Luận văn tốt nghiệp cô lập chất từ cao etyl acetat của cây rau má lá sen hydrocotyle bonariensis l , họ ngò (apiaceae)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HĨA HỌC


HUỲNH TRẦN MINH TUYỀN

CƠ LẬP CHẤT TỪ CAO ETYL ACETAT CỦA
CÂY RAU MÁ LÁ SEN HYDROCOTYLE
BONARIENSIS L.,
HỌ NGÒ (APIACEAE)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: HÓA HỌC

CẦN THƠ - 2011


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HĨA HỌC


ḶN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CƠ LẬP CHẤT TỪ CAO ETYL ACETAT CỦA
CÂY RAU MÁ LÁ SEN HYDROCOTYLE

BONARIENSIS L.,
HỌ NGỊ (APIACEAE)
Hướng dẫn khoa học: ThS. Tơn Nƣ̃ Liên Hƣơng
Sinh viên thực hiện:

Huỳnh Trần Minh Tuyề n - 2072119

Chuyên ngành: HÓA HỌC – K33

CẦN THƠ - 2011


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

LỜI MỞ ĐẦU
------

Ngày nay, việc nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên đã và đang trở thành một
lĩnh vực quan trọng của ngành Hóa Học Hữu Cơ trong và ngồi nƣớc. Phần lớn các
hợp chất đƣợc phân lập từ thực vật hay động vật đều có hoạt tính sinh học, có tác dụng
lên một số loại vi sinh vật có hại nên đƣợc dùng trong nông nghiệp, trong khoa học
cũng nhƣ chữa bệnh cho con ngƣời,… Cây rau má lá sen (Hydrocotyle bonariensis
L.), họ Ngị (Apiaceae) là một lồi rau mới đƣợc định danh ở Việt Nam trong những
năm gần đây. Trên các thử nghiệm bƣớc đầu cho thấy, các hợp chất trong cây rau má
lá sen có một số hoạt tính sinh học đáng chú ý. Khảo sát thành phần hóa học của loại
cây này hứa hẹn sẽ đem lại nhiều điều thú vị và đóng góp hữu ích.
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành điều chế cao metanol tổng từ nguyên liệu
bột cây bằng phƣơng pháp ngâm dầm kết hợp các kỹ thuật chiết rắn-lỏng để điều chế

các loại cao có mức độ phân cực khác nhau và sử dụng phƣơng pháp sắc ký cột kết
hợp sắc ký lớp mỏng trên cao etyl acetat của cây rau má lá sen để cô lập các hợp chất,
tinh chế các hợp chất bằng phƣơng pháp kết tinh lại. Xác định cấu trúc hợp chất dựa
trên các dữ liệu phổ NMR.

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

1


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

MỤC LỤC
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT ............................................................... 5
1.1

Khái quát chi Hydrocotyle .................................................................................5

1.2

Giới thiệu về rau má lá sen Hydrocotyle bonariensis L. ...................................6

1.2.1 Danh pháp và phân loại ...................................................................................6
1.2.1

Mô tả về đặc điểm, xuất xứ và phân bố ......................................................7

1.2.2

Thành phần hóa học ....................................................................................8

1.2.3

Cơng dụng ...................................................................................................8

CHƢƠNG 2: GIỚI THIỆU VỀ STEROID GLYCOSID ................................................ 9
2.1 Sơ lƣợc về steroid ..................................................................................................9
2.2 Glycosid ...............................................................................................................11
2.2.1 Khái niệm về glycosid...................................................................................11
2.2.2 Phân loại glycosid .........................................................................................12
CHƢƠNG 3: CƠ SỞ LÝ THUYẾT MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM ... 16
3.1 Các kỹ thuật chiết tách các hợp chất ra khỏi cây .................................................16
3.1.1 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng ............................................................................16
3.1.2 Kỹ thuật chiết rắn-lỏng .............................................................................17
3.2 Một số kỹ thuật sắc ký .........................................................................................20
3.2.1 Sắc ký cột ......................................................................................................20
Nạp chất hấp thu vào cột ....................................................................................21
Nạp mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc ký ..........................................................22
Giải ly cột sắc ký ................................................................................................23
3.2.3 Sắc ký lớp mỏng ............................................................................................25
Giải ly bản mỏng ................................................................................................26
CHƢƠNG 4: PHƢƠNG PHÁP – PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ........................... 29
4.1

Phƣơng pháp ....................................................................................................29

4.1.1

Tính chất nguyên liệu ................................................................................29

4.1.2

Phƣơng pháp chiết tách .............................................................................29

4.1.3

Phƣơng pháp phân lập và tinh chế ............................................................31

4.1.4

Phƣơng pháp xác định cấu trúc .................................................................31

4.2

Phƣơng tiện ......................................................................................................31

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

2


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

4.2.1

Dụng cụ .....................................................................................................31

4.2.2

Hóa chất.....................................................................................................31

4.2.3

Thời gian, địa điểm ...................................................................................32

CHƢƠNG 5: THỰC NGHIỆM .................................................................................... 33
5.1 Điều chế các loại cao ...........................................................................................33
5.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu ....................................................................................33
5.1.3

