che pham bao ve thuc vat

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (132.18 KB, 26 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

VI.3

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

Phân lập virus diệt côn trùng

Thu mẫu côn trùng bệnh

Nghiền, lọc bã

Nước 
cất

Ly tâm 500v/ph

trong 5 phút

Thu dịch

Ly tâm 2500v/ph

trong 15 phút

Thu cặn

Ly tâm 10000v/ph

trong 60 phút

Thu cặn trắng

chứa thể vùi

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

Sản xuất virus

Sản xuất

in vitro

Sản xuất

in vivo

Tìm ký chủ sâu

ngồi đồng để

sản xuất

Ni ký chủ

sâu trong PTN

Ni trên các

dịng tế bào sâu

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4>

Phương pháp thủ công SX chế phẩm NPV cho nơng dân

Thu sâu hại tuổi trung bình khoẻ

ngồi ruộng

Ni trong các dụng cụ gia đình

xơ, chậu, thúng…

Nơi thoáng mát, thức ăn tươi

Khi sâu đạt tuổi 3 – 4

tiến hành nhiễm virus

Nghiền, lọc và phun

trên đồng ruộng

Ủ bệnh trong khoảng 3 – 5 ngày

trong bình thuỷ tinh tối màu

Nguồn virus tinh

Sau khoảng 2 – 3 ngày

</div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

Phương pháp nuôi sâu chủ trong PTN

Để trứng đẻ hàng ngày vào điều kiện ơn,
ẩm độ thích hợp đến khi trứng nở sâu non

.

Bắt sâu xanh ngoài ruộng
chọn sâu non tuổi 4 - 5
Nuôi cá thể từng con trên
môi trường thức ăn nhân tạo

Ghép cặp bướm mới vũ hoá
1 – 2 ngày ra (10 đực + 10 cái)

Nuôi trong lồng trong
điều kiện gần với tự nhiên.

Dịch virus 107 PIB/ml trộn vào

thức ăn nhân tạo

(có aga hoặc khơng có aga)
Ni sâu non bằng thức ăn nhân tạo

tới độ tuổi 4

Thu hồi chế phẩm

Sau khi giao phối 1 – 2 ngày
Thu trứng hàng ngày
trong thời gian 3 – 5 ngày
Nuôi cho đến khi sâu chết

T = 28 – 30oC, W > 80%, t = 3 – 5 ngày

Nuôi sâu non bằng thức ăn nhân tạo

tới khi vào nhộng và vũ hố

(vịng đời khoảng 30 – 35 ngày)

Ghép cặp bướm mới vũ hoá
1 – 2 ngày ra (10 đực + 10 cái)

</div>
(6)<div class='page_container' data-page=6>

Thu hồi chế phẩm



Đối với chế phẩm dùng ngay



Thu nhặt sâu chết cho vào dụng cụ tối màu, giữ ở nhiệt độ thấp.



Nghiền nhỏ sâu chết: tỷ lệ nước/ sâu = 3/1.



Lọc qua vải mỏng và thu hồi dịch



Bổ sung các phụ gia để sấy phun



Đối với chế phẩm bảo quản lâu dài



Nghiền nhỏ sâu chết: tỷ lệ nước/ sâu = 3/1.



Lọc qua vải mỏng và thu hồi dịch



Ly tâm 10.000 – 20.000 vòng/phút, – 15 – 20 phút và thu hồi

tinh thể trắng



Kiểm tra và dếm số lượng PIB để đưa đi tạo chế phẩm



Tạo chế phẩm:



CP dạng dịch thể: Bổ sung chất bám dính, chất chống thối,

kháng sinh, chất chống tia tử ngoại… đóng chai tối màu để bảo

quản.



CP dạng bột: Bổ sung các chất bột và chất phụ gia, sấy phun

</div>
(7)<div class='page_container' data-page=7>

Tiêu chuẩn hoá chế phẩm



Kiểm tra chất lượng chế phẩm:

Kiểm tra nồng độ thể vùi và hoạt tính sinh học



Đóng gói sản phẩm:

Đóng chai; đóng gói; dán nhãn ghi rõ ngày SX, hoạt lực, hạn sử

dụng, hướng dẫn sử dụng



Các chỉ tiêu cần đạt của sản phẩm



Chế phẩm dạng dịch thể:

10

7

– 10

8

PIB/ml, thời gian bảo quản 6 – 12 tháng, HQDS 70 –

100% sau 7 – 10 ngày phun.



