Tạo mẫu sinh phẩm đông khô và đánh giá tiêu chí của mẫu ngoại kiểm sử dụng trong chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm pcr hbv hcv
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.08 MB, 80 trang )
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----------------
NGUYỄN THỊ NGỌC HIẾU
TẠO MẪU SINH PHẨM ĐƠNG KHƠ VÀ ĐÁNH GIÁ TIÊU CHÍ CỦA
MẪU NGOẠI KIỂM SỬ DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH NGOẠI
KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM PCR HBV - HCV
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
------------------
NGUYỄN THỊ NGỌC HIẾU
TẠO MẪU SINH PHẨM ĐƠNG KHƠ VÀ ĐÁNH GIÁ TIÊU CHÍ CỦA
MẪU NGOẠI KIỂM SỬ DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH NGOẠI
KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM PCR HBV - HCV
Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất
Mã số: 8720210
Luận văn Thạc sĩ Dược học
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN HỮU TÂM
PGS.TS. VĨNH ĐỊNH
Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018
.
.
MỤC LỤC
KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT ............................................................................ v
DANH MỤC HÌNH .................................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG .................................................................................... ix
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Mục tiêu tổng quát .................................................................................... 1
2. Mục tiêu cụ thể .......................................................................................... 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 3
1.1. Tổng quan tình hình bệnh Viêm gan do siêu vi ........................................ 3
1.2. Viêm gan do siêu vi B (HBV) ................................................................. 4
1.3. Viêm gan do siêu vi C (HCV) ................................................................. 8
1.4. Đồng nhiễm HBV và HCV .................................................................... 12
1.5. Xét nghiệm chẩn đoán viêm gan do siêu vi............................................ 13
1.6. Kiểm soát chất lượng và đảm bảo chất lượng trong phát hiện và chẩn
đoán bằng phương pháp sinh học phân tử ..................................................... 15
1.7. Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm ................................................... 18
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 24
2.1. Đối tượng .............................................................................................. 24
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................. 37
3.1. Tạo mẫu sinh phẩm đông khô ................................................................ 37
3.2. Kết quả kiểm tra độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu HBV và HCV.... 39
.
.
3.3. Ứng dụng triển khai chương trình ngoại kiểm ....................................... 54
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN .......................................................................... 58
4.1. Độ đồng nhất ......................................................................................... 58
4.2. Độ ổn định ............................................................................................. 58
4.3. Biện luận kết quả ................................................................................... 59
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
.
.
KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT
STT
1
2
Viết tắt
Tên đầy đủ tiếng Anh
ALT
Alanin transaminase
Anti-HBc Antibody to Hepatitis B
virus Core
Dịch nghĩa tiếng Việt
Enzyme chuyển nhóm amin của alanin
Kháng thể lõi của siêu vi viêm gan B
3
Anti-Hbe
Antibody to Hepatitis B
virus Envelop
Kháng thể vỏ của siêu vi viêm gan B
4
Anti-HBs
Antibody to Hepatitis B
virus surface
Kháng thể bề mặt của siêu vi viêm
gan B
5
Antibody to Hepatitis C
virus
Branched DNA
College of American
Pathologists
Kháng thể viêm gan C
6
7
AntiHCV
bDNA
CAP
8
cccDNA
DNA vịng kín đồng hóa trị
9
cDNA
Covalently-close circular
DNA
Complementary
deoxyribonucleic acid
10
CLIA
Clinical Laboratory
Improvement Amendments
Các sữa đổi cải tiến phòng xét nghiệm
lâm sàng
11
12
13
Ct
DNA
EDTA
Chu kỳ ngưỡng
14
ELISA
Threshold cycle
Deoxyribonucleic acid
Ethylene-diamine-tetra
acetic acid
Enzyme-linked
immunosorbent assay
15
EMQN
European Molecular
Genetics Quality Network
Mạng lưới chất lượng di truyền phân
tử Châu Âu
16
ER
Endoplasmic reticulum
Lưới nội sinh chất
17
18
HbeAg
HbsAg
19
20
21
HBV
HCV
HCVAg
Hepatitis B virus E antigen
Hepatitis B virus surface
antigen
Hepatitis B virus
Hepatitis C virus
Hepatitis C virus Core
antigen
Kháng nguyên lõi Siêu vi viêm gan B
Kháng nguyên bề mặt Siêu vi viêm
gan B
Siêu vi viêm gan B
Siêu vi viêm gan C
Kháng nguyên lõi của viêm gan C
Nhánh DNA
Ban nghiên cứu bệnh học Hoa Kỳ
DNA bổ sung
Kỹ thuật miễn dịch gắn kết enzyme
.
.
