Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng nấm phytophthora sp gây bệnh sương mai trên cây cà chua

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG

HỨA THỊ VY

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG NẤM
PHYTOPHTHORA SP. GÂY BỆNH SƢƠNG MAI TRÊN CÂY
CÀ CHUA

Đà Nẵng – Năm 2019


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG

HỨA THỊ VY

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG
NẤM PHYTOPHTHORA SP. GÂY BỆNH SƢƠNG MAI
TRÊN CÂY CÀ CHUA

Chun ngành: Cơng nghệ sinh học

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S LÊ VŨ KHÁNH TRANG

Đà Nẵng – Năm 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là hoàn toàn
trung thực và chưa từng được cơng bố trong các cơng trình nghiên cứu khác. Các
thơng tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Đà Nẵng, ngày tháng năm 2019
Tác giả luận văn

Hứa Thị Vy


LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc
trước sự quan tâm, dìu dắt và tận tình hướng dẫn của cơ Lê Vũ Khánh Trang trong
suốt q trình thực hiện đề tài và hồn thành bản luận văn này.
Tơi xin trân trọng cảm ơn trước sự quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ của
các quý thầy, cô trong khoa Sinh – Môi trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ tơi trong
q trình thực hiện luận văn này.

Đà Nẵng, ngày tháng năm2019
Tác giả luận văn

Hứa Thị Vy


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .....................................................................................................
LỜI CẢM ƠN ...........................................................................................................
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................7
1. Tính cấp thiết của đề tài........................................................................................7
2. Mục tiêu ................................................................................................................8
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn .................................................................8
3.1. Ý nghĩa khoa học ...............................................................................................8
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................9
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................10
1.1. Tổng quan về cây cà chua ...............................................................................10
1.1.1. Cây cà chua ...................................................................................................10
1.1.2. Một số bệnh trên cây cà chua .......................................................................11
1.1.3. Triệu chứng bệnh sương mai trên cây cà chua .............................................12
1.2. Tổng quan về nấm Phytophthora sp. ...............................................................14
1.2.1 Đặc điểm sinh thái của nấm Phytophthora sp. ..............................................14
1.2.2 Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora sp. gây hại cây trồng .................14
1.3. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng với nấm Phytophthora sp. .......15
1.3.1. Những nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng với nấm Phytophthora sp trên thế giới
................................................................................................................................15
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................................18
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
................................................................................................................................20
2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................20
2.2 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................20
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................21
2.3.1. Bố trí thí nghiệm ...........................................................................................21
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................21
2.3.2.1 Phương pháp thu mẫu .................................................................................21
2.3.2.2 Phương pháp phân lập nấm bệnh Phytophthora sp. ...................................22
2.3.2.3 Phương pháp lây bệnh nhân tạo .................................................................22

1


2.3.2.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn .................................................................22
2.3.2.5 Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm
Phytophthora sp. .....................................................................................................23
2.3.2.6 Phương pháp xác định đặc tính sinh lý và sinh hóa của chủng vi khuẩn được
tuyển chọn...............................................................................................................24
2.3.2.7 Phương pháp định danh vi khuẩn bằng sinh học phân tử Error! Bookmark not
defined.25
2.3.2.8 Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................256
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.........................27
3.1 Kết quả phân lập nấm Phytophthora sp gây bệnh mốc sương cà chua ............27
3.2 Kết quả lây bệnh nhân tạo ................................................................................29
3.3. Kết quả phân lập vi khuẩn ...............................................................................29
3.4. Kết quả tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm Phytophthora
sp. ............................................................................................................................32
3.5. Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh lý và sinh hóa của chủng vi khuẩn VK15 ..34
3.6. Kết quả định danh loài vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử ..................36
3.6.1 Nuôi cấy sinh khối vi khuẩn Bacillus sp. ......................................................36
3.6.2 Khuếch đại vùng gen 16S rRNA ...................................................................36
3.6.3. Đọc trình tự sản phẩm PCR .........................................................................36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................42
1. Kết luận...............................................................................................................42
2. Kiến nghị ............................................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................43

2

DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu
bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Các bệnh phổ biến do vsv gây ra trên cây cà chua

5

3.1

Kết quả phân lập mẫu bệnh mốc sương trên cây cà
chua

21

3.2

Các chủng vi khuẩn phân lập được từ 3 vùng trồng cà
chua của TP. Đà Nẵng

24

3.3

Đặt điểm hình thái của 21 chủng vi khuẩn phân lập từ
3 vùng trồng cà chua của TP. Đà Nẵng

24

3.4

Khả năng đối kháng của một số vi khuẩn đối với nấm
Phytophthora sp.

