Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến sự sinh trƣởng và hàm lƣợng hợp chất có hoạt tính sinh học của hệ sợi nấm cordyceps militaris trong

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƢỜNG


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI
TRƢỜNG ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ HÀM LƢỢNG HỢP
CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HỆ SỢI NẤM
Cordyceps militaris TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LỎNG

HỒ MINH NGUYÊN

Đà Nẵng, năm 2020


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƢỜNG


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI
TRƢỜNG ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ HÀM LƢỢNG HỢP
CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HỆ SỢI NẤM
Cordyceps militaris TRONG ĐIỀU KIỆN NI CẤY LỎNG

Ngành: Cơng nghệ sinh học
Khóa: 2016-2020

Sinh viên: Hồ Minh Nguyên
Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Minh Lý

Đà Nẵng, năm 2020


LỜI CAM ĐOAN

Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai cơng
bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tác giả

Hồ Minh Nguyên

i


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Minh Lý – giáo viên
hƣớng dẫn đã tận tình giúp đỡ tơi trong q trình hồn thiện khóa luận tốt nghiệp. Và
lịng biết ơn chân thành nhất đến thầy Trịnh Đăng Mậu đã đi cùng tôi từ lúc bắt đầu xây
dựng đề tài đến thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu cho khóa luận. Đồng thời tơi
xin cảm ơn thầy Vũ Đức Hồng và cơ Lê Thị Mai đã tạo điều kiện tốt nhất để tơi có thể
hồn tất kết quả nghiên cứu này.
Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Khoa Sinh – Môi trƣờng cùng Ban
Giám hiệu trƣờng Đại học Sƣ phạm Đà Nẵng đã tạo điều kiện để tơi có thể thuận lợi tiến
hành và hồn thiện đề tài nghiên cứu của mình.
Chân thành cảm ơn đến các quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Sinh - Môi trƣờng,

Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Đà Nẵng đã trang bị cho tôi nền tảng kiến thức vững
chắc để có thể phục vụ cho q trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng tơi xin chân thành cảm ơn đến anh Lê Văn Kiêm và những ngƣời bạn
quý mến đã giúp đỡ tôi vƣợt qua những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa luận.
Đặc biệt là gia đình vì đã cổ vũ và tạo động lực cho tơi hồn thành khóa luận thành công
nhất.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN

i

LỜI CẢM ƠN

ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

v

DANH MỤC BẢNG BIỂU

vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH

vii

TĨM TẮT

viii

MỞ ĐẦU

1

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

1

2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

2

3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI

3

3.1. Ý nghĩa khoa học

3

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

3

4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ Cordyceps militaris

4

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI

9

1.2.1. Trên thế giới

9

1.2.2. Trong nƣớc

10

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

12

2.1. VẬT LIỆU

12

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

12

2.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH lên sự sinh trƣởng và hàm lƣợng cordycepin của hệ sợi
nấm Cordyceps militaris trong nuôi cấy dịch thể
12
2.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ C:N đến sự sinh trƣởng và tích lũy cordycepin của hệ
sợi nấm Cordyceps militaris trong nuôi cấy dịch thể
13
2.3.3 Phƣơng pháp đánh giá cảm quan thể lạc

13

2.3.4 Phƣơng pháp định lƣợng polysaccharides

14

2.3.5. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng cordycepin

14

2.3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu

15

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

16

3.1. ẢNH HƢỞNG CỦA PH MÔI TRƢỜNG NUÔI ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG CỦA
HỆ SỢI TRONG MÔI TRƢỜNG DỊCH THỂ
16
iii


3.2 ẢNH HƢỞNG CỦA PH MÔI TRƢỜNG NUÔI TỚI HÀM LƢỢNG
POLYSACCHARIDES VÀ CORDYCEPIN ĐƢỢC NUÔI TRONG MÔI TRƢỜNG
DỊCH THỂ
19
3.3 ẢNH HƢỞNG CỦA TỶ LỆ C:N ĐẾN SINH TRƢỞNG CỦA HỆ SỢI NẤM
Cordyceps militaris TRONG MÔI TRƢỜNG DỊCH THỂ
22
3.4 ẢNH HƢỞNG CỦA TỶ LỆ C:N ĐẾN HÀM LƢỢNG POLYSACCHARIDES VÀ
CORDYCEPIN CỦA HỆ SỢI NẤM NUÔI TRONG MÔI TRƢỜNG DỊCH THỂ
24
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

27

1.KẾT LUẬN

27

2.KIẾN NGHỊ

27

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

28

PHỤ LỤC

33

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

APS

Acidic polysaccharide

CMP

Comprehensive metabolic panel

cs

cộng sự

EPS

Exopolysaccharides

LPS

Lipopolysaccharide

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

OD

Optical density

PDA

Potato dextrose agar

v


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng

Tên bảng

Trang

2.1

Thành phần hóa học của mơi trƣờng với các tỷ lệ C:N khác
nhau cho quá trình nuôi cấy lắc của Cordyceps militaris

13

3.1

Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến sự sinh trƣởng của hệ sợi
nấm Cordyceps militaris trong môi trƣờng dịch thể

19

3.2

Ảnh hƣởng của tỷ lệ C:N đến sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm
Cordyceps militaris trong môi trƣờng dịch thể

24

vi


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Tên hình vẽ

Hình

1.1

2.1

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

Sự khác biệt về cấu trúc phân tử giữa cordycepin và
adenosine
Nấm Cordyceps militaris

