Ứng dụng công nghệ sinh học trong sinh tổng hợp một số Flavonoid glycosides có hoạt tính y dược học

<span class='text_page_counter'>(1)</span><div class='page_container' data-page=1>

ỨNG D NG CÔNG NGHỆ SINH HỌG TRONG SINH TỎNG HỢP MỘT SỎ

FLAVONOID GLYCOSIDES CĨ HOẠT TÍNH Y D ư ợ c HỌC

TS. Nguyễn H uy Thuần*
TÓM T T

Glycosides là các họp chất hố học có cấu trúc gồm phân tử đường gắn với phần còn lại có bản chất khác nhau như
steroid, flavonoid, térpenoid hoặc alkaloid, v.v. Glycosides được phát hiện chù yếu ở thực vật có mạch và xạ khuẩn
(actinomycetes) đưới dạng các chất trao đổi thứ sinh và có hoạt tính y được học quan trọng. Ví đụ, các chất flavonoid
glycosides tách chiết từ gừng, đưa hấu, nghệ có tác dụng chống oxy hố, kháng khuẩn, kháng viêm, v.v. Do đó, nhu cầu
về sử dụng hợp chất glycosides trong nghiên cứu và thực tiễn (thực phẩm ăn kiêng, thuốc chữa bệnh, kháng sinh) ngắy
càng tăng cao. Tuy vậy, các phương pháp tách chiết hoá học để sản xuất ra glycosiđes có nhiều hạn chế đã dẫn đến giá
thành sản phẩm tăng cao, khó tiếp cận. Bời vậy, chúng tôi tiến hành áp dụng các biện pháp công nghệ sinh học hiện đại
để sinh tổng họp glycosides nhằm đa dạng hoá sản phẩm, tãng năng suất và hướng tói phát triển cơng nghệ sản xuất các
hợp chất này ở Việt Nam, đặc biệt trong lĩnh vực dược học.

* Từ khố: Vi khuẩnEsch richia coli;Cơng nghệ DNAtáitổ họp; Flavonoid; Glycosides.

A pp lica tio n o f b io t chn o lo g ica l aprroa ch fo r b iosynth sis o f fla v o n o id glycosid s,
th rap utically valuabl ag nts

Sum m ary

Structurally, glycosides are consisting of sugar molecule linking with the remaining one like steroid, flavonoid,
terpenoid or alkaloid, etc. These compounds are ubiquitous in vascular plants and actinomycetes as secondary metabolites and
own lots of significantly medical and pharmaceutical effects. As an example, flavonoid glycosides obtained from ginger,
watermelon and turmeric display anti­oxidant, anti­inflammatory, anti­bacterial properties, etc. Thereby, requirement
for glycosides have been increasing in the science as well as in the human life (diet foods, drugs, antibiotics). However,
chemical method for glycosides extraction still have much restricts and in this manner obtained products are of high
cost as well as limiting their commercial available. We have applied modern biotechnological methods for biosynthesis
of flavonoid glycosides using recombinantEsch richia colias hosts. It is proven as a feasible approach for structural

diversification, improvement of productivity as well as green technology for synthesis of glycosidcs. Furthermore,
we are setting up the bases to scale up production of these valuable compounds in Vietnam.

* Key words:Esch richia coli,Recombinant DNA technology; Flavonoid; Glycosides.
I. ĐẶT VÁN ĐÈ

v ề phương diện trao đổi chất, quá tr nh chuyển hoá của rất nhiều hợp chất như steroid, terpenoid,
alkaloid, etc thường dẫn tới phản ứng gắn phân tử đường khác nhau (glycosylation) vào các chất này để tạo
ra phân tử glycoside tan tốt trong nước, cớ hoạt tính bền vững và tham gia trong nhiều quá tr nh sinh lý, sinh
hoá của cơ thể sinh vật. Những hợp chất này vốn là thành phần quan trọng của cây thuốc như quercetin và
kaempferol (Phạm Thanh Kỳ và c s , 2005; Bachir và c s , 1992). Trước đây, người ta thường sử dụng dạng
hợp chất thô cùa glycosides như lấy dịch chiết nhưng hiệu quả thu được chưa cao. Ngày càng có nhiều nghiên
cứu đề cập đến vai trò của các glycosides như chất kháng ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn và chống oxy hoá
mạnh (Kren và c s , 2001; Di Carlo và CTV, 1999; Fuchs và c s , 1993; Lê Thị Diễm Hồng và c s , 2007) và do đó,

</div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>

nhu cầu với nhóm hợp chất này tăng lên. Tuy nhiên, phương pháp tách chiết hoá học với nhược điểm phụ
thuộc vào nguồn cung thực vật, hàm lượng glycoside cần tách chiết thấp, tinh sạch phức tạp đã không tạo ra
được sản lượng glycosides lớn (Srivastava và

cs,

2009).

