Luận văn tốt nghiệp khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate lá cây me rừng phyllanthus emblica bùi thị hồng lĩnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HĨA HỌC


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CAO ETHYL ACETATE LÁ CÂY ME RỪNG
PHYLLANTHUS EMBLICA

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết
Sinh viên thực hiện : Bùi Thị Hồng Lĩnh
Mã số sinh viên
: K38.201.062

Tp Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2016


NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG:
.............................................................................................
.............................................................................................
.............................................................................................
.............................................................................................
.............................................................................................
.............................................................................................
.............................................................................................
.............................................................................................
.............................................................................................
.............................................................................................
.............................................................................................

.............................................................................................
.............................................................................................
.............................................................................................
.............................................................................................
.............................................................................................
.............................................................................................
.............................................................................................
.............................................................................................


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay cùng với sự phát triển kinh tế xã hội, chất lượng cuộc sống ngày càng
cao, con người càng quan tâm hơn đến việc chăm sóc sức khoẻ. Thế nhưng bệnh tật
khơng vì thế mà giảm đi, tỷ lệ mắc bệnh tăng lên từng ngày xuất phát từ nhiều nguyên
nhân do ô nhiễm môi trường, do hóa chất trong thực phẩm, hay cũng có thể do di truyền
và nhiều nguyên nhân khác…
Trước tình trạng đó, nhiều quốc gia trên thế giới đã tiến hành tìm kiếm các loại
thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên với hi vọng những tìm ra những hợp chất mới có thể
trị bệnh một cách an tồn, thân thiện với sức khỏe con người.
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên được thừa hưởng nguồn thiên
nhiên vơ cùng phong phú với nhiều lồi dược liệu quí. Các hợp chất thiên nhiên thể
hiện hoạt tính sinh học rất đa dạng nên là một trong những định hướng để nghiên cứu,
chiết xuất và tìm ra các loại thuốc mới bằng con đường tổng hợp.
Nhằm đóng góp một phần hiểu biết thêm về thành phần hóa học của cây thuốc dân
gian, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate lá cây me
rừng”.

Me rừng là một loài cây mà hầu hết các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt đều có thể
dùng làm thuốc trị bệnh. Rễ me rừng trị viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp, hạt
được sử dụng để trị hen hay viêm khí quản, lá dùng làm thuốc trị phù thũng, viêm da mẩn
ngứa, eczema hay dùng nấu nước tắm rửa phịng trị bệnh ngồi da, quả me cũng được chế
thành thuốc long đờm, hạ nhiệt, lợi niệu, trị tiêu chảy, chống bệnh thiếu vitaminC…. Hi
vọng với đề tài này có thể đóng góp một phần nhỏ những chứng cứ khoa học có giá trị
vào kho dược liệu của Y học dân tộc Việt Nam.

1


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

Chương I
TỔNG QUAN
1.1.

ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

Me rừng còn gọi là chùm ruột núi hay du cam tử, ngưu cam tử, dư cam tử
Tên khoa học: Phyllanthus emblica Linn
Thuộc họ thầu dầu Euphorbiaceae. [1]

Hình 1.1 Cây me rừng

Hình 1.2 Quả me rừng

Cây me rừng phân bố chủ yếu ở những khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới của Trung

Quốc, Ấn Độ, Indonesia và Malaysia. Ở nước ta, cây me rừng mọc phổ biến trên các đồi
trọc, các bãi hoang, trong các rừng thưa [1].
Me rừng là cây ưa ánh sáng, chịu được khô hạn, cây nhỡ cao 3m, phân nhiều cành nhỏ
mềm, có lơng, dài 20cm. Hoa nhỏ, cụm hoa thành xim co mọc ở nách lá phía dước của
cành, gồm rất nhiều hoa đực và vài hoa cái. Hoa mọc từ tháng 3 đến tháng 11. Lá xếp
thành hai dãy trên các cành nhỏ trông giống một lá kép lông chim, cuống lá rất ngắn. Lá
kèm rất nhỏ hình ba cạnh. Quả hình cầu trước mọng, sau khơ thành quả nang, hạt hình ba
cạnh, màu hồng nhạt[1].
1.2.

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH

1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền
Ở Việt Nam:

2


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

Quả có vị chua, ngọt, đắng, tính mát, có tác dụng nhuận phế, hóa đờm, sinh tân,
chữa cảm, phát sốt ho, đau cổ họng [1].
Rễ có tác dụng trị viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp: ngày dùng 15-20g
rễ sắc uống [1].
Lá có tác dụng trị lở loét, mẩn ngứa [1].
Ở Ấn Độ:
Cây me rừng là một trong những loài thảo dược được sử dụng phổ biến ở Ấn Độ
và được coi như một nguồn cung cấp vitamin C. Quả tươi là một vị thuốc mát, lợi tiểu,