Trang

6

12

Trọng lƣợng khô của hệ sợi nấm Cordyceps militaris ở các
ngƣỡng pH 5, 6, 7 và 8
Đƣờng kính và mật độ thể lạc cầu của hệ sợi nấm Cordyceps
militaris ở các ngƣỡng pH 5, 6, 7 và 8
Hàm lƣợng polysaccharides nội bào của hệ sợi nấm
Cordyceps militaris ở các ngƣỡng pH 5, 6, 7 và 8
Hàm lƣợng (a) và năng suất (b) cordycepin của hệ sợi nấm
Cordyceps militaris ở các ngƣỡng pH 5, 6, 7 và 8
Trọng lƣợng khô của hệ sợi nấm Cordyceps militaris đƣợc
ni trong các mơi trƣờng có tỷ lệ C:N khác nhau

17

18

20

21

22

Đƣờng kính và mật độ thể lạc của hệ sợi nấm Cordyceps
3.6

militaris đƣợc nuôi trong các môi trƣờng dinh dƣỡng có tỷ lệ

23

C:N khác nhau
Hàm lƣợng polysaccharides nội bào của hệ sợi nấm
3.7

Cordyceps militaris đƣợc nuôi trong các mơi trƣờng dinh

25

dƣỡng có tỷ lệ C:N khác nhau
Hàm lƣợng (a) và năng suất (b) cordycepin có trong hệ sợi
3.8

nấm Cordyceps militaris đƣợc ni trong các mơi trƣờng
dinh dƣỡng có tỷ lệ C:N khác nhau

vii

26


TĨM TẮT

 Trong q trình sinh trƣởng và phát triển của hệ sợi nấm Cordyceps militaris chịu
ảnh hƣởng rất nhiều từ cá yếu tố mơi trƣờng bên ngồi. pH và tỷ lệ C:N trong mơi trƣờng
dinh dƣỡng mang tính quyết định đến nhiều chỉ tiêu năng suất của hệ sợi nấm C.militaris.
Nghiên cứu đƣợc thực hiện để tìm đƣợc ngƣỡng pH và tỉ lệ C:N tối ƣu nhất cho sự sinh
trƣởng hệ sợi nấm, hàm lƣợng cordycepin và polysaccharides của nấm Cordyceps
militaris trong điều kiện nuôi cấy lỏng. Tỷ lệ dinh dƣỡng C:N và pH trong môi trƣờng
nuôi cấy lỏng là những yếu tố có ảnh hƣởng mạnh mẽ đến các chỉ tiêu về đƣờng kính thể
lạc, mật độ thể lạc, sinh khối hệ sợi và đặc biệt là sinh tổng hợp cordycepin và
polysaccharides nội bào của hệ sợi nấm C. militaris. Với điều kiện mơi trƣờng ni cấy
lắc có tốc độ 150 vòng/phút ở 240C, pH 7 đƣợc chứng minh là tối ƣu cho sinh trƣởng của
hệ sợi với sinh khối đạt trọng lƣợng là 10,719 ± 0,24 mg/mL. Hệ sợi nấm nuôi ở môi
trƣờng pH 7 thu đƣợc thể lạc có đƣờng kính (3,1 ± 0,86 mm) và mật độ (14,8 ± 8,44
tl/mL) thích hợp cho việc cấy chuyền nuôi trồng quả thể nấm Cordyceps militaris. Môi
trƣờng pH 6 là tối ƣu cho hệ sợi nấm sản sinh polysaccharides nội bào (9,1 ± 1,14 mg/g).
Năng suất cordycepin của hệ sợi nấm ở mơi trƣờng ni cấy có pH 7 đạt cao nhất với
15,866 ± 0,351 mg/L. Tỷ lệ C:N càng giảm thu đƣợc trọng lƣợng khô hệ sợi càng cao (Tỷ
lệ 12:1 đạt 10,776 ± 0,64 mg/mL) cùng với hàm lƣợng và năng suất cordycepin đạt tối
đa (tỷ lệ 18:1 đạt hàm lƣợng 0,185 mg/g và năng suất 14,997 ± 4,047 mg/L). Ngƣợc lại,
nồng độ polysaccharides nội bào đƣợc sản sinh mạnh mẽ ở mơi trƣờng có tỷ lệ C:N cao
(tỷ lệ 36:1 đạt 7,49 ± 0,23 mg/g).

viii


MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Lồi Cordyceps là nấm kí sinh thuộc họ Clavicipitaceae và ngành Ascomycota (nấm
túi). Các sợi nấm ký sinh phát triển trong cơ thể ấu trùng vào mùa thu, và hình thành bào
tử hữu tính trƣởng thành, gọi là stroma, nhơ ra khỏi cơ thể côn trùng vào mùa hè (Won và
cs, 2005). Các stroma có hoặc khơng có ấu trùng đƣợc sử dụng nhƣ dƣợc liệu điều trị ở
các nƣớc châu Á trong nhiều thế kỷ qua (Buenz và cs, 2005). Vì thế, Cordyceps đƣợc sử
dụng rộng rãi nhƣ một loại thực phẩm bổ dƣỡng, đƣợc chứng nhận nhƣ một loại thuốc bổ
hay thực phẩm chức năng cho sức khỏe ở châu Á. Trong số các loại nấm ký sinh ở sâu
bƣớm, C. sinensis đã nhận đƣợc nhiều sự chú ý do hoạt tính sinh học của nó. Có rất nhiều
tài liệu nghiên cứu về những hoạt tính sinh học của C. sinensis bao gồm tráng dƣơng,
giảm đau, chống ung thƣ, hạ huyết áp và các hoạt động giãn mạch, giảm gốc tự do, và
điều chế miễn dịch (Yu và cs, 2006). Tuy nhiên, C. sinensis tự nhiên rất khan hiếm và
cực kỳ tốn kém. Do đó, nhiều nhà nghiên cứu đã tập trung nỗ lực vào việc tìm lồi thay
thế có giá trị kinh tế hơn (Li và cs, 2006).
Cordyceps militaris là một nấm ký sinh đã nhận đƣợc sự chú ý đáng kể trong những
năm gần đây do đƣợc thừa nhận rằng nó có tác dụng sinh học có đặc tính tăng cƣờng sức
khỏe (Nan và cs, 2001). Các phân tích hố học cho thấy trong sinh khối của Cordyceps
militaris có 17 axit amin khác nhau, lipit và nhiều nguyên tố vi lƣợng thiết yếu. Quan
trọng hơn là trong sinh khối có nhiều hoạt chất sinh học có giá trị cao, đặc biệt phải kể
đến là hợp chất cordycepin có trong quả thể nấm (Tang và cs, 2018). Bên cạnh đó, nhiều
hoạt chất thiết yếu cũng đã đƣợc phát hiện nhƣ adenosine, polysaccharides,
nucleotides, ... Các hợp chất này đƣợc nghiên cứu chứng minh có tác dụng hỗ trợ điều trị
bệnh ung thƣ, điều tiết đƣờng huyết, kiểm soát bệnh tiểu đƣờng và tác động tích cực đến
hệ miễn dịch (Kim và cs, 2003).
Ngoài ra, polysaccharides nội bào và ngoại bào đã đƣợc chứng minh là có tác dụng