Phương pháp tổng hợp hố học cũng có những hạn chế như tạo ra sản phẩm là hỗn hợp nhiều dẫn xuất,
khó thiết lập điều kiện phản ứng, tinh sạch tốn kém và đòi hỏi nhiều thời gian (Ren và

cs,

2012). Bởi vậy,
giá thành cùa glycosides trên thị trường khá cao, khó tiếp cận.

Những năm gần đây, do sự phát triển của các ngành thuộc công nghệ sinh học như công nghệ gen và
protein tái tổ hợp, công nghệ vi sinh... đã tạo ra bước đột phá cho phép sinh tổng họp hàng ioạt các hợp chất
glycoside khác nhau góp phần tạo ra sự đa dạng hoá sản phẩm, tăng năng suất và điều quan trọng nó là cơng
nghệ sạch, ít gây ơ nhiễm môi trường. Trong báo cáo này, chứng tôi mô tả một số thành tựu sinh tổng họp
flavonoid glycosides đã được thực hiện và các bước xây dựng cơ bản đã và đang được tiến hành tại Trường
Đại học Duy Tân (Đà Nằng) nhằm hướng tới sản xuất các hợp chất glycosides tại Việt Nam bằng biện pháp
công nghệ sinh học.

1

2

3

H nh l. Cấu trúc của một số hợp chất flavonoid dùng trong thí nghiệm sinh tổng họp flavonoid glycosides.
1: apigenein; 2: baicalein; 3: myricetin

II.

ĐÓI

TƯỢNG VÀ PHƯƠNG

PH Á P

NGHIÊN c ứ u

2.1.Đối tượng nghiên cứu

Sinh tổng hợp một số hợp chất flavonoid glycosides từ cơ chất chọn lựa ban đầu (h nh 1) bằng biện pháp
công nghệ sinh học.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

* Sinh tổng hợp các flavonoid glycosides: Phương pháp chuyển hóa cơ chất sử dụng trực tiếp tế bào vi
khuẩn E.coỉỉ tái tổ hợp. Nguyên tắc căn bản của phương pháp này là chuyển gen mã hóa cho flavonoid
glycosyltransferase vào trong vi khuẩn E.coli. Đồng thời, vi khuẩn này cũng được cải biến các gen tham
gia vào chuỗi sinh tổng hợp phân tử đường (UDP­glucose hoặc TDP­rhamnose). Thí nghiệm được bắt đàu
bằng việc ni cấy vi khuẩntrên trong mơi trường dinh dưỡng thích hợp, sau đó khi mật độ vi khuẩn đạt
đến ngưỡng nhất định th sẽ bổ sung cơ chất là các flavonoid (myricetin, apigenein hoặc baicalein).
Vi khuẩn chuyển hóa các chất này thành dạng glycosides tương ứng, rồi giải phóng ra mơi trường
(h nh 2a, 2b). Sử dụng các phương pháp tách chiết, phát hiện sản sân phẩm như TLC, HPLC, LC­ESI/MS
(Thuanvà

cs,

2013).

</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3>

OH

O il Õ
Mỵrỉcctin

Recombtiwrt E. coil 8121<DEjy ^^iJfV /A iO T ­J Jỉữ

H nh 2a. Sơ đồ mô phỏng quá tr nh chuyển hóa, tổng hợp myricetin­3­O­L­rhamnosides ờ ví khuẩn

E. coỉitái tổ hợp. Trong đó, các gen tham gia vào quá tr nh sinh tổng hợp TDP­L­rhamnose từ D­g ucose bao
gồm:h xos kinas (HK),phosphoglyc rat mutas (PGM),TDP-gỉucos synthas (TGS),d hydrog n as

(DH), pim ras (EP) và k tor ẩuctas (KR). Những gen này được tăng cường biểu hiện trong vi khuẩn

E. coli nhờ sự góp mặt của chúng trong các plasmid tái tổ hợp như pAC­EPKR, pCDTGSDH. Gen mã hoá
cho rhamnosyltransferase được biểu hiện nhờ vector tái tổ hợp pGT. Vi khuẩnE. coỉisẽ hấp thụ myricetin từ
mơi trường, sau đó, xảy ra quá tr nh gắn phân tử đường TDP­rhamnose vào myricetin tại vị trí 3­OH nhờ sự
có mặt của enzym glycosyltransferase ưên. Quá tr nh tạo sản phẩm xảy ra trong nội bào. Sau đó glycoside
được xuất ra mơi trường ngoài.

