Nghiên cứu xây dựng công thức và quy trình bào chế viên nang cứng nattokinase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

-----------------

HUỲNH VĂN HẬU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CƠNG THỨC VÀ QUY TRÌNH
BÀO CHẾ VIÊN NANG CỨNG NATTOKINASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

HUỲNH VĂN HẬU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CƠNG THỨC VÀ QUY TRÌNH BÀO CHẾ
VIÊN NANG CỨNG NATTOKINASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc

Mã số: 60 72 04 02

Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. TRẦN CÁT ĐƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh – 2017


Lời Cam Đoan
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Huỳnh Văn Hậu


Lời cảm ơn
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy hướng dẫn tôi, PGS.TS.Trần
Cát Đông. Cảm ơn Thầy đã nhận, hướng dẫn và truyền đạt kiến thức để tôi thực
hiện đề tài này.
Trân trọng cảm ơn TS Vũ Thanh Thảo, cô Nguyễn Thị Linh Giang đã hết mực tận
tụy trong việc tạo điều kiện và hướng dẫn tơi trong q trình thực hiện đề tài.
Cảm ơn bộ môn Bào chế đã hỗ trợ tôi rất nhiều về trang thiết bị máy móc.
Cảm ơn các cán bộ, viên chức của bộ môn Vi sinh – ký sinh, bộ môn Bào chế đã
chia sẻ và động viên tôi trong quá trình học tập và làm đề tài tại trường.
Cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp của tơi đã khuyến khích tơi trong suốt thời
gian qua.


Mục Lục
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2

1.1. Tổng quan về Nattokinase

2

1.1.1. Lịch sử, khái niệm

2

1.1.2. Đặc điểm, tính chất lý hóa

4

1.1.3. Cơ chế q trình đơng máu

5

1.1.4. Tác dụng sinh học

5

1.1.5. Tác dụng dược lý

6

1.1.6. Một số dạng bào chế phẩm natto và nattokinase trên thị trường

7

1.1.7. Liều lượng, cách dùng

8

1.1.8. Các thử nghiệm lâm sàng về nattokinase

8

1.2. Tổng quan về viên nang cứng

9

1.2.1. Ưu, nhược điểm viên nang cứng

10

1.2.2. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của viên nang cứng

10

1.2.3. Các loại tá dược trong viên nang cứng

12

1.3. Kỹ thuật bào chế viên nang cứng.

14

1.3.1. Phương pháp đóng thuốc khơng qua xát hạt

14

1.3.2. Phương pháp đóng thuốc qua xát hạt

14

1.4. Các nghiên cứu về bào chế nattokinase
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

14
16

2.1. Nguyên liệu và tá dược

16

2.2. Trang thiết bị

17

2.3. Phương pháp nghiên cứu

18

2.3.1. Phương pháp định lượng hoạt tính enzym

18


2.3.2. Thẩm định quy trình định lượng nattokinase nguyên liệu

21

2.3.3. Thẩm định quy trình định lượng nattokinase trong viên nang cứng

23

2.3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của tá dược đến hoạt tính nattokinase

23

2.3.5. Đánh giá các cơng thức bào chế thử nghiệm

29

2.3.6. Bào chế viên nang cứng chứa nattokinase

31

2.3.7. Tối ưu hóa cơng thức

34

2.3.8. Nâng cỡ lơ 300 viên

35

2.3.9. Đánh giá chỉ tiêu chất lượng của viên nang cứng nattokinase

35

2.3.10. Theo dõi độ ổn định

36

Chương 3. KẾT QUẢ
3.1. Thẩm định quy trình định lượng nattokinase ngun liệu

37
37

3.1.1. Tính tuyến tính

37

3.1.2. Tính chính xác

39

3.1.3. Độ đúng

39

3.2. Thẩm định quy trình định lượng nattokinase trong viên nang

40

3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của tá dược đến hoạt tính nattokinase

41

3.3.1. Khảo sát tá dược tạo màng bảo vệ hoạt chất nattokinase

41

3.3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của tá dược đến hoạt tính nattokinase

42

3.4. Bào chế viên nang cứng chứa nattokinase

44

3.5. Khảo sát tỉ lệ tá dược trong viên

46

3.5.1. Saccharose

46

3.5.2. Tá dược trơn, bóng

46

3.5.3. Tá dược rã

47

3.6. Tối ưu hóa cơng thức.

47

3.7. Khảo sát đặc tính của 3 lơ H1, H2, H3, mỗi lơ 300 viên.

51


3.8. Kết quả theo dõi độ ổn định.
Chương 4. BÀN LUẬN

54
58

4.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng nattokinase trong nguyên
liệu và viên nang cứng

