Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng phát sinh callus từ bao phấn cây mướp đắng (momordica charantia l ) in vitro

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG


NGUYỄN THỊ NHƯ THẢO

NGHIÊN CỨU Ả NH HƯỞNG CỦ A MỘT SỐ YẾU TỐ
ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TỪ BAO PHẤN
CÂY MƯỚP ĐẮNG (MOMORDICA CHARANTIA L.)
IN VITRO

Đà Nẵng – Năm 2017


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG


NGUYỄN THỊ NHƯ THẢO

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN
KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TỪ BAO PHẤN CÂY
MƯỚP ĐẮNG (MOMORDICA CHARANTIA L.) IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngành: Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Minh Lý

Đà Nẵng – Năm 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai cơng
bố trong bất kì cơng trình nào khác.
Tác giả Khóa luận

Nguyễn Thị Như Thảo


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện Khóa luận tốt nghiệp tại Khoa Sinh – Môi trường,
Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng, tôi đã học hỏi được rất nhiều kiến thức lý
thuyết cũng như thực hành thí nghiệm về phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật, qua
đó bản thân tơi đã trưởng thành hơn trong tư duy, bố trí và tiế n hành các nghiên cứu
khoa học.
Để hoàn thành đươ ̣c Khóa luâṇ tố t nghiê ̣p, ngoài sư ̣ nỗ lư ̣c của bản thân, tơi xin
tỏ lịng biết ơn sâu sắc sư ̣ tận tình hướng dẫn, giúp đỡ về măṭ khoa ho ̣c của TS. Nguyễn
Minh Lý.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Trần Quang Dần và Quý thầ y cô
thuô ̣c bô ̣ môn Công nghê ̣ sinh ho ̣c đã truyề n daỵ cho tôi rất nhiều trong việc làm quen
và phát triển kĩ năng thực hành thí nghiệm trong q trình tơi thực hiện đề tài Khoá luận,
cũng như trong 4 năm ho ̣c đaị ho ̣c.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thành viên trong nhóm nghiên cứu, đã ln
giúp đỡ và chia sẻ kinh nghiệm trong thời gian tôi thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã ln động viên,
khích lệ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tơi có thể đạt được kết quả tốt nhất.

Xin trân tro ̣ng cảm ơn.
Đà Nẵng, tháng 5 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Như Thảo


MỤC LỤC
Mở đầu .................................................................................................................................. 1
1. Đặt vấn đề..................................................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài ...................................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu................................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa ho ̣c và thư ̣c tiễn của đề tài ................................................................. 3
4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................. 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................................. 3
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 4
1.1. Giới thiệu chung về cây mướp đắng (Momordica charantia l.) ........................ 4
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại .................................................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm thực vật ............................................................................................. 4
1.1.3. Điề u kiê ̣n sinh thái của cây mướp đắng ......................................................... 5
1.1.4. Thành phần dinh dưỡng và công dụng dược liệu của cây mướp đắng
(Momordica charantia l.)............................................................................................ 7
1.2. Vai trò của cây đơn bội trong chọn tạo giống cây trồng ..................................... 8
1.3. Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro để tạo cây đơn bội...................................... 9
1.3.1. Giới thiệu chung ................................................................................................ 9
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn ............................... 9
1.3.3. Nghiên cứu về kĩ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội in vitro trên thế
giới và trong nước ...................................................................................................... 13
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................. 17
2.1. Vật liệu nghiên cứu................................................................................................ 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu........................................................................................ 18
2.2.1. Phương pháp xử lý mẫu.................................................................................. 18
2.2.2. Phương pháp tạo callus đơn bội cây mướp đắng ........................................ 20


3.2.3. Bố trí thí nghiệm và xử lí thống kê ............................................................... 22
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................ 23
3.1. Phương pháp xử lý mẫu ........................................................................................ 23
3.2. Ảnh hưởng của kiể u gen mướp đắng đến khả năng phát sinh callus .............. 24
3.3. Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa mướp đắng đến khả năng phát sinh callus 26
3.4. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) đến sự phát sinh callus đơn
bội .................................................................................................................................... 29
3.5 Ảnh hưởng của tiền xử lý lạnh (4 oC) đến khả năng phát sinh callus đơn bội . 37
3.6. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy trong tối ở nhiệt độ 25±1 0C và 32±1 0C đến
khả năng tạo callus đơn bội .......................................................................................... 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 42
1. Kết luận ...................................................................................................................... 42
2. Kiến nghị .................................................................................................................... 44
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 45
PHỤ LỤC ........................................................................................................................... 50


