Nghiên cứu đánh giá đa dạng vi sinh vật, sàng lọc, thu nhận và xác định tính chất của cellulase suối nước nóng bình châu bằng kỹ thuật metagenomics TT

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRẦN THANH THỦY

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG VI SINH VẬT,
SÀNG LỌC, THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CỦA
CELLULASE SUỐI NƯỚC NĨNG BÌNH CHÂU, VIỆT NAM
BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 9 42 01 07

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2021


Cơng trình được hồn thành tại Viện Cơng nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Kim Thoa
Viện Công nghệ sinh học
2. PGS. TS. Trần Đình Mấn
Viện Cơng nghệ sinh học

Phản biện 1:

PGS. TS. Trương Quốc Phong
Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Phản biện 2:

PGS. TS. Nguyễn Xuân Cảnh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Phản biện 3:

PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà
Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học
Quốc gia Hà Nội

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ Viện
Công nghệ sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Vào hồi …….. giờ, ngày ….. tháng ….. năm 2021

Có thể tìm hiểu luận án tại:
1. Thư viện Quốc gia Việt Nam
2. Thư viện Viện Công nghệ sinh học
3. Webside:


1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân các liên kết β-1,4-glucoside trong
phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự
khác. Cellulase được tổng hợp bởi cổ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, động vật
nguyên sinh, thực vật và động vật. Enzyme này được ứng dụng rộng rãi trong
công nghiệp thực phẩm, lên men rượu, thức ăn gia súc, dệt may, giặt ủi, trong
ngành công nghiệp giấy và bột giấy,... Khi nguồn nguyên liệu hóa thạch dần

cạn kiệt thì nhu cầu sử dụng các nguồn năng lượng thay thế, có thể tái tạo và
thân thiện với môi trường ngày càng tăng. Một trong những nguồn năng lượng
thay thế được quan tâm nhất hiện nay là nhiên liệu sinh học từ sinh khối
lignocellulose. Q trình chuyển hóa lignocellulose thành các sản phẩm có giá
trị như nhiên liệu sinh học, nhựa sinh học, axit hữu cơ và các cụm hóa chất kiến
tạo khác thường được thực hiện ở các điều kiện đặc biệt như ở nhiệt độ cao,
tiền xử lý bằng kiềm hoặc axit hoặc trong dung môi hữu cơ… Do đó địi hỏi
các nhà khoa học phải nghiên cứu tìm kiếm các cellulase mang những đặc tính
mới (như bền với nhiệt độ cao, chịu được áp suất cao, chịu được pH axit/kiềm,
dung môi …) để đáp ứng được các u cầu của q trình chuyển hóa
lignocellulose và hạ được giá thành sản xuất.
Một trong những nguồn địa nhiệt có thể thu nhận cellulase bền nhiệt là
nhóm vi sinh vật ưa nhiệt ở suối nước nóng. Tuy nhiên, sử dụng các phương
pháp phân lập, nuôi cấy vi sinh vật truyền thống không thể khai thác hết được
tiềm năng của vật liệu di truyền trong hệ sinh thái này vì có tới 99% các lồi vi
sinh vật sống trong mơi trường là các lồi khơng ni cấy được. Hơn nữa, do
đặc tính riêng của hệ sinh thái suối nước nóng có mật độ vi sinh vật thấp hơn
rất nhiều so với các mơi trường bình thường khác, vì vậy việc thu nhận được
các loài vi sinh vật mới để khai thác nguồn gen của chúng bằng phương pháp
nuôi cấy thơng thường gặp nhiều khó khăn.
Ngày nay, nhờ sự tiến bộ của cơng nghệ giải trình tự gen thế hệ mới, việc
tách dịng các gen mới có thể được thực hiện bằng cách tiếp cận cơ sở dữ liệu
metagenome kết hợp với các phần mềm tin sinh để dự đoán tính chất của protein


2
tiềm năng trước khi biểu hiện và nghiên cứu đặc tính của enzyme tái tổ hợp.
Thơng qua cách tiếp cận này, các nhà nghiên cứu không chỉ đánh giá được mức
độ đa dạng vi sinh vật ở trong một hệ sinh thái mà còn bảo tồn và khai thác được
các gen mới hoặc các protein có tính chất đặc biệt từ các vi sinh vật đó.

Với mong muốn có thể đánh giá đa dạng vi sinh vật, đồng thời tiếp cận và
khai thác được nguồn cellulase bền nhiệt mới từ suối nước nóng Bình Châu suối nước nóng có nhiệt độ cao thứ hai ở Việt Nam không thông qua nuôi cấy,
chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu, thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đánh giá đa
dạng vi sinh vật, sàng lọc, thu nhận và xác định tính chất của cellulase suối
nước nóng Bình Châu, Việt Nam bằng kỹ thuật Metagenomics”.
2.

Mục tiêu nghiên cứu
Thơng qua kết quả giải trình tự DNA metagenome vi sinh vật suối nước

nóng Bình Châu bằng hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới, (i) Đánh giá được
nguồn đa dạng vi sinh vật ưa nhiệt và xây dựng được bộ dữ liệu các gen mã hóa
cho cellulase; ii) Biểu hiện được các cellulase tái tổ hợp đồng thời (iii) Tinh
sạch và xác định được tính chất của các cellulase tái tổ hợp này.
3.

Nội dung nghiên cứu

- Khai thác bộ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome vi sinh vật suối nước
nóng Bình Châu, đánh giá đa dạng vi sinh vật và xây dựng bộ dữ liệu các gen
mã hóa cellulase.
- Biểu hiện gen mới mã hóa cho cellulase (endoglucanase và β-glucosidase)
chịu nhiệt tiềm năng được lựa chọn từ bộ dữ liệu DNA metagenome.
- Tinh sạch và xác định tính chất của các cellulase tái tổ hợp.
4.