nhuận tràng , quả khô dùng chữa lỵ, ỉa chảy.
Cây có tác dụng hạ men gan, tăng hấp thụ thức ăn, cân bằng lượng acid trong dạ
dày, tăng cường phổi và hệ miễn dịch, kích thích nhuận tràng, hỗ trợ hệ tiết niệu, tốt cho
da, mắt và tóc.[3]
1.2.2 Một số nghiên cứu về dược tính
+ Hoạt tính kháng herpes simplex virus (HSV) loại 1 và loại 2.
Năm 2011, Yangfei Xiang và các cộng sự [16] đã thử nghiệm khả năng kháng
viêm nhiễm HSV-1 và HSV-2 của hợp chất 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose
(1246TGG) (62) được cô lập từ cây me rừng. Kết quả cho thấy 1246TGG ở nồng độ
31,70 µM có khả năng ức chế sự phát triển của virus Herpes và có thể được dùng trong
điều trị HSV.
+ Tác dụng gây độc tế bào ung thư.
Năm 2011, Xiaoli Liu cùng với các cộng sự [15] đã tiến hành nghiên cứu khả năng
điều hòa miễn dịch và gây độc tế bào ung thư của một số hợp chất phenol được cô lập từ
quả me rừng. Kết quả cho thấy hai hợp chất isocorilagin (49) và geraniin (50) có khả
năng gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7) ở người với IC 50 lần lượt là 13,2 và 80,9 µg/ml.
Ngồi ra, isocorilagin (49) cịn có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi (HELF) ở người
với IC 50 51,4 µg/ml.
+ Tác dụng phục hồi tổn thương tinh hoàn do tác dụng phụ của thuốc động kinh.
3


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

Valproic acid được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh động kinh nhưng lại gây
tác dụng phụ ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của nam giới. Theo nghiên cứu vào năm
2015 của Sitthichai Iamsaard và các cộng sự [9], dịch chiết từ cành me rừng có tác dụng
cải thiện nồng độ tinh dịch của chuột đực đã được tiêm valproic acid.

+ Hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxi hóa.
Theo các nghiên cứu vào năm 2007 của Xiaoli Liu cùng các cộng sự [14] và
nghiên cứu vào năm 2010 của Wei Luo cùng các cộng sự [11], một số hợp chất phenol
như 3-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (29), kaempferol 3-β-D-glucopyranoside (46),
kaempferol (47), quercetin (48), isocorilagin (49), geraniin (50) isomallotusinin (59),
chebulagic acid (60), chebulanin (61) được cô lập chủ yếu từ vỏ và quả me rừng có các
tác dụng kháng khuẩn, kháng oxi hóa hiệu quả.
+ Tác dụng phục hồi chức năng gan và hạ men gan
Theo nghiên cứu do Sharma Bhawna và các cộng sự thực hiện vào năm 2010 [8],
dịch chiết ethanol của cây me rừng có tác dụng hạ men gan, phục hồi chức năng của tế
bào gan với liều lượng 75mg/kg/ngày khi thử nghiệm trên chuột.
1.3.

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
Các nghiên cứu từ năm 1998 trở về trước cho thấy trong cây me rừng có các hợp

chất: zeatin (1), zeatin nucleotide (2), zeatin riboside (3), chebulic acid (4), chebulinic
acid (5), corilagin (6), 3,6-di-O-galloyl glucose (7), gallic acid (8), ethyl gallate (9),
gluco-gallin (10), ellagic acid (11), gibberellin (A1, A3, A4, A7, A9) (12-16),
leucodelphinidin (17), rutin (18), β-sitosterol (19) [4].
NH
OH

N

N

N
HO

N
H
(1)

N
NH

O
HO P O
OH

N

OH

N

N

N

O
OHOH

(2)

4

N
N

H

OH
O
HO OH

N

N
(3)


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh
RO
OR
O

OR

OR
O

HO

O
HO

O

HOOC

O

O

O

COOH

OH

O

HO

OH

OH
HOOC

R=Galloyl
(5)

COOH

(4)

O

OH

O

HO

O

HO

O
O

HO
OH

HO
OH
R=Galloyl
(6)

OH

OR

O

OH

RO
HO
RO

O

OH

HO

OH
R=Galloyl
(7)

O

R2

O

HO
O

OH

HO

O

OH

O
H

OH

O
H
O

H

OH

OR

OH
R=Galloyl
(10)

OH
(8) R=H
(9) R=C2H5
O

O

HO
HO

OH

H
R1

HO

O
O
(11)

OH

OH
OH
HO

R
(13) R=OH
(15) R=H

(12) R1=R2=OH
(14) R1=H, R2=OH
(16) R1=R2=H

O

HO

O

OH
OH

OH OH
(17)

OH

H
H

OR
OH O

H

R=Rha-glu
(18)

HO

H
H
(19)

Từ 1999-2001, Ying-Jun Zhang và các cộng sự đã nghiên cứu thành phần từ các
bộ phận khác nhau của cây me rừng. Kết quả cho thấy nhóm tác giả đã cơ lập và nhận
danh các hợp chất sau: phyllaemblic acid (20), các phyllaemblicin A-C (21-23), sáu hợp
chất phenolic mới là 2-O-galloyl L-malic acid(24), 2-O-galloyl mucic acid (25) và ba dẫn

xuất methyl ester (26-28), 2-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (29) cùng dẫn xuất methyl
ester (30), 5-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (31) cùng dẫn xuất methyl ester (32), 3-O5