</div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>

glucos -l-phosphat uridyltransf ras và glucosyltransferase (tách từ Arabìdopsỉs). Sản phẩm được tạo
thành là apigenein­7­ỡ­glucoside và baicalein­7­ỡ­glucoside. Một số gen tham gia vào chuỗi trao đổi chất
nhánh bên đã bị xố để nhằm tăng tích luỹ ƯDP­glucose nội bào nhưD-gỉucos phosphat ỉsom ras (pgi),

UDP-glucos hydrolas (ushA) vàD-gỉucos -6-phosphat d hydrog n as (zwf).

* Các phư ng pháp nghiên cứu thực nghiệm:Sử dụng các thao tác kỹ thuật di truyền hiện đại được mô tả
theo protocol chuẩn (Sambrook và c s , 2001) trong việc cắt, nối, nhân các đoạn gen mong muốn (PCR). Hàm
lượng các cơ chất được sử dụng cho chuyển hoá là 100 fiM. Phương pháp sắc ký để phát hiện, đo hàm lượng và
tinh sạch sản phẩm được mô tả chi tiết theo các tài liệu (Simkhada và

cs.

2010; Thuan và

cs.

2013).

m . K ẾT QUẢ

* Sinh tong hợp 3 hợp chatflavonoid glycosid s:

Bằng phương pháp được tiến hành như mơ tả ờHình
2a và 2by chúng tôi đã sử dụng gen 3­ỡ­rhanmosyl
glycosyltransferase biến nạp vào chủng vi khuẩnE. coỉi

MG3, đồng thời chủng vi khuẩn này cũng được cài biến
con đường sinh tổng hợp đường TDP­L­rhamnose để
tăng sinh nhiều hơn loại đường này. Cuối cùng, chúng
tôi thu được chủng tái tổ hợpE. coỉiM3G3. Chủng này
sau đó được sử dụng để chuyển hóa cơ chất thuộc nhóm
flavonol là myricetin, và cho ra sản phẩm là myricetin­
3­O­L­rhamnoside. Sản phẩm này được phát hiện, đo
hàm lượng bằng phương pháp sắc ký TLC, HPLC và
LC­ESI/MS (h nh 3a, 3b, 3c). Hàm lượng sản phẩm tối
đa thu nhận được là 55,6 ỆiM.

i 2

m ỵricetm

m ỉd cetm -th ao m osỉđe

H nh 3a. sắc ký lớp mỏng (TLC) của myricetin
và dẫn xuất rhamnosiđes (2) so với đối chứng (1).

A

iĩ

+

_{Ả H}

1

_A (12hí

... _ A ...

ử

|Ị

_(24hí

________/ t _

ử

ẳ Ầ ..

h (36h)

..._

a

a_.

+

1

ủ

h

ị*m

ứ

h

(60h)

6 ỉ 10 n 14 it II 20

H nh 3b: Phân tích HPLC q tr nh chuyển hố myricetin (khoảng phút thứ 8)
thành rayricetm­3­O­L­rhamnosiđe (khoảng phút thứ 10)

</div>
<span class='text_page_counter'>(5)</span><div class='page_container' data-page=5>

Oil

[Myricclín­3­f>­rỉ)atti K>s dc]'

46S.10ỈI

1 _{Ọ » T}

p »K

319.0444

rnm

1 IB MI «s «1 a ĩ» ỉe 260 % 3JJ a 3« Ỉ60 so « eo

w

I HI SĐQ S20'

m/z

H nh 3c. Dữ liệu LC­ESI/MS của phân tử myricetin­3­O­rhamnoside

Tương tự, chúng tôi đã tiến hành thiết kế và tạo ra chủng E. coli MA3F mang gen mã hóa cho

1-0-glucosyltransferase từArabidopsis thaỉỉana.Chuỗi gen sinh tổng hợp UDP­Đ­glucose cũng được cải biến để
tăng cường tích lữy hợp chất này. Vi khuẩn được sử dụng như một nhà máy tế bào (microbial factory) thực
hiện chuyển hóa 2 cơ chất thuộc nhóm flavones là apigenein và baicalein thành sàn phẩm tương ứng là
apigenein­7­O­glucoside và baicalein­7­ơ­ghicosiđe. Các sản phẩm này được phát hiện, đo hàm lượng bằng
phương pháp TLC, HPLC, LC­ESI/MS (H nh 4a, 4b, 4c, 4d, 4e). Hiệu suất chuyển hóa các chất này trong
điều kiện tối ưu lần lượt là 90,88 và 76,82 %tương ửng với 90,88 và 76,82 |iM .