Điều chế các cao có độ phân cực tăng dần từ cao metanol tổng...............34

5.2 Sắc ký cột cao Ea3 ...............................................................................................37
5.2.1 Xử lý phân đoạn Ea3.2 ..................................................................................40
5.2.2 Xử lý phân đoạn Ea3.3 ..................................................................................43
CHƢƠNG 6: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 58
6.1 Kết luận ................................................................................................................58
Qua thời gian thực hiện đề tài “Phân lập chất từ cao etyl acetate của cây rau má lá
sen Hydrocotyle bonariensis L.” chúng tơi có kết luận sau: ....................................58
6.2 Kiến nghị..............................................................................................................58
PHẦN PHỤ LỤC .......................................................................................................... 61
Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR hợp chất TUYEN_Hydbon ................................................61
Phụ lục 2: Phổ 1H-NMR hợp chất Ea8 .....................................................................64
Phụ lục 3: Phổ 13C-NMR hợp chất Ea8 ....................................................................69
Phụ lục 4: Phổ DEPT của hợp chất Ea8 ....................................................................72

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

3


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

Phần 1
TỔNG QUAN

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

4


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT
1.1 Khái quát chi Hydrocotyle[5]
Trên thế giới, chi Hydrocotyle là tập hợp hơn 30 loài, có đặc điểm chung là cây
thảo, sống nhiều năm, vùng phân bố rộng. Những loài cây thuộc chi Hydrocotyle rất dễ
sống ở các vùng đất ẩm, có bóng râm, khí hậu mát mẻ, có thể sống cả trong mơi
trƣờng nƣớc và đặc biệt có lồi sống đƣợc trong mơi trƣờng đất cằn, ngay cả nƣớc
mặn chúng cũng có khả năng sinh sống và phát triển.
Theo tác giả Đỗ Tất Lợi, ở Việt Nam có hơn 10 lồi vẫn thƣờng gọi là rau má,
gồm: Hydrocotyle asiatica, Hydrocotyle chevalieri (Chern) Tard, Hydrocotyle

chinensis (Dunn) Craib, Hydrocotyle nepalensis Hook, Hydrocotyle petelotii Tard,
Hydrocotyle pseudosanicula De Boiss, Hydrocotyle siamica Craib, Hydrocotyle
sibthorpioides Lamk, Hydrocotyle tonkinensis Tard, Hydrocotyle wilfordii Maxim.
Trong đó, Hydrocotyle asiatica L. và Hydrocotyle sibthorpioides (rau má lá nhỏ) là hai
loài thƣờng gặp nhất và rất quen thuộc với ngƣời dân Việt Nam.
Hiện nay, trong thực tế, các nhà khoa học đã phát hiện thêm vài lồi rau má
mới. Năm 2005, dƣợc sĩ Phan Đức Bình đã định danh hai lồi rau má có hình dạng rất
khác biệt so với rau má thƣờng là: Hydrocotyle bonariensis L. và Hydrocotyle vulgaris
L.. Hai loài này hiện rất phát triển tại khu vực đồng bằng sơng Cửu Long, có đặc điểm
chung là thân dài, lá rất giống với lá sen nên còn đƣợc gọi là rau má lá sen. Tuy nhiên
chúng đƣợc phân biệt nhờ so sánh đặc điểm của hoa, cây Hydrocotyle bonariensis L.
có hoa gồm nhiều tua tụ tạo thành vịng trịn, cây Hydrocotyle vulgaris L. có hoa mọc
thành tầng.
Đề tài này chúng tôi chủ yếu khảo sát trên cây rau má lá sen Hydrocotyle
bonariensis L, một loại cây mới đƣợc phát hiện ở Việt Nam trong những năm gần đây.

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

5


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

Hình 1: Cây và hoa Hydrocotyle bonariensis L.

Hình 2: Cây và hoa Hydrocotyle vulgaris L.

1.2 Giới thiệu về rau má lá sen Hydrocotyle bonariensis L.

1.2.1 Danh pháp và phân loại
Tên khoa học: Hydrocotyle bonariensis L.
Tên nƣớc ngoài: Penywort, large leaf penywort paraguita,…
Tên thƣờng gọi: Rau má lá sen

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

6


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

Phân loại:
Giới: Thực vật
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Apiales
Họ: Apiaceae
Chi: Hydrocotyle
Lồi: Bonariensis L.

1.2.1

Mơ tả về đặc điểm, xuất xứ và phân bố

Đặc điểm:
- Cây sống dễ trong nƣớc, nơi ẩm ƣớt, đất cát, cũng nhƣ nơi có mơi trƣờng khơ.
- Là loại cỏ lƣu niên, nhẵn, dạng thân rễ mọc bò, tại mỗi đốt có nhiều rễ và cho

ra 1–2 lá vƣơn thẳng lên, cọng lá dài 15–20 cm.
- Lá mỏng, hình lọng, phiến trịn, rộng 3–12 cm, có thùy cạn, mép lá khía tai
bèo, cuống lá mọc ở giữa.
- Hoa nhỏ, năm cánh, có màu trắng hoặc vàng kem, tán hoa đƣờng kính 1–6 cm
gồm nhiều tua tụ tạo thành vịng trịn, cây ra hoa từ mùa xuân đến đầu mùa thu.
- Quả hình bầu dục, dày 0,5–2 mm, rộng 2,5–3 mm, đáy và đỉnh có khía sống
lƣng và phần bên gân nổi rõ.