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

galloyl mucic acid 1,4-lactone (33), và 3,5-di-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (34),
phyllaemblic acid B (35) và phyllaemblic C (36), phyllaemblicin D (37), cùng với hai
hợp chất mới, 2-carboxylmethylphenol 1-O-β-D-glucopyranoside (38) và 2,6-dimethoxy4-(2-hydroxyethyl)phenol 1-O-β-D-glucopyranoside (39), các phyllanemblinin A-F (4045) [10, 17, 18, 20, 21].
O
O

HO

HO
O

O
O

O

O

OH

O

OH

OH

O

HO
HO

O

O
O

O
O
(21)

OH

OH
(20)

O
O

HO

HO
O

OH

HO
HO

O
O

HO

O

HO
OH HO
O
HO
OH

O

O

OH
(22)

HOOC
RO

H

COOH

R=Galloyl
(24)

O

OH

OH
O

HO
HO
O

HO

O
O

HO
HO
O

OH
O

O

O

O

(23)

ORH H OH
R1OOC
COOR2
H OHOHH
R=Galloyl
(25) R1=R2=H
(26) R1=R2=CH3
(27) R1=H, R2=CH3
(28) R1=CH3, R2=H

H OR3
OR4
O
HO

R1O
OR2
=
allo
R
29
G
yl, R2=R3=R4=H
( ) 1

=
allo
(30) R1 G yl, R2=R3=H, R4=CH3
(33) R1=R3=R4=H, R2=G
(34) R1=R4=H, R2=R3=G

RO H
R1O
O

O

O

H
HO

OH

R=Galloyl
(31) R1=H
(32) R1=CH3

6

O

O
O

O


Khóa luận tốt nghiệp
OH
H
R1

Bùi Thị Hồng Lĩnh

OH

H
O

O
OH

HO

OR2
COOH

O

O

OR

HOOC

(35) R1=OH, R2=H
(36) R1=R2=H
(37) R1=H, R2=Glu

OR
R=Glu
(39)

R=Glu
(38)

OH HO

HO

OH

HO

HO
OH
O

HO
HO

OR

O

O

O

O

O

HO
OH

O HO
H
R=Galloyl
(41)

R=Galloyl
(40)

O

OH

OH
O

O

O

HO

HO

O

O

HO

O

O

O

O
OR

O

OG

O

O
O

OH

OH

H
HOOC

OH

HO

O
COOH

OH

R=Galloyl
(42)

OR4
R3O
R2O

O

OR1

OH
(43) R1=Galloyl, R2=neoche, R3=R4=H
(44) R1=Galloyl, R2=H, R3=neoche, R4=H
(45) R1=Galloyl, R2=R3=H, R4=neoche

Năm 2007, Xiaoli Lin cùng các cộng sự đã cô lập được 5 hợp chất từ cây me rừng,
bao gồm: kaempferol 3-β-D-glucopyranoside (46), kaempferol (47), quercetin (48),
isocorilagin (49) và geraniin (50) [14]. Cũng vào năm này, hợp chất mới phyllanthunin
(51) cũng đã được cô lập cùng với các hợp chất đã biết: daucosterol (52), stearic acid
(53), lauric acid (54), cinnamic acid (55) [2].

7


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh
HO
R

OH
HO

O
HO

OH

O

O
HO

O

HO
HO

O
OH O

OH

HO

OH O

O

HO
HO

OH
HO
(46)

R=Galloyl
(49)

(47) R=H
(48) R=OH

OH HO

HO

OR

OH

OH

O

O

HO
O

OH

HO

OH
O
OR

O
O

O

OH OR
OH
O

O
O

O

O

O

O
H

O

HO

OH

O
HO
OHOH

O
OH O
O
O
O

HO

OH

O
HO

OH
OH

O

OH

R=Galloyl
(51)

R=Galloyl
(50)

H

O
OH
H
HO
HO

O
OH

H

R

O

COOH

(53) R=n-C17H35
(54) R=n-C11H23

(52)

OH
(55)

Năm 2008, S. K. EL-DESOUKY và cộng sự đã cô lập được hợp chất mới là
acylated apigenin glucoside (apigenin-7-O-(6”-butyryl-β-glucopyranoside)) (56) và các
hợp chất khác như 1,2,3,4,6-penta-O-galloyglucose (57). Xiaoli Liu và các cộng sự đã cô
lập thêm quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (58) [7, 13].