Chế phẩm dạng bột:

10

8

– 10

9

PIB/gram, HLÂ 7 – 10%, thời gian bảo quản 6 – 12

</div>
(8)<div class='page_container' data-page=8>

Sản xuất chế phẩm bột kỹ thuật LdMNPV nuôi in vivo

Thành phần

Phần trăm (w/w)

Vai trò

LdMNPV

14-18

Tác nhân diệt

sâu

Mảnh xác sâu

82-86

Tác nhân trơ

Tiến hành:

1. Trứng sâu bướm nuôi trong PTN được giữ ở 6ºC trong 150 ngày

để hoàn tất vòng đời phát triển.

2. Rửa trứng trong 1 giờ (trong dung dịch formalin 10% v/v), tráng

kỹ và cho 10-15 trứng vào cốc thức ăn thể tích 6oz.

</div>
(9)<div class='page_container' data-page=9>

3. Ấu trùng sâu nở ra được giữ 14 ngày ở 26ºC trong phịng lọc khí

4. Khi ấu trùng đạt đến đầu giai đoạn IV, bổ sung vào mỗi cốc 1ml dịch

chứa 5x10 thể vùi virus/ml và giữ ở 29ºC

5. Thu lấy ấu trùng sâu (có tỷ lệ chết > 70%) sau 14 ngày ủ và giữ ở -20ºC

cho đến khi sử dụng

6. Ấu trùng đông lạnh được rã đông trong 24 giờ ở 4ºC, sau đó được

nghiền (1,0 g ấu trùng : 5 ml nước cất) ở nồng độ cao trong 10 giây để

giải phóng ra thể vùi virus

7. Xác sâu đã nghiền được sàng qua máy nghiền rung để loại bỏ các

mảnh xác sâu lớn

8. Ly tâm dịch liên tục 60l/h ở vận tốc 15500 rev/phút

9. Lấy phần chất rắn trải lên khay và đông lạnh ở -35ºC

10.Sấy đông khô phần chất rắn trong 24-36 giờ và nghiền thành bột mịn

(độ ẩm 3-4%) chứa khoảng 15% (w/w) là OV

11.Kiểm tra chất lượng vi sinh sản phẩm thu được trước khi đóng trong

gói kín

</div>
(10)<div class='page_container' data-page=10>

VI.4

</div>
(11)<div class='page_container' data-page=11>

Một số loài nấm diệt sâu (theo thứ tự quan trọng)

Loài nấm

Đặc điểm

Hyphomycetes

Beauveria (bạch cương)
Metarhizium (lục cương)
Paecilomyces

Verticillium
Hirsutella
Nomurea
Aschersonia
Tolypocladium, 
Culicinomyces

Bào tử conidia dễ dàng tạo ra trên môi trường rắn, 
blastospore trên mơi trường lỏng. Nhiệt độ ni các

lồi Beauveria thường thấp hơn so với Metarhizium
Sản xuất như trên nhưng conidia tạo thành dưới 
dạng phần đầu trịn dính. Sử dụng trong nhà kính.
Khó sản xuất hơn các loại nấm trên. Không tạo được 
conidia trong môi trường lỏng

Entomophthorales
Entomophthora

</div>
(12)<div class='page_container' data-page=12>

Phân lập và tuyển chọn chủng có hoạt tính cao

diệt cơn trùng



Ngun tắc chung



Có phổ diệt sâu không quá hẹp, nhưng phải không gây bệnh

cho các lồi có lợi.



Có khả năng tạo bào tử cao.



Có nhu cầu dinh dưỡng đơn giản.



Các chủng tái tổ hợp có độ ổn định về khả năng tạo bào tử cao.