ức chế sự phát triển của một số tế bào ung thƣ (Sone và cs, 1985). Các polysaccharides
có khả năng chống lại hoạt động của các tế bào ung thƣ chúng bao gồm homopolymer có
cấu tạo đơn giản đến phức tạp bao gồm glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose,
1


fructose, ribose và acid glucuronic. Nó là chất kích thích miễn dịch mạnh nhất từng đƣợc
biết đến, là một chất phịng chống khối u lành tính và ác tính rất mạnh mẽ, làm giảm
cholesterol và chất béo trung tính, điều hòa lƣợng đƣờng trong máu.
Hiện nay giống nấm Cordyceps militaris ở Việt Nam đã đƣợc nuôi trồng khá phổ
biến. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, nuôi trồng nấm C. militaris sử dụng công nghệ
nhân giống dạng dịch thể mang lại hiệu quả cao, rút ngắn đƣợc thời gian, giảm tỷ lệ
nhiễm và thích hợp cho ni trồng với quy mơ lớn (Kwon và cs, 2009). Tuy nhiên sự
phát triển của hệ sợi tơ nấm trong môi trƣờng dịch thể bị chi phối rất nhiều bởi thành
phần dinh dƣỡng, các yếu tố ngoại cảnh nhƣ ánh sáng, nhiệt độ, pH, tỷ lệ C:N…(Dong và
cs, 2005). Trong đó pH mơi trƣờng đóng vai trò rất quan trọng, ảnh hƣởng trực tiếp đến
sự hình thành tơ nấm trong mơi trƣờng dịch thể, ảnh hƣởng đến chức năng của màng tế
bào, hình thái và cấu trúc tế bào, độ hòa tan của các muối, các ion, sự hấp thụ các chất
dinh dƣỡng và quá trình sinh tổng hợp các chất khác nhau.
Tỷ lệ C:N trong môi trƣờng nuôi cấy ảnh hƣởng đến tốc độ sinh tổng hợp của nhiều
chất chuyển hóa, đặc biệt là sự tăng trƣởng sợi nấm và sản xuất Exo-biopolymer. Trong
một số nghiên cứu, tỷ lệ C:N thấp sẽ thuận lợi cho quá trình sản xuất adenosine và
cordycepin, nhƣng nếu nồng độ nguồn nitơ quá cao sẽ ức chế sản phẩm. Vì thế, sự sinh
tổng hợp cordycepin đƣợc kiểm sốt bởi sự cân bằng giữa các điều kiện nuôi cấy và nồng
độ dinh dƣỡng trong môi trƣờng.
Tuy nhiên, hiện nay vẫn chƣa có nhiều nghiên cứu đánh giá đƣợc mức độ ảnh
hƣởng của các điều kiện nuôi cấy này đến sự sinh trƣởng sợi nấm và sự sinh tổng hợp
cordycepin. Để xác định đƣợc điều kiện mơi trƣờng ni cấy thích hợp nhất cho sản xuất
và lƣu trữ bảo quản giống, tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu ảnh
hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến sự sinh trƣởng và hàm lƣợng hợp chất có

hoạt tính sinh học của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong điều kiện ni cấy lỏng”.

2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Tìm đƣợc ngƣỡng pH, tỉ lệ C:N tối ƣu nhất cho sự sinh trƣởng hệ sợi nấm, hàm
lƣợng cordycepin và polysaccharides của nấm Cordyceps militaris trong điều kiện nuôi
cấy lỏng.

2


3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI

3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài sẽ là dẫn liệu khoa học cho các nghiên cứu sau này về chủng nấm
Cordyceps militaris.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài sẽ cung cấp thêm dữ liệu về quy trình nhân giống cũng nhƣ sản
xuất chủng nấm Cordyceps militaris trên địa bàn thành phố Đà Nẵng.

4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến sinh trƣởng và hàm lƣợng hợp chất có
hoạt tính sinh học của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong môi trƣờng dịch thể.
Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ C:N đến sinh trƣởng và hàm lƣợng hợp chất có hoạt
tính sinh học của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong môi trƣờng dịch thể.