8


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh
OH
OH

O

OH
O

HO
HO

O

HO

O

O

O

OR

O

O

RO
RO

OH

OH

OR
OH
HO

OR
R=Galloyl
(57)

OH O
(56)

OO

OH
HO

(58)

Từ vỏ quả me rừng, năm 2011, Wei Lou và các cộng sự đã cô lập được
isomallotusinin (59), chebulagic acid (60), chebulanin (61) [10]
Hợp chất 1,2,4,6-tetra-O- galloyl-β-D-glucose (62) đã được cô lập từ lá và cành của
cây me rừng bởi Yangfei Xiang và các cộng sự vào năm 2011 [16].
OH HO

HO

OH

HO

HO

OH
O
OR

O
O

O

OH HO

OH

HO

O

O

OH
O

O

O

O

HO

O
OR

O

O
O

OH

O

HOOC

O

O
O

O

OH
O

HO

R=Galloyl

(59)

O
O

O

HO

HO

HO

O

HOOC

OR

O

OH

O
OH

OH
R=Galloyl
(60)

O

O

OH
OH

R=Galloyl
(61)

RO
RO
HO

O

OR

OR
R=Galloyl
(62)

Năm 2012, Wei-Yan Qi và cộng sự đã cô lập được β-sitosterol (19), daucosterol
(52), cùng 12 hợp chất sterol khác (63-74), trong đó có 2 hợp chất sterol mới là 5α,6β,7αtrihydroxysitosterol (64) và 7α-acetoxysitosterol (65) từ cành và lá của cây me rừng [12].
9


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

H

H

HO

R1
R2

HO

R
OH
OH
(63) R=H
(64) R=OH

(65) R1=H, R2=CH3COO
(66) R1=H, R2=OH
(67) R1=CH3CH2O, R2=H
(68) R1=R2=O

H

H

O
R1 R2
(69) R1=R2=H

(70) R1=R2=O
(71) R1=H, R2=OH

HO
OH
(72)

H
R2
HO
HO

O

O

R1

OH
(73) R1=H, R2=CH3-(CH2)14COO
(74) R1=OH, R2=CH3-(CH2)14COO

10


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

Chú thích:

O

O

OH

HO
H

HOOC H
OH

HO

HOOC

OH

Ac=Acetyl

HO

HO

OH

OH
OH

O

O

O

OH
Glu=Glucopyranosyl

O

O
neoche

G=Galloyl

HO
HO

OH

O

HO
HO

OH

Rha-Glu=α-L-rhamnopyranosyl (1→6) -O-β-D-glucopyranosyl

11

Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

CHƯƠNG II
THỰC NGHIỆM
2.1.

HỐ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP

2.1.1. Hoá chất
 Silica gel 0,04-0,06 mm, Merck và silica gel 0,04-0,06 mm, Himedia dùng cho sắc
kí cột.
 Sắc ký lớp mỏng loại 25DC – Alufolein 20×20, Kiesel gel 60F

254

, Merck.

 Sắc ký lớp mỏng loại 25DC, RP-18, Merck.
 Dung mơi dùng cho q trình thí nghiệm gồm: hexane, ethyl acetate, acetone,
acetic acid, ethanol, methanol.
 Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên lớp mỏng: sử dụng H 2 SO 4 20%.

2.1.2. Thiết bị
 Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.

 Các cột sắc ký.

 Máy cô quay chân không.
 Bếp cách thuỷ.
 Đèn soi UV: bước sóng 254 nm.
 Cân điện tử Sartorius Mass 620g.

2.1.3. Phương pháp tiến hành
2.1.3.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
Sắc kí cột silica gel pha thường và sắc kí lớp mỏng.
Hiện hình sắc ký lớp mỏng bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm hoặc dùng
thuốc thử là dung dịch H 2 SO 4 20%.

2.1.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và 2DNMR được ghi trên máy Bruker Avance tại Phịng thí nghiêm phân tích trung tâm, Đại
học Khoa Học Tự Nhiên, 227 Nguyễn Văn Cừ, Q5, Tp.HCM.

12


Khóa luận tốt nghiệp
2.2.

Bùi Thị Hồng Lĩnh

NGUYÊN LIỆU

2.2.1. Thu hái nguyên liệu
Mẫu được dùng trong nghiên cứu khoá luận là lá cây me rừng được thu hái tại
Bình Thuận vào tháng 5/2014.
Mẫu cây đã được TS. Phạm Văn Ngọt nhận danh tên khoa học là Phyllanthus
emblica Linn, họ thầu dầu ( Euphorbiaceae).

2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu
Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm,
rồi xay thành bột mịn. Sau đó tiến hành ngâm chiết và phân lập các hợp chất.
2.3.

ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO
Lá me rừng được phơi khô, chặt nhỏ và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối

lượng không đổi (m =7,2 kg). Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 960 bằng
phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao
ethanol thô (285,5 g).
Cao ethanol thô được chiết lỏng – lỏng lần lượt với hexane, ethyl acetate thu được
cao hexane (22,1 g), cao ethyl acetate (143,1 g) và phần cao cịn lại (77,1 g). Q trình
thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1.

13


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh
Sơ đồ 2.1. Qui trình điều chế các loại cao
Bột lá me rừng
( 7,2 Kg)
-

Bã khô

Ngâm trong ethanol 96

Lọc

o

Dịch ethanol
- Cô quay thu hồi dung môi

Ethanol thu hồi

Cao ethanol
(285,5 g)
-

Cao hexane lá me
(22,1 g)

Chiết lỏng – lỏng với
hexane, ethyl acetate
Cô quay thu hồi dung mơi

Cao ethyl acetate lá me
(143,1 g)

Cao cịn lại
(77,1 g)

2.4
CƠ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE LÁ
ME RỪNG
Cao ethyl acetate được SKC silica gel giải ly với hệ dung môi H: EA (80% đến 100%

EA) và tiếp tục với hệ dung môi EA: Me (5% đến 100% Me). Dịch giải ly qua cột được
hứng vào các lọ. Theo dõi q trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng. Những lọ cho kết quả
sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn. Kết quả thu được 5 phân
đoạn (EA1-EA5). Quá trình thực hiện được trình bày trong bảng 2.1

14


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate lá me (143,1g).