26

3.5

Đặc điểm của dịng vi khuẩn VK15

29

3.6

Đường kính vòng phân giải của enzyme ngoại bào

30

3


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Số hiệu
hình

Tên hình

Trang

1.1

Hình ảnh mơ tả cây cà chua

4

1.2

Triệu chứng bệnh sương mai trên lá cà chua

7

1.3

Triệu chứng bệnh sương mai trên lá cành chua

7

1.4

Triệu chứng bệnh sương mai trên quả cà chua

8

3.1

Triệu chứng bệnh mốc sương do nấm Phytophthora sp
trên cây cà chua

22

3.2

Tản nấm và Bào tử nang của Phytophthora sp trên môi
trường PDA

22

3.3

Kết quả lây bệnh nhân tạo trên lá cà chua

23

3.4

Hình ảnh bệnh được lấy ngồi thực tế

23

3.5

Hình dạng khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn

25

3.6

Khả năng đối kháng của chủng vi khuẩn VK15 với
nấm Phytophthora sp.

27

3.7

Bào tử chủng vi khuẩn VK15

28

3.8

Kết quả khảo sát các cơ chế đối kháng của một số
dòng vi khuẩn

29

3.9

Sinh khối Bacillus sp.

30

3.10

Khuếch đại vùng gen 16S rRNA (Bacillus sp.)

30

3.11

Trình tự vùng gen 16S rRNA

32

4


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CS

: Cộng sự

MT

: Môi trường

NB

: Nấm bệnh

STT

: Số thứ tự

TP

: Thành phố

VSV

: Vi sinh vật

VK

: Vi khuẩn

5


6


MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Trên thế giới, cà chua (Solanum lycopersicum) là cây rau ăn quả quan trọng
được hầu hết các nước quan tâm và phát triển vì có giá trị dinh dưỡng và mang lại hiệu
quả kinh tế cao. Theo thống kê của FAO (2010), diện tích cà chua sản xuất năm 2009,
đạt 5.227.883 ha tăng 30% so với năm 2000. Năng suất 28,39 tấn/ha (năm 2009), sản
lượng đạt 141.400.629 tấn. Tại Việt Nam, cây cà chua được chú trọng đẩy mạnh đầu
tư phát triển để nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm. Theo số liệu thống kê năm

2013, năm 2012 diện tích trồng cà chua cả nước đạt 23.917,8 ha, tăng 11,3% so với
năm 2010 (21.178,2 ha). Năng suất trung bình 252,6 - 257,9 tạ/ha, sản lượng đạt
616.890,6 tấn. Tuy nhiên, quá trình sản xuất cà chua gặp nhiều khó khăn trở ngại, bởi
rất nhiều tác nhân gây bệnh như côn trùng, vi khuẩn và nấm bệnh. Trong đó nấm
Phytophthora sp. gây bệnh sương mai là một trong những bệnh được coi là gây hại
nghiêm trọng nhất đến năng suất và chất lượng cà chua. Hiện nay, trên thế giới cũng
như ở Việt Nam, nấm Phytophthora sp. có thể làm giảm năng suất đến 40-70% tổng
sản lượng cà chua.
Bệnh sương mai cà chua đã được nghiên cứu từ rất lâu nhưng đến nay bệnh vẫn
là đối tượng gây hại phổ biến và ảnh hưởng lớn đến năng suất, phẩm chất cà chua.
Biện pháp chủ yếu để diệt nấm bệnh là dùng thuốc diệt nấm có nguồn gốc hóa học.
Tuy nhiên nếu dùng nhiều loại thuốc hóa học với liều lượng cao trong thời gian dài sẽ
làm mất cân bằng trong quần thể vi sinh vật đất có ích, tạo mơi trường bất lợi đối với
các sinh vật có ích phát triển và tạo điều kiện để nấm bệnh, các lồi cơn trùng có hại
kháng thuốc hơn, đồng thời cũng tiêu diệt các loài thiên địch có ích. Dư lượng thuốc
diệt nấm, thuốc trừ sâu hóa học cịn lại trên sản phẩm nơng nghiệp và trên đất sẽ làm ô
nhiễm vào nguồn nước ngầm, gây ra tác hại nghiêm trọng đối với sức khỏe của người
và vật nuôi. Ở một số nước phát triển, thuốc diệt nấm có nguồn gốc hóa học bị hạn chế
hoặc cấm sử dụng. Do đó việc tìm ra biện pháp an tồn hiệu quả phịng trừ bệnh mốc
sương là một trong những vấn đề cấp thiết hiện nay.
Trong các biện pháp phòng trừ đang được nghiên cứu để dần thay thế biện pháp
hóa học thì biện pháp sinh học là một hướng đi được các nhà khoa học của nhiều nước