Thu thập côn trùng và xác côn trùng



Thu thập côn trùng chết hoặc bị bệnh do nấm ở đồng ruộng,

hồ, sông, rừng…

</div>
(13)<div class='page_container' data-page=13>



Môi trường phân lập

Môi trường được lựa chọn phù hợp với từng lồi; Mơi trường đặc bổ sung

khoảng 2% agar



Mơi trường nước mắm pepton

Pepton

10g

Nước mắm hay xì dầu20ml

Nước sạch

1000ml



Môi trường nước mạch nha

1kg bột mầm đại mạch (mầm lúa) + 3 lít nước đường hố ở 60

C + 03 lịng

trắng trứng; đun sơi; lọc lấy dịch trong thu môi trường Bx = 10,8; d = 1,043.



Môi trường Sabouroud Dextrose Agar Yeast (SDAY)

Pepton

10g

Dextrose

40g

Cao men

2g

Agar

20g

Nước sạch

1000ml

pH = 6,5



Môi trường Czapek - Dox

Sacarose

30g

NaNO

2g

K

HPO

1g

MgSO

.7H

O

0,5g

KCl

0,5g

FeSO

0,01g

Nước sạch

1000ml

</div>
(14)<div class='page_container' data-page=14>

Phân lập bào tử

Phương pháp mưa bào tử

•

Xác CT nhấn chìm trong etanol 60-70%,
 t = 15 phút, chuyển sang DD natrihypoclorit,
rửa bằng nước cất.

• Đặt CT lên một mảnh giấy lọc thấm nước.
•Dán giấy lọc lên đáy một nắp hộp đĩa petri.
•Lập úp nửa hộp này lên MT chứa SDAY.
•Bào tử rơi xuống và phát triển.

•Thu thập bào tử theo từng thời gian.

Phương pháp bào tử bay

•

Thu xác CT đặt lên mảnh giấy lọc thấm nước.

• Đặt CT lên.

• Đặt giấy lọc này vào hộp đĩa petri.

</div>
(15)<div class='page_container' data-page=15>

Bảo quản các chủng giống nấm diệt côn trùng



Bảo quản trong thạch 1 – 2 tuần, sau đó giữ trong

lạnh T = 5 – 6

o

C và 2 – 3 tháng cấy truiyền lại. Thòi

gian bảo quản hạn chế.



Bảo quản ở nhiệt độ lạnh sâu – 20

o

C, - 80

o

C, - 120

o

C.

Bảo quản lâu dài.



Phương pháp hút bào tử bằng máy hút chân không,

sau đó giữ trong tủ lạnh. Bảo quản được vài năm.



Phương pháp đông khô VSV. Bảo quản được 5 – 7

</div>
(16)<div class='page_container' data-page=16>

Sản xuất vi nấm

Trên môi

trường rắn

Trên mơi

trường lỏng

conidia

blastospore

• Dạng bào tử tự nhiên của nấm

Hyphomycetes.

• Được phát tán nhờ gió và mưa.

• Bền và dễ phát tán nhất.

• Tế bào kiểu nấm men.

• Xâm nhiễm và nẩy mầm nhanh hơn

bào tử trần.

• Nhạy cảm với điều kiện mơi

</div>
(17)<div class='page_container' data-page=17>

ống thạch

nghiêng Bình Δ

Thiết bị

lên men Giống

Hệ sợi nấm tạo 
blastospore

Túi plastic 
đựng môi 
trường được

thổi khí

Ly tâm thu 
sinh khối

Sấy

Tạo chế phẩm 
bột thấm ướt

Bảo quản

Phun

Hệ sợi tạo 
conidia

Thu hồi và sấy

Bảo quản với 
chất hút ẩm

Phối trộn trên 
cánh đồng

Phun

</div>
(18)<div class='page_container' data-page=18>

Nhân giống

Nhân giống cấp 1



Mơi trường Sabouroud bổ sung thêm khống chất

MgSO

4

.7H

2

O và KH

2

PO

4

.



Nuôi cấy ở T = 25 – 27

o

C trong 24 giờ.