Những đóng góp mới của luận án

- Đã xây dựng được bộ dữ liệu DNA metagenome của vi khuẩn và cổ khuẩn
suối nước nóng Bình Châu với kích thước 9,4 Gb độ bao phủ trên 60%. Qua

phân tích đã xác định được đa dạng vi sinh vật và gen mã hóa enzyme thủy
phân cellulose, lựa chọn được hai gen mới (có độ tương đồng thấp 50,35% và
53,94%) mã hóa cho hai enzyme tương ứng là endoglucanase và β-glucosidase.


3
- Đã biểu hiện, tinh sạch và nghiên cứu tính chất sinh học của endoglucanase và
β-glucosidase. Đã xác định được Vmax và Km của hai enzyme này.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Về khoa học:
- Kết quả nghiên cứu của luận án đã làm phong phú thêm về bộ dữ liệu nhằm bảo
tồn nguồn vi sinh vật cũng như nguồn gen của chúng trong suối nước nóng Bình
Châu của Việt Nam.
- Bổ sung thêm minh chứng về hiệu quả của kỹ thuật metagenomics để khai
thác đa dạng vi sinh vật và những gen mới từ vi sinh vật ở những hệ sinh thái
đặc biệt. Cụ thể xây dựng được bộ dữ liệu đa dạng vi sinh vật của suối nước
nóng Bình Châu. Bổ sung hai trình tự gen mới [denovogenes]_18736 mã hóa
cho endoglucanase và [denovogenes]_32768 mã hóa cho β-glucosidase so với
các gen đã được công bố trong ngân hàng dữ liệu NCBI của thế giới. Hai gen
này khơng chỉ mới về trình tự (mức độ tương đồng < 55%) mà cịn mới về đặc
tính (bền nhiệt, bền kiềm) mà bằng các phương pháp ni cấy thơng thường
khó có thể thu nhận được.
Về ý nghĩa thực tiễn:
- Luận án có ý nghĩa thực tiễn. Hai enzyme tái tổ hợp thu nhận được là những
enzyme quan trọng trong cocktail enzyme thủy phân sinh khối lignocellulose. Hai
enzyme này có mức độ tương đồng trong tính chất (cùng có nhiệt độ tối ưu ở 55ºC,
hoạt động ở dải pH rộng), do đó có thể phối hợp với các enzyme khác trong
cocktail để nâng cao hiệu quả chuyển hóa sinh khối lignocellulose làm nguyên liệu
cho sản xuất nhiên liệu sinh học cũng như các hóa chất kiến tạo khác.
Bố cục của luận án

Luận án gồm 144 trang. Cụ thể: Mở đầu (2 trang); Chương 1: Tổng quan
tài liệu (32 trang, 4 bảng, 8 hình); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên
cứu (17 trang, 1 hình); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (43 trang, 11 bảng, 34
hình); Chương 4: Bàn luận kết quả nghiên cứu (16 trang); Kết luận và kiến nghị
(2 trang); Danh mục các cơng trình cơng bố (1 trang); Tóm tắt luận án bằng
tiếng Anh (8 trang); Tài liệu tham khảo (23 trang gồm 15 tài liệu tiếng Việt, 185
tài liệu tiếng Anh và 5 trang web); Phụ lục (23 trang).
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU


4
Hiện nay, suối nước nóng đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên
cứu bởi lẽ đây là nơi sống của các vi sinh vật ưa nhiệt (thermophilic) và siêu ưa
nhiệt (hyperthermophilic) với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu tương ứng lần lượt
trên 55°C và trên 80°C. Enzyme nói chung và cellulase nói riêng của vi sinh
vật sống trong suối nước nóng có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong một số
quy trình sản xuất cơng nghiệp và trong cơng nghệ sinh học. Tuy nhiên, việc
nghiên cứu khu hệ vi sinh vật sống trong suối nước nóng cũng như các enzyme
của chúng bằng các phương pháp truyền thống thông qua ni cấy khơng thể
khai thác hết tiềm năng vốn có bởi lẽ có đến 99% vi sinh vật sống trong suối
nước nóng là những vi sinh vật khơng ni cấy được. Vì vậy, metagenomics đã
trở thành một cơng cụ hữu ích để nghiên cứu vi sinh vật cũng như khám phá
các cellulase mới từ DNA vi sinh vật suối nước nóng.
Mặc dù một số lượng lớn dịng cellulase đã được phân lập từ các thư viện
metagenomic nhưng chỉ một số ít trong chúng được xác định đặc điểm ở mức
độ protein sở dĩ là do tỷ lệ dòng biểu hiện có hoạt tính rất thấp. Bằng cách giải
trình tự metagenomic, vấn đề đưa ra ở trên đã được giải quyết. Đồng thời, với
sự phát triển của các công nghệ giải trình tự thế hệ mới, giải trình tự
metagenome đã trở thành một công cụ mạnh để nghiên cứu trực tiếp các vi sinh
vật không nuôi cấy được cũng như khai thác các gen cellulase mới.

Ở Việt Nam, tiếp cận metagenome suối nước nóng để khám phá đa dạng
vi sinh vật và khai thác các gen mã hóa cho cellulase vẫn chưa được cơng bố.
Với mong muốn có thể tiếp cận và đánh giá được đa dạng vi sinh vật trong suối
nước nóng cũng như tìm kiếm được nguồn cellulase mới có khả năng bền nhiệt
và bền trong các điều kiện pH axit/kiềm của quá trình tiền xử lý lignocellulose,
trong nghiên cứu này, suối nước nóng Bình Châu - suối nước nóng có nhiệt độ
cao thứ hai ở Việt Nam được chọn làm nguồn thu nhận DNA metagenome để
khám phá đa dạng vi sinh vật và khai thác các gen cellulase mới.
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