58

4.2. Xây dựng công thức bào chế viên nang nattokinase

58

4.3. Khảo sát tá dược tạo màng bảo vệ

59

4.4. Khảo sát tá dược độn

59

4.4.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của saccharose

60

4.4.2. Khảo sát tỉ lệ tá dược trơn, bóng

60

4.4.3. Khảo sát tỉ lệ tá dược rã

60

4.5. Tối ưu hóa cơng thức

61

4.6. Đánh giá tính chất viên nang cứng nattokinase

61

4.7. Theo dõi độ ổn định.

62

Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

63

5.1. KẾT LUẬN

63

5.2. KIẾN NGHỊ

64

TÀI LIỆU THAM KHẢO

65

PHỤ LỤC

68


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Sự phân chia kích thước vỏ nang cứng theo thể tích, khối lượng riêng .. 11
Bảng 2.1. Danh mục tá dược ................................................................................... 16
Bảng 2.2. Danh sách trang thiết bị dùng trong bào chế và kiểm nghiệm ................ 17
Bảng 2.3. Tiêu chuẩn đánh giá tính trơn chảy dựa vào góc nghỉ . .......................... 30
Bảng 2.4. Giới hạn chênh lệch khối lượng trung bình ............................................. 30
Bảng 3.1. Khảo sát sơ bộ tương quan nồng độ và độ hấp thu ................................. 37
Bảng 3.2. Tương quan nồng độ và độ hấp thu. ........................................................ 37
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ chính xác................................................................. 39

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát về độ đúng ................................................................... 39
Bảng 3.5. Các thông số bào chế và kết quả hoạt tính của các cơng thức thử
nghiệm ..................................................................................................................... 42
Bảng 3.6. Các thơng số khảo sát đóng nang ............................................................ 44
Bảng 3.7. Các thơng số bào chế khi đóng nang....................................................... 45
Bảng 3.8. Một số đặc tính của viên với tỉ lệ saccharose khác nhau. ......................... 46
Bảng 3.9 Một số đặc tính của viên với tỉ lệ magnesi khác nhau và tỉ lệ talc 1 % ...... 46
Bảng 3.10. Một số đặc tính của viên với tỉ lệ croscarmellose khác nhau .................. 47
Bảng 3.11. Loại tá dược và các mức cần khảo sát ................................................... 47
Bảng 3.12. Mơ hình các cơng thức và kết quả định lượng hoạt tính và pH ............. 48
Bảng 3.13. Phân tích phương sai của mơ hình đáp ứng theo RSM.......................... 49
Bảng 3.14. Kết quả đánh giá mô hình tối ưu trên thực nghiệm ............................... 50
Bảng 3.15. Thành phần và công thức khối lượng .................................................... 51
Bảng 3.16. Kết quả đánh giá chất lượng của 3 lô H1, H2, H3 ................................ 53


Bảng 3.17. Kết quả theo dõi độ ổn định mẫu nguyên liệu theo thời gian ................ 54
Bảng 3.18. Kết quả theo dõi độ ổn định mẫu thành phẩm theo thời gian ................ 55
Bảng 3.19. Tóm tắt kết quả theo dõi độ ổn định hoạt tính của nguyên liệu và
viên nang nattokinase .............................................................................................. 56


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo nattokinase .................................................................. 4
Hình 1.2 Ảnh hưởng sinh lý của nattokinase trên fibrin ............................................ 6
Hình 3.1. Đồ thị tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu nattokinase .................... 38
Hình 3.2. Phổ hấp thu của hỗn hợp tá dược ............................................................ 40
Hình 3.3. Phổ hấp thu của vỏ nang rỗng ................................................................. 41
Hình 3.4. Kết quả ảnh hưởng của MCC 101, mannitol đến hoạt tính enzym........... 50
Hình 3.5. Một số viên thành phẩm........................................................................... 52

Hình 5.1. Hình ảnh kiểm tra chất ức chế Escherichia coli. ..................................... 69
Hình 5.2 Hình ảnh kiểm tra chất ức chế Salmonella ............................................... 69
Hình 5.3. Hình ảnh kiểm tra chất ức chế Staphylococcus. ...................................... 69
Hình 5.4. Hình ảnh kiểm tra chất ức chế Pseudomonas aeruginosa ....................... 69
Hình 5.5. Hình ảnh kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí ........................................... 70
Hình 5.6. Hình ảnh kiểm tra Staphylococcus aureus (thạch muối mannitol) .......... 70
Hình 5.7. Hình ảnh kiểm tra Pseudomonas aeruginosa (thạch centrimid) .............. 70
Hình 5.8. Hình ảnh ria lên mơi trường MacConkey để tìm E. coli .......................... 71
Hình 5.9. Hình ảnh cấy ria mẫu H3 lên mơi trường EMB. ...................................... 71
Hình 5.10. Hình ảnh kiểm tra Salmonella (thạch Bismuth sulfit) ............................ 71
Hình 5.11. Hình ảnh kiểm tra Enterobacteria (muối mật violet-red) ...................... 72
Hình 5.12. Hình ảnh kiểm tra tổng số nấm men, mốc.............................................. 72
Hình 5.13. Hình ảnh điện di protein của mẫu nattokinase ...................................... 72


Hình 5.14. Màu sắc nattokinase nguyên liệu sau 2 tháng bảo quản ở các điều kiện
khác nhau ................................................................................................................ 73
Hình 5.15. Màu sắc nattokinase nguyên liệu sau 3 tháng bảo quản ở các điều kiện
khác nhau ................................................................................................................ 73
Hình 5.16. Màu sắc nattokinase nguyên liệu sau 4 tháng bảo quản ở các điều kiện
khác nhau ................................................................................................................ 73
Hình 5.17. Màu sắc bột, hạt của viên nang nattokinase sau 2 tháng bảo quản ở các
điều kiện khác nhau ................................................................................................. 74
Hình 5.18. Màu sắc bột, hạt của viên nang nattokinase sau 3 tháng bảo quản ở các
điều kiện khác nhau ................................................................................................. 74
Hình 5.19. Màu sắc bột, hạt của viên nang nattokinase sau 4 tháng bảo quản ở các
điều kiện khác nhau ................................................................................................. 74


ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh tim mạch là thuật ngữ chung nói về các bệnh lý của tim và mạch máu như:
tăng huyết áp, rối loạn nhịp tim, bệnh động mạch vành, bệnh van tim, nhồi máu cơ
tim, xơ vữa động mạch, đột quỵ, suy tim..vv. Theo số liệu thống kê của Tổ chức Y
tế Thế giới, hàng năm có khoảng 7 triệu người tử vong do nhồi máu cơ tim và 5
triệu người tử vong do đột quỵ. Sự hình thành các cục máu đông là nguyên nhân
hàng đầu trong bệnh nhồi máu cơ tim và tai biến mạch máu não [4]. Khi bệnh đã
xảy ra thì việc điều trị khơng những gây nhiều tốn kém mà còn để lại những di
chứng như liệt, suy kiệt sức khỏe…vv mặc dù đã được điều trị thành công.
Vậy việc ngăn ngừa sự phát triển và hình thành của cục máu đơng giúp ích rất nhiều
cho bệnh nhân có nguy cơ cao bị nhồi máu cơ tim và tai biến mạch máu não. Hiện
nay, để phịng ngừa sự hình thành cục máu đơng thì aspirin liều thấp hay được các
bác sĩ khuyến cáo dùng. Tuy nhiên, các tác dụng phụ liên quan đường tiêu hóa làm
cho aspirin khơng phải là một lựa chọn an tồn. Để góp phần hỗ trợ trị liệu cho vấn
đề này, sản phẩm nguồn gốc sinh học nattokinase đã được nghiên cứu, đánh giá tại
Mỹ và Nhật Bản để sản xuất hàng loạt. Tuy chưa phải là thuốc, nhưng tác dụng làm
tan máu đông của nattokinase đã được công nhận [23]. Mặc dù thế, thông tin về tác
dụng của nattokinase cũng như việc thương mại hóa sản phẩm đến tay người dùng
tại thị trường Việt Nam vẫn chưa phát triển mạnh và đầy đủ.
Thị trường và người tiêu dùng muốn có nhiều sản phẩm để đa dạng hóa sự lựa chọn
của họ trong vấn đề bảo vệ sức khỏe. Nhận thấy vấn đề này nên đề tài “Nghiên cứu
xây dựng cơng thức và quy trình bào chế viên nang cứng nattokinase” được nghiên
cứu nhằm xây dựng cơng thức có tiềm năng, đảm bảo chất lượng cho sản phẩm
chứa enzym và tiêu chuẩn hóa để tạo ra sản phẩm nội địa với giá thành hợp lý.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Nattokinase
1.1.1. Lịch sử, khái niệm

Natto là một món ăn truyền thống của người Nhật Bản được làm từ đậu tương lên
men. Natto được ăn như thức ăn kèm với cơm, hoặc nấu thành soup, làm nhân
sushi cuộn, thậm chí làm cả spagetti và soba. Hay natto sấy khơ đóng bao để ăn như
một món thức ăn nhẹ (snack) [25]. Các kinh nghiệm dân gian ở Nhật Bản cho rằng
natto rất hữu hiệu trong việc phòng chống bệnh cảm cúm, phụ nữ mang thai khỏe
mạnh và giúp người dân có tuổi thọ cao, ít mắc các bệnh tim mạch.
Nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về sự bí ẩn của natto là tiến sĩ K.Yabe, một
chuyên gia về vi sinh học công bố những kết quả tìm tịi của ơng về sự lên men của
natto vào năm 1894, ghi lại rằng “Natto, một loại phô mai thực vật” để giới thiệu
với các nước phương tây vốn rất quen thuộc với các loại phơ mai từ sữa bị hay sữa
dê. Qn đội Nhật Bản trong thời chiến tranh Nhật-Nga (1904-1905) đã phải ăn
ngày ba bữa bằng natto với cơm nhờ vậy binh lính gìn giữ được sức khỏe khơng bị
đau bụng, tiêu chảy hay táo bón trên đường hành quân. Vào năm 1905 tiến sĩ Shin
Sawamura (đại học Tokyo) đã thành công trong việc tách 2 loại vi khuẩn natto từ
đậu nành nấu chín, trong đó vi khuẩn gây ra mùi hương đặc biệt làm hạt đậu lên
men (Bacillus natto)[25].
Các nhà khoa học Nhật Bản đã cất công nghiên cứu về thực phẩm độc đáo này vì
cho rằng đây là một thức ăn giúp con người sống lâu, giữ gìn được sức khỏe. Việc
tìm tịi để sản xuất theo lối cơng nghiệp sản phẩm natto được nghiên cứu liên tục ở
các trường đại học Nhật Bản để phục vụ quân đội viễn chinh Nhật Bản ở Mãn
Châu, Trung Quốc… từ năm 1919. Từ đó, natto đã trở thành thực phẩm chủ yếu cho
quân đội viễn chinh trong thế chiến thứ hai và ngày càng phổ cập đến nhân dân.
Qua thống kê cho thấy từ mức tiêu thụ natto 39000 tấn năm 1958 tăng vọt lên đến