Nhân giống cấp 2

Phương pháp lên men chìm

• Mơi trường cao nấm men

Cao nấm men Pepton

KH2PO4 MgSO4.7H2O

pH = 6,0 nước sạch

•

Mơi trường SDAY

Pepton 10g Dextrose 40g

Cao nấm men 2g Agar 20g

pH = 6,5 nước sạch

Phương pháp lên men x

ốp

Bột cám gạo
Bột ngô

Bột đậu tương (đậu xanh)
Trấu (bã mía; vỏ lạc)

Nước sạch

</div>
(19)<div class='page_container' data-page=19>

Lên men trong

môi trường lỏng

Lên men hai

giai đoạn

Đầu tiên nấm phát triển trên

mơi trường lỏng, sau đó:

Nấm phát triển trên

môi trường lỏng

Lên men trên môi

trường bán rắn

Cấy bào tử trên cơ chất

rắn để thu bào tử trần

Trải lên khay để

tạo bào tử trần

Trộn với cơ chất rắn

để tạo bào tử trần

</div>
(20)<div class='page_container' data-page=20>

Sản xuất trên mơi trường lỏng



Thiết bị có khuấy (stirred tank)



Đảo trộn mãnh liệt mơi trường.



Đồng hố tốt canh trường, hệ số chuyển khí cao.



Tránh đóng tụ hệ sợi và tạo thành bánh sợi.



Làm thương tổn hệ sợi khi va đập cơ học.



Thiết bị tháp (tower)



Tỷ lệ chiều cao trên đường kính lớn hơn 6m.



Đảo trộn mơi trườngnhờ hệ thống bơm khí từ đáy thiết bị.



Nấm tạo thành hệ sợi tụ lại trong thiết bị.



Thích hợp với loại nấm có tiếp hợp.



Thiết bị lên men dạng vòng (loop fermenter)

</div>
(21)<div class='page_container' data-page=21>

Tiến hành:

1. Lên men 5 ngày trong môi trường lỏng có thổi khí
2. Hạ nhiệt độ xuống 5-10ºC

3. Ly tâm (> 10000g, < 35ºC) để thu được dịch sệt chứa khoảng 22% chất rắn. 
Khuấy trộn đều trong thùng lên men

4. Lấy mẫu để xác định lượng bào tử và các thơng số khác

5. Bổ sung bột oxít theo tỷ lệ 1:1 (Clarcel Flo, Wessalon S) vào bột nhão và nhào 
trộn trong thiết bị đảo trộn

6. Với mỗi kg bột bổ sung 250ml paraffin lỏng + 250ml dung dịch saccharoza 80% 
+ mì chính theo tỷ lệ 2%. Đảo trộn lại đến khi thu được bột mịn ở < 350C

7. Sấy từng lớp mỏng trong các buồng sấy có thổi gió ở ≤ 25ºC đến độ ẩm ≤ 7%
8. Lấy mẫu để xác định độ ẩm và lượng bào tử

9. Bổ sung chất dinh dưỡng cho nấm (bột ngũ cốc) đủ để có được hàm lượng 
bào tử cần để thương mại hóa

10. Có thể bổ sung Bevaloid 116 (2%) làm chất phân tán và Surfynol 104S (2%) làm 
chất thấm ướt nhưng phải sau khi đã yên tâm về ảnh hưởng của các chất này 
đến VSV

</div>
(22)<div class='page_container' data-page=22>

Tạo chế phẩm bột thấm ướt từ blastospore

Thành phần

Phần trăm (%)

Vai trò

Bào tử thu sau ly

tâm

22

Tác nhân sinh học

Clarcel Flo

2,2

Chất chống vón

Paraffin lỏng

19,9

Chống oxi hóa

Labrafil

(polyoxyethylene

glyceryl

monooleate)

2,1

Chống oxi hóa

Saccharoza

22

Bảo vệ tế bào

Na glutamate

2

Bảo vệ tế bào

Bột ngũ cốc

25,8

Chất mang, chất dinh

dưỡng

Bevaloid 116

2

Chất phân tán

</div>
(23)<div class='page_container' data-page=23>

Sản xuất trên mơi trường bán rắn

• Mơi trường lên men

– Cơ chất thường là hạt ngũ cốc nghiền nhỏ (gạo tốt nhất).

– Bổ sung nước để có độ ẩm cần thiết: tăng diện tích tiếp xúc, tăng

lượng khí lưu giữ.

– Bổ sung CaSO

4

và CaCO

3

: tăng pH và chống dính hạt.

– Tiệt trùng bằng nhiệt.