22
HIV
Human immunodeficiency
virus
Siêu vi gây suy giảm miễn dịch ở
người
23
24
25
26
27
IC
IgC
IgG
IgM
ILAC
Internal control
Immunoglobulin C
Immunoglobulin G
Immunoglobulin M
International Laboratory
Accreditation Cooperation
Mẫu chứng nội
Globulin miễn dịch nhóm C
Globulin miễn dịch nhóm G
Globulin miễn dịch nhóm M
Hiệp hội cơng nhận phịng thí nghiệm
quốc tế
28
IUPAC
International Union of Pure Hiệp hội hóa học quốc tế
and Applied Chemistry
29
30
mRNA
NRL
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
Messenger ribonucleic acid
National Serology
Reference Laboratory
PXN
Laboratory
PCR
Polymerase chain reaction
RNA
Ribonucleic acid
rt-PCR
Reverse transcription PCR
TMA
Transcription-mediated
amplification
tRNA
Transportribonucleic acid
TTKCXN Center for Standardization
and Quality control in
Medical laboratory of
Hochiminh city
UKNEQ United Kingdom National
AS
External Quality
Assessment.
WHO
World Health Organization
(+)
Positive
(-)
Negative
RNA thơng tin
Phịng xét nghiệm tham chiếu huyết
thanh quốc gia
Phòng xét nghiệm
Phản ứng khuếch đại chuỗi
PCR phiên mã ngược
Khuếch đại qua trung gian phiên mã
RNA vận chuyển
Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm
Chương trình ngoại kiểm tra chất
lượng của Vương Quốc Anh
Tổ chức Y tế thế giới
Dương tính
Âm tính
.
i.
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Biểu tượng ngày Viêm gan Thế giới ........................................................ 3
Hình 1.2. Bản đồ dịch tễ vùng phân bố HBV ........................................................... 4
Hình 1.3. Mơ hình cấu tạo HBV .............................................................................. 5
Hình 1.4. Cấu trúc phân tử HBV.............................................................................. 6
Hình 1.5. Chu kỳ xâm nhiễm và tái bản của HBV ................................................... 7
Hình 1.6. Phân bố nhiễm HCV trên thế giới ............................................................ 9
Hình 1.7. Cấu tạo HCV ......................................................................................... 10
Hình 1.8. Cấu trúc phân tử ở HCV......................................................................... 11
Hình 1.9. Chu trình xâm nhiễm và tái bản HCV .................................................... 12
Hình 1.10. Vịng trịn thẩm định phương pháp chẩn đốn bằng PCR ..................... 16
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tổng quát sản xuất mẫu ngoại kiểm HBV-HCV ............. 34
Hình 3.1. Lọ đơng khơ mẫu huyết thanh HBV (+) ................................................. 38
Hình 3.2. Lọ đơng khơ mẫu huyết thanh HCV (+) ................................................. 38
Hình 3.3. Lọ đơng khơ mẫu huyết thanh HCV (-), HBV (-) ................................... 38
Hình 3.4. Biểu đồ nồng độ mẫu HBV để đánh giá độ đồng nhất ............................ 39
Hình 3.5. Biểu đồ nồng độ mẫu HCV để đánh giá độ đồng nhất ............................ 40
Hình 3.6. Biểu đồ nồng độ mẫu HBV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 25oC ....... 41
Hình 3.7. Biểu đồ nồng độ mẫu HBV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 4oC .......... 43
Hình 3.8. Biểu đồ nồng độ mẫu HBV lưu trữ 30 ngày ở 4oC và 25oC ................... 44
Hình 3.9. Nồng độ mẫu HCV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 25oC .................... 46
Hình 3.10. Nồng độ mẫu HCV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 4oC .................... 48
Hình 3.11. Biểu đồ nồng độ mẫu HCV lưu trữ 30 ngày ở 4oC và 25oC .................. 50
.
.i
Hình 3.12. Biểu đồ phịng xét nghiệm phân tích mẫu HBV ................................... 53
Hình 3.13.Biểu đồ đánh giá độ đồng nhất mẫu HBV tại các phịng xét nghiệm tham
gia ngoại kiểm………..………………….………………..……....………………..55
Hình 3.14. Biểu đồ đánh giá độ đồng nhất mẫu HCV tại các phòng xét nghiệm tham
gia ngoại kiểm………………………………………………………………...........57
.
.