5
2.1. Vật liệu nghiên cứu
-

Mẫu nghiên cứu: Mẫu nước và mẫu bùn được thu thập từ suối nước nóng Bình
Châu ngày 14 tháng 5 năm 2015. Mẫu nước được lấy trực tiếp từ miệng giếng
phun (10º36’03.9’’ Bắc và 107º33’30.0’’ Đông) với nhiệt độ 82°C, pH = 7,5.
Bùn được thu thập ở vị trí bên ngồi miệng giếng phun, dọc theo dịng chảy
(10o37’03.9” Bắc và 107o32’30.0” Đơng) với nhiệt độ dao động từ 45 đến
65ºC, pH 7,7 - 9.
- Chủng vi khuẩn sử dụng: Escherichia coli TOP10F' (Thermo Fisher
Scientific), E. coli JM109 (DE3) (Promega) và E. coli C43 (DE3)
(Lucigen).
- Gen [denovogenes] _18736 mã hóa cho endoglucanase và [denovogenes]
_32768 mã hóa cho β-glucosidase.
- Các vector và hóa chất sử dụng: Vectors pJET1.2_18736 và pJET1.2_32768
(PhuSa Biochem); Vector pET17b (Novagen); Enzyme cắt giới hạn NdeI và
HindIII (NEB) và T4 DNA ligase (Thermo Fisher Scientific); Các kit tách
chiết: Kit PowerWater® DNA Isolation (MO BIO), Kit PowerMax® Soil

DNA Isolation (MO BIO), kit tinh sạch PCR (GeneJet PCR purification kit Thermo Fisher Scientific), kit tách chiết plasmid (GeneJet Plasmid
Miniprep Kit - Thermo Fisher Scientific); Các hóa chất chính dùng cho
phân tích: Carboxymethyl cellulose (low viscosity, Sigma: C5678), DNSA,
glucose, p-nitrophenyl-β-glucopyranoside (pNPG) (Sigma Aldrich), IPTG;
và các hóa chất dùng cho sinh học phân tử, hóa sinh và ni cấy vi sinh vật.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết DNA metagenome và giải trình tự: DNA metagenome mẫu
nước và mẫu bùn suối nước nóng Bình Châu được tách chiết bằng Kit theo
hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó hai mẫu này được trộn lại với nhau (theo tỉ
lệ 1:1) để tạo thành mẫu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu trước
khi gửi đi đọc trình tự tại Cơng ty BGI Co., Ltd (HongKong) bằng thiết bị giải
trình tự Illumina HiSeqTM platform.


6
2.2.2. Các công cụ tin sinh sử dụng trong xử lý, phân tích dữ liệu giải trình tự
DNA metagenome và sàng lọc gen mã hóa enzyme thủy phân cellulose tiềm
năng.
2.2.3. Thiết kế vector biểu hiện: gen denovogenes_18736 mã hóa cho
endoglucanase và denovogenes_32768 mã hóa cho β-glucosidase đã được chọn
từ bộ dữ liệu DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu để biểu
hiện. Hai gen này được gắn thêm đuôi 6 His - tag ở đầu C của gen và được tổng
hợp, lưu giữ trong vector tách dòng pJET1.2 tại Cơng ty Sinh hóa Phù Sa
(PhuSa Biochem Co., Ltd). Vector pET-17b được chọn làm vector biểu hiện để
biểu hiện gen trong chủng chủ E. coli Top10F’. Các plasmid mang gen được
tạo thành có tên là pET17b_18736 và pET17b_32768.
2.2.4. Lựa chọn một số điều kiện biểu hiện gen: Các điều kiện: chủng chủ, mơi
trường ni cấy, độ thống khí, nồng độ IPTG đã được nghiên cứu để nâng cao
hiệu quả biểu hiện endoglucanase được mã hóa bởi gen denovogenes_18736 và
β-glucosidase được mã hóa bởi denovogenes_32768. Dưới các điều kiện được

lựa chọn, xác định động thái sinh trưởng và biểu hiện endoglucanase và βglucosidase của chủng tái tổ hợp.
2.2.5. Xác định hoạt tính enzyme:
- Hoạt tính endoglucanase được xác định theo phương pháp của Ghose (1987), sử
dụng CMC làm cơ chất phản ứng. Một đơn vị enzyme được định nghĩa là lượng
enzyme cần thiết để tạo ra 1 μmol glucose trong một phút ở điều kiện phản ứng.
- Hoạt tính β-glucosidase được xác định theo phương pháp của Shi và cs. (2017),
sử dụng p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (p-NPG) làm cơ chất phản ứng. Một
đơn vị hoạt tính enzyme được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết xúc tác phản
ứng để giải phóng ra 1 mol p- nitrophenyl (p-NP) từ p-NPG trong thời gian một
phút ở điều kiện phản ứng.
2.2.6. Tinh sạch, kiểm tra kích thước protein (SDS – PAGE) và xác định hoạt
tính enzyme (Zymogram): sử dụng cột IMAC – Ni2+ để tinh sạch
endoglucanase_18736 và β-glucosidase_32768 tái tổ hợp. Nồng độ protein
được xác định theo phương pháp Bradford (1976). Khối lượng phân tử của
enzyme được xác định tương đối bằng SDS-PAGE theo phương pháp của


7
Laemmli (1970). Zymogram của endoglucanase được tiến hành trên gel
polyacrylamide có bổ sung CMC theo phương pháp của Sharma và Guptasarma
(2017) cải tiến. Zymogram của β-glucosidase được tiến hành theo phương pháp
của Neddersen và Elleuche (2015) cải tiến.
2.2.7. Nghiên cứu một số đặc tính của enzyme tái tổ hợp: Một số đặc tính của
enzyme endoglucanase_18736 và β-glucosidase_32768 tái tổ hợp đã được xác
định: nhiệt độ, pH tối ưu cho hoạt động của enzyme; ảnh hưởng của nồng độ
ion kim loại lên hoạt tính enzyme; độ bền nhiệt, kiềm của enzyme; tính đặc
hiệu cơ chất và thơng số động học của enzyme.
2.2.8. Xử lý thống kê: Sử dụng Microsoft excel 2016 để xử lý dữ liệu. Các kết
quả được hiểu thị là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của mẫu. Giá trị p < 0,05
được coi là có ý nghĩa thống kê trong dữ liệu.