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ Cordyceps militaris
Nấm Cordyceps là một giống nấm túi, đƣợc các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện
lần đầu tiên ở vùng núi cao nguyên Tây Tạng, loại dƣợc liệu quý này thực chất là ấu
trùng các loài bƣớm thuộc chi Thitarodes hoặc Hepialus bị nấm Cordyceps ký sinh. Chi
nấm Cordyceps có tới 350 lồi khác nhau, chỉ riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy 60 lồi
nhƣ C. liangshanensis, C. taishanensis, C. shanxiensis, C. gansuensis, C. grasspara, C.
guizhouensis… Ngồi ra cịn có các chủng C. militaris, C. nutans, C. gunnuii. Tuy nhiên
cho đến nay ngƣời ta chỉ mới nghiên cứu nhiều nhất đƣợc về 2 loài Cordyceps sinensis và
Cordyceps militaris.
Nấm Cordyceps militaris thuộc
Giới
:
Ngành :

Nấm
Ascomycota

Lớp

:

Sordariomycetes

Bộ

:

Hypocreales

Họ

:

Cordycipitaceae

Chi

:

Cordyceps

Lồi

:

Cordyceps militaris

Sinh học và hình thái
Cordyceps militaris kí sinh trên sâu non, có thân hình trụ dài 20-50 mm, chúng có
thân màu vàng sẫm hoặc cam tƣơi. Cordyceps militaris thƣờng xuất hiện vào mùa hè,
mọc ra từ xác sâu non đã chết.
Phân bố
Lồi nấm C. militaris tìm thấy ở vùng núi có độ cao 2000 - 3000 m, thƣờng tìm thấy
Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và các nƣớc trong khu vực Đông Nam Á.
Nấm Cordyceps militaris là loài đƣợc nghiên cứu kỹ nhất trong tất cả các loài của
giống Cordyceps (Kobayashi và cs, 1941). Sự đa dạng về hình thái và khả năng thích
4

nghi của loài này ở nhiều sinh cảnh khác nhau có thể là nguyên do khiến chúng có mặt ở
nhiều vùng địa lý và sinh thái trên trái đất (Kobayashi và cs, 1941; Mains và cs, 1958).
Ký chủ phổ biến của loài C. militaris trong tự nhiên bao gồm ấu trùng và nhộng của
các lồi bƣớm. Trong tự nhiên có nhiều lồi Cordyceps có hình thái tƣơng tự hoặc gần
giống loài C. militaris, bao gồm C. cardinalis và một số loài khác (Sung và cs, 2006).
Hoạt chất sinh học
Các phân tích hóa học cho thấy trong sinh khối của Cordyceps có 17 đến 19 loại
acid amin khác nhau: D - manitol, lipid, một số yếu tố vi lƣợng (Na, K, Ca, Mg, Al, Mn,
Cu, Zn, Bo, Fe… trong đó cao nhất là P). Ngoài ra những hoạt chất làm nên giá trị dƣợc
liệu của Cordyceps đáng kể đến là cordyceptid acid, cordycepin, adenosine,
hydroxyethyl-adenosine, polysaccharide…và một số loại vitamin thiết yếu nhƣ vitamin
B12, vitamin A, vitamin E, vitamin K…
Cordycepin
Cordycepin lần đầu tiên đƣợc tách ra từ C. militaris vào năm 1950 do Cunningham
và cộng sự thực hiện, sau đó chúng cũng đƣợc tìm thấy ở C. sinensis và C. kyushuensis.
Mặc dù cordycepin có thể đƣợc tổng hợp hóa học nhƣng chỉ cho sản lƣợng thấp.
Cordyceps tự nhiên chứa lƣợng cordycepin vào khoảng 0,006 - 6,36 mg/g. Các nhà khoa
học cho biết khi thu nhận trong tự nhiên, nồng độ cordycepin trong quả thể C. militaris
cao hơn C.sinensis với hàm lƣợng lần lƣợt là 2,65 và 1,64 mg/g (Lo và cs, 2013).
Cordycepin là một dẫn xuất của nucleotide adenosine mà tại vị trí 3’ khơng có O
khác với thực thể ribose. Trọng lƣợng phân tử của cordycepin C10H13N5O3 là 251, có
nhiệt độ nóng chảy là 230 - 231oC, độ hấp thụ cao nhất ở 259 nm (Das và cs, 2009).
Cordycepin có thể tan trong saline, cồn hoặc methanol, nhƣng không tan trong benzen,
ether hoặc chloroform, các nhà khoa học thƣờng sử dụng saline khử trùng và đệm
phosphate để hòa tan cordycepin (Zhou và cs, 2009). Cordycepin có khả năng kháng
nấm, kháng ung thƣ và kháng virus. Ngồi ra, khả năng điều hịa sản phẩm của
interleukins trong tế bào lympho T của cordycepin đã đƣợc chứng minh (Masuda và cs,
2006).

5

Adenosine
Adenosine xuất hiện khá nhiều trong quả thể và đƣợc cho là phong phú ở hầu hết
các loài Cordyceps với hàm lƣợng dao động từ 0,28 tới 14,15 mg/g. Khi thu nhận nấm
Cordyceps trong tự nhiên, hàm lƣợng adenosine ở C. militaris cao hơn C. sinensis (Lo và
cs, 2013). Adenosine đƣợc cho là có tác dụng điều hịa miễn dịch, bảo vệ tim mạch
(Shashidhar và cs, 2013).

Hình 1.1. Sự khác biệt về cấu trúc phân tử giữa cordycepin và adenosine
Nucleotides
Nucleotides (gồm có adenosine, uridine và guanosine) là các thành phần khá đa
dạng trong nấm Cordyceps. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, guanosine có hàm lƣợng cao
nhất trong tất cả các mẫu tự nhiên, khi nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo hàm lƣợng của
nucleotide thƣờng cao hơn Cordyceps spp. tự nhiên. Nucleotides trong Cordyceps tự
nhiên bắt nguồn từ sự phân rã của nucleotide trong suốt quy trình bảo quản tiếp đó các
nhà nghiên cứu cũng tìm ra rằng độ ẩm có thể làm tăng đáng kể hàm lƣợng nucleotide
trong Cordyceps khi nuôi trên môi trƣờng rắn (Zhou và cs, 2009).
Polysaccharide
Nấm Cordyceps spp. đƣợc đánh giá cao về giá trị dinh dƣỡng trong sản xuất thực
phẩm chức năng và sản xuất thuốc trong phòng và chữa bệnh. Chứng chứa rất nhiều loại
đƣờng, bao gồm mono-, di- và các oligosaccharide, và nhiều polysaccharides phức tạp.
Các polysaccharides chính trong nấm Cordyceps là một dạng glucans với các mối
liên kết: (⅓) - (⅙) β glucans và (⅓) - 1 - glucans. Mặc dù, vách tế bào nấm là nguồn cung
cấp chính của polysaccharides đã đƣợc chứng minh kháng khối u, trong khi
polysaccharides thu nhận từ thực vật lại khơng có đặc điểm này, điều này chỉ có thể giải
thích đƣợc thơng qua sự khác nhau trong cấu trúc hóa học của các polysaccharides. Các
6