Hình 3: Lá và hoa Hydrocotyle bonariensis L.
SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

7


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

Xuất xứ: cây có nguồn gốc từ Nam Mỹ.
Phân bố: Nam Mỹ, gần đây phát hiện mọc hoang ở Việt Nam.

1.2.2

Thành phần hóa học
Trong q trình nghiên cứu đặc điểm sinh thái trên cây Hydrocotyle

bonariensis L. chỉ mới tập trung về khả năng hấp thụ muối NaCl của lá cây này ở
những vùng đất mặn có ảnh hƣởng đến hàm lƣợng chlorophyl và làm thay đổi hàm
lƣợng protein trong lá. So với cây Foeniculum vulgare L. thì cây Hydrocotyle
bonariensis L. nhận NaCl nhiều hơn.

Hydrocotyle bonariensis L. là loại rau má mới đƣợc định danh nên các thành
tựu nghiên cứu về cây này cịn khá hạn chế. Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Thạc
sĩ Tôn Nữ Liên Hƣơng đã và đang khảo sát thành phần hóa học cũng nhƣ hoạt tính
sinh học của nó trong những năm gần đây.

1.2.3

Cơng dụng

Rau má là loại rau rất thông dụng trong y học dân gian cũng nhƣ trong cuộc sống
ngày thƣờng của ngƣời dân Việt Nam. Cây có tác dụng thanh nhiệt, giải độc gan, trị
bệnh cao huyết áp, làm chậm sự lão hóa da, là món ăn quen thuộc và là loại thức uống
bổ dƣỡng cho sức khỏe con ngƣời.
Riêng đối với tinh dầu của rau má lá sen có thể kháng đƣợc cả hai chủng vi
khuẩn Gram âm: Escherichia coli, Psendomonas aeruginosa; vi khuẩn Gram dƣơng:
Staphylococcus aureus và một chủng nấm mốc: Fusarium oxysporum; có độc tính
chọn lọc trên một số dịng tế bào ung thƣ biểu mô (KB), gan (Hep-G2) và
vú (MCF-7)[5].

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

8


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

CHƢƠNG 2: GIỚI THIỆU VỀ STEROID
GLYCOSID

2.1 Sơ lƣợc về steroid[1,2,6]
Steroid là những hợp chất thiên nhiên có chung đặc điểm cấu tạo phân tử có chứa
hệ vịng cyclopentanoperhydrophenantren hoặc trong trƣờng hợp rất hiếm là sự biến
đổi của hệ vịng đó. Phép phân tích tia X cho thấy các phân tử steroid dài và mỏng,
đều phù hợp với cấu hình vịng B và C ở vị trí trans với nhau, cịn A/B, C/D có thể cis
hoặc trans. Tất cả các steroid bão hòa thuộc 2 loại là cholestan và coprostan. Khung
cholestan là sự kết hợp A/B trans, B/C trans, C/D trans, đƣợc gọi là allo. Khung
coprostan là sự kết hợp A/B cis, các vịng khác là trans.

12
11
1
2

10

4

5

6

17
D

16

14 15

B8

A

3

9C

13

7

Hình 4: Khung sƣờn cơ bản của Steroid
Steroid có nhiều trong thiên nhiên nhƣ: các sterol, các nội tiết tố (hormon) nhƣ
nội tiết tố sinh dục, acid mật, hormon tuyến thƣợng thận, các glycosid, đặc biệt là
glycosid trợ tim, các sapogenin,…
Sterol là những alcol có nguồn gốc động vật hoặc thực vật, có cấu trúc từ 27-29
nguyên tử carbon và một nhóm thế alkyl mạch nhánh ở C17. Sterol phân bố rất rộng,
thƣờng có mặt song song với alkaloid hoặc saponinsterol. Chúng đƣợc tìm thấy trong
động vật có xƣơng sống, khơng xƣơng sống và sau đó đƣợc tìm thấy trong thực vật.
- Nhóm sterol động vật (zoosterol): cholesterol, cholestan-3β-ol, desosterol,
coprostanol, cerebrosterol, lathosterol,....
- Nhóm sterol của động vật biển không xƣơng sống: spongesteol, clionasterol,
24-methylencholesterol, fucosterol,....

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

9


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

- Nhóm sterol thực vật (phytosterol): sitosterol (có các đồng phân α, β),
stigmasterol, spinasterol, brassicasterol,... Các sterol thực vật có trong tất cả các bộ
phận của cây nhƣng nhiều nhất ở các hạt có dầu, dƣới dạng tự do, ester hoặc ở dạng
glycosid.
- Nhóm sterol nấm men: ergosterol, zymosterol, acosterol,...
Sterol khơng phân cực nên tan rất kém trong nƣớc, tan trong dầu béo và các dung
môi hữu cơ không phân cực nhƣ eter dầu hỏa, benzen, cloroform, aceton,... cho nên có
thể dùng các chất này để chiết chúng. Đối với các sterol glycosid có thể chiết bằng
alcol.

