất. Một nghiên cứu cho thấy hiệu quả gây papiloma và carcinoma tối đa khi
croton oil được bôi 1 hay 2 lần/tuần nhưng kết quả sẽ đạt sớm hơn nếu bôi 2
lần/tuần. Nếu giảm tuần suất bơi cịn một lần một tuần trong 4 tuần với tổng liều
như trên thì khơng có khối u nào phát triển [46].
1.2.1.3. Giai đoạn tiến triển (progression)
Đây là q trình khơng hồi phục, dẫn đến sự di căn của các khối u: papiloma
chuyển thành carcinoma. Ở giai đoạn này, các gene tiếp tục bị đột biến nhiều hơn
nữa, bao gồm: hoạt hóa các gene gây ung thư và bất hoạt các gene ức chế tế bào u,
dẫn đến sự biệt hóa tế bào và gây rối loạn thơng tin di truyền [44].

1.2.2. Tác nhân hóa học chính trong mơ hình gây u hai giai đoạn
1.2.2.1. DMBA (7,12-dimethylbenzen[a]anthracen)

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của 7,12-dimethylbenzen[a]anthracen (DMBA)
DMBA là một tác nhân gây ung thư được sử dụng nhiều trong các mơ hình gây u
trên chuột thực nghiệm. DMBA tác động lên nhiều cơ quan, bao gồm da, tuyến vú,
khoang miệng, gan,…Trên da chuột, DMBA hoạt hóa gene gây u bằng cách gắn
nhóm 12-methyl của nó lên N-7 của adenine, gây ra sự chuyển đảo adenine thành


7

thymine trên codon 61 của gene c-H-ras và cuối cùng dẫn đến sự hình thành các
papillomas [16].
DMBA thường đóng vai trò như một chất khởi phát – initiator, đặc biệt trong các
mơ hình gây u da 2 giai đoạn với chất tăng hoạt – promoter là croton oil hoặc TPA
[46].
1.2.2.2. Croton oil
Croton oil được chiết xuất từ hạt cây Ba Đậu, tên khoa học là Croton Tiglium, thuộc
họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Thành phần chính của croton oil là các ester phorbol,
trong đó chiếm chủ yếu là TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) (Hình
1.10).

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)
Croton oil là một chất gây phỏng rất mạnh: khi bôi lên da, da bị nóng bỏng và
phồng lên, tạo mụn nước sau đó thành mụn tróc da. Croton oil có tác dụng chậm, và
chỉ tác dụng lên trên bề mặt da, sau khi khỏi mụn thì khơng để lại sẹo, trừ khi tại
cùng một chỗ bơi nhiều lần [2].
Trong mơ hình u da trên chuột, croton oil đóng vai trị là chất tăng hoạt nhờ khả
năng gây viêm, làm thúc đẩy quá trình tăng sinh tế bào và sự hình thành khối u.

1.2.3. Các mơ hình gây u da hai giai đoạn bằng hóa chất trong các nghiên cứu
trên thế giới
Đây là mơ hình được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu về đánh giá tác động
của các thuốc kháng u cũng như tìm hiểu bản chất các giai đoạn của ung thư biểu
mơ. Khác với mơ hình sử dụng đơn chất, mơ hình này sử dụng hai hóa chất gây u


8

với mục đích và thời gian tác động khác nhau. Hai chất được sử dụng chính trong
mơ hình này gồm DMBA và croton oil (hoặc TPA). DMBA được sử dụng một lần
duy nhất, dùng để gây đột biến gene ở giai đoạn khởi phát. Croton oil sau đó sẽ
được bơi lặp lại trong một khoảng thời gian thử nghiệm nhất định, đóng vai trị tăng
hoạt q trình viêm và kích thích sự tiến triển và hình thành khối u.
Mơ hình gây u này giúp quan sát được hai giai đoạn u riêng biệt, có lợi lớn trong
việc theo dõi sự ảnh hưởng của yếu tố môi trường hoặc tác dụng của thuốc thử
nghiệm lên các giai đoạn khác nhau của sự hình thành khối u. Thời gian quan sát sự
tiến triển của khối u có thể diễn ra trong suốt vịng đời của chuột. Trong q trình
quan sát, có thể sử dụng các phương pháp không xâm lấn để đánh giá mức độ tiến
triển u và cuối thử nghiệm có thể tiến hành giải phẫu vùng da giúp đánh giá một
cách toàn diện, khách quan và cho kết quả tin cậy. Các khối u gây ra bởi mơ hình 2
giai đoạn có thể là papiloma lành tính hoặc có khả năng tiến triển đến SCCs. Vì vậy,
mơ hình này tạo cơ hội có thể theo dõi sự tiến triển sớm và muộn trong quá trình
phát triển của khối u [34].
Các mơ hình gây u 2 giai đoạn khác nhau về giống chuột thử nghiệm, liều lượng
hoạt chất, tần suất, khoảng cách bôi giữa DMBA và croton oil (Bảng 1.1). Nghiên
cứu của Lê Thị Ngọc Thúy năm 2016, tác giả đã chỉ ra mơ hình gây u 2 giai đoạn
bơi DMBA 0,2% một lần duy nhất, sau 2 tuần bôi croton oil 2% 2 lần/tuần là tối ưu
và ổn định khi cho tỷ lệ sống sót và tỷ lệ papiloma cao, đồng thời làm giảm gánh
nặng khối u trên chuột, phù hợp để áp dụng mơ hình trong các thử nghiệm khảo sát