polysaccharides có khả năng chống lại hoạt động của các tế bào ung thƣ chúng bao gồm
homopolymer có cấu tạo đơn giản đến phức tạp bao gồm glucose, galactose, mannose,
xylose, arabinose, fructose, ribose và acid glucuronic. Trong một số loài nấm,
polysaccharides liên kết với các protein hoặc peptide tạo thành các hệ polysaccharide protein hoặc polysaccharide - peptide cấu trúc có hoạt tính kháng u mạnh hơn. Cấu trúc
⅓ - β - glucans có khả năng kháng khối u đƣợc biết đến nhiều nhất, theo các nghiên cứu
cho biết những glucans có đƣợc hoạt tính sinh học này là trong cấu tạo các phân tử có
dạng mạch thẳng hoặc phân nhánh với cấu trúc chính là phân tử đƣờng glucose liên kết
với các đơn vị trong chuỗi tại các vị trí khác nhau, với các chuỗi bên bao gồm các đơn vị
nhƣ acid glucuronic, xylose, galactose, mannose, arabinose hoặc ribose. Heteroglycans là
một nhóm polysaccharides lớn có hoạt tính sinh học đa dạng đƣợc phân loại là galatians,
fucans, xylene và mannans.
Giá trị dƣợc liệu
Các hợp chất dƣợc liệu của loại nấm Cordyceps militaris ứng dụng trong điều trị
bệnh và nâng cao sức khỏe con ngƣời, do đó lồi nấm này có giá trị kinh tế cao. Nấm
Cordyceps militaris rất khan hiếm trong tự nhiên. Vì vậy, việc sản xuất ở quy mô lớn các
chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và điều trị bệnh từ Cordyceps militaris hiện đang là
một vấn đề cấp thiết.
Các hợp chất chống ung thư: Hợp chất cordycepin (3’- deoxyadenosine) từ nấm
cho thấy có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thƣ, ngừa di căn, điều hịa miễn dịch
(Shonkor Kumar và cs, 2010).
Hoạt tính kháng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy hợp chất CM - hs - CPS2 chứa
trong dịch chiết nấm C. militaris có tính kháng DPPH, hoạt tính khử và tạo phức ở nồng
độ (8 mg/ml) là 89%, 1,188 và 85%.
Tăng số lượng tinh trùng: Nghiên cứu trên cho thấy khi dùng chế phẩm từ
Cordyceps militaris, số lƣợng tinh trùng tăng, số phần trăm tinh trùng di động và hình
dạng bình thƣờng tăng. Hiệu quả này đƣợc duy trì thậm chí sau 2 tuần ngƣng sử dụng chế
phẩm. Lƣợng cordycepin trong tế bào tăng trong thời gian sử dụng chế phẩm nên có khả
năng chất này làm tăng lƣợng tinh dịch và chất lƣợng tinh trùng ở lợn (Lin và cs, 2007).

7

Hạn chế virus cúm: Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm Cordyceps
militaris trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng dụng trong điều trị cúm A. Chất
này góp phần điều hòa hoạt động miễn dịch của các đại thực bào (Ohta và cs, 2007).
Kháng khuẩn, kháng nấm và kháng ung thư: C. militaris: protein (CMP) tách chiết
từ nấm có kích thƣớc 12 kDa, pI 5,1 và có hoạt tính trong khoảng pH 7 - 9. Protein này
ức chế nấm Fusarium oxysporum và gây độc đối với tế bào ung thƣ bàng quan (Park và
cs, 2009). Hợp chất cordycepin còn cho thấy khả năng kháng vi khuẩn Clostridium. Các
hợp chất dẫn xuất từ nấm đƣợc mong đợi ứng dụng trong việc điều trị các bệnh nhiễm
khuẩn đƣờng ruột. Cordycepin ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm điều hịa
bệnh tiểu đƣờng thơng qua việc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF - κB,
do đó đƣợc hy vọng sẽ ứng dụng đƣợc nhƣ một chất điều hòa miễn dịch dùng trong điều
trị các bệnh về miễn dịch (Shin và cs, 2009).
Tan huyết khối: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris có
hoạt tính gắn fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin. Enzyme này có khả năng sử
dụng trong điều trị tan huyết khối tƣơng tự nhƣ các enzym fibrinolytic mạnh khác
nhƣ nattokinase và enzyme chiết từ giun đất. Khi enzyme này có thể sản xuất ở quy
mơ lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzyme fibrinolytic giá thành cao
hiện đang đƣợc sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở ngƣời
Tính kháng viêm: Để xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch chiết từ quả
thể nấm Cordyceps militaris đƣợc thử nghiệm về tác dụng kiểm sốt lipopolysaccharide
(LPS) (chịu trách nhiệm kích thích việc sản xuất nitric oxide), việc phóng thích yếu tố
hoại tử khối u α (TNF - α) và interleukin - 6 (IL - 6) của tế bào RAW264,7. Các đại thực
bào đƣợc xử lý với nồng độ khác nhau của dịch chiết làm giảm đáng kể LPS, TNF - α và
IL - 6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch chiết. Những kết quả này cho thấy rằng
dịch chiết có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản xuất các chất trung gian gây viêm của tế
bào.
Các ứng dụng trên lâm sàng của nấm Cordyceps militaris: Mặc dù nấm Cordyceps
sinensis đƣợc sử dụng rộng rãi hơn Cordyceps militaris, tuy nhiên các ứng dụng lâm sàng

của chung cũng khá tƣơng tự nhau. Các chiết xuất từ nấm Cordyceps militaris có thể
đƣợc sử dụng trong các trƣờng hợp suy giảm chức năng phổi, ho có đờm, chóng mặt.
8