2


170000 tấn/năm 1982 chứng tỏ natto đã trở thành lương thực dinh dưỡng mà bình
quân người Nhật sử dụng 1,42 kg/năm (và hiện nay là khoảng 2 kg/năm).
Vào năm 1980, tiến sĩ Sumi Hiroyuki đã đưa ra những kết quả bất ngờ về hiệu quả

của natto trong việc làm tan các huyết khối trong động mạch. Trong bữa cơm trưa
tại nhà ăn của đại học y khoa Chicago, Sumi lấy một mẫu natto đặt vào khay thủy
tinh có cục máu đơng thì 18 giờ sau cục máu đơng này tan rã dễ dàng, điều đó gợi ý
rằng trong natto có thể có một hay nhiều hoạt chất có thể phân hủy huyết khối nhờ
thủy phân sợi fibrin. Sumi bắt đầu lưu ý tới vai trò của nattokinase và vitamin K2 có
trong natto để chứng minh nó là hoạt chất giúp cho người Nhật Bản sống lâu, làm
tăng khả năng tạo ra plasmin nội sinh giúp cho cơ thể tránh được tai biến hay đột
quỵ bởi huyết khối hay các chứng xơ vữa động mạch, suy tim biến chứng gây nên
[26].
Năm 1986, tiến sĩ Sumi Hiroyuki cơng bố tồn bộ kết quả nghiên cứu về tác dụng
của nattokinase sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác nhau để so sánh,
xác định nattokinase là một loại enzym mang khả năng phân hủy huyết khối một
cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzym, gấp 4 lần plasmin – enzym nội
sinh làm tan máu đông – đồng thời tuyệt đối an toàn cho cơ thể khi hấp thu qua
đường ăn uống [25].
Tuy nhiên, mùi vị của natto lại khó chịu. Nó cịn có tên gọi là đậu tương thối nên
chưa thích hợp được với nhiều người dùng. Việc lên men và tinh khiết nattokinase
thủ cơng khơng mang lại dịng sản phẩm có độ tinh khiết cao cũng như hiệu suất
vẫn cịn thấp. Vì thế, vào năm 1998, Japan Bio Science laboratory là công ty đầu
tiên trên thế giới sử dụng chủng Bacillus subtilis natto để đưa vào lên men công
nghiệp nhằm sinh tổng hợp nattokinase [27]. Sản phẩm được đưa ra thị trường với
tên Nattokinase NSK-FD với hoạt lực 13000 FU/g và sau đó mở rộng và phát triển
sang các thị trường Mỹ, châu Âu, Hàn Quốc, Đài Loan và Trung Quốc. Năm 2001
công ty đã phát triển sản phẩm này với hoạt lực cao hơn và được biết với tên NSKSD (hoạt lực 20000 FU/g). Sản phẩm này đã nhanh chóng chiếm tổng lượng và thị

3


phần nattokinase lớn nhất thế giới. Quá trình sinh tổng hợp nattokinase từ vi sinh
vật đã và đang trở thành hướng phát triển mới cho ngành công nghiệp sản xuất

nattokinase [22]

1.1.2. Đặc điểm, tính chất lý hóa
Nattokinase (EC 3.4.21.62) là một serine peptidase enzym được chiết xuất từ dòng
vi khuẩn Bacillus subtilis subsp. natto trong quá trình lên men đậu tương [14]. Gồm
275 acid amin, khối lượng phân tử 27724 Dalton và có cơng thức cấu tạo như Hình
1.1

Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo nattokinase [28]
Nattokinase đã được giải trình tự acid amin bởi Yanagisawa, Yasuhide và cộng sự
vào năm 2010 [28]: Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala
Leu His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile
Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala Ser Ser Phe Val Pro Ser
Glu Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His Gln Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala
Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val
Lys Val Leu Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gln Ile Glu Trp
Ala Ile Ser Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Thr Gly Ser Thr
Ala Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Gly Ile Val Val Ala Ala Ala Ala Gln
Asn Asn Glu Gly Ser Ser Gly Ser Thr Ser Thr Val Gly Thr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser
Thr Ile Ala Ser Thr Ser Thr Val Gly Thr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala Val

4


Gly Ala Val Asn Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ser Glu Leu
Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Ala
Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser
Lys His Pro Thr Trp Thr Asn Ala Gln Val Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr
Tyr Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala.
Tính chất vật lý: dạng bột kết tinh màu trắng, trắng ngà vàng hoặc nâu nhạt, tan

trong nước, tan nhiều trong ethanol [12].