tác động điều trị và dự phòng u da của hoạt chất kháng u.
Bảng 1.1. Các mơ hình gây u da hai giai đoạn bằng hóa chất trên chuột
Tác giả
Prashar

Thú thử nghiệm
R. Chuột

Swiss

và cs., 1994 albino 7-8 tuần
[43]

tuổi

Das R. K. Chuột

Mơ hình
Bơi DMBA 1 lần duy nhất
(195 nmol). Sau 2 tuần, bơi
100 µl croton oil 1% 2
lần/tuần trong 12 tuần

Kết quả
100% số chuột bị
papiloma vào tuần
thứ 12

Swiss Bôi DMBA 1 lần duy nhất 100% số chuột bị

9

và cs., 2004 albino 5-6 tuần (50 mg/kg). Sau 1 tuần, bơi papiloma vào tuần
[42]

100 µl croton oil 1% 2 thứ 12

tuổi

lần/tuần trong 12 tuần
Kim DJ và
cs.,

2006

[15]

Bôi DMBA 1 lần duy nhất
Chuột C57BL/6 (50 µg). Sau 1 tuần, bơi 200 83% số chuột bị u
8-10 tuần tuổi

trong 22 tuần

Sharma K.
và cs., 2009
[39]

Chuột

Swiss

albino 7-9 tuần
tuổi

Roslida AH
và cs., 2011
[45]

2011 [17]

tuần 7. 100% chuột
bị u ở tuần 16

Chuột ICR, 6-8 (100 µg). Sau 1 tuần, bôi 100 tuần

Chuột

Swiss

tuổi

Thị Chuột

tuổi

66,7%

11

Bôi DMBA 1 lần duy nhất
(100 µg). Sau 2 tuần, bơi 100 100% chuột bị u ở
µl croton oil 1% 3 lần/tuần tuần 16
trong 16 tuần

Swiss

tuổi
Thị Chuột

6.

µl croton oil 1% 2 lần/tuần chuột bị u ở tuần

tuần tuổi

Bơi DMBA 0,2% 1 lần duy
nhất (50 µl). Sau 1 tuần, bôi 71-100% số chuột
croton oil 2% 2 lần/tuần bị u sau 18 tuần
trong 18 tuần

Swiss

Ngọc Thúy, albino 6-8 tuần
2016 [4]

µl croton oil 1% 3 lần/tuần

Khối u đầu tiên ở

Bôi DMBA 1 lần duy nhất Khối u đầu tiên ở

Ngọc Vân, albino 6-8 tuần

Lê

(100 µg). Sau 2 tuần, bôi 100

trong 16 tuần

G. và cs., albino 7-8 tuần

2014 [6]

Bôi DMBA 1 lần duy nhất

trong 10 tuần

Chaudhary

Trần

µl croton oil 2,5% 3 lần/tuần sau 22 tuần

Bơi 50 µl DMBA 0,2% 1 lần
duy nhất. Sau 2 tuần, bôi 50 68,75% số chuột bị
µl croton oil 1% 2 lần/tuần u sau 20-22 tuần
trong 20-22 tuần

10

1.2.4. Đặc điểm mô học khối u trên da chuột
1.2.4.1. Cấu trúc da chuột
Da chuột nhìn chung tương tự da người về thành phần cấu tạo: đều có lớp biểu bì,
trung bì, hạ bì và các phần phụ của da nhưng mỏng hơn và các nang lông phân bố
dày đặc hơn. (Hình 1.5). Lớp biểu bì da chuột trưởng thành thường rất mỏng (gồm 1
đến 2 lớp) nhưng vẫn bao gồm đầy đủ bốn lớp cấu tạo chính giống như da người:
lớp tế bào đáy, lớp tế bào gai, lớp tế bào hạt và lớp sừng (Hình 1.5).

