Thiết lập qui trình phân lập tế bào và nhuộm huỳnh quang từ bệnh phẩm u nguyên bào thần kinh đệm

.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI (TOÀN VĂN)
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

THIẾT LẬP QUI TRÌNH PHÂN LẬP TẾ BÀO VÀ
NHUỘM HUỲNH QUANG TỪ BỆNH PHẨM
U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM

Mã số:
Chủ nhiệm đề tài: Tiến sĩ Huỳnh Thanh Tuấn

.


.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI (TOÀN VĂN)
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

THIẾT LẬP QUI TRÌNH PHÂN LẬP TẾ BÀO VÀ
NHUỘM HUỲNH QUANG TỪ BỆNH PHẨM U
NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2019

.


.

DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU

Chức danh trong
STT

Họ và tên

q trình thực hiện

Đơn vị cơng tác

nhiệm vụ
Trung tâm Y Sinh học Phân
1

TS. Huỳnh Thanh Tuấn

Chủ nhiệm đề tài

tử - Đại học Y Dược

TP.HCM

.


.

MỤC LỤC
DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU .......................................... i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................................... iii
BÁO CÁO THỐNG KÊ ................................................................................................................ iv
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................ 1
Chương I.

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ............................................................. 2

Chương II.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP......................................................................... 4

1.

2.

Đối tượng nghiên cứu và địa điểm .................................................................................. 4
1.1.

Đối tượng và vật liệu ................................................................................................ 4

1.2.

Hóa chất .................................................................................................................... 4

Phương pháp thí nghiệm ................................................................................................. 4
2.1.

Thu mơ từ bệnh nhân ................................................................................................ 4

2.2.

Nuôi cấy tế bào ......................................................................................................... 4

2.3.

Nhuộm miễn dịch ...................................................................................................... 5

2.4.

Phân tích dữ liệu ....................................................................................................... 5

Chương III.

KẾT QUẢ .......................................................................................................... 6

1.

Phân lập và nuôi cấy sơ cấp ............................................................................................ 6

2.

Nuôi cấy thứ cấp ............................................................................................................. 6

3.

Nhuộm miễn dịch huỳnh quang ...................................................................................... 7

Chương IV.
Chương V.

THẢO LUẬN .................................................................................................... 9
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 10

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................ 11

.

i


.

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
UNBTKĐ : U nguyên bào thần kinh đệm
MDHH : Miễn dịch huỳnh quang
EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor
PTEN: Phosphatase and Tensin homolog
IDH1 : Isocitrate dehydrogenase 1

.

ii


.

DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Kết quả ni cấy sơ cấp tế bào đơn thu nhận từ mẫu khối u. Tế bào được quan sát sau 1
ngày, 2 ngày, 4 ngày, 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày. Bar = 50 µM. ..................................................... 6
Hình 2: Kết quả ni cấy thứ cấp tế bào đơn thu nhận từ mẫu khối u NB49(X20). Tế bào đươc
quan sát sau 3 ngày, 5 ngày, 10 ngày, bar = 50 µM ....................................................................... 7
Hình 3: Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho 2 marker Neurofilaments và Astrocyte ở
ngày thứ 10 (40X) ........................................................................................................................... 7
Hình 4: Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho 2 marker Neurofilaments và Astrocyte ....... 8

.

iii


.

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
............., ngày

tháng

năm 200...