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Khai thác bộ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome vi sinh vật suối
nước nóng Bình Châu, đánh giá đa dạng vi sinh vật và xây dựng bộ dữ liệu
gen mã hóa cellulase.
3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng
Bình Châu
Mẫu nước và mẫu bùn thu thập từ suối nước nóng Bình Châu được sử
dụng làm nguyên liệu tách DNA metagenome. Kết quả tách chiết DNA
metagenome của mẫu nước và bùn suối nước nóng Bình Châu cho thấy DNA
metagenome của mẫu nước và mẫu bùn suối nước nóng Bình Châu có chất
lượng tốt, DNA khơng bị đứt gãy (Hình 3.1).


8
Hình 3.1. DNA metagenome của mẫu nước và bùn suối nước nóng Bình Châu.
Chú thích: M: thang DNA chuẩn 1 kb; 1 và 3: DNA metagenome của mẫu nước thu lần
1 và 2; 2 và 4: DNA metagenome của mẫu bùn thu lần 1 và 2.

Kết quả đo nồng độ DNA metagenome của các mẫu sau khi tách chiết
bằng máy quang phổ Nano Drop 1000 cho thấy cả hai mẫu DNA thu được đều
có độ tinh sạch cao, tỷ lệ A 260/A280, A260/A230 đều lớn hơn 2. Lượng DNA
metagenome mẫu nước đạt 63,75 ng/µl và mẫu bùn đạt 120,9 ng/µl. Mẫu DNA
thu được này đảm bảo đủ điều kiện đáp ứng về số lượng và chất lượng để gửi
đi giải trình tự gen thế hệ mới. DNA metagenome mẫu nước và mẫu bùn được
trộn lại với nhau theo tỷ lệ 1:1 (v/v) để tạo thành mẫu DNA metagenome suối
nước nóng Bình Châu.
3.1.2. Khai thác bộ dữ liệu DNA metagenome, đánh giá đa dạng vi sinh vật,
xác định và tổng hợp gen mới mã hóa cho các enzyme thủy phân cellulose
(enzyme chịu kiềm, chịu axit và chịu nhiệt).
3.1.2.1. Giải trình tự và tiền xử lý dữ liệu DNA metagenome suối nước nóng

Bình Châu
DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu được gửi đi đọc trình tự tại
cơng ty BGI Co., Ltd (HongKong) bằng thiết bị giải trình tự thế hệ mới
IlluminaHiSeqTM platform. Kết quả giải trình tự thu được 10.4 Gb dữ liệu thô.
Sử dụng phần mềm Trimmomatic để tinh sạch dữ liệu (loại bỏ trình tự chất
lượng kém), kết quả được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả tinh sạch dữ liệu giải trình tự DNA metagenome
suối nước nóng Bình Châu
Dữ liệu tinh

Q20 (%)

Q30 (%)

sạch (G)
9,4

94,98

87,97

Số lượng

N50

Tỉ lệ lắp

contig

(bp)

ráp (%)

51.346

9.791

65,12

3.1.2.2. Lắp ráp de novo metagenome
Dữ liệu DNA metagenome của khu hệ vi sinh vật ở suối nước nóng Bình
Châu được lắp ráp bằng phần mềm SOAPdenovo2 để tạo thành các contig và
sử dụng công cụ Quast để đánh giá chất lượng lắp ráp. Kết quả được trình bày
trong Bảng 3.2.


9
Bảng 3.2. Kết quả lắp ráp de novo metagenome suối nước nóng Bình Châu
Tổng số đoạn trình tự
Số đoạn trình tự được lắp ráp
Tổng chiều dài lắp ráp (bp)
Tỉ lệ lắp ráp (%)
Tổng số contig
Contig dài nhất (bp)
Contig ngắn nhất (bp)
Độ dài contig N90 (bp)
Độ dài contig N50 (bp)
Độ dài trung bình các contig (bp)

93.999.534

61.212.496
172.103.446
65,12
51.346
1.767.609
500
1.059
9.791
3.351

3.1.2.3. Dự đốn gen
Sử dụng chức năng dự đoán ORF của phần mềm MetaGeneMark v2.10, từ
51.346 contig chúng tôi thu được 156.093 khung đọc mở tiềm năng.
3.1.2.4. Đánh giá đa dạng vi sinh vật
Cơ sở dữ liệu nr và MEGAN được sử dụng để chú giải và phân loại tất cả
156.093 khung đọc mở, kết quả cho thấy có 106.903 gen được chú giải và
49.190 gen là những gen chưa biết. Các gen này được phân loại thuộc 41
ngành, 57 lớp, 128 bộ, 245 họ, 825 chi và 2250 loài khác nhau. Trong số
106.903 gen đã được chú giải có 29.069 gen vi khuẩn, 1.416 gen cổ khuẩn, 4
gen nhân thật, 3 gen virus và 76.411 gen chưa được xác định (unclassfied).
Trong giới vi khuẩn, ngành Proteobacteria là ngành chiếm ưu thế nhất chiếm
68,68%, tiếp theo là Firmicutes (8,22%), Cyanobacteria (4,53%), Bacteroidetes
(3,52%), Planctomycetes (2,81%), Actinobacteria (2.43%) và các ngành khác (độ
phong phú tương đối <2%). Hơn nữa, trong ngành Proteobacteria, lớp
Gammaproteobacteria là lớp chiếm ưu thế nhất (24,87%), tiếp sau là
Alphaproteobacteria (19.61%) và Betaproteobacteria (16.42%). Phân loại vi
khuẩn ở cấp độ loài cho thấy Marinobacter manganoxydans là loài chiếm ưu thế
nhất (5,57%), tiếp theo là Roseobacter sp. (4,81%), Gamma proteobacterium