HO

HO

Cholesterol

HO

Spinasterol

HO

Stigmasterol

Ergosterol

Hình 5: Các sterol phổ biến trong thiên nhiên

Riêng phytosterol có khả năng hấp thụ là 2-5% so với cholesterol là 60%, nhƣng
có cấu trúc tƣơng tự nhau nên phytosterol ức chế hấp thụ cholesterol ở ruột và làm
giảm nồng độ của chất béo này trong máu. Do đó phytosterol có tác dụng chống xơ
vữa động mạch, chống sự oxy hóa. Phytosterol cịn có tác dụng chuyển hóa cholesterol
nên giúp ngƣời sử dụng giảm đƣợc nguy cơ với bệnh tim, mạch vành. Ngoài ra một số
phytosterol cịn có khả năng kiềm hãm sự phát triển của tế bào ung thƣ, kháng viêm và
kháng nấm.[10, 11]
SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

10


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

2.2 Glycosid [1, 2]
2.2.1 Khái niệm về glycosid
Glycosid là dạng phổ biến của nhiều hợp chất tự nhiên, chất tạo thành do sự
ngƣng tụ giữa một phần là đƣờng và một phần không phải là đƣờng, đƣợc gọi là
“heterosid”. Phần không đƣờng gọi là aglycon hoặc genin. Phần đƣờng và phần khơng
đƣờng liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycosid dễ bị phân huỷ khi
có nƣớc dƣới ảnh hƣởng của các enzym có chứa trong cây.
Phần aglycon của glycosid rất đa dạng và gồm tất cả các loại hợp chất thiên
nhiên nhƣ: monoterpen, sesquiterpen, diterpen, triterpen, steroid, iridoid, flavonoid,
quinonoid, polyphenol,…
Phần đƣờng trong glycosid chủ yếu là monosaccarid hoặc oligosaccarid, thƣờng
là glucose, rhamnose, galactose,... Tác dụng của các glycosid lên cơ thể phụ thuộc vào
phần aglycon và phần đƣờng làm tăng hoặc giảm tác dụng của chúng

HN

O

CH3

O

O

HO

Spirotan

Solasodin

H OH
HO

HO
H

H
OH

OH
H

O

Sitosterol glucopyranosid
Hình 6: Mô ̣t số glycosid thƣờng gă ̣p

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

11


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

2.2.2 Phân loại glycosid
Phân loại glycosid dựa theo phần đƣờng và phần aglycon.
Phân loại theo tên của đƣờng: tùy theo nhóm glycon mà glycosid có tên gọi
tƣơng ứng nhƣ glucosid, rhamnosid, galactosid, rutosid,…
Phân loại theo mạch đƣờng: phần glycon gồm một hoặc nhiều đơn vị đƣờng nối
với nhau theo “di” hoặc “trisaccarid”. Nếu aglycon có 2 nhóm OH trở lên thì có
“diglycosid” hay “bidesmosid” (desmos có nghĩa là mạch).
Phân loại theo dây nối aglycon-đƣờng: phần đƣờng và phần không đƣờng của
các glycosid thƣờng nối với nhau bằng các cầu nối: O-glycosid, S-glycosid,
N-glycosid, C-glycosid. Một số trƣờng hợp phần đƣờng và không đƣờng liên kết với
nhau bằng dây nối ester, loại này đƣợc gọi là “pseudoglycosid”.
Phân loại theo cấu trúc của aglycon: Hệ thống phân loại thƣờng dùng hiện nay
là phân loại theo cấu trúc của phần không đƣờng. Dựa vào cấu trúc của phần khơng
đƣờng ngƣời ta chia thành các nhóm chất nhƣ: steroid glycosid, terpenoid glycosid,
polyphenol glycosid, alkaloid glycosid,…

2.2.3 Lý tính của glycosid
Kết tinh, dạng vơ định hình hoặc lỏng sánh. Đa số khơng màu (trừ

anthraglycosid có màu đỏ, flavonoid có màu vàng), có vị đắng. Aglycon thân dầu nên
ít tan trong nƣớc. Ở dạng glycosid dễ tan hơn, nhờ phần đƣờng, nên tan đƣợc trong
dịch tế bào.