BÁO CÁO THỐNG KÊ

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài:
THIẾT LẬP QUI TRÌNH PHÂN LẬP TẾ BÀO VÀ NHUỘM HUỲNH QUANG TỪ
BỆNH PHẨM U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM.
2. Chủ nhiệm nhiệm vụ:
Họ và tên: Huỳnh Thanh Tuấn
Ngày, tháng, năm sinh: 1978

Nam/ Nữ: Nam

Học hàm, học vị: Tiến sĩ
Chức danh khoa học: Không

Chức vụ: Giảng viên

Điện thoại: Tổ chức: (+84-28) 3855 8411

Nhà riêng: Không

Mobile: 0938489640
Fax: Không

E-mail:

Tên tổ chức đang công tác: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Địa chỉ tổ chức: 217 Hồng Bàng, phường 11, quận 5, TP.HCM

Địa chỉ nhà riêng:
3. Tổ chức chủ trì nhiệm vụ(1):
Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Điện thoại: (+84-28) 3855 8411

Fax: (+84-28) 3855 2304

E-mail:
Website: />Tên Khoa hoặc Trung tâm, đơn vị - nơi quản lý trực tiếp cá nhân làm chủ nhiệm đề tài.

.

iv


.

Địa chỉ: 217 Hồng Bàng, phường 11, quận 5, TP.HCM
4. Tên cơ quan chủ quản đề tài: Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh
II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện nhiệm vụ:
- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 6 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019
- Thực tế thực hiện: từ tháng 6 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019
- Được gia hạn (nếu có): Khơng
Từ tháng…. năm…. đến tháng…. năm….
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 5 tr.đ, trong đó:
+ Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học của nhà trường: 5 tr.đ.
+ Kinh phí từ các nguồn khác: 0 tr.đ.
b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học:

Số
TT
1

Thực tế đạt được

Theo kế hoạch

Ghi chú

Thời gian

Kinh phí

Thời gian

Kinh phí

(Số đề nghị

(Tháng, năm)

(Tr.đ)

(Tháng, năm)

(Tr.đ)

quyết toán)

5

5

6 năm 2018
đến tháng 6

5

năm 2019
2

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:
Đơn vị tính: Triệu đồng
Thực tế đạt được

Theo kế hoạch

Số

Nội dung

TT

các khoản chi

Tổng

NSKH

Nguồn

Tổng

NSKH

khác
1

Trả công lao động
(khoa học, phổ

.

5

5

0

v

Nguồn
khác

5

5

0

.

thơng)
2

Ngun, vật liệu,
năng lượng

3

Thiết bị, máy móc

4

Xây dựng, sửa chữa
nhỏ

5

Chi khác
Tổng cộng

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

5

5

0

5

5

0

- Lý do thay đổi (nếu có):

3. Tổ chức phối hợp thực hiện nhiệm vụ:
Số
TT

Tên tổ chức

Tên tổ chức đã

Nội dung

Sản phẩm

đăng ký theo

tham gia thực

tham gia chủ

chủ yếu đạt

Thuyết minh

hiện

yếu

được

Ghi
chú*

1
2
- Lý do thay đổi (nếu có):

4. Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:
(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10
người kể cả chủ nhiệm)
Số
TT
1

Tên cá nhân

Tên cá nhân

Nội dung

Sản phẩm

đăng ký theo

đã tham gia

tham gia

chủ yếu đạt

Thuyết minh

thực hiện

chính

được

Huỳnh Thanh

Huỳnh Thanh

Chủ nhiệm đề

Tuấn

Tuấn

tài

2
- Lý do thay đổi ( nếu có):

.

vi

Ghi
chú*


.

5. Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

TT

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác,

số đoàn, số lượng người tham

số đoàn, số lượng người tham

gia...)

gia...)

Ghi
chú*

1
2
...
- Lý do thay đổi (nếu có):
6. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

Số
TT

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

(Nội dung, thời gian,

địa điểm )

Ghi chú*

kinh phí, địa điểm )

1
2
...
- Lý do thay đổi (nếu có):

7. Tóm tắt các nội dung, cơng việc chủ yếu:
(Nêu tại mục .....của đề cương, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát
trong nước và nước ngồi)
Thời gian
Số
TT

Các nội dung, cơng việc

(Bắt đầu, kết thúc

Người,

chủ yếu

- tháng … năm)

cơ quan

(Các mốc đánh giá chủ yếu)

.