10
IMCC2047 (3,93%), Thiobacillus thioparus (1,11%), Bdellovibrio bacteriovorus
(0,96%), Thiobacillus denitrificans (0,96%), Caldimonas manganoxidans
(0,85%) và các loài khác với tỷ lệ các gen đã được phân loại chiếm < 0,85%.
Trong suối nước nóng Bình Châu, Aquificae (0,44%), Thermodesulfobacteria
(0,29%) và Thermotogae (0,06%) được biết đến là các Ngành vi khuẩn ưa nhiệt
hoặc siêu ưa nhiệt. Mặc dù sử dụng cơ sở dữ liệu nr và MEGAN đã chú giải
được 106.903 gen nhưng đánh giá đa dạng vi sinh vật ở mức độ phân loại đến
lồi cịn khá hạn chế, có tới 78.487 gen chưa được phân loại chiếm 50,282%
tổng số gen được dự đoán và 73,419% so với gen được chú giải.
Cổ khuẩn có mặt trong suối nước nóng Bình Châu chủ yếu thuộc Ngành
Thaumarchaeota (51,76%), tiếp theo là Ngành Euryarchaeota (35,38%). Ở cấp
độ phân loại loài, loài cổ khuẩn Candidatus Nitrosoarchaeum limnia là lồi
chiếm ưu thế nhất (22,17%) trong suối nước nóng Bình Châu.
3.1.2.5. Khai thác gen mã hố cho enzyme tham gia vào quá trình thủy phân
cellulose từ DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu
Nhằm tìm ra trình tự axit amin có mức độ tương đồng cao nhất, qua đó
chú giải chức năng của các protein và sàng lọc ORF mã hóa cho enzyme tham
gia vào q trình thủy phân cellulose, toàn bộ 156.093 khung đọc mở tiềm năng
thu nhận được ở trên được so sánh với các cơ sở dữ liệu bằng công cụ Blast++.
Kết quả cho thấy theo cơ sở dữ liệu NR có 106.903 ORF; Swiss-Prot: 46.085
ORF; CAZy: 2.849 ORF; KEGG: 67.379 ORF.
Với mục tiêu tiếp cận để khai thác các gen mã hóa cho enzyme tham gia
vào quá trình thủy phân cellulose từ DNA metagenome vi sinh vật suối nước
nóng Bình Châu, chúng tơi so sánh các trình tự ORF trong bộ dữ liệu DNA
metagenome với cơ sở dữ liệu CAZy. Kết quả được thể hiện trong Hình 3.2.


11

Hình 3.2. Phân bố các họ enzyme được tìm thấy trong bộ dữ liệu DNA metagenome
suối nước nóng Bình Châu khi so sánh với cơ sở dữ liệu CAZy.
Chú thích: GHs: họ glycoside hydrolases; GTs: họ glycosyl transferases; PLs: họ
polysaccharide lyases; CEs: họ carbohydrate esterases; CBM s: họ carbohydrate-binding
modules.

Quần xã vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu có khả năng sinh tổng
hợp nhiều loại enzyme tham gia thủy phân cellulose và hemicellulose, tạo
thành các dạng monosaccharide. Phân bố các ORF thuộc họ enzyme GH tham
gia chuyển hóa lignocellulose được trình bày trong Hình 3.3.
Hình 3.3. Phân bố các ORF thuộc họ enzyme GH tham gia chuyển hóa
lignocellulose trong bộ dữ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu.
Từ các ORF mã hóa cho các họ GH, nhóm enzyme cellulase gồm 82 trình
tự: mã hóa cho endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Phân bố của các
ORF mã hóa cho cellulase được trình bày trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Phân bố của các ORF mã hóa cho cellulase được dự đốn
từ bộ dữ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu.
Enzyme

Mức độ
tương

ORF

a

đồng (%)

Endo-

Exo-

Beta-

glucanase

glucanase

glucosidase

Tổng


12
Đầy đủ

Thiếu đầu N
(5’)
Thiếu đầu C
(3’)
Thiếu cả 2

< 50
50 - 65
65 - 85
> 85
< 50
50 - 65
65 - 85
< 50

50 - 65
65 - 85
65 - 85

9
6
0
0
5
3
1
4
1
1
2

1
0
0
0
0
0
0
1
0
1
0

12
9

6
4
3
2
4
2
4
1
0

22
15
6
4
8
5
5
7
5
3
2

32

3

47

82

đầu: N (5’)
và C (3’)
Tổng

Ghi chú: a so với cơ sở dữ liệu non-redundant (nr) protein của NCBI.

Trong 47 trình tự ORF hồn thiện có 15 ORF mã hóa cho endoglucanase,
1 ORF mã hóa cho exoglucanase và 31 ORF mã hóa cho β-glucosidase. Các
trình tự này chủ yếu là các trình tự chưa có chú giải nguồn gốc tiến hóa (NANo Annotation), chưa phân loại được dựa vào các cơ sở dữ liệu của NCBI.
Đồng thời, cây phát sinh chủng loại của các ORF này cho thấy các trình tự mã
hóa cho endoglucanase chủ yếu thuộc họ GH5, GH6 và GH8. Các trình tự mã
hóa cho β-glucosidase chủ yếu thuộc họ GH1 và GH3. Đây là hai họ GH phổ
biến cho enzyme thủy phân cellulose. Xét về đặc điểm tiến hóa, các ORF mã
hóa cho cellulase rất đa dạng về nguồn gốc tiến hóa.
3.1.2.6. Phân tích một số tính chất của các enzyme được mã hóa từ các gen
trong bộ dữ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu để lựa chọn gen
tiềm năng cho quá trình biểu hiện.
Với mục tiêu tiếp cận để khai thác các enzyme mới hoặc có tính chất mới
như bền nhiệt (có chỉ số Tm cao), có khả năng chịu kiềm hoặc chịu axit, các
công cụ tin sinh đã được sử dụng để dự đốn tính bền nhiệt và tính chịu kiềm,
chịu axit của protein. Kết quả được trình bày trong hình 3.4.