• Ni cấy

– Túi plastic có các lỗ kích thước <0,4mm: thơng khí (25cm

3

/cm

2

/phút ở

1at); thông hơi nước (500g/m

2

/24h ở 23

o

C và RH 50%).

– Thơng gió và làm mát phịng.

– Độ ẩm RH trong túi khoảng 100% đảm bảo tốt nhất để tạo bào tử.

• Thu hồi bào tử

– Khơng mở túi để thu hồi vì dễ lây nhiễm VSV.

– Thổi gió trong một thiết bị tầng sôi và thu bào tử sau khi đi qua một

cyclon phân tách/ hoặc không cần phân tách phần tế bào nấm và cơ

chất rắn.

– Bào tử thu hồi được sấy, nghiền nhẹ và sàng đưa vào bảo quản, vận

</div>
(24)<div class='page_container' data-page=24>

Tiến hành:

1. Nhân giống trong 3 ngày ở 150 rpm ở 24ºC. Kiểm tra sự nhiễm tạp bằng kính hiển vi 
và trang trên hộp thạch

2. Ngâm kiều mạch trong 24 giờ

3. Chắt nước và nghiền kiều mạch với 5% CaCO3 và 5% CaSO4 trong máy đảo trộn quay 
(drum mixer)

4. Thanh trùng trong mỗi túi nuôi nấm 400g kiều mạch ở 120ºC trong 40 phút. Làm 
nguội. Kiểm tra nhiễm tạp vi sinh vật bằng cách đặt vài hạt ngũ cốc lên mặt thạch
5. Sau khi làm nguội xuống 35ºC cấy vô trùng vào mỗi túi 70 ml dịch giống, sau đó hàn

nhiệt túi lại. Đảo trộn để cho giống phân bố đồng đều.

6. Ủ túi 14 ngày ở 25-30ºC (đặt chế độ ổn nhiệt). Thổi khí trong phịng trong tuần 2 để 
giảm độ ẩm và làm khô hạt giúp kích thích tạo bào tử. Đảo túi định kỳ để tránh đóng 
bánh khối mơi trường

7. Để thu hồi bào tử cho phần môi trường sau lên men vào máy phân tách tầng sôi sau 
khi đã loại bỏ các túi bị nhiễm

8. Trải bào tử thành lớp mỏng trên khay và sấy đến độ ẩm < 6%, định kỳ kiểm tra độ ẩm. 
Tránh tạo thành các điểm ẩm cục bộ do thổi khí khơng đủ trong phịng

9. Sàng qua lỗ 100µm. Năng suất thu được khoảng 1 kg bào tử (1-5 x 10 bào tử/g hạt 
khô)

10. Trộn với bột oxit silic10% và bảo quản trong túi đen không thấm nước ở 4-10ºC. Nên 
bào quản chân không

</div>
(25)<div class='page_container' data-page=25>

Sản xuất chế phẩm bột kỹ thuật

Thành phần

Tính cho mẻ 4 kg

Vai trị

Dịch cao nấm 
men-saccharoza

(mỗi thứ 30g/l)

500 ml Môi trường nhân giống

Kiều mạch 4 kg Môi trường dinh dưỡng nuôi bán

rắn
Túi nuôi nấm

35 x 22 x 0,1 cm

10 Túi để nuôi bán rắn

Bột CaCO3 200 g Làm tăng pH

Ngăn các hạt đóng dính

Bột CaSO4 200 g

Bột silica gel, Gasil GM2 10% w/w

bổ sung vào bào tử

Hút ẩm
Thùng PE sẫm mầu

(chiều dầy 0,001 inches)

</div>
(26)<div class='page_container' data-page=26>

Sản xuất trên môi trường rắn



Các dạng thiết bị lên men

• Thiết bị dạng khay

– Nhiều khay chứa mơi trường.

– Nhiệt độ và độ ẩm điều chỉnh bằng cách bổ sung nước hoặc mơi

trường

– Nhược điểm: chu trình kéo dài (3 – 4 tuần) nên nguy cơ nhiễm

cao. Sử dụng mơi trường ít hiệu quả.

• Thiết bị lên men đảo trộn

– Môi trường lên men đảo trộn được bằng nhiều biện pháp.