1.1.3. Cơ chế q trình đơng máu
Q trình đơng máu xảy ra qua bốn giai đoạn [6].
Giai đoạn 1: hình thành phức hợp prothrombinase. Tùy theo con đường ngoại sinh
(tổn thương bên ngoài) hay nội sinh (tổn thương bên trong) thì sẽ kích hoạt các yếu
tố X (Stuart-Prower), yếu tố V (proaccelerin) và yếu tố IV (ion Ca++). Ba yếu tố này
sẽ kết hợp tạo thành phức prothrombinase. Theo cơ chế nội sinh chậm hơn nhiều (16 phút) so với cơ chế ngoại sinh (15 giây).
Giai đoạn 2: hình thành thrombin. Khi phức hợp prothrombinase hình thành nó sẽ
chuyển prothrombin thành thrombin. Giai đoạn này cũng cần sự có mặt của ion
Ca++). Sự hình thành thrombin từ prothrombinase là rất nhanh, được tính bằng vài
giây.
Giai đoạn 3: tạo thành fibrin. Thrombin sau khi được hình thành đã chuyển
fibrinogen thành fibrin đơn phân. Các fibrin đơn phân tự trùng hợp thành fibrin ở
dạng sợi. Một mạng lưới fibrin đã hình thành và được ổn định nhờ yếu tố XIII
(antihemophilic globinAHG). Giai đoạn này cũng có sự tham gia của ion Ca++.
Giai đoạn 4: hình thành cục máu đông. Các tế bào máu được giữ lại trong lưới fibrin
và tạo nên cục máu đông.

1.1.4. Tác dụng sinh học.
Nattokinase khơng phải là một kinase (enzym vận chuyển nhóm phosphat) như tên
của nó mà thực chất là một serine peptidase thuộc họ subtilisin với số phân loại

5


chính thức là EC 3.4.21.62. Vi khuẩn B. subtilis tiết nattokinase nhằm thủy phân
protein đậu nành. Tuy nhiên, người ta phát hiện nó có hoạt tính tiêu sợi huyết, phá
cục máu đông mạnh. Khả năng tiêu fibrin của nattokinase đã được phát hiện trong
nghiên cứu in vitro bằng cách sử dụng đĩa fibrin [14]. Hoạt tính của nattokinase

mạnh hơn plasmin 6 lần trong việc tiêu fibrin và mạnh hơn xấp xỉ 4 lần trong việc
tách các liên kết của fibrin khi so sánh in vivo trên chuột [12].

1.1.5. Tác dụng dược lý
Trong cơ thể người, nattokinase có khả năng tiêu sợi huyết. Quá trình tiêu sợi huyết
bởi nattokinase được giải thích như sau (Hình 1.2):
Nattokinase
A
Fibrin

Sản phẩm phân
giải của fibrin

C

B

Plasmin
Prourokinase
Plasminogen
của mơ
Plasminogen

Urokinase

Hình 1.2 Ảnh hưởng sinh lý của nattokinase trên fibrin
A = Phân giải trực tiếp fibrin, B = Biến prourokinase thành urokinase, C = Tăng t-PA

Cơ chế tan cục máu đông là do khả năng tiêu hủy các sợi fibrin trực tiếp và gián
tiếp. Trực tiếp bằng cách tác động và tiêu hủy các sợi tơ fibrin và cơ chất của

plasmin, gián tiếp thông qua việc tăng cường biến đổi prourokinase được chuyển
đổi thành urokinase. Phá vỡ fibrin thành các sản phẩm phân huỷ của nó, bên cạnh
đó q trình cũng được tăng cường bởi sự chuyển đổi plasminogen thành plasmin.
Nattokinase cũng làm tăng chất hoạt hóa plasminogen của mơ (t-PA), tăng
cường phân hủy fibrin và giảm đông máu hơn nữa [23]. Bằng cách làm giảm sự
hình thành huyết khối, nattokinase giảm tốc độ tiến triển của sự hình thành mảng
bám và đảo ngược tiến triển tổn thương xơ vữa động mạch.

6


Hiệu lực của việc tăng khả năng phân hủy fibrin và chống đông máu kéo dài từ 2–8
giờ sau khi uống [19].
Sự hấp thu: nattokinase được hấp thu tại tá tràng và ruột non [19]. Khi sử dụng độc
lập, enzym sẽ bị bất hoạt hoàn toàn bởi acid dạ dày (pH 1,2) trong vòng 1 giờ. Ổn
định ở pH từ 7-12 và nhiệt độ dưới 50 °C [23].
Sự chuyển hóa, thải trừ: chưa được nghiên cứu đầy đủ.
Chỉ định:
Việc sử dụng nattokinase thường xuyên sẽ giúp cải thiện các bệnh lý về máu và
tuần hoàn. Như :
- Hỗ trợ sự lưu thông máu, tốc độ vận chuyển máu và giảm độ nhớt của máu [18].
- Hỗ trợ cơ chế đông máu của cơ thể [18].
- Hỗ trợ việc duy trì huyết áp ổn dịnh khi dùng 2000 FU nattokinase mỗi ngày
[18].
Nattokinase được sử dụng trong các bệnh tim mạch như tăng huyết áp, đột quỵ, đau
thắt ngực, huyết khối tĩnh mạch sâu, xơ hóa động mạch, giãn tĩnh mạch, huyết khối
tĩnh mạch ngoại vi, bệnh lý võng mạc [18].
Nattokinase cũng được sử dụng trong các cơn đau: đau xơ cơ, hội chứng suy nhược
mãn tính, thiếu oxi mơ, u xơ tử cung. Hoặc sử dụng trong việc loại trừ các phơi
nhiễm từ máu động vật, dụng cụ phẫu thuật và chế phẩm máu [18].