13

A

B
Hình 3.4. Dự đốn tính chất của các protein tham gia vào q trình
thủy phân cellulose được mã hóa bởi các gen trong bộ dữ liệu

DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu. A) Dự đốn Tm
của các enzyme; B) Dự đốn tính kiềm/ axit của các enzyme.
Với mục tiêu tiếp cận được nguồn gen mới từ vi sinh vật suối nước nóng
Bình Châu mã hóa cho cellulase có tính chất đặc biệt, kết hợp với những cơ sở
phân tích trên, gen đích được lựa chọn để phân lập hoặc tổng hợp phải thỏa
mãn đồng thời các tiêu chí sau:
- Là ORF hồn chỉnh có độ dài trong khoảng 1200 – 1600 bp trong bộ dữ liệu
gen mã hóa cho enzyme thủy phân cellulose.
- Là ORF mã hóa cho enzyme có độ tương đồng nằm trong khoảng từ 50 đến
70% so với các enzyme cellulase trong cơ sở dữ liệu NCBI.
- Là ORF có chỉ số dự đốn Tm ≥ 55C.
- Là ORF được dự đốn có tính chất kiềm hoặc axit tính.
Bộ dữ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu gồm 47 ORF hồn
chỉnh mã hóa cho cellulase, trong đó có 5 ORF đáp ứng được các tiêu chí lựa chọn ở
trên. Tuy nhiên, chúng tơi chọn ORF có mã số: [denovogenes]_18736 mã hóa
cho endoglucanase và [denovogenes]_32768 mã hóa cho β-glucosidase để tổng
hợp nhân tạo trong vector tách dòng pJET1.2 (pJET1.2_18736 và pJET1.2_32768)
tại cơng ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa (Việt Nam) bởi các lý do sau: i) suối


14
nước nóng Bình Châu là suối nước nóng kiềm nhưng endoglucanase được mã
hóa bởi [denovogenes]_18736 lại được dự đốn với tính chất axit. Hơn nữa,
endoglucanase của ORF này thuộc họ GH6 có khoảng cách di truyền tiến hóa
cách xa so với các trình tự cịn lại, có nhiệt độ nóng chảy theo tính tốn lý
thuyết ≥ 65ºC, do đó có thể có những tính chất mới chưa được khai thác. ii)
trong số 3 ORF mã hóa cho β-glucosidase, ORF có mã số
[denovogenes]_32768 có tính chất kiềm và độ hịa tan cao nhất, trong khi ORF
[denovogenes]_31089 có tính axit yếu cịn ORF [denovogenes]_23970 có tính
kiềm nhưng mức độ hịa tan thấp. Hai gen được chọn có các đặc điểm được mơ tả

trong bảng 3.4. Trình tự nucleotide của gen [denovogenes]_18736 và
[denovogenes]_32768 đã được đăng ký trên Ngân hàng Gen với các mã số lần
lượt là QAU55420.1 và QAU55422.1.
Bảng 3.4. Đặc điểm của ORF có mã số [denovogenes]_18736 và ORF có mã
số [denovogenes]_32768 được chọn.
Mã số gen

Chiều

Độ tương đồng

Dự

Dự đốn

Chỉ số hịa

%

dài gen

(%)

đốn

tính chất

tan của

GC

Tm

Kiềm/ Axit

protein

Axit 0,99

0,429

56,4

Kiềm 0,83

0,242

54

(bp)
50,35% với
endoglucanase
[bacterium JGI

[denovogenes

053], mã số

]_18736
Mã hóa cho

1.506

endoglucanas

SOD03652.1;

≥

49,31% với

65ºC

endoglucanase

e

[Polyangium
fumosum], mã số
WP_136936398.1

[denovogenes

53,94% với Beta-

55ºC

]_32768

1.224

glucosidase A

~

Mã hóa cho

[nhóm vi khuẩn

65ºC

β-glucosidase

Parcubacteria],
mã số


15

KKT80126.1

3.1.2.7. Phân tích mơ hình cấu trúc của [denovogenes]_18736 và
[denovogenes]_32768
Gen denovogenes_18736 được dự đốn có tâm hoạt động nằm ở vị trí axit
amin D299 trong khi gen denovogenes_32768 khơng xác định được vị trí tâm
hoạt động. Đồng thời, cả hai gen trên đều được dự đốn khơng có trình tự đoạn
peptide tín hiệu. Gen denovogenes_18736 được dự đốn chỉ có một domain
duy nhất là domain xúc tác thuộc họ GH6 nằm ở vị trí axit amin Q236-G483.
Mơ hình cấu trúc 3D của denovogenes_18736 đã được xây dựng dựa trên
khuôn cellulase Cel6 (mã số 1up3.1.A) với đặc trưng tâm hoạt động hình khe

hở, ở trạng thái monomer - A, khơng có phối tử (Hình 3.5a và Hình 3.5b).
Tương tự, gen denovogenes_32768 cũng được dự đốn chỉ có một domain duy
nhất là domain xúc tác nhưng domain này lại thuộc họ GH1 nằm ở vị trí axit
amin E2-E407. Mơ hình cấu trúc 3D của denovogenes_32768 đã được xây dựng
dựa trên khuôn β-glucosidase (mã số 1vff.1.A) với đặc trưng tâm hoạt động hình
túi, ở trạng thái monomer, khơng có Ligands (Hình 3.5c và Hình 3.5d).

a

b

c

d

Hình 3.5. Mơ hình cấu trúc protein 3D được xây dựng bằng phần mềm
Swissmodel của ExPASy. a) Cấu trúc của endoglucanase_18736
dựa theo khn mơ hình cấu trúc của cellulase Cel6 giả định (1up3.1.A);
b) Cấu trúc khuôn cellulase Cel6 giả định (1up3.1.A); c) Cấu trúc của βglucosidase_32768 dựa theo khuôn mơ hình cấu trúc β-glucosidase (1vff.1.A);
d) Cấu trúc của β-glucosidase khuôn (1vff.1.A).


16
3.1.2.8. Truy cứu nguồn gốc của các gen denovogenes_18736 và
denovogenes_32768
Sử dụng công cụ Blast – Explorer tại địa chỉ (để
xác định nguồn gốc của gen [denovogenes]_18736 và [denovogenes]_32768.
Kết quả cho thấy cả hai gen này đều là các gen mới, không xác định được nguồn
gốc. Đồng thời, kết quả này cũng phù hợp với kết quả phân loại: cả hai gen đều là
những gen chưa được phân loại vì khơng có cơ sở dữ liệu phù hợp để so sánh.