STT

Phân
đoạn

Dung mơi giải ly

Trọng
lượng
(g)

1
2

EA1
EA2

H:EA 2:8
EA

16,50
13,28

3

EA3

EA:Me 95:5

22,25

Sắc kí lớp
mỏng

EA:Me 8:2
EA4
33,40
EA5
EA:Me 7:3
14,70
Ghi chú: H (hexane), EA (ethyl acetate), Me (methanol)

4
5

Ghi chú

Vệt dài
Nhiều vết
Nhiều vết
kéo vệt
Nhiều vết
Nhiều vết

Khảo sát
Chưa khảo sát
Đã khảo sát
Khảo sát
Chưa khảo sát

2.4.1 SẮC KÍ CỘT SILICA GEL TRÊN PHÂN ĐOẠN EA1 (16,50 g)
Tiến hành sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA1 (16,50 g) bằng hệ dung môi C:Me
(0% đến 20% Me), sau đó chuyển sang hệ dung mơi EA:Me (5% đến 100% Me) thu
được 10 phân đoạn, kí hiệu từ EA1.1 đến EA1.10.
Trong phân đoạn EA1.9 cho kết quả sắc kí lớp mỏng có sự tách vết màu vàng rõ
ràng. Tiếp tục sắc kí cột pha thường trên phân đoạn EA1.9 nhiều lần, thu được hợp chất ở
dạng bột màu vàng, kí hiệu là PAL3. Hợp chất PAL3 có khối lượng 25mg (hệ dung mơi
H: Ac: AcOH 6:4:0,2 màu vàng khi hiện hình bằng thuốc thử H 2 SO 4 20%). Kết quả được
trình bày trong bảng 2.2, 2.3.
Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA1 (16,50 g) của bảng 2.1.

STT
1
2
3
4

5
6
7
8
9
10

Phân
đoạn

Dung mơi giải ly

Trọng
lượng
(g)

Sắc kí lớp
mỏng

Ghi chú

0,39
0,32
0,31
0,38
0,32
0,22
0,24
0,31
9,73

0,83

Nhiều vết
Nhiều vết
Nhiều vết
Vệt dài
Vệt dài
Vệt dài
Vệt dài
Vệt dài
Vết rõ ràng
Nhiều vết

Khảo sát
Chưa khảo sát
Chưa khảo sát
Chưa khảo sát
Chưa khảo sát
Chưa khảo sát
Chưa khảo sát
Chưa khảo sát
Khảo sát
Chưa khảo sát

EA1.1
C
EA1.2
C
EA1.3
C

EA1.4
C : Me 9:1
EA1.5
C : Me 9:1
EA1.6
C : Me 9:1
EA1.7
C : Me 85:15
EA1.8
C : Me 85:15
EA1.9
C : Me 8:2
EA1.10
C : Me 8:2
Ghi chú: C (chloroform)

15


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA1.9 của bảng 2.2.

Dung mơi giải ly

Trọng
lượng
(g)

Sắc kí lớp mỏng

Ghi chú

EA1.9.1
EA1.9.2
EA1.9.3
EA1.9.4
EA1.9.5

DCM:Me 95:5
DCM:Me 95:5
DCM:Me 95:5
DCM:Me 9:1
DCM:Me 9:1

0,41
0,65
0,54
1,57
1,51

Vết mờ
Nhiều vết
Nhiều vết
Nhiều vết
Vết rõ ràng

EA1.9.6

DCM:Me 9:1

0,40

Vết rõ ràng

1,62

Nhiều vết

Khảo sát
Đã khảo sát
Đã khảo sát
Chưa khảo sát
Chưa khảo sát
Khảo sát thu
được PAL3
Chưa khảo sát

STT

Phân
đoạn

1
2
3
4
5

6
7
2.4.2

EA1.9.7
DCM:Me 9:1
Ghi chú: DCM (dichloromethane)

SẮC KÍ CỘT SILICAGEL TRÊN PHÂN ĐOẠN EA4 (33,40 g)

Tiến hành sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 (33,40 g) bằng hệ dung môi
H:EA (75% đến 100% EA) sau đó chuyển sang hệ dung mơi EA:Me (5% đến 40% Me)
thu được 8 phân đoạn, kí hiệu từ EA4.1 đến EA4.8.
Trong phân đoạn EA4.7 cho kết quả sắc kí lớp mỏng có sự tách vết màu vàng rõ
ràng. Tiếp tục sắc kí cột pha thường trên phân đoạn EA4.7 nhiều lần, thu được hợp chất
khơng màu, kí hiệu là PAL4. Hợp chất PAL4 có khối lượng 7mg (hệ dung mơi H: Ac:
AcOH 6:4:0,2 màu vàng khi hiện hình bằng thuốc thử H 2 SO 4 20%). Kết quả được trình
bày trong bảng 2.4, 2.5.
Bảng 2.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 (33,40 g) của bảng 2.1.