7


trên thế giới cũng như Việt Nam quan tâm. Một trong những hướng cơ bản của
phương pháp sinh học là tăng cường sản xuất các chế phẩm sinh học. Vì có tác dụng
tích cực đối với nơng nghiệp và ưu việt hơn so với các sản phẩm hóa học, chế phẩm
sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng ngày càng được quan tâm sử dụng để

diệt nấm gây hại cây. Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng để diệt
nấm gây hại trên cây trồng sẽ mang lại những lợi ích lâu dài cho người sản xuất như:
làm tăng năng suất của cây trồng, giảm chi phí đầu tư, làm đất khơng bị bạc màu, thân
thiện với môi trường sinh thái, không ảnh hưởng đến sức khỏe của người và vật ni,
góp phần quan trọng trong việc phát triển nền nông nghiệp hữu cơ bền vững và hiệu
quả. Người sản xuất hồn tồn có thể yên tâm sử dụng chế phẩm sinh học từ vi sinh
vật để kiểm soát nấm gây hại cây trồng.
Các chủng vi khuẩn đối kháng như Burkholderia, Pseudomonas, Bacillus đã và
đang được quan tâm nghiên cứu vì chúng tổng hợp một số chất ngoại bào với khả năng
ức chế sự nẩy mầm và phát triển của nấm bệnh hại cây trồng. Trong nhóm vi khuẩn
đối kháng nấm, chủng Bacillus sp. được xem là chuyên gia trong khả năng kiểm soát
nấm Phytophthora sp. gây bệnh sương mai trên cây cà chua.
Để góp phần vào việc đa dạng hóa các chế phẩm sinh học, cải thiện và ứng
dụng chế phẩm Bacillus spp. vào lĩnh vực nông nghiệp, tôi đã tiến hành nghiên cứu đề
tài: “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng nấm Phytophthora sp. gây bệnh
sƣơng mai trên cây cà chua”
2. Mục tiêu
Phân lập được chủng nấm gây bệnh Phytophthora sp. gây bệnh sương mai trên
cây cà chua đồng thời phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng đối
kháng mạnh với nấm gây bệnh.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Cung cấp các dẫn liệu khoa học về thành phần loài, khả năng đối kháng của một
số vi khuẩn với nấm Phytophthora sp. gây bệnh sương mai cà chua, tạo cơ sở khoa
học cho việc nghiên cứu và ứng dụng các vi khuẩn này để phát triển chế phẩm sinh
học phòng trừ bệnh mốc sương cà chua.

8

3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học cho việc ứng dụng sản xuất các
chế phẩm sinh học trong lĩnh vực bảo vệ cây trồng tại điều kiện địa phương, nhằm góp
phần nâng cao năng suất cây trồng và xây dựng nền một nông nghiệp sạch và bền
vững.

9


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây cà chua
1.1.1. Cây cà chua
Cà chua có tên khoa học là Lycopersium esculentum Millier thuộc họ cà
Solanacea, có nguồn gốc từ Nam Mỹ.[11]

Hình 1.1 Hình ảnh mơ tả cây cà chua
Mô tả sơ bộ cây cà chua:
Cà chua là cây hằng niên, tuy nhiên trong điều kiện tối hảo nhất định cà có thể
là cây nhiều năm.
Rễ: Rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh, khả năng phát triển rễ phụ rất lớn.
Thân: Thân tròn, thẳng đứng, mọng nước, phủ nhiều lơng, khi cây lớn gốc thân
dần dần hóa gỗ. Thân mang lá và phát hoa. Ở nách lá là chồi nách. Chồi nách ở các vị
trí khác nhau có tốc độ sinh trưởng và phát dục khác nhau, thường chồi nách ở ngay
dưới chùm hoa thứ nhất có khả năng tăng trưởng mạnh và phát dục sớm so với các
chồi nách gần gốc.
Tùy khả năng sinh trưởng và phân nhánh các giống cà chua được chia làm 4
dạng hình:
- Dạng sinh trưởng hữu hạn (determinate)