– Nhiệt độ mơi trường có thể kiểm soát được

– Ưu nhược điểm: sự đồng nhất của mơi trường tốt hơn nhưng

độ sáng lại thấp hơn.

• Thiết bị lên men plastic

</div>

che pham bao ve thuc vat

<b>VI.3</b>

<b>Phân lập virus diệt côn trùng</b>

<b>Thu mẫu côn trùng bệnh</b>

<b>Nghiền, lọc bã</b>

<b>Ly tâm 500v/ph </b>

<b>trong 5 phút</b>

<b>Thu dịch</b>

<b>Ly tâm 2500v/ph </b>

<b><sub>trong 15 phút</sub></b>

<b>Thu cặn</b>

<b>Ly tâm 10000v/ph </b>

<b>trong 60 phút</b>

<b>Thu cặn trắng </b>

<b>chứa thể vùi</b>

<b>Sản xuất virus</b>

<b>Sản xuất </b>

<b>in vitro</b>

<b>Sản xuất </b>

<b>in vivo</b>

<b>Tìm ký chủ sâu </b>

<b>ngồi đồng để </b>

<b>sản xuất</b>

<b>Ni ký chủ </b>

<b>sâu trong PTN</b>

<b>Ni trên các </b>

<b>dịng tế bào sâu</b>

<b>Phương pháp thủ công SX chế phẩm NPV cho nơng dân</b>

<b>Thu sâu hại tuổi trung bình khoẻ</b>

<b> ngồi ruộng</b>

<b>Ni trong các dụng cụ gia đình</b>

<b>xơ, chậu, thúng…</b>

<b>Nơi thoáng mát, thức ăn tươi</b>

<b>Khi sâu đạt tuổi 3 – 4</b>

<b>tiến hành nhiễm virus</b>

<b>Nghiền, lọc và phun</b>

<b>trên đồng ruộng</b>

<b>Ủ bệnh trong khoảng 3 – 5 ngày</b>

<b>trong bình thuỷ tinh tối màu</b>

<b>Nguồn virus tinh</b>

<b>Sau khoảng 2 – 3 ngày</b>

<b>Phương pháp nuôi sâu chủ trong PTN</b>

<b>.</b>

<b>Thu hồi chế phẩm </b>

<b>Nuôi sâu non bằng thức ăn nhân tạo</b>

<b>tới khi vào nhộng và vũ hố</b>

<b>(vịng đời khoảng 30 – 35 ngày) </b>

<b>Thu hồi chế phẩm</b>



<b><sub>Đối với chế phẩm dùng ngay</sub></b>



<b><sub>Thu nhặt sâu chết cho vào dụng cụ tối màu, giữ ở nhiệt độ thấp.</sub></b>



<b><sub>Nghiền nhỏ sâu chết: tỷ lệ nước/ sâu = 3/1.</sub></b>



<b><sub>Lọc qua vải mỏng và thu hồi dịch</sub></b>



<b><sub>Bổ sung các phụ gia để sấy phun</sub></b>



<b><sub>Đối với chế phẩm bảo quản lâu dài</sub></b>



<b><sub>Nghiền nhỏ sâu chết: tỷ lệ nước/ sâu = 3/1.</sub></b>



<b><sub>Lọc qua vải mỏng và thu hồi dịch</sub></b>



<b><sub>Ly tâm 10.000 – 20.000 vòng/phút, – 15 – 20 phút và thu hồi </sub></b>

<b>tinh thể trắng</b>



<b><sub>Kiểm tra và dếm số lượng PIB để đưa đi tạo chế phẩm</sub></b>



<b><sub>Tạo chế phẩm:</sub></b>



<b><sub>CP dạng dịch thể: Bổ sung chất bám dính, chất chống thối, </sub></b>

<b>kháng sinh, chất chống tia tử ngoại… đóng chai tối màu để bảo </b>

<b>quản.</b>



<b><sub>CP dạng bột: Bổ sung các chất bột và chất phụ gia, sấy phun </sub></b>

<b>Tiêu chuẩn hoá chế phẩm</b>



<b><sub>Kiểm tra chất lượng chế phẩm:</sub></b>