Theo kế

Thực tế đạt

hoạch

được

vii

thực hiện


.

1

Thu mô bướu

6-9 /2016

6-9 /2017

2

Phân lập tế bào

9-12 /2016

9-12 /2017

3

Nhuộm miễn dịch huỳnh quang

1-4 /2017

1-4 /2018

4

Viết báo cáo và tiến hành

4-6 /2017

4-6 /2018

nghiệm thu đề tài.
- Lý do thay đổi (nếu có):

III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI
1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:
a) Sản phẩm Dạng I:
Số
TT

Tên sản phẩm và
chỉ tiêu chất lượng
chủ yếu

Đơn
vị đo

Số lượng

Theo kế

Thực tế

hoạch

đạt được

1
2

...
- Lý do thay đổi (nếu có):
b) Sản phẩm Dạng II:
Yêu cầu khoa học
Số
TT

Tên sản phẩm

cần đạt
Theo kế hoạch

Thực tế
đạt được

1
2
...
- Lý do thay đổi (nếu có):

c) Sản phẩm Dạng III:

.

viii

Ghi chú


.

Số
TT

Tên sản phẩm

Yêu cầu khoa học

Số lượng, nơi

cần đạt

công bố

Theo

Thực tế

(Tạp chí, nhà

kế hoạch

đạt được

xuất bản)

1
2
...
- Lý do thay đổi (nếu có):

d) Kết quả đào tạo:
Số

Cấp đào tạo, Chuyên

TT

ngành đào tạo

1

Thạc sỹ

Số lượng
Theo kế hoạch

Ghi chú

Thực tế đạt

(Thời gian kết

được

thúc)

- Lý do thay đổi (nếu có):
đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp:
Số

Tên sản phẩm

TT

đăng ký

Kết quả

Ghi chú

Theo

Thực tế

(Thời gian kết

kế hoạch

đạt được

thúc)

1
2
...
- Lý do thay đổi (nếu có):
e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế
Số

Tên kết quả

TT

đã được ứng dụng

.

Thời gian

ix

Địa điểm

Kết quả

(Ghi rõ tên, địa

sơ bộ


.

chỉ nơi ứng
dụng)
1
2
2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại:
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ cơng
nghệ so với khu vực và thế giới…)

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:
(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do nhiệm vụ tạo ra so với các sản phẩm
cùng loại trên thị trường…)
3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài:
Số

Nội dung

TT
I

Thời gian
thực hiện

Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận
chính, người chủ trì…)

Báo cáo tiến độ
Lần 1
…

II

Báo cáo giám định giữa kỳ
Lần 1
….
Chủ nhiệm đề tài

Thủ trưởng tổ chức chủ trì

(Họ tên, chữ ký)

(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)

.

x


.

MỞ ĐẦU

U nguyên bào thần kinh đệm (UNBTKĐ) là u nguyên phát thường gặp nhất của hệ
thần kinh trung ương, chiếm 12-15% các loại u nội sọ và 50-60% u tế bào thần kinh đệm.
Mỗi năm có khoảng trên 50.000 trường hợp được chẩn đốn mới, trong đó khoảng 60%
là ở nam giới. Độ tuổi trung bình của các bệnh nhân được chẩn đoán u nguyên bào thần
kinh đệm là 64. Hiện nay mặc dù với sự tiến bộ của phẫu thuật, xạ trị và hóa trị liệu đặc
biệt liệu pháp điều trị đúng đích, U nguyên bào thần kinh đệm vẫn là u có tiên lượng rất
xấu trong các u của hệ thần kinh trung ương. Tỉ lệ sống sau 2 năm và 5 năm lần lượt là
13,7% và 4,7%.
Ở Việt Nam, hiện chưa số liệu dịch tễ học u não trong cộng đồng, tuy nhiên tỉ lệ sao
bào ác tính trong thực hành lâm sàng khá cao. Theo nghiên cứu của tác giả Trần Minh
Thông, trong thời gian 7,5 năm (1/2000-7/2007) tại bệnh viện Chợ Rẫy có 1187 ca u sao
bào được chẩn đoán và phẫu thuật, trong đó u sao bào độ ác cao (u sao bào thoái sản, u
nguyên bào thần kinh đệm) chiếm 56%. Hiện nay nghiên cứu căn bản về u nguyên bào
thần kinh đệm ở Việt Nam chưa được phổ biến một phần vì việc chuẩn hóa q trình
phân lập tế bào bướu từ mẫu mơ của bệnh nhân. Vì thế trong nghiên cứu này chúng tơi
thiết lập qui trình phân lập và nhuộm miễn dịch huỳnh quang tế bào bướu trong môi