10


- Dạng sinh trưởng vô hạn (indeterminate)
- Dạng sinh trưởng bán hữu hạn (semideterminate)
- Dạng lùn (dwart)
Lá: Lá thuộc lá kép lơng chim lẻ, mỗi lá có 3 - 4 đơi lá chét, ngọn lá có 1 lá
riêng gọi là lá đỉnh. Rìa lá chét đều có răng cưa nơng hay sâu tùy giống. Phiến lá
thường phủ lông tơ. Đặc tính lá của giống thường thể hiện đầy đủ sau khi cây có chùm
hoa đầu tiên.
Hoa: Hoa mọc thành chùm, lưỡng tính, tự thụ phấn là chính. Sự thụ phấn chéo
ở cà chua khó xảy ra vì hoa cà chua tiết nhiều tiết tố chứa các alkaloid độc nên không
hấp dẫn côn trùng và hạt phấn nặng không bay xa được. Số lượng hoa trên chùm thay
đổi tùy giống và thời tiết, thường từ 5 - 20 hoa.
Trái: Trái thuộc loại mọng nước, có hình dạng thay đổi từ trịn, bầu dục đến
dài. Vỏ trái có thể nhẵn hay có khía. Màu sắc của trái thay đổi tùy giống và điều kiện
thời tiết. Thường màu sắc trái là màu phối hợp giữa màu vỏ trái và thịt trái.
Tại Việt Nam, việc phát triển trồng cà chua có ý nghĩa quan trọng về mặt luân
canh, tăng vụ và tăng năng suất trên đơn vị diện tích, do đó cà chua là loại cây trồng
được khuyến khích phát triển. Tuy nhiên, việc trồng cà chua chưa được phát triển
mạnh theo mong muốn vì cà chua trồng trong điều kiện nóng và ẩm ở nước ta dễ mắc
nhiều bệnh gây hại đáng kể như bệnh sương mai, héo xanh, virus,... khó trị. Ngồi ra
mùa hè vùng nhiệt đới làm cà kém đậu trái vì nhiệt độ cao nên hạt phấn bị chết (bất
thụ).
1.1.2. Một số bệnh trên cây cà chua [5]
Bảng 1.1 Các bệnh phổ biến do vsv gây ra trên cây cà chua
Bệnh
Héo vi khuẩn

Dấu hiệu chuẩn đoán bệnh

Tác nhân vsv
Ralstonia

Héo, dịch khuẩn xuất hiện ở thân, thân

solanacearum

biến màu nâu.

Thối gốc

Sclerotium rolfsii

Sưng rễ tuyến

Meloidogyne sp.

Hạch nấm nhỏ màu nâu, tròn và sợi
nấm màu trắng xuất hiện ở gốc thân.
Héo, u sưng trên rễ

11


trùng
Mốc sương

Thối vi khuẩn
Đốm vi khuẩn

Virut héo đốm cà
chua

Héo Fusarium
Đốm vòng

Mốc lá

Virus vàng ngọn

Phytophthora infestans

Nấm màu xám nằm ở mặt dưới lá

Clavibacter

Lá vàng, héo, thân biến màu nâu, đốm

michiagnensis

trên quả

Pseudomonas sitingae

Đốm hoại trên là
Lá non bị biến màu nâu cục bộ, có các

Virus

đốm hoặc vịng màu tối ở lá già

Fusarium oxysporum f.
sp. lycopersici

Các vòng tròn đồng tâm màu đen trên lá

Alternaria solani
Cadosporium

Héo, mạch dẫn biến màu nâu

fulvum

(fulvia fulva)

Nấm màu xám/tía mọc ở mặt dưới lá
Lá quăn, nhỏ, biến màu vàng

Virus

1.1.3. Triệu chứng bệnh sƣơng mai trên cây cà chua [5]
Tác giả William W. Kirk và cộng sự năm 2009 [49] cho biết, bệnh sương mai
có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nơi đây cũng chính là nguồn gốc ra đời của cây khoai tây.
Sau đó, bệnh đã lan ra các nước châu Âu, châu Á... cùng với việc di thực của cây này.
Bệnh được chính thức xác định đầu tiên năm 1930 ở Đức, 15 năm sau bệnh trở thành
dịch nguy hiểm ở Bắc Âu, đặc biệt ở Ai-rơ-len. Tác nhân gây bệnh do nấm thuộc loài
nấm Phytophthora sp..
Triệu chứng trên lá: Bệnh thường xuất hiện đầu tiên ở mép chóp lá tạo vết xám
xanh nhạt sau đó lan rộng vào phiến lá. Phần giữa vết bệnh chuyển màu nâu đen và
xung quanh vết bệnh thường có lớp cành bào tử màu trắng xốp bao phủ như một lớp

mốc trắng như muối làm cho lá chết lụi nhanh chóng. Ở mặt dưới lá, vết bệnh có một

12


lớp mốc trắng như sương (phân sinh bào tử). Bệnh nhẹ lá hơi bị cháy, bệnh nặng có
thể làm tồn bộ phiến lá bị cháy khơ.