3.2. Biểu hiện gen [denovogenes]_18736 và [denovogenes]_32768.
3.2.1.

Thiết

kế

vector

biểu

hiện

gen

[denovogenes]_18736

và

[denovogenes]_32768 trong E. coli
Vector pET17b (Novagen) được lựa chọn làm vector biểu hiện gen
[denovogenes]_18736 và [denovogenes]_32768. Sau khi khuếch đại cả 2 ORF và
xử lý với HindIII và NdeI, các ORF này lại được ghép nối vào vector pET17b
đã mở vòng tại các vị trí enzyme giới hạn tương ứng. Sản phẩm ghép nối được
biến nạp vào E. coli TOP10F’ để nhân dòng trước khi kiểm tra lại bằng cách cắt
các vector tái tổ hợp bằng HindIII và NdeI. Kết quả điện di đồ sản phẩm cắt
cho

thấy

đã

gắn

thành

cơng

gen

[denovogenes]_18736

và

[denovogenes]_32768 vào vector pET17b (Hình 3.6). Các dịng plasmid này
sau đó được gửi đi đọc trình tự để đảm bảo đúng codon dịch mã từ promoter

đến mã khởi đầu.


17
Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pET17b mang các đoạn
gen ngoại lai bằng hai enzyme giới hạn HindIII và NdeI.
Chú thích: 1) gen [denovogenes]_18736 có kích thước 1506 bp; M) Marker DNA 1kb và 2)
gen [denovogenes]_32768 có kích thước 1224 bp. Vector pET17b có kích thước 3306 bp.

3.2.2. Lựa chọn một số điều kiện biểu hiện gen [denovogenes]_18736 và
[denovogenes]_32768 trong E. coli
Các plasmid pET17b mang đoạn gen ngoại lai [denovogenes]_18736 mã
hóa cho endoglucanase và [denovogenes]_32768 mã hóa cho β-glucosidase biểu

hiện tốt nhất trong chủng chủ E. coli C43(DE3) (Lucigen). Enzyme tái tổ hợp
được biểu hiện tốt nhất trong mơi trường TB với thể tích dịch ni cấy chiếm
20% so với thể tích bình và nồng độ IPTG cảm ứng là 0,25mM (Hình 3.7, 3.8,
3.9).

Hình 3.7. Ảnh hưởng của chủng chủ lên quá trình sinh trưởng và biểu hiện
enzyme tái tổ hợp. A. Endoglucanase; B. β-glucosidase.
Hình 3.8. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng và hoạt tính
enzyme ở chủng E. coli C43(DE3) tái tổ hợp. A. Endoglucanase; B. β-glucosidase.


18

A

B

Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG lên sinh trưởng và hoạt tính enzyme ở
chủng E. coli C43(DE3) tái tổ hợp. A. Endoglucanase; B. β-glucosidase.
3.2.3. Động thái sinh trưởng và biểu hiện endoglucanase và β-glucosidase
của chủng E. coli C43(DE3) tái tổ hợp
Dưới các điều kiện nuôi cấy được lựa chọn ở trên, quá trình sinh trưởng,
biểu hiện endoglucanase và β-glucosidase của chủng E. coli C43(DE3) tái tổ
hợp vào pha cân bằng sau 42-48 giờ nuôi cấy, sinh tổng hợp endoglucanase
đạt 1,92-1,98 U/ml (Hình 3.10A), sinh tổng hợp β-glucosidase đạt 0,33-0,34
U/mL (Hình 3.10B).


19

A

B

Hình 3.10. Động thái sinh trưởng và sinh enzyme của chủng E. coli C43(DE3)
tái tổ hợp. A) Endoglucanase; B) β-glucosidase
3.3. Tinh sạch và xác định tính chất của các cellulase tái tổ hợp.
3.3.1. Tinh sạch enzyme tái tổ hợp
Dịch enzyme tái tổ hợp thơ có gắn đi His-tag được tinh sạch bằng cột
sắc ký IMAC-Ni2+. Enzyme endoglucanase_18736 và β-glucosidase_32768 tái
tổ hợp sau tinh sạch chỉ xuất hiện 1 băng có kích thước tương ứng khoảng 55
kDa (Hình 3.11A và hình 3.11B) và 50 kDa (Hình 3.11C và hình 3.11D). Hiệu
suất tinh sạch của endoglucanase_18736 và β-glucosidase_32768 đều đạt trên
80%, mức độ tinh sạch tăng từ 5,2-5,6 lần so với dịch enzyme thơ (Bảng 3.5).

Hình 3.11. Điện di đồ SDS-PAGE
Chú thích: (A) Endoglucanse tái tổ hợp: 1) Vector O ; M: protein ladder (10-250 kDa);
2) Dịch phá tế bào trước cảm ứng; 3) Dịch nổi sau khi ly tâm dịch lên men; 4) Dịch
enzyme thô; 5) enzyme tinh sạch bằng cột IMAC-Ni2+; (B) Zymogram của
endoglucanase tái tổ hợp; (C) β-glucosidase tái tổ hợp: M) thang protein chuẩn (10-250


20
kDa); 1) Dịch enzyme thô; 2) protein sau tinh sạch bằng cột IMAC-Ni2+; (D)
Zymogram của β-glucosidase tái tổ hợp.

Bảng 3.5. Kết quả tinh sạch endoglucanase_18736
và β-glucosidase_32768 tái tổ hợp bằng cột IMAC-Ni 2+.

Chú thích: Egl: Endoglucanase tái tổ hợp; Bgl: β-glucosidase tái tổ hợp.

3.3.2. N g h i ê n c ứ u m ộ t s ố đ ặ c t í n h c ủ a e n d o g l u c a n a s e _ 1 8 7 3 6
và β-glucosidase_32768 tái tổ hợp.
3.3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp
Cả endoglucanase_18736 và β-glucosidase_32768 đều hoạt động tối ưu ở
nhiệt độ 55C nhưng endoglucanase có xu hướng hoạt động tốt trong khoảng
nhiệt độ từ 55 - 60C; trong khi β-glucosidase lại hoạt động tốt trong khoảng
nhiệt độ thấp hơn chỉ từ 50 - 55C.
3.3.2.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp
Cả hai enzyme tái tổ hợp đều có khả năng hoạt động trong dải pH rộng từ
axit đến kiềm. Tuy nhiên, endoglucanase tái tổ hợp có phổ pH rộng hơn βglucosidase tái tổ hợp. Endoglucanase_18736 hoạt động tốt trong dải pH 3-10.
Trong khi β-glucosidase_32768 hoạt động tốt trong dải pH 4-9.
Endoglucanase_18736 hoạt động tốt nhất khi phản ứng trong môi trường đệm
Tris 0,1 M, pH 10 (Hình 3.12A); cịn β-glucosidase_32768 hoạt động tốt nhất
khi phản ứng trong môi trường đệm Tris 0,05 M, pH 8,5 (Hình 3.12B).