1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI
1.2.1. Trên thế giới
Jeong Seok Kwon và cs (2009) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ
Cacbon-nitơ (tỷ lệ C:N) đến sự tăng trƣởng của hệ sợi nấm và sản xuất EPS của
Cordyceps militaris. Để thực hiện khảo sát này, nồng độ glucose và cao nấm men trong
môi trƣờng đƣợc thay đổi tƣơng ứng từ 10 đến 100 g/L và 1 đến 40 g/L. Tỷ lệ C:N dao
động từ 4 đến 10 để xác định mức độ thích hợp cho sự tăng trƣởng sợi nấm và sản xuất
EPS. Kết quả thu đƣợc, tỷ lệ C:N tƣơng ứng là 4 (C:N = 80:20) và 8 (C:N = 80:10) dẫn
đến sự tăng trƣởng hệ sợi nấm và sản xuất EPS đạt cao nhất. Những kết quả này hợp lý
đối với một nghiên cứu trƣớc đó, sự sản xuất EPS đạt tối đa trong điều kiện sử dụng hạn
chế của nguồn nitơ (Kim và cs, 1999). Trong nghiên cứu này, tỷ lệ C:N tối ƣu đƣợc xác
định là 8, tại đây sự sản xuất EPS là tốt nhất mặc dù năng suất sinh khối sợi nấm đạt thấp
hơn (Kwon và cs, 2009).
Vào năm 2007, Ing - Lung Shih và các cộng sự của mình đã thực hiện nghiên cứu
về sự ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp các hoạt
chất sinh học của nấm Cordyceps militaris trong môi trƣờng dịch thể. Kết quả cho thấy,
cao nấm men thích hợp đƣợc chọn làm nguồn nitơ cung cấp dinh dƣỡng cho môi trƣờng.
Khi tăng nồng độ nitơ với pH ban đầu đƣợc giữ ở mức 6 thì trọng lƣợng sinh khối hệ sợi
nấm có sự giảm rõ rệt lần lƣợt là 22,3 mg/L, 16,5 mg/L và 7,8 mg/L tƣơng ứng với với
nồng độ cao nấm là 10 g/L, 15 g/Lvà 30 g/L. Trong khi đó, hàm lƣợng cordycepin thu
đƣợc tƣơng ứng lần lƣợt là 154,8 mg/L, 650,2 mg/L và 590 mg/L và hàm lƣợng
adenosine là 50 mg/l, 70 mg/l và 55,3 mg/l. Điều này chứng tỏ rằng tỷ lệ C:N thấp thích
hợp cho sự tích lũy cordycepin và adenosine; ngoài ra, nồng độ nitơ cao dẫn đến tỷ lệ
C/N quá thấp sẽ làm giảm sinh khối hệ sợi thu đƣợc. Sản lƣợng Cordycepin đạt cao nhất
từng đƣợc báo cáo đạt 1041.5 mg/l khi trong môi trƣờng chứa 10 g/l Glucose và 30g/l cao

nấm men ở pH 5.
Ngƣời ta thấy rằng trọng lƣợng khô sợi nấm với pH 4, 5, 6 và 7 lần lƣợt là 15,2 g/l,
14,1 g/l, 13,9 g/l và 13,6 g/l thu đƣợc tƣơng tự vào ngày 36, 30, 30 và 30. Điều đáng lƣu
ý là độ pH của môi trƣờng thấp hơn so với pH ban đầu trong khi sự tăng trƣởng của hệ
sợi tăng lên khi tiêu thụ Glucose. Những điều này cho thấy sự tăng trƣởng của hệ sợi có
thể là do sự tiêu thụ nguồn carbon, dẫn đến việc sản xuất acid hữu cơ và do đó làm giảm
9