STT

Phân
đoạn

Dung môi giải ly

Trọng
lượng
(g)

1

EA4.1

H:EA 1:3

4,67

2

EA4.2

H:EA 1:3

3,78

3

EA4.3

H:EA 1:9

2,52

4
5
6

EA4.4

EA4.5
EA4.6

H:EA 1:9
EA
EA:Me 95:5

2,75
1,59
1,86

7

EA4.7

EA:Me 85:15

3,40

8

EA4.8

EA:Me 6:4

2,80
16

Sắc kí lớp
mỏng

Vệt dài
Nhiều vết
kéo vệt
Nhiều vết
kéo vệt
Vệt dài
Vệt dài
Kéo vệt
Có vết
tách rõ
Kéo vệt

Ghi chú
Đã khảo sát
Chưa khảo sát
Chưa khảo sát
Chưa khảo sát
Đã khảo sát
Chưa khảo sát
Khảo sát
Chưa khảo sát


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

Bảng 2.5. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.7 (3,40 g) của bảng 2.4

Dung mơi giải ly

Trọng
lượng
(g)

Sắc kí lớp
mỏng

EA4.7.1
EA4.7.2

H:Ac 4:1
H:Ac 4:1

0,16
0,24

Vệt dài
Nhiều vết

3

EA4.7.3

H:Ac 3:2

0,8

Nhiều vết

4

EA4.7.4

H:Ac 3:2

1,20

Vệt dài

STT

Phân
đoạn

1
2

17

Ghichú
Chưa khảo sát
Chưa khảo sát
Khảo sát thu
được PAL4
Chưa khảo sát


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PAL3 (25 mg)

Hợp chất PAL3 thu được sau quá trình sắc kí cột nhiều lần phân đoạn EA1.9.6 của
bảng 2.3 có những đặc điểm quan trọng sau:
• Hợp chất ở dạng bột màu vàng.
• Kết quả sắc kí lớp mỏng giải ly với hệ môi hexane : acetone : acetic acid 6: 4:
0,2; hiện hình bằng thuốc thử H 2 SO 4 20%, đun nóng bảng mỏng thu được 1 vết
trịn màu vàng nhạt.
• Phổ 1H-NMR (acetone – d 6 , phụ lục 1), δ H ppm: 7,69 (1H, dd, H-6’), 6,99 (1H,
d, H-5’), 7,82 (1H, d, H-2’), 6,51 (1H, d, H-8), 6,26 (1H, d, H-6),
• Phổ 13C-NMR (acetone – d 6 , phụ lục 2), δ C ppm: 176,36 (>C=O) và độ chuyển
dịch của các cacbon khác được trình bày trong bảng 3.1.
Biện luận cấu trúc:
Phổ 1H-NMR của PAL3 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 5 proton vịng thơm
trong vùng δ H 7,82-6,26. Trong đó ở δ H 7,82 (J=2,0 Hz) xuất hiện tín hiệu cộng hưởng
của proton bị tách meta, ở δ H 7,69 (J=8,5 Hz) xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của proton
bị tách ortho và meta. Ngồi ra trên phổ cịn xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của hai proton
khác bị tách meta ở δ H 7,82 (J=2,0 Hz) và 7,69 (J=2,5 Hz).
Phổ

C-NMR của PAL3 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của 15 C trong vùng δ C

13

176,4 -94,3, cho phép dự đoán PAL3 là hợp chất flavon. Trong đó có carbon >C=O cộng
hưởng ở δ C 176,4 ppm. Như vậy có thể dự đốn PAL3 là một flavonol.
Từ những dữ liệu trên kết hợp so sánh với dữ liệu phổ của quercetin cho thấy sự
tương đồng, nên hợp chất PAL3 được đề nghị là quercetin
5'

OH

6'
8

HO

4'

1
9

1'

O

3'

2

7

2'

3

6
5

OH

10

4

OH

O

Quercetin (PAL3)
18

OH


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất PAL3

Hợp chất PAL3 ( Acetone-d 6 )

Vị trí
carbon

2
3
4
5
6
7
8
9
10
1’
2’
3’
4’
5’
6’

3.2

Quercetin (Acetone-d 6 ) [5]

δ H ppm (J, Hz)

δ C ppm

δ C ppm

6,26 (d, 2,0)
6,51 (d, 2,0)
7,82 (d, 2,0)
6,99 (d, 8,0)

7,69 (dd, 8,5; 2,5)

146,8
136,6
176,4
163,0
98,9
164,8
94,3
157,6
104,0
123,6
115,6
145,6
148,1
116,0
121,3

146,0
136,8
176,7
162,3
99,3
165,3
94,5
157,8
104,1
123,8
115,8
147,1

148,5
116,2
121,5

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PAL4 (7 mg)