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1.Kết quả đo nồng độ mẫu HBV để đánh giá độ đồng nhất………………. 39
Bảng 3.2.Kết quả đo nồng độ mẫu HCV để đánh giá độ đồng nhất………………. 39
Bảng 3.3. Nồng độ mẫu HBV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 25oC……………. 41
Bảng 3.4. Nồng độ mẫu HBV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 4oC………........... 42
Bảng 3.5. Nồng độ mẫu HBV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 4oC và 25oC……. 43
Bảng 3.6. Nồng độ mẫu HBV trong thời gian lưu trữ 3 tháng ở 25oC và 4oC…….. 45
Bảng 3.7. Nồng độ mẫu HCV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 25oC……………. 46
Bảng 3.8. Nồng độ mẫu HCV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 4oC……………... 47
Bảng 3.9. Nồng độ mẫu HCV trong thời gian lưu trữ 30 ngày ở 4oC và 25oC……. 49
Bảng 3.10. Nồng độ mẫu HCV trong thời gian lưu trữ 3 tháng ở 25oC và 4oC…… 51
Bảng 3.11. Nồng độ mẫu HBV và HCV qua quá trình vận chuyển 7 ngày……….. 52
Bảng 3.12. Nồng độ mẫu HBV và HCV kiểm tra tại một số PXN…………........... 52
Bảng 3.13. Kết quả đo nồng độ mẫu PB0301 tại các phòng xét nghiệm tham gia
ngoại kiểm …………………………......……………....…………………………..54
Bảng 3.14. Kết quả đo nồng độ mẫu PB0302 tại các phòng xét nghiệm tham gia
ngoại kiểm……………………………………………..…………………………...55
Bảng 3.15. Kết quả đo nồng độ mẫu PC0301 tại các phòng xét nghiệm tham gia
ngoại kiểm…………………………………………………….................................56
Bảng 3.16. Kết quả đo nồng độ mẫu PC0302 tại các phòng xét nghiệm tham gia
ngoại kiểm……………………………………………….........................................57
Bảng 4.17. Kết quả độ ổn định của mẫu HBV-HCV qua các chỉ số thống kê……..59
.
.
MỞ ĐẦU
PCR là một kỹ thuật hiện đại, có giá trị chẩn đoán cao và cho kết quả nhanh trong
xét nghiệm chẩn đoán các bệnh nhiễm vi khuẩn, siêu vi. Đặc biệt trong việc chẩn
đoán và điều trị bệnh viêm gan do siêu vi các loại B, C, phương pháp PCR ngày
càng được sử dụng phổ biến do tính ý nghĩa và hiệu quả trong chẩn đoán và theo
dõi điều trị thông qua giá trị hàm lượng và khả năng tái bản của siêu vi có trong
mẫu bệnh phẩm. Khả năng định lượng siêu vi chính xác phụ thuộc vào nhiều yếu tố,
có thể bao gồm: kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu đến phòng xét
nghiệm; kỹ thuật ly trích và thực hiện xét nghiệm; thiết bị và hóa chất. Do đó để đạt
được kết quả đáng tin cậy, phịng xét nghiệm phải tham gia chương trình ngoại
kiểm để kiểm tra và so sánh kết quả xét nghiệm với các phòng xét nghiệm khác sử
dụng cùng kỹ thuật và thiết bị.
Trên thế giới đã có một số cơ quan, tổ chức như NRL (Úc), EuroGentest (Châu Âu),
American Society for Microbiology (Mỹ) triển khai chương trình ngoại kiểm tra
chất lượng xét nghiệm chẩn đoán bằng PCR. Tuy nhiên việc tham gia các chương
trình cịn nhiều trở ngại do chi phí cao và khó khăn trong vận chuyển mẫu.
Chương trình ngoại kiểm đã được triển khai tại Việt Nam vài năm gần đây cho các
lĩnh vực xét nghiệm Sinh hóa, Huyết học, Vi sinh… nhưng vẫn chưa áp dụng đối
với lĩnh vực Sinh học phân tử nói chung và kỹ thuật PCR nói riêng vì chưa có bất
kỳ tổ chức hoặc công ty nào cung cấp mẫu ngoại kiểm hoặc chương trình ngoại
kiểm tra chất lượng trong lĩnh vực xét nghiệm chẩn đốn bằng kỹ thuật PCR. Do
đó, đề tài “Tạo mẫu sinh phẩm đông khô và đánh giá tiêu chí của mẫu ngoại
kiểm sử dụng trong chƣơng trình ngoại kiểm tra chất lƣợng xét nghiệm PCR
HBV – HCV” nhằm phục vụ chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm
PCR cho các phòng Xét nghiệm Y khoa được thực hiện với:
1. Mục tiêu tổng quát
Tạo mẫu sinh phẩm đông khô đáp ứng các yêu cầu của mẫu ngoại kiểm dùng trong
kiểm tra chất lượng xét nghiệm định lượng PCR HBV – HCV.
.
.
2. Mục tiêu cụ thể
a. Tạo mẫu sinh phẩm đông khô từ huyết thanh người nhiễm HBV, HCV và huyết
thanh người không mang bệnh.
b. Đánh giá độ đồng nhất mẫu sinh phẩm đông khô, xác định độ ổn định của mẫu
trong điều kiện bảo quản ở nhiệt độ phòng (25oC) và bảo quản bằng thiết bị mát
(4oC), trong thời gian 1 tháng và 3 tháng.
c. Ứng dụng triển khai chương trình ngoại kiểm.
.
.