trường nuôi cấy để tạo tiền đề cho các nghiên cứu về u nguyên bào thần kinh đệm về sau.

.

1


.

Chương I.

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

U nguyên bào thần kinh đệm là khối u não ác tính nguyên phát phổ biến nhất, bao
gồm 16% của tất cả các khối u thần kinh trung ương và hệ thần kinh trung ương (13). Tỷ
lệ mới mắc trung bình được điều chỉnh theo tuổi là 3,2 trên 100.000 dân (7,8). Mặc dù
UNBTKĐ xảy ra hầu như chỉ trong não, nhưng chúng cũng có thể xuất hiện trong thân
não, tiểu não và tủy sống. Sáu mươi mốt phần trăm của tất cả các u thần kinh đệm nguyên
phát xảy ra ở bốn thùy não: trán (25%), thái dương (20%), thùy đỉnh (13%) và chẩm
(3%) theo Hiệp hội điều dưỡng thần kinh học Mỹ năm 2014. Ban đầu, UNBTKĐ được
cho là chỉ bắt nguồn từ các tế bào thần kinh đệm; tuy nhiên, bằng chứng cho thấy rằng
chúng có thể phát sinh từ nhiều loại tế bào có đặc tính giống tế bào gốc thần kinh. Các tế
bào này ở nhiều giai đoạn biệt hóa từ tế bào gốc đến tế bào thần kinh đến tế bào thần kinh
đệm, với sự thay đổi kiểu hình được xác định, phần lớn, bởi sự thay đổi phân tử trong con
đường truyền tín hiệu thay vì khác biệt về loại nguồn gốc tế bào(10).
Theo kết quả từ dự án Atlas Genome Atlas (9), hơn 600 gen đã được giải trình tự từ
hơn 200 mẫu khối u ở người, cho thấy hồ sơ di truyền phức tạp của UNBTKĐ và thiết
lập một bộ ba lõi. Con đường truyền tín hiệu thường được kích hoạt là p53, con đường
truyền tín hiệu tyrosine kinase / Ras / phosphoinositide 3-kinase. Phần lớn các UNBTKĐ
nguyên phát và thứ phát có sự thay đổi trong các con đường này, dẫn đến sự tăng sinh tế

bào khơng kiểm sốt và tăng cường sự sống của tế bào, đồng thời cho phép tế bào khối u
thoát khỏi các trạm kiểm soát chu kỳ tế bào, lão hóa và apoptosis (4).
Sự thay đổi di truyền điển hình cho UNBTKĐ nguyên phát là sự biểu hiện của yếu tố
tăng trưởng biểu bì (EGFR), đột biến gen tương đồng phosphate và tenin (PTEN) và mất
nhiễm sắc thể 10q. Trong UNBTKĐ thứ cấp, đột biến isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1),
đột biến p53 và mất nhiễm sắc thể 19q thường thấy (1,14,15). Ngồi ra, bốn phân nhóm
UNBTKĐ đã được xác định, mỗi loại có các mơ hình tiến triển bệnh và kết quả sống
khác nhau. Để phân tích chi tiết hơn về các lộ trình và phân nhóm tín hiệu UNBTKĐ, độc
giả có thể tham khảo các cơng trình ngun cứu của Brennan và cộng sự, 2013; Verhaak
và cộng sự, 2010; và Wang và cộng sự, 2015.