21

Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính endoglucanse_18736 (A)
và β-glucosidase_32768 (B).
Chú thích: pH: 3-6 (đệm citrate); pH: 7-10 (đệm tris); pH: 11-12 (đệm Na2HPO4).

3.3.2.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp
Endoglucanase_18736 và β-glucosidase_32768 đều bị ảnh hưởng bởi các
ion kim loại. Ở nồng độ 5 mM ion kim loại, mức độ ảnh hưởng cụ thể:
Đối với endoglucanase_18736: Ca 2+ và Na+ có tác dụng làm tăng hoạt tính
enzyme. Các ion cịn lại đều làm giảm (K +, Mn2+, Fe2+, Li+, Co2+, Zn2+, Mg2+,
Fe3+) hoặc làm mất hồn tồn hoạt tính enzyme (Ag +, Cu2+). Thứ tự ảnh hưởng
của các ion kim loại theo chiều hướng làm tăng hoạt tính của enzyme được

biểu diễn như sau: Ag+< Cu2+< Zn2+< Co2+< Mn2+< Fe3+< Fe2+< Mg2+< Li+< K+<
Na+< Ca2+ (Hình 3.13A).
Đối với β-glucosidase tái tổ hợp: K+, Mn2+, Fe2+, Li+, Mg2+, Fe3+, Ca2+ và
Na+ có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme; trong khi Cu2+, Zn2+ và Co2+ lại làm
giảm hoạt tính mạnh đến mức gần như làm mất hồn tồn hoạt tính enzyme.
Thứ tự ảnh hưởng của các ion kim loại theo chiều hướng làm tăng hoạt tính của
enzyme được biểu diễn như sau: Cu2+< Co2+Fe2+

22

Hình 3.13. Ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp.
A) endoglucanase_18736; B) β-glucosidase_32768.
3.3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ ion kim loại lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp
Trên cơ sở những ion kim loại có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme
tái tổ hợp ở trên, một số ion kim loại đã được thay đổi nồng độ để nghiên cứu
mức độ ảnh hưởng của chúng lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp. Kết quả nghiên
cứu cho thấy: ở nồng độ thấp, các ion kim loại được nghiên cứu (Li+, Na+, Ca2+
và Mg2+) có thể làm tăng hoạt tính của enzyme tái tổ hợp (nồng độ 5-15mM);
nhưng ở nồng độ cao (nồng độ 10-30mM), các ion kim loại này lại làm giảm
đáng kể và có thể làm mất hồn tồn hoạt tính enzyme, ngoại trừ ion Ca2+ trong
trường hợp endoglucanase_18736. Nồng độ Ca 2+ lên tới 30mM vẫn duy trì hoạt
tính của enzyme cao hơn 1,4 lần so với đối chứng khơng có ion. Đồng thời, kết
quả nghiên cứu cũng cho thấy: nồng độ 15mM Ca2+ là nồng độ thích hợp nhất
cho hoạt động của endoglucanase_18736, hoạt tính enzyme đã tăng 1,6 lần so
với mẫu không bổ sung ion kim loại; nồng độ 10mM Li + là nồng độ thích hợp
nhất cho hoạt động của β-glucosidase_32768, ở nồng độ này, Li + đã tạo ra một
sự khác biệt rất lớn khi có khả năng làm tăng hoạt tính của enzyme lên 25,5 lần
so với mẫu không bổ sung ion.

3.3.2.5. Độ bền của enzyme tái tổ hợp
Endoglucanase_18736 bền ở nhiệt độ 55C hơn so với 60C. Đồng thời,
sự có mặt của ion Ca 2+ (15 mM) khơng chỉ làm tăng hoạt tính của enzyme mà
cịn góp phần làm cho enzyme bền hơn. Cụ thể: ở nhiệt độ 60C, khi có mặt


23
của ion Ca2+, hoạt tính enzyme tăng lên 1,66 lần và vẫn duy trì được hoạt độ
này sau 16 giờ ủ, cịn ở mẫu khơng có Ca 2+, hoạt tính enzyme chỉ giữ được 8
giờ ủ. Ở 55C, khi có ion Ca2+, hoạt tính enzyme cũng tăng lên 1,66 lần và duy
trì hoạt độ sau 24 giờ ủ, trong khi ở mẫu khơng có Ca 2+, hoạt tính enzyme chỉ
giữ được trong 12 giờ ủ. Nửa chu kỳ sống của endoglucanase tái tổ hợp được

xác định ở 55ºC là 25.16  0.21 giờ và ở 60ºC là 23.11  0.42 giờ (Hình
3.14A).
Hình 3.14. Độ bền nhiệt của enzyme tái tổ hợp được khảo sát tại giá trị Topt
và pHopt. A) Endoglucanase_18736; B) β-glucosidase_32768.
Beta-glucosidase_32768 rất bền ở nhiệt độ 50 và 55C. Trong tất cả các
phương án thí nghiệm, β-glucosidase_32768 vẫn giữ được trên 60% hoạt tính
sau 10 ngày ủ ở 50 và 55C (Hình 3.14B). Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu
cũng cho thấy: với nồng độ 10 mM Li+ duy trì trong suốt q trình ủ enzyme
chỉ có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme ngay tại thời điểm ban đầu (làm cho
hoạt tính tăng lên 25,5 lần) mà khơng có tác dụng duy trì hoạt tính cũng như
làm tăng độ bền của enzyme. Nửa chu kỳ sống của β-glucosidase tái tổ hợp
được xác định ở 55ºC là 11 ngày.