(A)

(B)

Hinh 1.5. Cấu trúc da người (a) và da chuột (b)
Nằm trong cùng của lớp biểu bì là lớp đáy, gồm các tế bào hình trụ, nằm vng góc
với đường phân cách giữa biểu bì và chân bì. Lớp đáy có chức năng tăng sinh và là
nơi duy nhất diễn ra quá trình phân bào [14]. Lớp tế bào gai nằm trên tế bào đáy, là
những tế bào đa diện, xếp sát nhau, trên bề mặt có những nhú bào tương giống
những cái gai. Các tế bào hạt nằm trên lớp gai có chứa các hạt sừng keratohyalin
trong bào tương, có dạng hình dẹt và độ dày mỏng phụ thuộc vào quá trình sừng
hóa. Ngồi cùng là lớp sừng, các tế bào dẹt hoàn toàn, màng bào tương dày và nhân
biến mất. Các tế bào sừng chồng chất thành lớp lên nhau và tế bào ngồi cùng nhất
ln bị bong ra.


11

Hình 1.6. Cấu trúc lớp biểu bì của da
1.2.4.2. Đặc điểm mô học khối u trên da chuột

Trong tất cả các mơ hình gây u da bằng hóa chất trên da chuột, hầu hết các khối u
tiến triển thành carcinoma đều là loại ung thư tế bào gai – SCCs [20]. Quá trình
hình thành và tiến triển đến SCCs ở chuột được trình bày ở hình 1.7.
Hyperplasia

Papilloma

SCCs
Hình 1.7. Quá trình hình thành SCCs ở da chuột
Hyperplasisa: là hiện tượng tăng sinh các lớp tế bào khơng keratin của biểu bì, có
các đặc điểm nhận biết điển hình sau: [27], [50]
- Độ dày của lớp tế bào gai và lớp tế bào hạt tăng.
- Tăng số lượng tế bào của lớp biểu bì, đặc biệt ở lớp tế bào gai.
- Thường kèm theo sự hình thành rete ridge và dày sừng.
- Có thể bao gồm lớp mơ đệm của nang lơng.
- Lớp màng đáy cịn ngun vẹn.
Với hyperplasia khơng điển hình:
- Độ dày lớp tế bào gai và lớp tế bào hạt tăng bất thường.
- Không phân biệt được ranh giới giữa lớp tế bào đáy, lớp tế bào gai và lớp tế bào
hạt.


12

- Tế bào sừng khơng điển hình với nhân to, tăng nhiễm sắc xuất hiện trong lớp tế
bào đáy và lớp tế bào gai.

B

A

Hình 1.8. Hyperplasia ở da chuột [27]
(A) Thể điển hình ; (B) Thể khơng điển hình
Hyperplasia tế bào gai xảy ra do nhiều nguyên nhân, bao gồm sự viêm nhiễm hoặc
viêm tự phát, sự kích ứng bởi độc chất, sự cọ xát liên tục lớp sừng bề mặt hay việc
tiếp xúc lâu dài với tia UV. Trường hợp hyperplasia được gây ra trực tiếp bởi hóa
chất xảy ra trong các mơ hình gây u da thử nghiệm có sử dụng các tác nhân tăng
hoạt như TPA.
Papilloma: trong mơ hình gây u da trên chuột, papilloma khơng được đánh giá
tương đương như papilloma ở người [18]. Nó là các khối u nhú có hình dạng rõ
hoặc khối mơ sống không bao gồm tế bào mỡ với các đặc điểm biệt hóa rõ như sau:
[27], [50]
- Khối u nhú cấu tạo bởi các tế bào gai keratin hóa bao phủ lên mơ đệm.
- Màng đáy cịn ngun vẹn, các tế bào đáy xếp khít nhau, vng góc với màng đáy.
- Tế bào gai và tế bào hạt bị biệt hóa và keratin hóa thành các lớp tế bào dày kèm sự
gia tăng bất thường các hạt keratohyalin.
- Thường xuất hiện sự phân bào.
- Các lớp tế bào trên màng đáy có thể có hiện tượng keratin hóa sớm (dyskeratosis).
- Tăng sinh lớp sừng.
- Có thể bị loét và viêm.