.

2


.

Với quy trình trị liệu hiện tại là cắt bỏ khồi u kết hợp với điều trị đa phương thức,
khoảng 70% bệnh nhân UNBTKĐ sẽ có tiến triển bệnh trong vịng một năm chẩn
đốn(12), với ít hơn 5% bệnh nhân sống sót sau năm năm sau chẩn đốn(7). Cắt bỏ khối
u là một lựa chọn cho một số bệnh nhân, và phẫu thuật cắt bỏ có thể làm giảm bớt các
hiệu ứng và triệu chứng hàng loạt, chẳng hạn như co giật, nói và thiếu hụt vận động,
thường thấy khi tái phát.
Phẫu thuật lặp lại có thể được yêu cầu để xác nhận chẩn đoán tái phát khối u so với
giả mạc hoặc hoại tử phóng xạ và cũng có thể cung cấp mô để xét nghiệm phân tử để xác
định các tác nhân mục tiêu mới tiềm năng (3). Ý kiến thay đổi như liệu phẫu thuật lặp lại
có tăng cường hệ điều hành hay không. Một số bằng chứng tồn tại rằng mức độ cắt bỏ
lớn hơn khi tái phát có liên quan đến khả năng sống sót được cải thiện (2,5); tuy nhiên,
các nghiên cứu khác không tìm thấy lợi ích tuyệt đối về mặt sinh tồn (3), tính thấm và

phù mạch, cải thiện oxy hóa và giảm hoại tử phóng xạ khi dùng RT (6). Tuy nhiên, nó có
thể gây ra các sự kiện có khả năng đe dọa đến tính mạng, như xuất huyết, đơng máu và
thủng ruột (11).

.

3


.

Chương II.
1.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Đối tượng nghiên cứu và địa điểm

Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Sinh học phân tử tại Đại học Y Dược
thành phố Hồ Chí Minh.
1.1. Đối tượng và vật liệu

Dịng tế bào ung thư vú MCF-7 và MDA-MB-231 là quà tặng từ các đối tác nước
ngồi của phịng thí nghiệm.
1.2. Hóa chất

Các kháng thể đã được sử dụng cho miễn dịch huỳnh quang: Neurofilaments ( độ
pha lỗng 1/100, Cơng nghệ sinh học Santa Cruz), Astrocyte (độ pha lỗng 1: 100, Cơng
nghệ sinh học Santa Cruz), kháng thể thứ cấp IgG Alexa (độ pha lỗng 1: 2000,
Invitrogen)

2.

Phương pháp thí nghiệm
2.1. Thu mơ từ bệnh nhân

Mẫu mô được thu từ khối u của bệnh nhân bằng phương pháp phẫu thuật và được
trữ trong môi trường vận chuyển và đưa về phịng thí nghiệm.
2.2. Ni cấy tế bào

Phân lập và nuôi cấy tế bào: Trong nghiên cứu này tế bào UNBTK sinh thiết từ
khối mô được nuôi trong môi trường DMEM bổ sung 10% huyết thanh thai bò (FBS),
1% penicillin và streptomycin. Mẫu khối u được nghiền bằng biện pháp cơ học (bầm
nhuyễn bằng dao mổ) và hóa học (ủ trong dung dịch Trypsin/EDTA 0.5% 20 phút, 37oC)
giúp tách mảng tế thành bào đơn và cuối cùng lọc qua màng lọc 40 µm để loại bỏ các
mảng tế bào lớn. Ly tâm dịch huyền phù tế bào 1200 rpm trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi
và thu sinh khối tế bào. Huyền phù tế bào trong môi trường nuôi cấy mới bổ sung 10%
huyết thanh thai bị (FBS), 1% penicillin và streptomycin và ni ở ở 370C, 5% CO2. Sau
khi tế bào mọc ổn định tiến hành cấy chuyền và tiến hành thí nghiệp tiếp theo khi tế bào
ở P3.