Hình 1.2 Triệu chứng bệnh sƣơng
mai trên lá cà chua
Triệu chứng trên thân cành: Bị bệnh từng đoạn dài, vỏ và ruột thân lúc đầu màu
nâu hoặc thâm đen, sau đó thối ướt màu nâu đen. Chỗ bị bệnh nhỏ tóp lại có khi chỉ
một phía thân bị thối. Khi ẩm ướt, trên vết bệnh có lớp nấm trắng như sương muối bao
phủ. Phía trên chỗ bị bệnh, lá héo dần. Cành, thân bị bệnh dễ bị gãy gục làm tán cây
xơ xác.

Hình 1.3 Triệu chứng bệnh sƣơng mai
trên lá cành chua
Triệu chứng trên quả: Bệnh thường xuất hiện ở mặt trên của quả, trên quả có
những đốm màu xanh xám, có vẻ ướt, vết bệnh lớn dần, chuyển sang màu trắng đục
sau đó chuyển sang màu nâu, hơi lõm, quả nhăn nheo, có viền rõ và bên trong có thể bị
thối. Bệnh nhẹ quả hơi nám và cứng, bệnh nặng quả không phát triển được, sau đó bị
rụng.

13


Hình 1.4 Triệu chứng bệnh sƣơng mai
trên quả cà chua
1.2. Tổng quan về nấm Phytophthora sp.

1.2.1 Đặc điểm sinh thái của nấm Phytophthora sp.
Bệnh sương mai trên cây cà chua do nấm Phytophthora sp. gây ra. Nấm gây
bệnh nhờ những bào tử, chúng có thể phát tán nhờ gió chuyển từ nơi này sang nơi
khác, cây này sang cây khác. Bào tử theo nước mưa, nước tưới xâm nhiễm vào cây.
Bệnh có quan hệ chặt chẽ với thời tiết như chế độ mưa, ẩm độ, nhiệt độ. Nếu nhiệt độ
thấp hơn 200C có mưa (hoặc sương) bệnh phát triển liên tục. Nếu vườn cà chua được
bón đạm nhiều, mất cân đối hoặc trồng quá dày, tiêu thoát nước kém, trồng liên tục
khơng có thời vụ rõ ràng, xen kẽ, khơng phân khu vực là những điều kiện thuận lợi để
bệnh phát sinh và phát triển [5].
1.2.2 Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora sp. gây hại cây trồng
Nấm Phytophthora sp. là nấm ký sinh chuyên tính, sống trong tế bào thực vật
tạo thành những vịi hút sinh sản vơ tính chủ yếu tạo bào tử phân sinh (conidi) trên các
cành conidi đâm nhánh hơi phình rộng. Cành conidi tương đối dài, conidi đơn độc
hình trứng hay hình quả chanh. Chỉ có một conidi trên đỉnh nhánh tạo cho bề mặt của
bộ phận bị bệnh có màu trắng rất dễ nhận dạng. (William W.Kirk và cộng sự, 2009)
[49].
Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả Andre và David (2004) [18], hình thức
sinh sản hữu tính có một số vai trị trong vịng đời của Phytophthora sp.. Trường hợp
những lồi Phytophthora sp. mang tính dị tản cho phép kết hợp những cặp gen tương
ứng. Bào tử nỗn có thể tồn tại trong một thời gian dài khi khơng có sự hiện diện của

14


cây ký chủ. Bào tử nỗn cũng có thể nhiễm bệnh vào mơ cây chủ trong điều kiện khí
hậu khơng thuận lợi, nóng và khơ.
Phương thức sinh sản của các lồi Phytophthora sp. quyết định khả năng phát
dịch. Tính đồng tản cho phép sinh sản tự do, tính dị tản tạo khả năng phát dịch. Gần
đây, những lồi mang tính đồng tản biểu hiện mức độ thấp của lai xa trong Invitro,
trong khi những lồi mang tính dị tản chỉ ra tính lai gần ở mức độ thấp (Goodwin và