Tương tác thuốc: Chưa có nghiên cứu đầy đủ

1.1.6. Một số dạng bào chế phẩm natto và nattokinase trên thị trường.
Natto tự nhiên lên men, dùng để ăn như thức ăn hàng ngày.
Viên nang mềm Nattokinase NSK-SD 2000 FU
Viên nang cứng Nattoenzym 670 FU, Nattospes 300 FU, Nattokinase 2000 FU.

7


Hình 1.3. Các sản phẩm natto và nattokinase trên thị trường

1.1.7. Liều lượng, cách dùng
Uống 2000 FU/ ngày. Với viên hàm lượng 670 FU/viên thì dùng 3 viên/ngày. Uống
kèm 200 ml – 600 ml nước, sau ăn 30 phút. Uống liên tục với liệu trình từ 2-4 tháng
[10].

1.1.8. Các thử nghiệm lâm sàng về nattokinase
Bradley J. Lampe và Caroline English.J (2016) đã tiến hành thử nghiệm độc tính
của nattokinase trên chuột [8], kết quả cho thấy:
- Không gây đột biến vi khuẩn tại nồng độ tới hạn (5000 µg/đĩa).
- Trong thử nghiệm kiểm tra biến đổi nhiễm sắc thể, số lượng tế bào với cấu trúc
hay số nhiễm sắc thể bị biến đổi không vượt quá 5% so với tổng số tế bào được
kiểm tra (200 trên mỗi mức độ).
- Độc tính cấp tính: khơng có tử vong trên chuột ở liều đơn 1000 mg/kg (20000
FU/kg) và 2000 mg/kg (40000 FU/kg). Trong 14 ngày quan sát, khơng có phản
ứng bất lợi trên lâm sàng được ghi nhận, khơng có sự khác biệt về trọng lượng cơ
thể giữa nhóm thử nghiệm và nhóm chứng. Tương tự, khơng có bệnh lý nào được
ghi nhận.
- Theo dõi ở 28 ngày: có hiện tượng phân lỏng.

8


- Theo dõi ở 90 ngày: khơng có chuột chết trong suốt thời gian dùng nattokinase,
khơng có bệnh lý bất thường nào được phát hiện trong động vật thí nghiệm.
Kazuya. O, Shigeo. I, Kenichi. S (2006) đã nghiên cứu tính an toàn của nattokinase
trong thực phẩm: nghiên cứu ngẫu nhiên, mẫu placebo, và nghiên cứu mù đơi:
người tình nguyện khỏe mạnh (15 nam và 16 nữ) trong độ tuổi 20 – 64 (BMI 1828), dùng liều 36,67 mg nattokinase (927 FU/viên nang) hay liều placebo trong thời
gian 4 tuần [17]. Kết quả cho thấy: Trọng lượng cơ thể, huyết áp, mạch, các thông
số máu, và thông số nước tiểu được đánh giá trong suốt thời gian dùng thuốc, ngay
tức thì sau khi uống thuốc và 2 tuần sau khi kết thúc liệu trình. Có sự thay đổi có ý
nghĩa thống kê về trọng lượng cơ thể, BMI. Có một vài thay đổi chỉ số huyết học,
các thông số cận lâm sàng khi so sánh với đường chuẩn, nhưng tất cả các giá trị đều
nằm trong giới hạn bình thường, mức độ thay đổi thấp hơn 5 %. Vì vậy, khơng có
tác dụng độc tính bất lợi nào có ý nghĩa thống kê. Một vài trường hợp ỉa chảy được
ghi nhận nhưng kết luận chỉ ra rằng dường như không liên quan đến việc dùng
nattokinase. Việc sử dụng 3 viên nattokinase/ngày (36,67 mg/viên) trong 4 tuần là
an toàn.
Ming-Ching. S, Jen-Shiou. L và cộng sự (2009) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của
nattokinase đến việc làm giảm nồng độ của fibrinogen, yếu tố VII, và yếu tố VIII
trong huyết tương người [10]. Kết quả cho thấy: Sau 2 tháng dùng nattokinase;
fibrinogen, yếu tố VII và yếu tố VIII giảm 9 %, 14 %, và 17 % đối với nhóm khỏe
mạnh; 7 %, 13 %, và 19 % cho nhóm có bệnh lý tim mạch; 10 %, 7 %, và 19 % đối
với nhóm đang lọc máu, tuy nhiên lipid máu khơng bị ảnh hưởng bởi nattokinase.
Khơng có sự thay đổi có ý nghĩa thống kê về acid uric hay các dấu hiệu bất thường
nào được ghi nhận.

1.2. Tổng quan về viên nang cứng
Thuốc nang cứng là thuốc trong đó vỏ nang gồm nắp nang và thân nang hình trụ

lồng khít vào nhau bằng khớp trên vỏ nang hoặc được hàn kín sau khi đóng thuốc.

9


Thuốc đóng trong nang thường ở dạng bột rắn (bột, hạt..). Quá trình chế tạo vỏ và
thuốc được thực hiện riêng [1].