Hợp chất PAL4 thu được sau q trình sắc kí cột nhiều lần phân đoạn EA4.7.3 của
bảng 2.5 có những đặc điểm quan trọng sau:
• Hợp chất ở dạng vơ định hình, khơng màu.
• Kết quả sắc kí lớp mỏng giải ly với hệ mơi hexane : acetone : acetic acid 6: 4:
0,2; hiện hình bằng thuốc thử H 2 SO 4 20%, đun nóng bảng mỏng thu được 1 vết
trịn màu vàng nhạt.
• Phổ 1H-NMR (MeOD, phụ lục 3), δ H ppm: 4,55 (1H, d, H-1), 1,27 (3H, d, CH 3 ), 3,35 (3H, s, -OCH 3 ), và độ chuyển dịch của các proton khác được trình
bày trong bảng 3.2.
• Phổ

13

C-NMR (MeOD, phụ lục 4), δ C ppm: 102,8 (C1), 55,1 (-OCH 3 ), 17,9 (-

CH 3 ) và độ chuyển dịch của các cacbon khác được trình bày trong bảng 3.2.
• Phổ HSQC (phụ lục 5)
• Phổ HMBC (phụ lục 6)
Biện luận cấu trúc:
Phổ 1H-NMR của PAL4 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của proton anomer ở δ H
4,55 (1H, d, J=1,5 Hz) và tín hiệu cộng hưởng của các proton gắn trên carbon mang
oxygen >CH-O trong vùng δ H 3,78-3,34. Ngoài ra phổ 1H-NMR cịn xuất hiện tín hiệu
19

Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

cộng hưởng của nhóm –CH 3 ở δ H 1,27 (3H, d, J =6,5 Hz), tín hiệu cộng hưởng của nhóm
–OCH 3 ở δ H 3,35 (3H, s).
Phổ 13C-NMR của PAL4 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của sáu carbon trong vùng
δ C 69,61-102,79.

Phổ HSQC của PAL4 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của proton anomer ở δ H 4,55
tương quan với carbon ở δ C 102,79; giúp xác định vị trí carbon anomer. Proton cộng
hưởng ở δ H 1,27 tương quan HSQC với carbon ở δ C 17,98 (-CH 3 ).
Phổ HMBC cho thấy sự tương quan giữa proton cộng hưởng ở δ H 3,35 (-OCH 3 )
với carbon anomer δ C 102,79 (C1). Như vậy nhóm –OCH 3 gắn vào C1.
Từ những dữ liệu phổ NMR trên cho phép dự đoán cấu trúc của PAL4 là một
đường rhamnose có gắn nhóm –OCH 3 , kết hợp so sánh với dữ liệu phổ của 1-O-methyl-

α-L-rhamnopyranoside [6] cho thấy có sự tương đồng nên cấu trúc của hợp chất PAL4
được đề nghị là 1-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside

H

H
5

H3 C
HO
4 HO

H

OCH3
H
O
3

H

H 3C

1 H

OCH3

H

O

HO

H

H

HO

2

H

OH

1-O-methyl-α-L-rhamnopyranside

OH

Hình 3.1. Một số tương quan HMBC của PAL4

Bảng 3.2. Dữ liệu phổ của hợp chất PAL4
Vị trí
carbon
1
2
3
4
5
-CH 3
-OCH 3

Hợp chất PAL4 ( MeOD)
δ H ppm (J, Hz)
4,55 (d, 1,5)
3,77 (dd, 1,5; 3,5)
3,60 (dd, 3,5; 9,5)
3,37 9 (t, 3,5; 6,0)
3,53 (m)
1,27 (d, 6,5)
3,35 (s)

δ C ppm

102,8
72,4
72,1
74,0
69,6
17,9
55,1

20

1-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside
D 2 O[6]
δ C ppm
102,6
72,7
72,1
73,8
69,5
18,6
54,4


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

Chương IV
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
4.1.

KẾT LUẬN

Việc khảo sát thành phần hóa học của lá cây me rừng thu hái ở Bình Thuận đã thu
được những kết quả như sau:
Từ phân đoạn EA1.9 và EA4.7 cao ethyl acetate, sử dụng các phương pháp chiết
xuất, sắc kí đã cơ lập được hai hợp chất được kí hiệu là PAL3 và PAL4. Sử dụng các
phương pháp phân tích hóa lí hiện đại kết hợp so sánh với dữ liệu trong các tài liệu tham
khảo đã đề nghị cấu trúc của PAL3 và PAL4 lần lượt là quercetin và 1-O-methyl-α-Lrhamnopyranoside
5'

OH

6'
8

HO

1
9

5

1'

O

3'

2

7

2'

H3 C

OH

3

6

10

5

OH

4

HO

OH

4 HO

H

O

Quercetin (PAL3)
4.2.

H

4'

OCH3
H

1 H

O
3

H
2

OH

1-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside (PAL4)

ĐỀ XUẤT

Do hạn chế về thời gian nên còn rất nhiều phân đoạn em chưa nghiên cứu. Trong
khóa luận này, em chỉ mới tiến hành phân lập với cao ethyl acetate. Vì vậy, trong thời
gian tới, em sẽ tiếp tục nghiên cứu trên các cao và các phân đoạn khác cũng như mở rộng
nghiên cứu sang các cây khác cùng chi.