2.2.4 Steroid glycosid
Steroid glycosid gồm phần aglycon là steroid và phần đƣờng, gồm 2 nhóm
chính là glycosid trợ tim và saponin.
Glycosid trợ tim
Glycosid trợ tim là một nhóm glycosid có cấu trúc steroid, có tác dụng đặc hiệu
đối với bệnh tim nhƣng với liều cao chúng là các chất gây độc. Tác dụng của glycosid
tim làm tăng sức co bóp của cơ tim cả ở ngƣời lành lẫn ngƣời bệnh, làm tăng trƣơng
lực cơ tim, làm ngắn chiều dài của các sợi cơ tim đã bị căng, giãn do vậy làm tăng
trƣơng lực cơ tim, giảm thể tích và kích thƣớc tim. Nhịp tim chậm lại do vừa có tác
SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

12


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

dụng trên dây thần kinh phế vị, vừa làm giảm tính tự động của nút xoang, giảm dẫn
truyền trong nhĩ, đặc biệt nút nhĩ thất, tính kích thích của cơ tâm nhĩ cũng giảm.
Ngƣợc lại, glycosid trợ tim làm tăng tính kích thích của cơ tâm thất, gây lợi tiểu nhẹ
do giảm tái hấp thu natri ở ống lƣợn gần.
Sự hấp thu glycosid qua dạ dày, ruột non phụ thuộc vào số lƣợng nhóm -OH
của aglycon. Một điển hình cụ thể nhƣ sau: digitoxin có 1 nhóm -OH dễ hấp thu qua
đƣờng tiêu hóa, tích luỹ trong cơ thể. Cịn ouabain có 5 nhóm -OH, khó hấp thu qua
đƣờng tiêu hóa nên tiêm tĩnh mạch đƣợc thải trừ nhanh. Đa số glycosid tim có vịng

A/B là cis, A/B ít gặp hơn. Ngƣời ta ghi nhận là nếu vịng A/B có cấu tạo trans thì
hoạt tính giảm hơn so với cấu tạo cis.

O

O

O

O
OH
OH

CH2OH
OH

Đường

Đường

O

Glycosid tim

O

OH

Ouabain

Hình 7: Các glycosid trơ ̣ tim

Saponin
Saponin là một glycosid phân bố khá rộng trong thực vật, có một số tính chất đặc
trƣng là khi hịa vào nƣớc sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và
tạo nhiều bọt, có tính phá huyết vì làm vỡ hồng cầu. Saponin thƣờng ở dạng vơ định
hình, có vị đắng, khó tinh chế có điểm nóng chảy thƣờng cao hơn 200C trở lên và có
thể cao hơn 300C. Saponin bị tủa bởi Pb2+, Ba(OH)2,… có thể lợi dụng tính chất này
để cơ lập saponin.

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

13


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33
O

O

O

O

HO

Diosgenin

Spirostan

Hình 8: Các saponin thƣờng gặp

2.2.5 Quy trình tách chiết glycosid ra khỏi cây
Cấu trúc hóa học của glycosid rất đa dạng nên tính phân cực của mỗi phân tử
thay đổi tùy theo cấu trúc của aglycon và số phân tử đƣờng gắn aglycon, vì thế khơng
thể có một phƣơng pháp chung nào cho tất cả các glycosid. Các glycosid có tính phân
cực khá mạnh, nên khơng tan trong eter dầu hỏa, hexan, benzen nhƣng tan đƣợc trong
cloroform, dietyl eter (các monoglycosid), tan tốt trong alcol, nƣớc. Ngƣời ta thƣờng
chiết glycosid bằng nƣớc nóng, etanol, metanol hoặc hỗn hợp alcol-nƣớc 50-90%.
Trƣớc tiên bột cây đƣợc loại béo bằng hexan hoặc eter dầu hỏa, bột cây còn lại
đƣợc chiết tiếp bằng alcol 50-100% (etanol, metanol). Dung dịch alcol đƣợc thêm một
ít nƣớc và đƣợc loại tạp bằng dung dịch chì acetat 20%. Cũng có thể loại tạp bằng
Pb(OH)2, Al(OH)3, Fe(OH)3,... Lọc bỏ tủa. Dung dịch nƣớc trong này đƣợc cho thêm
dung dịch nƣớc bão hịa Na2SO4 để tủa chì acetat. Lọc lấy phần nƣớc trong. Dung dịch
nƣớc này đƣợc làm khan với Na2SO4 hoặc MgSO4, rồi đuổi dung môi sẽ thu đƣợc cao.
Quy trình tách chiết trên đƣợc tóm tắt nhƣ hình 9.

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

14


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

Bột cây
Tận chiết với eter dầu hoả để loại béo

Tận chiết với hỗn hợp etanol hoặc metanol – nƣớc

Dung dịch nƣớc alcol

Eter dầu hoả

Dung dịch nƣớc chì acetat 2% - 5%
Lọc, rửa tủa với nƣớc cất
Dung dịch nƣớc

Trầm hiện

Dung dịch Na2SO4 bão hoà
Lọc, rửa tủa với nƣớc cất
Dung dịch nƣớc

Trầm hiện PbSO4

Tận chiết lỏng – lỏng với cloroform

Dung dịch nƣớc
Tận chiết lỏng – lỏng với etyl acetat

Dung dịch nƣớc
Tận chiết lỏng – lỏng với metanol

Dung dịch nƣớc

Dung dịch butanol

Dung dịch cloroform

Dung dịch etyl acetat

polyglycosid
Làm khan nƣớc
Thu hồi dung mơi
Glycosid tồn phần

Hình 9: Quy trình tách chiết glycosid ra khỏi cây
SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