1 2 3

*

</div>
<span class='text_page_counter'>(6)</span><div class='page_container' data-page=6>

Re

lat

ive

a

bn

jjd

ao

ce

(

Vi

)

Minutes

H nh 4b. Dữ liệu HPLC phân tích sự chuyển hố apigenin (khoảng phút thứ 5)
thành glucoside tương ứng (khoảng phút thứ 9)

' W í r
1

271.0620

120^812. J46.0617225.0650 247.Ị44Ô

m trn n TTTtmi IT*>y

433.1144

272,0543

7

273.0664 9MIWI]
. 331.2108 368 0061

434.1173_/

^35-1188 521.1299

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

l l/z

H nh 4c. Dữ liệu LC­ESI/MS của phân từ apigenin­7­O­glucosiđe

</div>
<span class='text_page_counter'>(7)</span><div class='page_container' data-page=7>

H nh 4e. Dữ liệu LC­ESI/MS của phân tử baicalein­7­O­glucoside

IV. M Ộ T SÓ NỘ I DUNG N G HIÊN

c ứ u

ĐÃ VÀ ĐANG ĐƯỢC TR I N K H AI TẠ I ĐẠI HỌC
DUY TÂN

Phương pháp và kết quả nghiên cứu sinh tổng hợp glycosiđes đă tr nh bày ở trên có ý nghĩa quan trọng
giúp cho tác giả và

c s

có cơ sở thiết lập phịng thí nghiệm, máy móc thiết bị, chủng giống vi khuẩn, vật liệu
di truyền và các hóa chất liên quan. Bắt đầu từ tháng 01 năm 2012, cho đến nay, nhờ sự đầu tư đặc biệt của
Hội đồng quản trị và lãnh đạo của Ban giám hiệu nhà trường, chúng tôi đã xây dựng được Phịng thí nghiệm
Sinh học phân tử với các thiết bị hiện đại, đồng bộ phục vụ cho nghiên cứu và giảng dạy. Cụ thể với các thí
nghiệm làm sinh tổng hợp glycoside nói riêng và các hợp chất có hoạt tính nói chung, chúng tơi đã đầu tư
đầy đủ các trang thiết bị, vật tư thí nghiệm để làm tách dòng (gen cloning), biểu hiện gen, làm thí nghiệm
sinh tổng hợp in­vitro hoặc in­vivo. Ngồi ra, các thiết bị phục vụ cho nghiên cứu phát hiện, tách chiết, tinh
sạch cũng đă được đầu tư như TLC, HPLC, cột tinh sạch và vật tư đi kèm, thiết bị lên men, chưng cất và
đông khô. Hiện nay, chúng tôi đang triển khai sinh tổng hợp một số dẫn xuất cùa flavonoid như flavonoid
glycoside, flavonoid bị methyl hóa hoặc các họp chất carotenoid. Hướng ưu tiên của chúng tồi là thiết lập
quy tr nh sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học bằng sử dụng các biện pháp công nghệ sinh học hiện
đại tập trung đầu tư trọng điểm cho lĩnh vực dược học.

V. K ẾT LUẬN

</div>
<span class='text_page_counter'>(8)</span><div class='page_container' data-page=8>

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Lê Thị Diễm Hồng, Nguyễn Thị Hồng Nhiên, Nguyễn Thị Hồng Vân, Nguyễn Viết Thân và Nguyễn Xuân Thắng,
2007. Nghiên cứu tác đụng chống viêm mạn của saponin và flavonoid cây kim ngân(Lonic rajaponicaThunb.). Tạp chí
dược học, 378, tr.24­29.

2. Phạm Thanh Kỳ, Phí Tùng Lâm và Vũ Thị Nguyệt Minh, 2005. Kết quả nghiên cứu về flavonoid trong lá mức
hoa Irắng (Holarrhena anditysenterica wall­Apocynaceae). Tạp chí Thơng tin Y được, 11, tr.25­27.

3. Bachir B; Albert JC; Mourad K; and Francois T. 1992. FJavonoid glycosides from Erica cinerea. Phytochemistry.
31, pp.2483­2486.