độ pH trong môi trƣờng. Sản lƣợng EPS tối đa là 1,1 g/l, 1,1 g/l, 0,9 g/l và 1,0 g/l, tƣơng
ứng với năng suất sản xuất EPS lần lƣợt là 0,19, 0,19, 0,23 và 0,06 g/(l d) cho pH 4, 5, 6
và 7. Điều này trái ngƣợc với thực tế là sản lƣợng EPS tối đa (0,29 g/l) ở mức pH ban đầu
6,0 và sản lƣợng EPS tối đa (1,25 g/l) ở mức pH ban đầu 8,0. Sản xuất Adenosine tối đa
trong môi trƣờng nuôi cấy lần lƣợt là 50,1, 40,5, 80,6 và 109,7 mg/l, tƣơng ứng với năng
suất sản xuất 10,0, 8,1, 13,4 và 21,8 mg/(l d) cho pH 4, 5, 6 và 7 (Shih và cs, 2007).
Bên cạnh đó, khơng phát hiện đƣợc sự có mặt của adenosine trong môi trƣờng nuôi
cấy C. militaris (Masuda và cs, 2006). Sự sinh tổng hợp cordycepin ngoại bào của
C.militaris bắt đầu sau khi tăng trƣởng tế bào đạt mức tối đa là 315,2, 190,1, 185,2 và
138,3 mg/l, tƣơng ứng với năng suất 12,6, 7,6, 7,41, 5,5 mg/ngày, lần lƣợt ở các ngƣỡng
pH 4, 5, 6 và 7 (Shih và cs, 2007).
Trong nghiên cứu tối ƣu hóa các điều kiện ni cấy dịch thể thích hợp cho sự sinh
trƣởng hệ sợi nấm và sản xuất Exo-biopolymer của Cordyceps militaris, Park và cộng sự
(2001) đã khẳng định rằng tỷ lệ C:N gây ảnh hƣởng đến tốc độ sinh tổng hợp của nhiều
hoạt chất sinh học, sự tăng trƣởng của hệ sợi nấm và sản xuất Exo-biopolymer. Ảnh
hƣởng của tỷ lệ C:N (tỉ lệ khối lƣợng) đối với sản xuất Exo-biopolymer đã đƣợc tiến
hành nghiên cứu bằng cách sử dụng saccharose và bột ngô. Theo nhƣ báo cáo, tỷ lệ C:N
cao hơn thuận lợi cho cả tăng trƣởng sợi nấm và sản xuất Exo-biopolymer. Kết quả thu
đƣợc phù hợp với một quá trình lên men khác để sản xuất polysaccharide; tức là sinh
tổng hợp Xanthan đƣợc tối ƣu bởi tỷ lệ C:N cao (Schweickart và cs, 1989). Bên cạnh đó,
ơng cũng tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của pH ban đầu đến sự sinh trƣởng hệ sợi và

sản xuất Exo-biopolymer. Ngƣỡng pH 6 đƣợc khẳng định là ngƣỡng pH thích hợp nhất
trong mơi trƣờng ni cấy dịch thể. Có nhiều báo cáo cho rằng, đa số các loại nấm phát
triển tối ƣu nhất ở mơi trƣờng lỏng có pH acid (Yang và cs, 2000; Yang và cs, 1998).
Nhiệt độ thích hợp đƣợc cố định trong nghiên cứu này là 20 oC. Vì các loại nấm thƣờng
địi hỏi thời gian dài trong q trình ni cấy lỏng, điều đó khiến chúng dễ bị nhiễm bẩn
và nhiễm khuẩn, thế nên tối ƣu hóa ở nhiệt độ thấp tạo điều kiện thuận lợi cho các hoạt
động sinh lý của chúng diễn ra ổn định (Park và cs, 2001).

1.2.2. Trong nƣớc
Tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu đƣợc tiến hành để khảo sát điều kiện môi
trƣờng ni cấy đến q trình sinh trƣởng và tích lũy các hợp chất sinh học quý hiếm của
10


Cordyceps militaris. Nhƣ ở đề tài nghiên của Trần Thu Hà (2016), các điều kiện nuôi cấy
nhƣ pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ, tốc độ lắc trong môi trƣờng dịch thể đều đƣợc khảo
sát và đánh giá thông qua sinh khối hệ sợi, mật độ, đƣờng kính thể lạc cầu. Kết quả cho
thấy, trong môi trƣờng dịch thể, pH tốt nhất cho sinh trƣởng của giống nấm Cordyceps
militaris là 6. Đƣờng saccharose và glucose là nguồn carbon tối ƣu cho sự phát triển của
nấm Cordyceps militaris. Nguồn dinh dƣỡng nitrogen từ nhộng tằm đƣợc đánh giá là tốt
nhất, tốc độ lắc 160 rpm (vòng/phút) phù hợp cho sự phát triển hệ sợi và tích lũy hoạt
chất của nấm Cordyceps militaris (Trần Thu Hà và cs, 2016).

11


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU
Giống nấm Cordyceps militaris đƣợc nuôi cấy và nhân giống tại phịng Cơng nghệ

sinh học nấm, thuộc Khoa Sinh - Môi trƣờng, Đại học Sƣ Phạm - Đại học Đà Nẵng.

Hình 2.1. Nấm Cordyceps militaris

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH lên sự sinh trƣởng và hàm lƣợng
cordycepin của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong nuôi cấy dịch thể
Để tìm tiến hành pha mơi trƣờng lỏng có sinh trƣởng của hệ sợi cao nhất với pH
khác nhau (pH 5, 6, 7 và 8) vào bình tam giác 250ml với thể tích mơi trƣờng 100ml/bình.
Mơi trƣờng PDA đƣợc hấp khử trùng ở 121oC trong vòng 20 phút, để nguội rồi tiến hành
cấy giống và nuôi cấy ở điều kiện lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở phòng lạnh 24 oC. Tiến
hành đánh giá cảm quan và thu nhận sinh khối sau 7 ngày. Sinh khối đƣợc sấy khô đến
khối lƣợng không đổi ở 50oC và tiến hành thu dữ liệu trọng lƣợng khô.
12


Bố trí thí nghiệm với 4 nghiệm thức (pH = 5, 6, 7 và 8), mỗi nghiệm thức 3 bình
tam giác. Thí nghiệm lặp lại 5 lần.