15


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

CHƢƠNG 3: CƠ SỞ LÝ THUYẾT MỘT SỐ
PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
3.1 Các kỹ thuật chiết tách các hợp chất ra khỏi cây[1, 7, 12]
Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ. Các kỹ thuật đều
xoay quanh hai phƣơng pháp chính là chiết lỏng-lỏng và chiết rắn-lỏng. Trong thực
nghiệm, việc chiết rắn-lỏng đƣợc áp dụng nhiều hơn gồm sự ngấm kiệt, sự ngâm dầm,
sự trích hệ thống chiết Soxhlet,… Ngồi ra, cịn có thể chiết bằng phƣơng pháp lôi
cuốn hơi nƣớc, phƣơng pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (lƣu chất siêu tới hạn),
chiết có sự hỗ trợ của vi sóng.
3.1.1 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng

Hình10: Kỹ thuật chiết lỏng–lỏng

Kỹ thuật này còn đƣợc gọi là sự chiết bằng dung môi. Ngƣời ta dùng kỹ thuật
chiết lỏng-lỏng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành
những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

16


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

Việc chiết lỏng-lỏng đƣợc thực hiện bằng bình lóng, cao alcol thơ ban đầu đƣợc
hồ tan vào pha nƣớc. Sử dụng lần lƣợt các dung mơi hữu cơ, loại khơng hồ tan với
nƣớc hoặc loại có thể hỗn hợp đƣợc với nƣớc để chiết ra khỏi pha nƣớc các hợp chất
có tính phân cực khác nhau (tuỳ vào độ phân cực của dung môi). Tùy vào tỷ trọng so
sánh giữa dung môi và nƣớc mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc ở dƣới so với pha
nƣớc. Thực hiện lần lƣợt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung mơi phân cực thí
dụ nhƣ: eter dầu hỏa hoặc hexan, diclorometan, etyl acetat, butanol,… Với mỗi loại
dung môi hữu cơ, việc chiết đƣợc thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lƣợng nhỏ thể tích
dung mơi, chiết đến khi khơng cịn chất hịa tan vào dung mơi thì đổi sang chiết với
dung mơi có tính phân cực hơn. Dung dịch của các lần chiết đƣợc gom chung lại, làm
khan nƣớc với các chất làm khan nhƣ Na2SO4, MgSO4, CaSO4,… đuổi dung mơi ta thu
đƣợc cao chiết.
Nhƣợc điểm:
Do phải lắc bình lóng nhiều lần nên ở những lần chiết sau dung mơi trong bình
lóng tạo nhũ tƣơng, gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp. Khi dung mơi

trong bình lóng tạo nhũ tƣơng có thể sử dụng một đũa thủy tinh dài đƣa vào trong bình
lóng, khuấy nhẹ dung dịch hoặc cọ xát nhẹ vào thành bình, chỗ mặt thống của dung
dịch nhằm phá vỡ các bọt khí để dung dịch nhanh chóng phân thành hai lớp. Cũng có
thể phá bọt bằng cách ly tâm dung dịch.
3.1.2 Kỹ thuật chiết rắn-lỏng
 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt
Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng khá phổ biến vì khơng địi hỏi thiết bị tốn kém,
phức tạp.
Dụng cụ: Gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dƣới đáy
bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt
bên dƣới để hứng dung dịch chiết. Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng để
chứa dung mơi tinh khiết.
Cách tiến hành: Bột cây đƣợc xay thô, lọt đƣợc qua lỗ rây 3 mm. Mẫu khơng
nên to hơn vì sẽ chiết khơng kiệt, mẫu đƣợc xay q mịn sẽ có tính nhầy nhựa hoặc có
thể trƣơng nở,… sẽ cản trở dịng chảy. Đáy của bình ngấm kiệt đƣợc lót bằng bơng
SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

17


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

thủy tinh và một tờ giấy lọc. Bột cây đƣợc đặt vào bình, lên trên lớp bơng thủy tinh,
lên gần đầy bình. Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng
những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót
dung mơi cần chiết vào bình cho đến khi dung mơi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt. Có
thể sử dụng dung mơi nóng hoặc nguội.
Để yên sau một thời gian, thƣờng là 12-24 giờ. Mở van bình ngấm kiệt cho

dung dịch chiết chảy ra từng giọt và đồng thời mở khóa bình lóng để dung mơi tinh
khiết chảy xuống bình ngấm kiệt. Điều chỉnh sao cho vận tốc dung mơi tinh khiết chảy
vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này.
Hiệu quả phƣơng pháp: So sánh với phƣơng pháp ngâm dầm, phƣơng pháp
này đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn một chút nhƣng hiệu quả lại cao hơn và ít mất cơng
hơn vì đây là q trình chiết liên tục, dung mơi trong bình ngấm kiệt đã bão hòa mẫu
chất sẽ đƣợc liên tục thay thế bằng dung mơi tinh khiết.