21

Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

TÀI LIỆU THAM KHẢO
 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1] Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, 2004, trang
695-696.

 TÀI LIỆU TIẾNG ANH
[2] Chun-Bin Yanga, Fan Zhang, Mei-Cai Denga, Guang-Yun Hea, Jian-Min Yuec, RunHua Lua (2007), A new ellagitannin from the fruit of Phyllanthus emblica L., Journal of
the Chinese Chemical Society, 54, 1615-1618.
[3] Ekta Singh, Sheel Sharma, Ashutosh Pareek, Jaya Dwivedi, Sachdev Yadav and
Swapnil Sharma (2011), Phytochemistry, traditional uses and cancer chemopreventive
activity of Amla (Phyllanthus emblica): The Sustainer, Journal of Applied
Pharmaceutical Science, 02 (01), 178-183.
[4] João B. Calixto, Adair R. S. Santos, Valdir Cechinel Filho, Rosendo A. Yunes (1998),
A Review of the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology, and
therapeutic potential, Med Res Rev, 18 (4), 225-258.
[5] Mutalib A. Aderogba, Ashwell R. Ndhlala , Kannan R. R. Rengasamy, Johannes Van
Staden (2013) Antimicrobial and selected in vitro enzyme inhibitory effects of leaf
extracts, flavonols and indole alkaloids isolated from Croton menyharthii, Molecules, 18,
12633-12644.
[6] R. Kasai, M. Okihara, J. Asakawa, K. Mizutani, O. Tanaka (1979), 13C NMR study of
α- and β-anomeric pairs of D-mannopyranosides and L-rhamnopyranosides, Tetrahedron,
35, 1427-1432.
[7] S. K. EL-Desouky, Shi Young Ryu, Young-Kyoon Kim (2008), A new cytotoxic
acylated apigenin glucoside from Phyllanthus emblica L., Natural Product Research, 22

(1), 91-95.
[8] Sharma Bhawna, Sharma Upendra Kumar (2010), Hepatoprotective activity of some
indigenous plants, International Journal of PharmTech Research, 2(1), 568-572.
22


Khóa luận tốt nghiệp

Bùi Thị Hồng Lĩnh

[9] Sitthichai Iamsaard, Supatcharee Arun, Jaturon Burawat, Wannisa Sukhorum, Porntip
Boonruangsri, Malivalaya Namking, Nongnut Uabundit, Somsak Nualkaew, Bungorn
Sripanidkulchai (2015), Phyllanthus emblica L. branch extract ameliorates testicular
damage in Valproic Acid-Induced rats, Int. J. Morphol., 33 (3), 1016-1022.
[10] Wei Luo, Lingrong Wen, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren, Guanglin Shen,
Guohua Rao (2012), Structural identification of isomallotusinin and other phenolics in
Phyllanthus emblica L. fruit hull, Food Chemistry, 132, 1527–1533.
[11] Wei Luo, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren, Guanglin Shen, Guohua Rao
(2011), Antioxidant and antiproliferative capacities of phenolics purified from
Phyllanthus emblica L. fruit, Food Chemistry, 126, 277-282.
[12] Wei-Yan Qi, Ya Li, Lei Hua, Ke Wang, Kun Gao (2013), Cytotoxicity and structure
activity relationships of phytosterol from Phyllanthus emblica, Fitoterapia, 84, 252-256.
[13] Xiaoli Liu, Chun Cui, Mouming Zhao, Jinshui Wang, Wei Luo, Bao Yang, Yueming
Jiang (2008), Identification of phenolics in the fruit of emblica (Phyllanthus emblica L.)
and their antioxidant activities, Food Chemistry, 109, 909-915.
[14] Xiaoli Liu, Mouming Zhao, Jinshui Wang and Wei Luo (2009), Antimicrobial and
antioxidant activity of emblica extracts obtained by supercritical cacrbon dioxide
extraction and methanol extraction, Journal of Food Biochemistry, 33, 307-330.
[15] Xiaoli Liu, Mouming Zhao, Kegang Wua, Xianghua Chai, Hongpeng Yu, Zhihua
Tao, Jinshui Wang (2012), Immunomodulatory and anticancer activities of phenolics

from emblica fruit (Phyllanthus emblica L.), Food Chemistry, 131, 685-690.
[16] Yangfei Xiang, Ying Pei, Chang Qu, Zhicai Lai, Zhe Ren, Ke Yang, Sheng Xiong,
Yingjun Zhang, Chongren Yang, Dong Wang, Qing Liu, Kaio Kitazato, Yifei Wang
(2011), In vitro Anti‐Herpes Simplex Virus Activity of 1,2,4,6‐Tetra‐O‐galloyl‐β‐D‐
glucose from Phyllanthus emblica L. (Euphorbiaceae), Phytother. Res., 25, 975-982.

[17] Ying-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2001), New
Phenolic constituents from the fruit juice of Phyllanthus emblica, Chem. Pharm. Bull.,
49(5), 537-540.

23