.

4


.

2.3. Nhuộm miễn dịch

Các tế bào được cấy trong một slide tám buồng (3 x 104 tế bào / giếng). Sau khi xử

lý, các slide được rửa với 1x PBS, cố định bằng 4% formaldehyd trong 5 phút, đtăng tinh
thấm của màng tế bào bằng 0,01% Triton X-100 ở 37oC trong 30 phút và bị khóa bằng
huyết thanh 5% trong PBS trong 1 giờ tại phòng nhiệt độ. Các tế bào được ủ đầu tiên với
Neurofilaments (1: 100) trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và được rửa 3 lần với 1x PBS. Sau
đó chúng được ủ với Astrocyte (1: 100) ở 4oC qua đêm. Các slide được rửa 3 lần bằng
PBS và nhuộm với kháng thể 2 phát huỳnh quang trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Nhân tế
bào được nhuộm với DAPI.
2.4. Phân tích dữ liệu

Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn của giá trị
trung bình (SE) của ba lần lặp lại. Các tính tốn thống kê được thực hiện bằng ANOVA
hai chiều trong phần mềm vẽ biểu đồ dữ liệu GraphPad Prism. Holm-testídák được sử
dụng

để

phân

.

tích

sự

khác

5

biệt

giữa

các

nhóm.


.

Chương III.
1.

KẾT QUẢ

Phân lập và nuôi cấy sơ cấp

Khoảng 2.8x108 tế bào được thu nhận ngày 0. Ở ngày thứ nhất sau khi phân lập có
rất nhiều tế bào chết và xác tế bào trong môi trường. Sau nhiều lần thay mơi trường thì
đến ngày thứ 7 tế bào đã bám vá phát triển tốt, mơi trường sạch khơng cịn mảnh vụn mô
nữa. Theo dõi tiếp tục đến ngày 14 thì tế bào khỏe và có thể cấy chuyền (Hình 1).

Hình 1: Kết quả ni cấy sơ cấp tế bào đơn thu nhận từ mẫu khối u. Tế bào được quan sát
sau 1 ngày, 2 ngày, 4 ngày, 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày. Bar = 50 µM.

2.

Ni cấy thứ cấp

.

6


.

Sau khi cấy chuyền tế bào cũng phát triển khá tốt, sau 10 ngày cấy chuyền thì tế
bào có hình dạng của tế bào thần kinh đệm và bao phủ hơn 60% bề mặt ni cấy, có thể
tiến hành nhuộm miễn dịch huỳnh quang. (Hình 2).
D5

D3

D10

Hình 2: Kết quả ni cấy thứ cấp tế bào đơn thu nhận từ mẫu khối u NB49(X20). Tế bào
đươc quan sát sau 3 ngày, 5 ngày, 10 ngày, bar = 50 µM
3.

Nhuộm miễn dịch huỳnh quang

Sau khi cấy chuyền tế bào phát triển ổn định đến ngày thứ 10 thì tế bào được tiến hành
nhuộm miễn dịch huỳnh quang với 2 marker cho tế bào thần kinh đệm là Neurofilaments và
Astrocyte để xác nhận khả năng phân lập thành công tế bào thần kinh đệm. Kết quả nhuộm cho
thấy các tế bào điều biểu hiện cao các marker cho tế bào thần kinh đệm.

DAPI

Neurofilaments

Astrocyte

Merge

Hình 3: Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho 2 marker Neurofilaments và
Astrocyte ở ngày thứ 10 (40X)

.

7


.