cộng sự, 1994)[33].
Kết quả nghiên cứu của Andre và David (2004) [18] cho thấy chu kỳ sống của
nấm Phytophthora sp. có thể bao gồm tới 3 dạng sinh sản vơ tính - bào tử nang, du
động bào tử, hậu bào tử và bào tử nỗn với dạng sinh sản hữu tính. Sợi nấm sinh
dưỡng lưỡng bội sản sinh ra bào tử nang vơ tính mà có thể nảy mầm trực tiếp, hoặc có
thể phân chia để sản sinh ra 8-12 bào tử động, mỗi bào tử động trải qua một quá trình
lan truyền và bơi vào nang trước khi nảy mầm.
Kết quả của (Letter W. Burgess, 2008)[39] cho rằng Phytophthora sp. thuộc lớp
nấm trứng, không phải nấm thực và sinh sản ra du động bào tử. Vì vậy, phịng trừ nấm
này khác với phòng trừ các bệnh do nấm thực gây ra và các thuốc dùng trong phòng
trừ cũng khác. Theo tác giả, các bệnh do nấm này gây hại cho cây lâu năm, rau và các
cây trồng khác làm tổn thất đáng kể về kinh tế cho các nước vùng Đông Nam Á. Tác
giả cũng cho biết môi trường nuôi cấy nấm Phytophthora sp.. Các loài Phytophthora
sp. sản sinh bọc bào tử trên môi trường chọn lọc PSM nếu được đặt trong điều kiện có
chiếu sáng. Một số lồi cũng sản sinh bọc bào tử trên môi trường PCA hoặc mơi
trường potato-dextrose agar (PDA). Phần lớn các lồi gây bệnh ở Việt Nam là dị tản
như P.capsici, P.palmivora, P.infestans.
1.3. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng với nấm Phytophthora sp.
1.3.1. Những nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng với nấm Phytophthora sp trên thế
giới
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng phòng trừ sinh học là biện pháp hữu hiệu bảo
vệ cây trồng trước sự tấn công của bệnh hại và an tồn với mơi trường. Phịng trừ sinh
học được định nghĩa là làm giảm mật độ của VSV gây hại hoặc hoạt động của VSV
gây hại bằng một hay một số tác nhân VSV có ích khác (Baker và Cook, 1974) [20].
Tác động trực tiếp của phòng trừ sinh học là sử dụng các VSV đối kháng đặc hiệu để

15


hạn chế tác hại của bệnh hoặc sự tồn tại của VSV gây hại. Cơ chế tác động của các tác

nhân VSV có ích trong phịng trừ sinh học bao gồm: Cạnh tranh dinh dưỡng và nơi cơ
trú của VSV có ích và VSV gây hại; các VSV có ích sản sinh ra các chất kháng sinh,
men phân giải, hoạt chất có độc tính hạn chế mật độ của VSV gây hại; ký sinh bậc hai
và tăng cường hiệu quả của các loài VSV khác dưới tác động của VSV có ích (Cook
và Baker, 1983)[23].
Những tiến bộ đạt được gần đây trong biện pháp sinh học bao gồm việc định
dạng các tác nhân phòng trừ sinh học như: Tác giả Galindo (1992) [31] đã tiến hành
nghiên cứu nhiều thí nghiệm để kiểm tra khả năng phòng trừ sinh học đối với nấm P.
palmivora ở cây ca cao bằng sử dụng các vi sinh vật đối kháng như Bacillus spp. và
Pseudomonas fluorescens cũng đã đem lại một số thành công.
Hoạt động phịng trừ sinh học có thể được tiến hành một cách thủ công bằng
cách đưa các vật đối kháng ngoại lai vào trong đất, hoặc bằng cách kích thích hoạt
động của các đối kháng nội sinh thông qua việc bổ xung thêm các lớp che phủ hoặc
phân hữu cơ (Erwin và Ribeiro,1996) [27]. Chẳng hạn, sử dụng chất hữu cơ (lớp che
phủ, vỏ gỗ thông được chế thành phân trộn...) có vi sinh vật hoạt động mạnh và độ pH
thấp sẽ giúp phòng chống được P.cinnamomi ở trong các cây được trồng tại các vườn
ươm. Mycorhizae cũng có tác dụng phòng trừ sinh học đối với P. cinnamomi giống
như đã được xác định trên cây thông và dứa.
Các tác giả Diby và cộng sự (2001) [25] cho rằng vi khuẩn đối kháng
Pseudomonas fluorescent có khả năng hạn chế sự phát triển của một số tác nhân gây
bệnh tồn tại trong đất. Vi khuẩn này sản sinh các chất kích thích sinh trưởng như:
gibberellins, cytokinins và axit acetic. Các nguồn vi khuẩn này được nghiên cứu trong
phòng trừ bệnh do nấm P.capsici gây thối rễ cây hồ tiêu, hiệu quả phòng trừ đạt 70%
trong điều kiện phịng thí nghiệm. Theo dõi sau 4 tháng cho hiệu quả kích thích sinh
trưởng thân lá cây hồ tiêu tăng hơn 57,15% trong điều kiện nhà lưới.
Bên cạnh đó vi khuẩn như vi khuẩn Bacillus spp., xạ khuẩn Streptomyces spp.
và vi khuẩn huỳnh quang cũng được sử dụng nhiều để phát triển chế phẩm sinh học
phịng trừ bệnh hại do các nhóm vi khuẩn này có nhiều tiềm năng như chúng phân bố
rộng rãi trong tự nhiên, có tính kháng cao đối với các lồi VSV gây hại và an toàn với
các VSV khác và môi trường. Vi khuẩn Basillus subtilis GBO3 được sử dụng để xử lý