1.2.1. Ưu, nhược điểm viên nang cứng.
Ưu điểm:
+ Dễ sản xuất trên qui mô nhỏ hay công nghiệp [5].
+ Che dấu mùi vị rất tốt [5].
+ Hình dạng dễ nuốt [5].
+ Kỹ thuật bào chế không quá phức tạp vì khối bột thuốc có thể khơng cần phải
nén lại thành khối cứng như viên nén. Thành phần công thức cũng không dùng
nhiều loại như viên nén [5].
+ Sinh khả dụng có thể cao hơn so với viên nén cùng loại dược chất.
Nhược điểm:
+ Giá thành cao hơn viên nén [5].
+ Vỏ nang dễ hút ẩm, chảy lỏng [5].

1.2.2. Cấu trúc và quy trình sản xuất vỏ nang cứng
Viên nang cứng gồm có hai thành phần là vỏ nang và bột thuốc trong nang. Vỏ
nang bản chất thường làm từ gelatin, tinh bột hay hydroxy propyl methyl cellulose
(HPMC), chất hóa dẻo, dung mơi, chất bảo quản [5]. Q trình làm vỏ nang hay
được sử dụng hiện nay là phương pháp nhúng khn, quay trịn như sau:
1. Điều chế dung dịch nhúng khn (dung dịch gelatin hay HPMC): Hịa tan các
chất trên trong nước RO để có nồng độ khoảng 30 % - 40 %, loại khí, thêm các
chất phụ gia, kiểm tra và điều chỉnh độ nhớt (đây là yếu tố quyết định độ dày
mỏng vỏ nang)

2. Nhúng khuôn: các cặp khuôn bằng thép không rỉ được nhúng vào dung dịch
nhúng khn đã đun nóng ở khoảng 50 °C. Thời gian tùy thuộc vào quy trình.

10


3. Quay trịn khn: Các cặp khn sau đó được quay tròn theo phương ngang để
giúp dịch vỏ nang phân phối đều và tránh hiện tượng đọng giọt ở đáy vỏ nang.
4. Sấy vỏ nang: Chủ yếu dùng khơng khí khô và lạnh thổi qua các bộ phận khuôn.
Chỉ được phép gia nhiệt lên vài độ C để tránh chảy lỏng. Thời gian sấy thường
chiếm 2/3 thời lượng quy trình làm vỏ nang.
5. Tháo vỏ nang ra khỏi khuôn: Sử dụng các kẹp để tháo thân nang và nắp nang ra
khỏi khuôn.
6. Cắt: Các vỏ nang sẽ được cắt theo chiều dài xác định.
7. Đậy nắp nang: Nắp nang và thân nang sẽ được đậy hờ và sau đó lưu thơng trên
thị trường.
Kích thước vỏ nang được phân chia dựa theo thể tích bên trong vỏ nang, được mơ tả
ở Bảng 1.1.như sau:
Bảng 1.1. Sự phân chia kích thước vỏ nang theo thể tích và khối lượng riêng [11]
Lượng bột có thể chứa theo khối lượng riêng (mg)

Thể tích chứa
(ml)

0,6 g/ml

0,8 g/ml

1,0 g/ml

1,2 g/ml

000

1,37

822

1096

1370

1644

00el

1,02

612

816

1020

1224

00

0,91

546

728

910

1092

0el

0,78

468

624

780

936

0

0,68

408

544

680

816

1

0,50

300

400

500

600

2

0,37

222

296

370

444

3

0,3

180

240

300

360

4

0,21

126

168

210

252

5

0,1

78

104

130

156

Cỡ vỏ nang

11


1.2.3. Các loại tá dược trong viên nang cứng.
Tá dược độn: cơ bản giúp viên đạt khối lượng mong muốn để dễ dàng làm đầy
nang [5].
- Nhóm tinh bột và dẫn chất: tinh bột bắp, tinh bột mì, tinh bột khoai tây... nhóm
này khơng tan trong nước nhưng trương nở khá tốt, có tính trơn và rẻ tiền nên rất
thơng dụng. Thường ở dạng bột.
- Tinh bột biến tính: dextrin, natri starch, tinh bột hydroxy hóa, tinh bột glycerol
hóa. Tinh bột biến tính có tính dính, khả năng chịu nén tốt và tính rã cao. Đây là
dạng tá dược khá đa năng cho viên nén cũng như viên nang.
- Nhóm đường:
+ Lactose: có dạng khan và ngậm nước, thích hợp cho phương pháp xát hạt khô
và xát hạt ướt. Gần như không hút ẩm nên được dùng rộng rãi. Lactose có thể
tạo phản ứng với amin và có thể gây biến màu. Khả năng chịu nén tốt và làm
cốm cứng. Dạng lactose phun sấy còn cải thiện khả năng tạo khối và độ rã nên
có thể dùng đơn lẻ.
+ Saccharose: hay được gọi đường mía, có vị ngọt, dễ tan nên có thể dùng trong
viên nang nếu muốn cải thiện vị. Saccharose phun sấy còn giúp việc tạo khối
hạt dễ dàng và cải thiện độ rã.
+ Mannitol: vị mát dễ chịu, hòa tan nhanh.
+ Cellulose và dẫn chất: cellulose vi tinh thể hay dẫn chất cellulose như
NaCMC, CMC, CaCMC...vv. Tính trơ về mặt hóa học và khả năng hút nước,
tạo độ xốp cao giúp viên thuốc có độ rã tốt. Thích hợp cho nhiều loại dược
chất.