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan tình hình bệnh Viêm gan do siêu vi
Viêm gan là sự viêm nhiễm ở gan do nhiều nguyên nhân trong đó chủ yếu do nhiễm
siêu vi, có 5 loại siêu vi gây viêm gan chính được xem như các loại viêm gan: A, B,
C, D và E. Đây là các loại viêm gan được quan tâm nhiều nhất do gánh nặng về
bệnh tật và tử vong, đặc biệt hai loại viêm gan B và C là nguyên nhân dẫn đến hàng
triệu người bị viêm gan cấp tính và mãn tính và là căn nguyên của bệnh xơ gan và
ung thư gan.
Viêm gan A và E chủ yếu lan truyền qua đường tiêu hóa do thực phẩm hoặc thức
uống bị nhiễm siêu vi. Trong khi viêm gan B, C và D thường do tiếp xúc với dịch
cơ thể. Kiểu lan truyền chính của các loại siêu vi này bao gồm tiếp nhận máu và các
sản phẩm của máu bị nhiễm, sử dụng các thiết bị y tế bị nhiễm siêu vi, sự lây nhiễm
viêm gan siêu vi B từ mẹ sang con trong giai đoạn mang thai và sinh nở, giữa các
thành viên trong gia đình và qua quan hệ tình dục.
Ngày 28 tháng 7 năm 2011 được xem là ngày đầu tiên chính thức của Tổ chức Y tế
Thế giới đánh dấu sự gia tăng nhận thức và hiểu biết về viêm gan do siêu vi [21].
Hình 1.1. Biểu tượng ngày Viêm gan Thế giới
.
.
1.2. Viêm gan do siêu vi B (HBV)
1.2.1. Dịch tễ học
Mặc dù đã có vaccine phịng chống HBV từ năm 1982 và hiệu quả của vaccine đạt
đến 95% trong việc ngăn ngừa nguyên nhân gây ung thư đứng hàng thứ 5 trên thế
giới; ước tính hiện nay vẫn có khoảng 2 tỉ người nhiễm siêu vi viêm gan B và
khoảng 350 triệu người chuyển sang dạng mãn tính, trong đó có khoảng 600 ngàn
người tử vong hàng năm [9].
Tần suất nhiễm HBV khác nhau trên thế giới và được chia thành 3 vùng dịch tễ [1]
- Vùng dịch lưu hành thấp (Tây Âu, Bắc Mỹ, Úc): bệnh hiếm ở trẻ em; 3-5 %
người có anti-HBs; 0,1-0,5% người mang HBsAg mãn tính;
- Vùng dịch lưu hành vừa (Địa Trung Hải, Trung Đông, Nam Mỹ, Đông Âu, các
nước thuộc Liên Xô cũ): 20-50% người có anti-HBs; 2-7% người mang HBsAg
mãn tính;
- Vùng dịch lưu hành cao (Trung Quốc, Đông Nam Á, cận sa mạc Sahara): thường ở
trẻ sơ sinh; 70-95% người có anti-HBs; 8-15% người mang HBsAg mãn tính.
Hình 1.2. Bản đồ dịch tễ vùng phân bố HBV
.
.
1.2.2. Đặc tính cấu tạo và sinh sản của HBV
Siêu vi viêm gan B (HBV) là một thành viên tiêu biểu trong họ Hepaviridae - siêu
vi có vật chất di truyền là bộ gen DNA dùng tế bào gan làm vật chủ; tuy đơi khi có
thể tìm thấy lượng nhỏ DNA của HBV trong thận, lách và tế bào đơn nhân nhưng
thực ra tế bào gan mới là đích thực sự của chúng.
Dạng hạt hồn chỉnh (virion) của HBV có cấu tạo vỏ kép đường kính 42nm với lớp
vỏ ngồi là lipoprotein cấu thành bởi 3 loại glycoprotein vỏ (hay cịn gọi là kháng
ngun bề mặt- HBsAg) [19].
Hình 1.3.Mơ hình cấu tạo HBV
Bên trong vỏ này là nucleocapsid (hay còn gọi là kháng nguyên lõi- HBeAg). Lõi
chứa bộ gen của siêu vi và enzym polymerase đóng vai trị tổng hợp DNA siêu vi
trong tế bào bị xâm nhiễm. Chính việc giải trình tự bộ gen HBV DNA mà người ta
phân biệt được các kiểu gen dựa trên cấu trúc epitope của HBsAg – tạo nên các
.
.
phân type khác nhau (ayr, adr, adw, adyw, adwr, aywr, ay…) thường phân bố đặc
trưng theo vùng địa lý. Nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy phân type ayr và adr
chiếm lần lượt là 60 % và 17 %, còn lại các phân type khác chiếm tỷ lệ rất nhỏ.