16


hạt làm giảm bệnh thối rễ cây đậu và tăng năng suất 31% so với đối chứng (Jensen và
cộng sự, 2002) [34].
Kết quả nghiên cứu của tác giả Anandaraj và cộng sự (2003) [17], dịng
P.fluoresceus IISR-51 có hiệu quả phịng trừ nấm Phytophthora capsici tăng so với đối
chứng là 51,6% và 38,9% đối với dòng P. fluorescen IISR-6.
Kết quả nghiên cứu của Woo và cộng sự (2005) [50] ở Viện NAAS, Hàn Quốc
đã sử dụng chế phẩm từ Paenibacillus illinoisensis dòng KJA-424 để hạn chế bệnh
mốc sương do nấm P.capsici gây ra ở cây ớt có hiệu quả phịng trừ từ 50-63%.
Ở Hàn Quốc theo Dong và cộng sự (2006) [26] đã sử dụng sản phẩm vi khuẩn
có chứa enzyme chitinase và β-1,3-glucanase đã hạn chế được 64% tỷ lệ bệnh mốc
sương so với đối chứng trên cây ớt ở nhà lưới. Tác giả cũng sử dụng các giống chống
chịu, vệ sinh đồng ruộng, luân canh với cây khác họ cà,... kết hợp các biện pháp quản
lý tổng hợp đối với bệnh mốc sương trên đã hạn chế được 54-70% bệnh trên ớt ở ngồi
đồng.
Hỗn hợp hai dịng vi khuẩn Bacillus là BB1 và FH17 với bã nho đã phân hủy có
thể tiêt diệt tới 79-81% nấm Phytophthora capcisi gây bệnh trên cây ớt (Jang Z.Q và
cs 2006).
Theo Weller, D.M. (2007) [47], vi khuẩn Pseudomonas sp. là các vi khuẩn
Gram âm, sinh trưởng mạnh ở vùng rễ của cây, có khả năng đối kháng với các loại
nấm tồn tại trong đất. Pseudomonas có nhiều chủng khác nhau, tuỳ từng cây và các
điều kiện sinh thái khác nhau mà nó có tính thích ứng riêng đối với mỗi một loại tác
nhân gây bệnh cây trồng. Vi khuẩn Pseudomonas có một số đặc tính: có khả năng
nhân sinh khối nhanh trong điều kiện nhân tạo, kích thích hạt nảy mầm và hệ rễ cây
phát triển, nâng cao hệ thống tự phòng bệnh của thực vật, có khả năng ức chế được sự
phát triển của sợi nấm của một số tác nhân gây bệnh tồn tại trong đất.
Nghiên cứu của Lee. K. J. và cs (2008) [38] cho thấy Bacillus spp. Dòng R33

và R13 có khả năng hạn chế sự phát triển của nấm P. capcisi tới 86,8 và 71%.
Stephan Olson và cộng sự (2010) [45] trường đại học Florida của Mỹ đã ứng
dụng một số chủng VSV đối kháng để hạn chế bệnh trên cây cà chua như các chủng
PGPR Bacillus pumilus SE 34, EQTY, và Pseudomonas putida 89B61 được thông báo
hạn chế các nguồn bệnh: nấm, vi khuẩn, virus thực vật trên cà chua và dưa chuột, làm

17


giảm tỷ lệ bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) từ 10-25% so với đối chứng. Tác giả cũng
sử dụng 2 chủng Bacillus là B.amyloliquefaciens IN937a và B.subtilis GB03 cũng có
khả năng hạn chế bệnh HXVK và nấm Phytophthora trên cà chua, nhưng nếu kết hợp
xử lý Actigard, thymol với các chủng VSV có ích trên kết hợp với vệ sinh đồng ruộng,
canh tác, chọn lựa dịng/giống chống chịu bệnh thì tỷ lệ bệnh HXVK giảm 47-53%
trong điều kiện nhà lưới.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Trong những năm gần đây, tại Việt Nam đã có một số cơng trình nghiên cứu sử
dụng chế phẩm sinh học đối kháng để phòng trừ một số bệnh hại cây trồng như: Chế
phẩm BC (Bacillus subtilis) của Viện Bảo Vệ Thực Vật (1999) ứng dụng trong phòng
trừ bệnh chết nhanh hồ tiêu do nấm P.capsici [14].
Theo Mai Văn Trị và Nguyễn Thúy Bình (2003) [13], bón phân hữu cơ sinh học
đã làm tăng hoạt động của VSV đối kháng dẫn đến ngăn chặn sự phát triển của nấm
Phytophthora palmivora, làm giảm tỷ lệ bệnh trên vườn sầu riêng.
Trần Hà và cộng sự (2007)[3], xác định vi khuẩn Pseudomonas fluorescens
được phân lập từ vùng rễ của cây hồ tiêu ở Quảng Trị bằng phương pháp PCR, kết quả
nghiên cứu tính đối kháng cho thấy trong 5 chủng, có 1 chủng Pseudomonas
fluorescens SS101 có khả năng tiêu diệt được du động bào tử nấm Phytophthora gây
chết nhanh cây hồ tiêu trong vòng 60 giây, nghiên cứu khả năng ức chế bệnh chết
nhanh trong điều kiện nhà lưới cũng chỉ ra có hiệu quả giảm bệnh, theo dõi 60 ngày
sau trồng ở công thức không xử lý tỷ lệ bệnh là 40%, ở công thức được xử lý.