2.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ C:N đến sự sinh trƣởng và tích lũy
cordycepin của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong ni cấy dịch thể
Tiến hành pha mơi trƣờng lỏng có sinh trƣởng của hệ sợi cao nhất với các tỷ lệ C/N
khác nhau (12:1, 18:1, 24:1, 36:1 và 48:1) vào bình tam giác 250 ml với thể tích mơi
trƣờng 100ml/bình. Mơi trƣờng đƣợc hấp khử trùng ở 121oC trong vòng 20 phút, để
nguội rồi tiến hành cấy giống và nuôi cấy ở điều kiện lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở
phòng lạnh 24oC. Tiến hành đánh giá cảm quan và thu nhận sinh khối sau 7 ngày. Sinh
khối đƣợc sấy khô đến khối lƣợng không đổi ở 50o C và tiến hành cân trọng lƣợng khơ.
Bảng 2.1. Thành phần hóa học của môi trƣờng với các tỷ lệ C:N khác nhau cho q
trình ni cấy lắc của Cordyceps militaris (Wu và cs, 2004).
STT

Tỷ lệ C:N Glucose (g/l) C% Cao nấm men (g/l) N% Tổng (g/l)

1

12:1

26,9

10,8

7,10

0,88

34

2

18:1

28,8

11,5

5,17

0,64

34

3

24:1

30,0

12,0

4,0

0,5

34

4

36:1

31,2

12,5

2,8

0,35

34

5

48:1

31,8

12,7

2,15

0,27

34

Bố trí thí nghiệm với 5 nghiệm thức (tỷ lệ C:N = 12:1, 18:1, 24:1, 36:1 và 48:1),
mỗi nghiệm thức 3 bình tam giác. Thí nghiệm lặp lại 5 lần.

2.3.3. Phƣơng pháp đánh giá cảm quan thể lạc
Tiến hành lấy 5ml dịch thể hệ sợi nấm cho vào đĩa peptri, thu nhận hình ảnh và tiến
hành xử lý bằng phần mềm ImageJ. Đánh giá cảm quan thể lạc qua kích thƣớc, mật độ
khuẩn lạc.
Thể lạc có chất lƣợng tốt: hạt đồng đều có đƣờng kính từ 1 - 2 mm.
Thể lạc không đạt yêu cầu: hạt không đồng đều, kích thƣớc cầu lớn hơn 3 mm.
Hút lấy 1 thể lạc cầu trong mỗi bình và tiến hành đo đƣờng kính (mm).

13


2.3.4. Phƣơng pháp định lƣợng polysaccharides
Thu 2g sinh khối khô của hệ sợi nấm để tiến hành tách chiết và định lƣợng
polysaccharides nội bào. Sau khi nghiền nát mẫu thêm 10 mL nƣớc cất và siêu âm hỗn

hợp trong vòng 30 phút ở nhiệt độ phịng để trích ly polysaccharides. Ly tâm hỗn hợp
trên với máy ly tâm lạnh trong 10 phút với tốc độ 5000 vòng/phút. Thu 2ml dịch chiết và
kết tủa bằng cồn 96o. Ly tâm thu lấy phần kết tủa và tái hòa tan bằng 1mL nƣớc cất.
Tạo mẫu định lƣợng bằng cách bổ sung 1mL phenol 5% và 5 mL H2SO4 đặc, để
yên ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Tạo mẫu đối chứng tƣơng tự bằng cách thay dịch
chiết bằng 2mL nƣớc cất. Tiến hành phƣơng pháp đo OD ở bƣớc sóng 488nm. Từ hiệu số
giá trị OD (488nm) giữa dịch mẫu và đối chứng sẽ tính đƣợc nồng độ polysaccharides có
trong mẫu. Bằng cách so sánh với giá trị OD (λ = 488nm) của glucose (100 - 200 mg/mL)
đƣợc dùng làm chất chuẩn (Pawar và cs, 2011).

2.3.5. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng cordycepin
Sinh khối khô hệ sợi nấm sau khi thu đƣợc nghiền thành bột bảo quản ở nhiệt độ
4oC. Tiến hành hòa 2 g sinh khối khô vào 20 mL nƣớc cất và siêu âm 3 giờ ở nhiệt độ
phịng để trích ly cordycepin. Mẫu sau khi trích ly đƣợc ly tâm tại 4000 vòng/phút trong
vòng 15 phút tại 4oC, thu dịch nổi. Tái hịa tan dịch chiết trong 5mL dung mơi (nƣớc cất
và acetone với tỷ lệ 95:5 (v/v)), lọc qua màng lọc 0,45 μm, thu dịch lọc và tiêm vào hệ
thống HPLC (Wang và cs, 2016).
Dịch chiết chứa cordycepin đƣợc định lƣợng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Alliance (Waters e2695 Separations Module). Cột phân tích: Cột Symmetry C18 (4.6 x
250 mm, kích thƣớc hạt 5 μm). Nhiệt độ cột duy trì ở 35oC. Pha động gồm nƣớc cất và
Acetone (tiêu chuẩn HPLC) với tỷ lệ 95:5 (v/v). Tốc độ dịng: 1ml/phút. Detector UVVIS (Enable 3D Data), bƣớc sóng 260,3 nm. Thể tích tiêm 2,5 μL.
Hàm lƣợng cordycepin đƣợc định lƣợng theo phƣơng pháp với đƣờng chuẩn đƣợc
dựng bằng cordycepin chuẩn của nhà cung cấp.
Mẫu chuẩn: Cordycepin (C10H13N5O3) của nấm Cordyceps militaris đƣợc mua từ
Sigmaaldrich. Cordycepin đƣợc hòa tan trong nƣớc cất và pha loãng thành các nồng độ
khác nhau bao gồm 30 và 50 ppm để lập đƣờng chuẩn. Kết quả ta thu đƣợc có phƣơng
trình hồi quy y = ax

b.
14

Vẽ đồ thị đƣờng chuẩn biểu diễn của hàm lƣợng cordycepin. Dựa vào đồ thị đƣờng
chuẩn có thể xác định đƣợc hàm lƣợng cordycepin trong mẫu nghiên cứu.

2.3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập đƣợc phân tích thống kê mô tả bằng phần mềm. Sự sai khác có ý
nghĩa thống kê giữa các nhóm nghiệm thức đƣợc khảo sát bằng phân tích phƣơng sai
ANOVA và phân tích hậu định Tukey's Test. Các bƣớc xử lý số liệu đều đƣợc thực hiện
trên phần mềm R (Team, R. C, 2010).

15