Tế bào tiếp tục được duy trùy và cấy chuyền tới ngày thứ 20 để kiểm tra khả năng sống
sót của tế bào thần kinh đệm. Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang vẫn cho thấy sự
biểu hiện cao của 2 protein Neurofilaments và Astrocyte, chứng tỏ tế bào thần kinh đệm
vẫn phát triển tốt.

DAPI

Neurofilaments

Astrocyte

Merge

Hình 4: Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho 2 marker Neurofilaments và Astrocyte

.

8


.

Chương IV.

THẢO LUẬN

Thuật ngữ U nguyên bào thần kinh đệm được giới thiệu bởi Cushing vào nửa sau
của thế kỷ XIX, trong khi ca phẫu thuật đầu tiên trên một bệnh nhân bị loại khối u này
được tiến hành tại Vienna vào năm 1904. UNBTKĐ là một khối u nguyên phát của não,
bao gồm một nhóm các khối u khơng đồng nhất về mặt di truyền và kiểu hình. 90% các
trường hợp đa dạng glioblastoma phát triển de novo (glioblastoma nguyên phát) từ các tế
bào thần kinh đệm bình thường bằng phương pháp khối u đa nhân. 10% u thần kinh đệm
còn lại là các trường hợp u thần kinh thứ phát, phát triển thông qua tiến triển từ các khối
u thấp (u tế bào hình sao khuếch tán hoặc anaplastic), mất khoảng 4 năm5 năm. Bệnh u
thần kinh đệm thứ phát được chẩn đoán chủ yếu ở những người có độ tuổi trung bình 39
tuổi, phát triển chậm hơn và tiên lượng tốt hơn. Mặc dù cơ sở di truyền, cũng như các con
đường phân tử làm cơ sở cho sự phát triển của u thần kinh đệm thứ phát và thứ phát là
khác nhau, hai loại này cho thấy khơng có sự khác biệt về hình thái.
Nghiên cứu về UNBTKĐ cịn bị hạn chế bởi thiếu mơ hình nghiên cứu chính xác.
Trong nghiên cứu này nhóm tiến hành phân lập tế bào UNBTKĐ từ khối u của bệnh nhân
nắm phát triển một mơ hình nghiên cứu chính xác cho loại ung thư này. Tế bào phân lập
từ khối u sẽ mang 2 đặc điểm nổi bất là: có các đặc tính chung của UNBTKĐ và mang
một vài đặc tính chuyên biệt đặc trưng cho từng bệnh nhân một. Phát triễn mơ hình tế bào
phân lập từ khối u sẽ giúp tạo ra tiền đề cho mơ hình y học cá thể, từ đó sẽ giúp ta9ng cao
hiệu quả điều trị và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân.
Với phương pháp quan sát hình thái bên ngồi và nhuộm miễn dịch huỳnh quang
để xác nhận sự tồn tại và phát triển của tế bào thần kinh đệm phân lập từ khối u đã chứng

tỏ thành công bước đầu của đề tài. Tuy nhiên cần tiến hành thêm các nghiên cứu để xác
nhận một cách chính xác hơn sự tồn tại của các tế bào thần kinh đệm phân lập từ khối u
của bệnh nhân, từ đó cũng cố thêm tính chính xác của đề tài. Tuy nhiên nhiên trong giới
hạn của đề tài thì khơng thời gian để tiến hành thêm các thí nghiệm khác. Các nghiên cứu
kế thừa tiếp sẽ sẽ rất cần thiết và sẽ giúp hoàn thiện khả năng hướng tới y học cá thể
trong tương lai.

.

9


.

Chương V.