Trần Thị Thu Hà (2011) [4], Trường Đại học Huế, đã thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu sử dụng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas putida phòng trừ bệnh chết nhanh
(Phytophthora capsici) triển trên hồ tiêu” đạt được kết quả hiệu lực phòng trừ từ 61 77%
Nguyễn Quang Huy và cs (2012) [8], Trường đại học Khoa học Tự nhiên ĐHQG Hà Nội, đã phân lập hai chủng vi khuẩn ký hiệu U1.3 và U3.7 đều thuộc chi
Bacillus trong đó U1.3 gần với lồi Bacillus subtilis cịn chủng U3.7 gần với lồi
Bacillus velezensis. Hai chủng vi khuẩn phân lập đều có khả năng ức chế sự phát triển
của nấm Phytophthora sp.

18


Chế phẩm gồm 2 chủng vi khuẩn B. subtilis và B. Flexus của Phạm Thị Thuý
Hoài (2014) [6] ứng dụng trong phòng trừ bệnh do nấm P.capsici. Hiệu lực phòng trừ
của chế phẩm đối với chỉ số bệnh đạt từ 30,98% đến trên 79,25%.
Trần Ngọc Khánh & cộng sự (2015) [9] đã tuyển chọn và định danh được 2
chủng vsv kháng nấm Phytophthora infestans là Bacillus amyloliquefaciens và xạ
khuẩn Streptomyces toxytricini. Hiệu quả phòng trừ bệnh mốc sương trong các thí
nghiệm đạt 72,6%-75,3% sau 21 ngày xử lý bằng tổ hợp VSV đối kháng BS2.

19


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Các mẫu bệnh của cây cà chua bị bệnh sương mai (lá, quả, hoặc thân) lấy từ
các vườn trồng cà chua tại phường Hòa Thọ Đơng, P. Hịa Khánh Nam, Xã Hịa Phú,
TP. Đà Nẵng.
- Vi khuẩn đôi kháng với nấm Phytophthora sp. phân lập được từ các mẫu đất
của các vườn trồng cà chua tại phường Hịa Thọ Đơng, P. Hịa Khánh Nam, Xã Hòa

Phú, TP. Đà Nẵng.
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và định danh chủng nấm mốc Phytophthora sp. gây bệnh sương mai.
- Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm Phytophthora
sp.
- Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn được tuyển
chọn.
- Định danh vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh nhất với nấm Phytophthora
sp.

20


2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Bố trí thí nghiệm

Xác định mẫu và tiến hành thu
mẫu

Phân lập vsv

Vi khuẩn đối kháng

Nấm bệnh

Phân loại nấm bệnh

Quan sát hình thái
khuẩn lạc và hình
dàng tế bào

Tuyển chọn vi khuẩn có
khả năng đối kháng
mạnh với nấm
Phytophthora sp

Xác định đặc tính sinh lý
và sinh hóa của chủng vi
khuẩn được tuyển chọn

Lây bệnh nhân tạo

Định danh vi khuẩn
bằng sinh học phân
tử

2.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.2.1 Phƣơng pháp thu mẫu
- Phương pháp thu mẫu nấm bệnh: Thu thập tất cả các loại triệu chứng bệnh
hại trên tất cả các bộ phận của cây cà chua. Các mẫu bệnh được đựng trong ống tuýp
hoặc các túi xi măng, giấybáo và ghi rõ thông tin. (Phương pháp thu thập VSV gây hại
theo phương pháp nghiên cứu BVTV, quyển I, ấn hành 1997, 1998 của Viện BVTV và
Lester W. Burgess và cộng sự, 2008) [14].

21