Dung mơi tinh khiết

Giấy lọc
Bơng gịn

Dung mơi tinh khiết
Viên bi thủy tinh
Bột cây

Dung dịch chiết

Hình 11: Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

18


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

 Kỹ thuật chiết ngâm dầm
Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép khơng gỉ,
bình có nắp đậy. Rót dung mơi tinh khiết vào bình cho đều xấp bề mặt của lớp bột cây.
Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm
vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết
đƣợc lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung mơi sẽ có đƣợc cao chiết. Tiếp theo,
rót dung mơi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần
nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh
thoảng đảo trộn, xóc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý
nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài). Mỗi lần ngâm dung mơi, chỉ
cần 24 giờ là đủ vì với một lƣợng dung mơi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hịa tan
vào dung mơi đến khi đạt mức bão hịa. Dung mơi sau khi thu hồi đƣợc làm khan nƣớc
bằng các chất làm khan và đƣợc tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau.

Bình thủy tinh
Phễu và giấy lọc

Dung mơi
Bột cây

Dung dịch chiết
qua lọc

Hình 12: Kỹ thuật chiết ngâm dầm

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

19

Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

3.2 Một số kỹ thuật sắc ký
3.2.1 Sắc ký cột

[1, 7, 12]

Sắc ký cột là một trong những kỹ thuật rất quan trọng. Trong nghiên cứu các
hợp chất thiên nhiên, sắc ký cột thƣờng đƣợc sử dụng để tách riêng các hợp chất từ
một hỗn hợp.
Trong sắc ký cột thông thƣờng, chất hấp thu (pha tĩnh) đƣợc nạp vào một cột
làm bằng thủy tinh (có thể nạp dƣới dạng khơ hay ƣớt), dung môi di chuyển qua lớp
pha tĩnh theo chiều từ trên cao xuống thấp nhờ vào trọng lực. Mẫu đƣợc nạp ở đầu trên
của cột, do ái lực khác nhau của các hợp phần trong mẫu với pha tĩnh và pha động mà
có sự tách riêng giữa các hợp phần này.
Chất hấp thu thƣờng đƣợc sử dụng là silica gel, pha động là các dung môi hữu
cơ với nhiều tỷ lệ khác nhau, tìm hệ dung mơi dựa vào sắc ký bản mỏng. Thông
thƣờng ngƣời ta nạp silica gel vào cột dƣới dạng sệt (nạp ƣớt) do silica gel có khả năng
trƣơng nở khi bị solvat hóa.

Bơng gịn để bảo vệ
lớp bề mặt pha tĩnh

Dung môi (pha động)

Hỗn hợp mẫu ban đầu

Chất hấp thu (pha tĩnh)

Bơng gịn

Hình 13: Hệ thống sắc ký cột hở cổ điển

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

20


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

 Triển khai sắc ký cột
Chọn dung môi bắt đầu cho quá trình sắc ký cột
Trƣớc khi sắc ký cột, trƣớc hết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ dung
mơi cho phù hợp trong q trình giải ly cột, các bƣớc lần lƣợt nhƣ sau:
- Bước 1: Mẫu cần đƣợc sắc ký phải hịa tan hồn tồn trong một dung môi và
với nồng độ phù hợp.
- Bước 2: Chuẩn bị một vài tấm bản mỏng 2,5  10 cm. Chấm mẫu lên những
tấm bản này.
- Bước 3: Mỗi bản mỏng đƣợc giải ly với hệ dung môi có độ phân cực khác
nhau. Tiếp theo hiện hình mẫu chất bằng thuốc hiện hình H2SO4 20% trong metanol về
khối lƣợng.
- Bước 4:
Với hỗn hợp mẫu chất là kết quả của quá trình tổng hợp hữu cơ, hãy chọn hệ
dung mơi nào mà có thể đẩy đƣợc chất cần quan tâm lên vị trí có Rf = 0,2-0,3.
Với mẫu cao thô chiết từ cây cỏ, chọn hệ dung môi nào có thể đẩy đƣợc vết ít
phân cực nhất lên vị trí có Rf = 0,5.
Tỉ lệ mẫu chất cần phân tách với kích thước cột

Sắc ký cột là sắc ký mà chất hấp thu đƣợc nạp vào trong một cột bằng thủy tinh.
Kích cỡ cột tùy thuộc vào mẫu cần phân tách và tỷ lệ giữa đƣờng kính cột và lƣợng
chất hấp thu. Muốn tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần
trọng lượng của mẫu chất cần sắc ký. Tuy nhiên, nếu mẫu chất khó tách riêng thì có
thể sử dụng lƣợng chất hấp thu gấp 100-200 lần trọng lƣợng chất cần phân tách. Thực
nghiệm cũng cho thấy, muốn tách chất tốt thì chiều cao của chất hấp thu khi nạp vào
cột phải gấp từ 8-10 lần so với đường kính của cột.
Nạp chất hấp thu vào cột
Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá. Nếu phần đầu ra của cột không có
miếng thủy tinh xốp để chặn thì nhồi vào một lớp bơng gịn để thay thế. Chất hấp thu
nạp vào cột ở dạng sệt hoặc dạng khô đƣợc chuẩn bị nhƣ sau:

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

21


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

Nạp chất hấp thu dạng sệt
Rót một cách thật từ từ và đều đặn hỗn hợp dung môi giải ly và chất hấp thu vào
đầu cột. Phần đầu ra của cột đƣợc bố trí một becher để hứng dung mơi.
Chú ý:
- Trong q trình rót hỗn hợp chất hấp thu và dung mơi vào cột thì ta phải khuấy
cho thật đều.
- Lƣợng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp khơng đƣợc q sệt để tránh
tình trạng bọt khí nằm lại ở trong cột, dễ làm gãy cột và cũng không đƣợc quá lỏng.
- Đối với chất hấp thu có thể trƣơng nở trong dung mơi thì phải ngâm chất hấp

thu trong dung môi một khoảng thời gian trƣớc khi nạp cột.
- Trong q trình nạp cột, dung mơi vẫn chảy một cách liên tục qua cột, không để
đầu cột bị khơ, làm hƣ bề mặt cột hoặc có thể làm gãy cột.
Nạp chất hấp thu dạng khô
Cho chất hấp thu ở dạng bột khô thẳng vào trong cột có chứa sẵn một lƣợng dung
mơi kém phân cực khoảng 2/3 cột. Mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa cho vừa khỏ nhẹ thành
cột. Khi chất hấp thu đạt chiều cao thích hợp thì mở nhẹ khóa ở bên dƣới cột để cho
dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để ở bên dƣới cột, dung môi này đƣợc
sử dụng lại để rót trả lại lên đầu cột.
Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi thấy chất
hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.
Kết luận: Cả hai cách đều cho kết quả tốt nếu nạp cột một cách cẩn thận. Trong
trƣờng hợp cột nạp xong, quan sát thấy có nhiều bọt khí, có những bất thƣờng trong
cột thì phải xả hết cột và nạp lại từ đầu.
Nạp mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc ký
Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch
Nếu mẫu ở dạng lỏng, có thể cho trực tiếp mẫu lên đầu cột. Nếu mẫu ở dạng khơ
thì hịa tan mẫu bằng lƣợng nhỏ dung môi, dung môi khởi đầu cho việc sắc ký cột.
Dung dịch mẫu càng đậm đặc càng tốt.

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

22


Luận văn tốt nghiệp đại học

Cử nhân Hóa Học K33

Nạp mẫu chất ở dạng bột khô

Nếu mẫu chất không tan trong dung môi đƣợc lựa chọn để khởi đầu giải ly cột, vì
đây là dung mơi kém phân cực, thay vì mẫu chất tan trong dung mơi khá phân cực có
thể ảnh hƣởng đến q trình giải ly cột. Vì thế ta có thể nạp mẫu khơ.
Mẫu chất sau khi hịa tan, có thể đƣợc thổi khơ bằng máy thổi khơng khí hồ cá
hoặc cho vào bình cầu cơ quay để cơ quay chân khơng cho đến khi có bột silica gel
khô, lúc này mẫu chất cần sắc ký đã đƣợc tẩm lên bề mặt những hạt silica gel.
Dùng một ít dung mơi hịa tan lại bột silica gel khơ và cho dịch này vào đầu cột.
Cuối cùng cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu cột để bắt đầu q trình giải ly.
Giải ly cột sắc ký
Đơi khi, việc sử dụng một loại dung môi sẽ chỉ giải ly ra khỏi cột một số cấu tử
nhất định nào đó và một số cấu tử khác có tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu cột.
Nếu muốn đuổi chúng ra khỏi cột phải dùng một dung mơi có lực mạnh hơn. Trong
quá trình sắc ký, cần thay đổi nhiều loại dung mơi khác nhau, có độ phân cực tăng dần
để có thể đuổi hết các cấu tử khác ra khỏi cột. Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một
dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm: thêm từ từ mỗi lần vài phần trăm một dung
môi mới có tính phân cực cao hơn vào dung mơi cũ đang sử dụng.
Với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, q trình giải ly bằng sắc ký cột có
thể theo dõi bằng mắt thƣờng, nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc khác nhau, đang
tách xa nhau ra. Theo dõi các dãy màu và hứng chúng khi đƣợc giải ly ra khỏi cột.
Nhƣng đa số các hợp chất hữu cơ thƣờng khơng có màu, nên dung dịch giải ly cũng
trong suốt không màu, phải theo dõi bằng những cách khác nhau.
Phƣơng pháp thông dụng nhất là hứng dung dịch giải ly trong những lọ có đánh
số thứ tự. Hứng mỗi lọ một thể tích nhƣ nhau, thƣờng là 50 mL. Dung dịch trong
những lọ hứng đƣợc sẽ đƣợc sắc ký lớp mỏng trên cùng một bản mỏng. Những lọ nào
có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau sẽ đƣợc gom chung lại với nhau thành một
phân đoạn. Đuổi dung môi ở áp suất kém các phân đoạn này sẽ cho các cao của phân
đoạn đó.

SVTH Huỳnh Trần Minh Tuyền – MSSV 2072119

23