- Nhóm vơ cơ: calci phosphat, calci carbonat, magnesi carbonat, calci sulfat, natri
hydrocarbonat, natri carbonat: nhóm tá dược này có khả năng hút dịch và tăng
thêm độ cứng cho cốm, tuy nhiên có thể có đặc tính dược lý riêng nên khơng
được sử dụng rộng rãi như các nhóm trên.

12


Tá dược dính: mục đích tạo hạt cho khối bột, giúp q trình đóng thuốc vào nang
được dễ dàng và đạt độ phân tán hàm lượng tốt hơn [5].
- Polyvinyl pyrolidon (povidon) là polymer tổng hợp, có độ dính cao, lượng dùng
nhỏ và tan được trong nước lẫn ethanol, thích hợp cho việc tạo hạt ướt hay tạo
hạt khô. Dễ tan, giải phóng hoạt chất nhanh.
- Dẫn chất cellulose: natri carboxy methyl cellulose hay methyl cellulose được
dùng tá dược dính nhờ khả năng hút nước và dính. Tuy nhiên, nhược điểm là có
khả năng kéo dài thời gian rã của thuốc.
- Ethanol và hỗn hợp ethanol-nước: không phải là tá dược nhưng vẫn được dùng
như tá dược dính vì có khả năng giúp khối bột liên kết thành hạt.
- Bên cạnh đó, cịn có các tá dược dính khác như hồ tinh bột hay gelatin, gơm,
nhưng hiện nay ít sử dụng vì có nhiều nhược điểm và ảnh hưởng khơng tốt đến
quá trình bào chế lẫn chất lượng viên thuốc.
Tá dược rã: giúp viên thuốc khi tiếp xúc với nước hay dịch thể sẽ chuyển từ cấu
trúc rắn sang dạng phân tán thành nhiều hạt nhỏ. Rã là quá trình khởi đầu để thuốc
được phóng thích và hịa tan, do đó ảnh hưởng đến sinh khả dụng của thuốc [5].
Các loại tá dược rã hay dùng: natri starch glycolat bản chất là dẫn xuất của tinh bột,
croscarmellose bản chất là dẫn xuất của cellulose, crospovidon là dẫn xuất của
povidon [24]… Các tá dược rã đều có cơ chế là hút hay thấm nước và trương nở
mạnh để giải phóng các tiểu phân thuốc.
Tá dược trơn, bóng: tá dược này giúp làm trơn bề mặt cốm, bột thuốc giúp cho
quá trình đóng thuốc vào nang được dễ dàng hơn. Bột, cốm thuốc khơng bị phân

lớp, khơng bị dính vào bề mặt phễu hay các thiết bị đóng nang. Các loại tá dược
trơn, bóng thường dùng: talc, magnesi stearat, aerosil, acid stearic… Khơng có tá
dược trơn bóng nào đơn thuần chỉ mang tính chất gây trơn hay tạo độ bóng, hầu hết
đều có tác dụng vừa gây giảm ma sát vừa tạo độ bóng cho cốm, hạt thuốc, tuy nhiên

13


ở các mức độ khác nhau. Các loại tá dược trơn bóng có khả năng kéo dài thời gian
rã của viên, nên liều lượng sử dụng cần ở mức độ thấp [5].

1.3. Kỹ thuật bào chế viên nang cứng.
1.3.1. Phương pháp đóng thuốc khơng qua xát hạt
Hoạt chất được trộn đều với các thành phần có trong cơng thức thành khối bột đồng
nhất và đóng trực tiếp vào nang thơng qua máy [5]. Với phương pháp này, thông
thường cần phải thêm tá dược cải thiện độ trơn chảy, dính.

1.3.2. Phương pháp đóng thuốc qua xát hạt
Hoạt chất và tá dược phải qua công đoạn tạo hạt để thu hạt thuốc đạt tiêu chuẩn cho
việc đóng nang. Có 3 phương pháp [5]:
- Xát hạt khơ: tạo hạt với tá dược dính ở thể khô.
- Xát hạt ướt: tạo hạt với tá dược dính ở thể lỏng.
- Xát hạt ướt một phần.
Tùy vào yêu cầu của viên thuốc và tính chất của hoạt chất và tá dược để lựa chọn
phương pháp bào chế phù hợp cho mỗi công thức.

1.4. Các nghiên cứu về bào chế nattokinase
Các nghiên cứu đã được công bố về bào chế nattokinase còn rất hạn chế, một số
nghiên cứu gần đây được tóm tắt như sau:
Law D và Zhang Z (2007) đã nghiên cứu và xây dựng công thức bao phim

nattokinase nhằm mục đích ổn định bột nattokinase trong mơi trường enzym trung
tính để kiểm sốt tốc độ phóng thích khi uống vào đường tiêu hóa. Bột nattokinase
được nén thành viên với hỗn hợp tá dược bao tan trong ruột là Eudragit® L100-55
(EL100-55) và hydroxyl propyl cellulose (HPC) bằng phương pháp dập trực tiếp ở
các lực nén khác nhau từ 60 - 400 MPa [20]. Kết quả cho thấy: lực nén đến 400
MPa không gây ảnh hưởng đến sự mất hoạt tính nattokinase. Cơng thức gồm

14