Bộ gen của HBV là một phân tử DNA vịng có cấu trúc mạch kép khơng hồn tồn,
kích thước 3,2 Kb, được cấu tạo bởi 2 sợi có chiều dài khơng bằng nhau. Chuỗi dài
nằm ngồi có cực âm tính, tạo nên một vịng trịn liên tục có chiều dài cố định là
3,2Kb và mã hố cho các thơng tin di truyền của siêu vi. Chuỗi ngắn nằm trong có
cực dương tính thay đổi và chỉ bằng 50-80% chiều dài sợi âm. HBV có cấu tạo nhỏ
gọn do có sự tiết kiệm trong cấu trúc bộ gen nhờ cách sắp xếp những miền giao của
các gen S, C, P và X nên có khả năng tổng hợp được nhiều protein của siêu vi [20].
Hình 1.4.Cấu trúc phân tử HBV
+
Gen S: bao gồm vùng S, Pre-S1; Pre-S2 mã hoá tổng hợp các HBsAg;
Đoạn gen S tổng hợp nên protein S (Small). Đây là protein chủ yếu chiếm đa số.
.
.
+
Đoạn gen S và Pre-S2 tổng hợp nên protein M (Medium). Vùng Pre-S2 giúp
cho siêu vi bám dính và xâm nhập vào trong tế bào gan nhờ nó liên kết với một
loại albumin hiện diện trong huyết thanh người.
+
Đoạn S, Pre-S1, Pre-S2 tổng hợp nên protein L (Light).
Gen C mã hố các protein của nucleocapsid. Gen C có 2 đoạn là đoạn trước
nhân và đoạn nhân.
+
Đoạn trước nhân tổng hợp HbeAg;
+
Đoạn nhân tổng hợp HbcAg.
Gen P là gen lớn nhất chiếm 80% chiều dài bộ gen mã hoá cho DNA-polymerase.
Gen X tổng hợp HbxAg.
Khả năng nhân bản DNA bộ gen của HBV nằm chủ yếu ở khả năng phiên mã
ngược RNA trung gian [22].
Hình 1.5.Chu kỳ xâm nhiễm và tái bản của HBV
.
.
(1) Phần vỏ của HBV bám vào màng tế bào gan nhờ sự nhận biết của thụ thể trên
màng tế bào gan, sau đó HBV hịa nhập với protein màng của tế bào gan và xâm
nhập vào tế bào gan.
(2) Sau khi vào tế bào chất, chỉ có phần lõi chứa DNA và men DNA polymerase đi
vào nhân tế bào gan.
(3) Tại nhân tế bào gan, DNA được sửa chữa để tạo thành DNA vịng khép kín
(covalently-close circular DNA = cccDNA).
(4) cccDNA được xem là khuôn để sao chép RNA của HBV.
(5) mRNA được giải mã tạo thành các protein của HBV (protein lõi, polymerase,
protein X, protein bề mặt siêu vi) trong tế bào chất.
(6) Protein lõi (core protein) bao bọc RNA tiền genome (RNApregenome) và men
polymerase tạo thành capsid (7).
(8,9) RNA tiền genome sẽ sao chép ngược thành DNA.
(10) Capsid chứa DNA mới được tổng hợp này có thể phóng thích DNA vào nhân
tế bào gan để tạo thành cccDNA.
(11) DNA sẽ được ghép thêm phần vỏ bọc trong mạng lưới nội bào (endoplasmic
reticulum = ER) và thể Golgi sau đó phóng thích ra khỏi tế bào gan dưới dạng
virion hoàn chỉnh.
1.3. Viêm gan do siêu vi C (HCV)
1.3.1. Dịch tễ học
Viêm gan do siêu vi C (HCV) là nguyên nhân của phần lớn các trường hợp được
biết đến như viêm gan không A, không B. Lây nhiễm viêm gan siêu vi C chủ yếu
xảy ra qua đường máu (90%), lây qua vật dính máu và vơ trùng kém, dùng chung
kim trong tiêm chích ma túy (70%) và qua đường tình dục [4].
Theo ước tính của Tổ chức y tế thế giới (WHO), tỷ lệ nhiễm HCV trên thế giới
là 2,2%, khoảng 170 triệu người. Tính đến năm 2015 có đến 3 triệu người Mỹ đã
.
.
nhiễm HCV trên 20 năm, trong đó có ít nhất có 375.000 người xơ gan. Tỷ lệ nhiễm
HCV đưa đến xơ gan là 15 - 20% sau 20 năm, tỷ lệ càng tăng nếu thời gian nhiễm
càng lâu, nếu nhiễm hơn 60 năm thì xơ gan là 71% . Đa số người châu Á nhiễm lúc
mới sinh thường bị xơ gan lúc trung niên; sau khi bị xơ gan do HCV tỷ lệ đưa đến
ung thư gan 1,4 - 3,3% mỗi năm và tử vong 2,6 - 4% mỗi năm [4].