4. Di Carlo G; Mascolo N, Izzo, AA; and Capasso F 1999. Flavonoids: old and new aspects of a class of natural
therapeutic drugs. Life Science, 65, pp.337­353.

5. Fuchs J, Milbrađt R, 1993. Skin anti­inflammatory activity of apigenein­7­glucoside in rats. Aizneimittelforschung,
43, pp.370­372.

6. KrenV, Martinkova L. 2001. Glycosides in medicine: the role of glycosidic residue in biological activity. Current
Medicial Chemistry. 8, pp.1303­1328.

7. Nguyen Huy Thuan, 2013. Synthesis of flavonoid and sterol glycosides by biotransformation, (doctoral dissertation),
Sun Moon University, Korea.

8. Ren G, Hou J, Fang Q, Sun H, Liu X, Zhang, L, and Wang PG (2012). Synthesis of flavonoi 3­O­glycoside by
UGT78D1. Glycoconjugate Journal, 29, pp.425­432.

9. Sambrook J, Russell D

w,

2001. Molecular cloning: A laboratory manual. 3rdedition.Cold Spring: Harbor Laboratory
Press NewYork, USA.

10. Sirakhada D, Lee HC, Sohng JK., 2010. Genetic engineering approach for the production of rhamnosyl and
allosyi fiavonoids from Escherichia coll. Biotechnology and bioengineering, 107(1), pp.154­62.

11. Srivastava, JK, Gupta,

s,

2009. Extraction, characterization, stability and biological activity of fiavonoids
isolated from chamomile flowers. Molecular and celỉular Pharmacology, , pp.138.

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI MƠ u TRÊN CHUỘT

THIẾU H T MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƯ THANH QUẢN NGƯỜI

Ths. Nguyễn T hị B ình*

H ư ởng dẫn; PGS. TS. Trịnh Xn Đàn*

TĨM T T

Ung thư biểu mô thanh quản là bệnh lý ác tính thường gặp đứng thứ hai trong các ung thư vùng đầu cổ sau ung thư
vòm. Xuất phát từ thực tế, tại Việt Nam vẩn đề tạo mô h nh ung thư biểu mô thanh quan người trên chuột nuđe chưa
được nghiên cứu nhiêu. Chính v vậy, chúng tơi tiên hành nghiên cứu này với 2 mục tiêu: Xây đựng mô h nh tạo khối
ung thư thanh quản người trên chuột thiểu hụt miễn dịch bằng kỹ thuật ghép dị lồi; Mơ tả đặc điểm h nh thái mả u trên
chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư thanh quản người.

Đối tưọ­ng và phương pháp nghiên cứu: 10 chuột nhắt BALB/c thiếu hụt miễn dịch, khơng có tế bào lympho T
(nude mice, Foxnlnu) được nhập khẩu từ Công ty Charles­River (Hoa Kỳ). Dòng tế bào úng thư biểu mô thanh quản
n p ố i Hep­2 được mua từ công ty ATCC, Hoa Kỳ. Tiến hành tiêm vào dưới đa đui bên phải mỗi chuột dung dịch chứa
tê bào ung thư với số lượng lx 106 tế bào/chuột cho tổng số 10 con chuột. Sau đó theo dõi sự h nh thành khồi u ưên
chuột và lấy mô u làm giải phẫu bệnh sau ghép 4 tuần.

Kết quả: 10 ngày sau ghép tế bào, 10/10 (Ỉ00%) chuột h nh thành khối u, kích thước khối u đạt 37,2±7,1 mm3
Sau 4 tuần, các khối u phát triển đạt kích thước trung b nh 593,6±117,2 mm3. Trên tiêu bản nhuộm HE: tế bào uCO

h nh đa điện, nhân to nhỏ không đều, tăng kiềm tính, chất màu thơ đậm, nhiều h nh ảnh nhân chia bất thường tỷ lẹ
nhân so với bào tương lớn. Một sổ nơi tế nào u bị loạn sừng và tạo thành cầu sừng. Quan sát mô u trên kính hien vi điện
tửừuỵền qua cho thấy tế bào ung íhư có h nh cầu, h nh bẩú dục hoặc h nh đa diện trong đó có nhân lớn chiếm gần 2/3
mỗi tể bào phản ánh tỷ iệ hạt nhân cao. Một số tế bào ung thư có h nh ảnh lõm hạt nhân.

* Đại học Y Dược Thái Nguyên

</div>

<!--links-->