KẾT LUẬN

Căn nguyên của UNBTKĐ cùng với cơ chế di căn của nó được đang nghiên cứu
chuyên sâu. Sự tiến bộ trong chẩn đoán X quang tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển
của một chế độ điều trị thích hợp và theo dõi, điều này ảnh hưởng trực tiếp đến chất
lượng cuộc sống của bệnh nhân. Do vị trí của khối u và sự lây lan nhanh chóng của nó,
cần phải tăng cường cơng việc nghiên cứu dành cho sinh học của khối u này. Với kết quả
nghiên cứu thành công khi phân lập tế bào thần kinh đệm tử khối u sẽ giúp ích rất nhiều
cho các nghiên cứu sâu hơn về các đột biến, các con đường tính hiệu, các cơ chế đáp ứng
thuốc của loại ung thư này từ đó sẽ hỗ trợ rất nhiều cho việc điều trị cũng như tiên lượng
UNBTKĐ.
.

.

10


.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Alifieris C, Trafalis DT (2015). Glioblastoma multiforme: Pathogenesis and
treatment. Therapeutics, 152:63–82.
2. Bloch O, Han SJ, Cha S, Sun MZ, Aghi MK, McDermott MW, Parsa AT(2012).
Impact of extent of resection for recurrent glioblastoma on overall survival.
Journal of Neurosurgery, 117:1032–1038.
3. Brandes AA, Bartolotti M, Francheschi E (2013). Second surgery for recurrent
glioblastoma: Advantages and pitfalls. Expert Review of Anticancer Therapy,
13:583–587.
4. Chen J, McKay RM, Parada LF (2012). Malignant glioma: Lesions from
genomics, mouse models, and stem cells. Cell, 149:36–47.
5. McGirt MJ, Chaichana KL, Gathinji M, Attenello FJ, Than K, Olivi A, QuiñonesHinojosa AR (2009). Independent association of extent of resection with survival
in patients with malignant brain astrocytoma. Journal of Neurosurgery, 110:156–
162.
6. Niyazi M, Harter PN, Hattingen E, Rottler M, von Baumgarten L, Proescholdt M,
Mittelbronn M (2016). Bevacizumab and radiotherapy for the treatment of
glioblastoma: Brothers in arms or unholy alliance? Oncotarget, 7:2313–2328.
7. Ostrom QT, Bauchet L, Davis FG, Deltour I, Fischer JL, Langer CE, BarnholtzSloan JS (2014). The epidemiology of glioma in adults: A “state of the science”
review. Neuro-Oncology, 16:896–913.
8. Ostrom QT, Gittleman H, Fulop J, Liu M, Blanda R, Kromer C, Barnholtz-Sloan
JS (2015). CBTRUS statistical report: Primary brain and central nervous system
tumors diagnosed in the United States in 2008–2012. Neuro-Oncology, 17(Suppl.
4):iv1–v62.

9. Parsons DW, Jones S, Zhang X, Lin JC, Leary RJ, Angenendt P, Kinzler KW
(2008). An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme.
Science, 321:1807–1812.
10. Phillips HS, Kharbanda S, Chen R, Forrest WF, Soriano RH, Wu TD, Aldape K
(2006). Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a
pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell,
9:157–173.
11. Salacz ME, Watson KR, Schomas DA (2011). Glioblastoma: Part I. Current state
of affairs. Missouri Medicine, 108:187–194.
12. Stupp R, Hegi ME, Mason WP, van den Bent MJ, Taphoorn MJ, Janzer RC,
Mirimanoff RO (2009). Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant
temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a
randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTCNCIC trial. Lancet
Oncology, 10:459–466.
13. Thakkar JP, Dolecek TA, Horbinski C, Ostrom QT, Lightner DD, Barnholtz-Sloan
JS, Villano JL (2014). Epidemiologic and molecular prognostic review of
glioblastoma. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention, 23:1985–1996.

.

11


.

14. Wilson TA, Karajannis MA, Harter DH (2014). Glioblastoma multiforme: State of
the art and future therapeutics. Surgical Neurology International, 5:64–62.
15. Young RM, Jamshidi A, Davis G, Sherman JH (2015). Current trends in the
surgical management and treatment of adult glioblastoma. Annals of Translational
Medicine, 3:121.

.

12