Hình 1.6.Phân bố nhiễm HCV trên thế giới
1.3.2. Đặc tính cấu tạo, xâm nhiễm và tái bản của HCV
HCV với vật chất di truyền là sợi đơn RNA của chủng Flavivirus, bao gồm các siêu
vi viêm gan khác (siêu vi gây bệnh sốt vàng da) và các siêu vi gây bệnh không liên
quan đến viêm gan siêu vi C (chẳng hạn siêu vi West Nile). RNA của siêu vi C chứa
1 khung đọc. Chuỗi polypeptid được tách thành kháng nguyên lõi và kháng nguyên
vỏ và một số protein không cấu trúc (NS) bao gồm enzym tổng hợp, enzym protease
và thụ thể đáp ứng interferon. Siêu vi có một lớp vỏ lipoprotein bên ngồi bao bọc
một capsid 20 mặt có đường kính 56nm. Hệ gen của siêu vi gồm một dây xoắn
RNA nhận biết dương tính chứa khoảng 9600 nucleotid [8].
.
.
Hình 1.7.Cấu tạo HCV
Hệ gen của siêu vi C gồm 2 vùng:
Vùng cấu trúc nằm ở đầu 5’ phần không sao mã gồm các gen C, E1, E2, P7 các
gen mã hoá cho các protein cấu trúc của siêu vi.
Vùng không cấu trúc nằm ở đầu 3’ phần khơng sao mã có các gen NS2, NS3,
NS4, NS5 là các gen mã hoá cho các protein chức năng protease, RNA–polymerase
và các peptid tham gia vào quá trình sao chép siêu vi và các đoạn polyprotein [18].
.
.
Hình 1.8.Cấu trúc phân tử ở HCV
Nhiễm HCV có 10-15% khỏi bệnh, 20% người lành mang siêu vi, 60-70% viêm gan
mãn tính trong đó có 20% xơ gan và 3-5% ung thư gan nguyên phát [1]. HCV có
thể phát triển thành 1 dạng xơ gan hiện nay ở mức trung bình khoảng 1,5 đến 3
trường hợp/ năm. Tại Bắc Mỹ, Châu Âu và Nhật Bản, bệnh viêm gan siêu vi C là
nhân tố nguy cơ phổ biến nhất trong việc tiến triển của HCV.
Việc ngăn ngừa viêm gan siêu vi C cho thấy khó khăn hơn so với HIV và HBV.
Tuy nhiên, 80% tỷ lệ mắc bệnh viêm gan siêu vi C cấp tính đã được giảm trong các
thập kỷ qua, điều đó được chứng minh qua việc xét nghiệm máu từ những người
hiến máu bị bệnh viêm gan siêu vi C và thực hiện an toàn nhằm giảm nguy cơ lây
nhiễm. Đã có những cải tiến đáng kể trong việc điều trị viêm gan siêu vi C [3].
.
.
Hình 1.9.Chu trình xâm nhiễm và tái bản HCV
Chu trình xâm nhiễm và tái bản HCV bắt đầu từ việc nhận biết siêu vi hiện diện và
xâm nhiễm vào tế bào gan ở người, sau khi được tiếp nhận và RNA siêu vi phân
tách độc lập với bộ gen. RNA HCV được dịch mã bằng các ribosome của tế bào chủ
để sản sinh ra chuỗi polypeptide của HCV. Chuỗi polypeptide sẽ được giải mã nhờ
vào các enzym peptidase của tế bào chủ sau đó enzym protease của siêu vi NS2 và
NS3 sẽ chuyển mã thành 10 loại protein khác nhau của HCV. Protein không cấu
trúc NS2-NS5b tương đồng và định vị bên trong tế bào gan để hình thành nên phức
hợp tái lập để sản xuất hàng loạt RNA HCV. Các RNA bản sao này có thể tái xâm
nhiễm và sản xuất nhiều HCV nữa.
1.4. Đồng nhiễm HBV và HCV
Khoảng 2% đến 10% cá thể nhiễm bệnh viêm gan C thường nhiễm luôn cả viêm
gan B. Trong số những người bị viên gan B mãn tính có 15% đến 20% cũng bị viêm
gan C. Nét đặc trưng về lâm sàng và xét nghiệm của những bệnh nhân bị đồng
nhiễm HBV và HCV hơi trái ngược và khác với những cá thể chỉ bị nhiễm một loại
bệnh viêm gan. Các bệnh nhân đồng nhiễm viêm gan có lượng siêu vi thấp hơn so
.
.
với những bệnh nhân mắc một loại bệnh viêm gan. Trong số những cá thể mắc bệnh
viêm gan B mãn tính thì những cá thể bị nhiễm thêm bệnh viêm gan C cấp tính có
khả năng tiến đến mãn tính chiếm tỷ lệ thấp hơn. Những đặc trưng này được thừa
nhận là có lợi trong căn bệnh đồng nhiễm. Ngược lại, những bệnh nhân bị đồng
nhiễm viêm gan B và C mãn tính sẽ nhanh chóng tiến triển thành bệnh xơ gan.
Những bệnh nhân bị đồng nhiễm viêm gan B và viêm gan C cấp tính thì thường bị
viêm gan cấp tính nặng hơn.
Nhiều nghiên cứu cho rằng tần số xuất hiện cao của việc sao chép DNA siêu vi
HBV trong tế bào gan thậm chí trong sự vắng mặt của HBsAg. Chẳng hạn như
những bệnh nhân đồng nhiễm HBV và HCV cận lâm sàng cho thấy tổn thương gan
nghiêm trọng hơn và tần số chuyển thành bệnh xơ gan cao hơn. Mặc dù những phát
hiện được cho rằng hậu quả của những bệnh nhân đồng nhiễm viêm gan B và C
dường như nặng hơn là nhiễm một loại siêu vi.
1.5. Xét nghiệm chẩn đoán viêm gan do siêu vi
Viêm gan B, C có số lượng xét nghiệm chẩn đốn cao nhất trong các loại viêm gan do
siêu vi. Xét nghiệm gần đây bao gồm chủ yếu là phương pháp huyết thanh học như miễn
dịch gắn kết enzym (ELISA) hoặc các phương pháp liên quan đến các kỹ thuật định
lượng kháng nguyên siêu vi hoặc kháng thể, tuy nhiên hiện nay xét nghiệm sinh học
phân tử dựa trên phát hiện và định lượng acid nucleic được sử dụng rộng rãi hơn và được
sử dụng để đánh giá theo dõi, tiên lượng và điều trị hiệu quả.
Hiện nay, có hai phương pháp phổ biến trong việc xét nghiệm xác định viêm gan
HBV, HCV dựa trên chỉ số huyết thanh học và nồng độ siêu vi trong dịch cơ thể là
chẩn đoán bằng huyết thanh học và chẩn đoán bằng sinh học phân tử [4],[8].
1.5.1. Chẩn đoán bằng huyết thanh học
Xét nghiệm kháng thể với bệnh viêm gan do siêu vi là xét nghiệm sàng lọc chủ yếu
sử dụng phương pháp ELISA nhằm phát hiện sự hiện diện của các kháng thể với
một hoặc nhiều kháng nguyên. Mặc dù, xét nghiệm ban đầu chỉ xác định được một
kháng thể đối với một kháng nguyên riêng lẻ, những xét nghiệm tiếp theo sử dụng
.
.
kháng nguyên từ các vùng khác nhau của bộ gen để xác định diễn tiến của huyết
thanh học trong đáp ứng với sự xâm nhiễm của siêu vi.
Ví dụ: kháng thể đối với kháng nguyên lõi của viêm gan B (anti-HBc) thường được
phát hiện là dấu hiệu đáp ứng của hệ miễn dịch chống lại sự xâm nhiễm của HBV
và là dấu hiệu duy nhất được tìm thấy ở những người tiêm vaccine viêm gan B.
Thời gian kháng thể HBc xuất hiện bền hơn kháng thể HBs trong nhiễm bệnh tự
nhiên và khả năng tồn tại là 97% trong các cá thể đã bị nhiễm trước đây 30 năm sau
khi tiếp xúc. Những hướng dẫn gần đây của WHO cho rằng những người có hệ
miễn dịch ln ln đạt được anti-HBs 10 IU/ml hoặc nhiều hơn sẽ có khả năng
miễn dịch lâu dài với viêm gan B. Kháng nguyên viêm gan B (HBsAg) và kháng
thể với kháng nguyên vỏ (anti-HBe) thường được sử dụng trong chẩn đoán việc
chuyển sang HBV mãn tính.
1.5.2. Chẩn đốn bằng phƣơng pháp sinh học phân tử
Phát hiện và định lượng siêu vi viêm gan B và C bằng kỹ thuật PCR- khuếch đại
trình tự DNA hoặc RNA đích của siêu vi hiện diện trong dịch cơ thể người bị nhiễm
siêu vi ngày càng phổ biến khơng chỉ do phương pháp này có đặc điểm chính xác
cao mà cịn do tính hiệu quả trong việc theo dõi điều trị.
Năm 2001, WHO đã thiết lập tiêu chuẩn cho kỹ thuật khuếch đại HBV DNA; trong
đó, xét nghiệm bằng phương pháp PCR có các ngưỡng phát hiện được thấp nhất
trong khoảng 100 bản sao/ml. Tuy nhiên chưa xác định rõ chu kỳ nào của HBV
DNA được biểu thị cho siêu vi trong máu về phương diện lâm sàng. Có hai hướng
dẫn được thực hiện trong lâm sàng chọn 100.000 bản sao/ml là mức độ lâm sàng
xác định siêu vi trong máu. Ở hầu hết những người mang mầm bệnh HBV, 97% có
HBV DNA dưới 100.000 bản sao/ml và 89% các cá thể có lượng HBV DNA trên
100.000 bản sao/ml không thể xác định rõ siêu vi với phương pháp điều trị bằng
kháng thể siêu vi. Dữ liệu này khuyến khích với giá trị 100.000 bản sao/ml là mức
trung bình lý tưởng để xác định siêu vi trong máu. Khả năng đáp ứng thấp có thể
.
.
xảy ra trong việc điều trị với những người có hàm lượng HBV DNA dưới 100.000
bản sao/ml sau ba tháng điều trị.
Xét nghiệm chẩn đoán HCV bằng phương pháp sinh học phân tử được chia thành
định tính và định lượng. Tiêu chuẩn quốc tế chú trọng cho việc định lượng RNA
HCV, kết quả định lượng RNA HCV được dựa trên tiêu chuẩn quốc tế và và sử
dụng đơn vị quốc tế/milliliter (IU/ml). Mối liên quan giữa IU/ml và bản sao/ml khác
nhau đáng kể với phương pháp định lượng khác nhau. Các kết quả sử dụng đơn vị
IU/ml trong khoảng 1lg với 90% mẫu nhưng thường xuất hiện những kết quả trái
ngược nhau. Mãi đến gần đây, xét nghiệm định tính có giới hạn phát hiện thấp hơn
so với xét nghiệm định lượng. Tuy nhiên, một vài xét nghiệm định lượng có giới
hạn phát hiện tương đương hoặc thấp hơn so với xét nghiệm định tính. Hiện nay, độ
nhạy trong xét nghiệm định lượng liên quan đến sự khuếch đại sao chép trung gian
(TMA) với giới hạn phát hiện là 5 IU/ml. Về giá trị thương mại, sao chép ngược,
định lượng phản ứng chuỗi enzym tổng hợp (rt-PCR) có giới hạn xác định là
50 IU/ml. Hai xét nghiệm định lượng có giá trị thương mại là định lượng rt-PCR
với giá trị đo từ 500 đến 500.000 IU/ml và định lượng bDNA với phạm vi dao động
từ 615.000 đến 8.000.000 IU/ml. Một số xét nghiệm khác có sẵn các thuốc thử dùng
cho việc phân tích hoặc được cung cấp từ phịng xét nghiệm tham chiếu có ngưỡng
phát hiện thấp hơn tương tự như các phương pháp định tính, giới hạn phát hiện trên
tương đương hoặc cao hơn định lượng DNA.
Các thử nghiệm gần đây nhất dựa trên việc sử dụng phản ứng chuỗi polymerase
theo thời gian thực (Realtime-PCR) có thể phát hiện các lượng nhỏ RNA HCV
xuống đến 10 IU/ml và định lượng chính xác nồng độ RNA HCV lên đến
khoảng 10 7 IU/ml.
1.6. Kiểm soát chất lƣợng và đảm bảo chất lƣợng trong phát hiện và chẩn đoán
bằng phƣơng pháp sinh học phân tử
Đối với phương pháp sinh học phân tử, kiểm soát chất lượng cần thiết trong việc
phát hiện các yếu tố kìm hãm phản ứng khuếch đại, để đánh giá việc chiết tách acid
.
.
nucleic trong quá trình chiết tách mẫu bệnh phẩm và để xác định mức độ phân hủy
của acid nucleic trong quy trình chiết tách. Do đó cần phải có chứng dương và
chứng âm trong tất cả các giai đoạn của xét nghiệm (theo khuyến cáo của CLIA 88).
Đối với xét nghiệm định lượng, một mẫu chứng âm và hai mẫu chứng dương với
nồng độ khác nhau là bắt buộc trong mỗi lần chạy mẫu. Việc thất bại trong đạt được
kết quả đúng của bất kỳ mẫu chứng nào đều được xem như là lần chạy mẫu đó
khơng có kết quả. Chứng dương nên có nồng độ acid nucleic liên quan đến các số
liệu lâm sàng và phải ở gần ngưỡng phát hiện được của phép thử. Mẫu chứng dương
được xem như là mẫu bệnh nhân và cũng có thể sử dụng để kiểm chứng q trình
chiết tách.
Hình 1.10.Vịng trịn thẩm định phương pháp chẩn đoán bằng PCR
Một số mẫu chứng dương có sẵn hiện nay bao gồm mẫu bệnh nhân đã được xác
định nồng độ bằng phương pháp tương tự, mẫu chứng dương tổng hợp như
Armored RNA (Ambion, Austin- Texas, Mỹ) hoặc mẫu acid nucleic tinh khiết (mặc
dù acid nucleic tinh khiết khơng phù hợp để kiểm sốt q trình chiết tách).
Để kiểm soát các yếu tố ức chế phản ứng, mẫu chứng nội (internal control) được
thêm vào trong mẫu trước quá trình chiết tách, đối với những mẫu âm tính, kết quả
.