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây mướp đắng (Momordica charantia L.) thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) là loại
dây leo, cây hàng năm [28]. Cây có nguồn gốc từ Ấn Độ, Nam Trung Quốc và được
trồng rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trên khắp thế giới như Philippin, Malaysia, Australia,
các nước ở Châu Phi, Tây Á và Mỹ La Tinh ... [38], [61], [23], [22], [21]. Tại Việt Nam,
cây được trồng ở hầu hết các tỉnh từ đồng bằng đến trung du [7]. Theo Trung tâm Rau
màu thế giới, trước đây là trung tâm Rau màu Châu Á (Asian Vegetable Research and

Development - AVRDC) năm 2007, tổng diện tích trồng mướp đắng ở nước ta là 12.000
ha, Philppines 12.000 ha, Thái Lan 3.000 ha, Indonesia 8.000 ha [8]. Tại Pakistan mướp
đắng được sản xuất 9,92 tấn/ha, Trung Quốc 18,9 tấn/ha và trung nước Châu Á là 13,7
tấn/ha (FAOSTAT 2011) [44].
Mướp đắng là một loại rau ăn quả giàu chất sắt, carbonhydrate, protein,vitamin C,
B1, B2, PP, chất khoáng, protit, lipit, đường, chất xơ, canxi, photpho, caroten [58]. Từ
quả mướp đắng có thể chế biến thành nhiều món ăn khác nhau trong bữa ăn bình dân
đến bữa tiệc ở những khách sạn sang trọng. Nó là một trong ngũ vị được con người ưa
thích (đắng-cay-chua-chát-ngọt) [5]. Ngồi ra, quả mướp đắng cịn có tính hàn nên trong
dân gian thường dùng để trị các bệnh mụn nhọt, giải nhiệt, sáng mắt, cảm nắng, giảm
ho... Trong mướp đắng có chất Alkaloid có cơng dụng lợi tiểu, giúp lưu thông máu tốt,
chống viêm, hạ sốt và tăng cướng sức khỏe thị lực. Loại dầu có trong hạt mướp đắng rất
giàu cis(c) 9, trasn(t) 11 và axit linonic t13, Chanrantin, polypeptide-p, và vicine…,
những hợp chất này không chỉ làm giảm đường huyết mà còn cải thiện việc dung nạp
glucose và giảm cholesterol, triệt tiêu các mầm bệnh gây ung thư tá tràng và nhiều chứng
bệnh nan y khác [2], [8], [10], [7].
Mướp đắng là cây vừa có giá trị thực phẩm vừa có giá trị dược liệu nên đang dần
được người nơng dân trồng với diện tích lớn và cho thu nhập cao. Nhưng các giống đang
sử dụng hiện nay chủ yếu là giống địa phương tuy có khả năng thích nghi cao, chống
chịu sâu bệnh tốt, song năng suất lại thấp. Ngoài ra, các giống nhập từ các cơng ty nước
ngồi tuy là các giống lai F1 có năng suất và độ đồng đều cao, nhưng giá thành hạt giống
cao và nhiều giống chưa qua khảo nghiệm tính thích ứng đã ảnh hưởng đến hiệu quả sản
xuất. Một số giống lai nước ngoài được nhập nội trồng liên tục qua nhiều năm đã làm
suy giảm nguồn gen. Vì vây,̣ việc tạo giống trong nước theo yêu cầu của đăc̣ điể m sản
1


xuất và phù hợp với điề u kiê ̣n sinh thái vùng canh tác, có năng suất cao ngày càng trở
nên cần thiết.
Bên cạnh đó, cơng tác cho ̣n giớ ng lai F1 đòi hỏi phải có các dòng thuần, mà hiện

nay viê ̣c taọ ra các dòng này bằng phương pháp truyền thống thường tốn rất nhiều thời
gian và công sức. Thông qua thụ phấn cưỡng bức và chọn lọc liên tục 7-8 thế hệ mới
nhận được các dòng thuần để đánh giá khả năng kết hợp của giống. Tuy vây,̣ phương
pháp này trong nhiều trường hợp vẫn không cho các dòng bố mẹ đồng hợp tử ở các cặp
allen.
Vì vậy, việc áp dụng kĩ thuật ni cấy in vitro tạo giống cây mướp đắng từ bao
phấn sẽ rút ngắn được thời gian tạo dòng thuần tuyệt đối xuống cịn một thế hệ, từ đó
cho phép giảm chi phí, tăng hiệu quả của quá trình tạo giống mướp đắng có năng suất
cao, khả năng thích nghi và chống chịu với điều kiện tại Việt Nam [31], [29].
Trên thế giới, quá trình tạo cây mướp đắng đơn bội in vitro mới chỉ được nghiên
cứu từ năm 2008, tuy có đạt được một số thành tựu nhưng hiện vẫn chỉ dừng lại ở giai
đoạn tạo callus mà chưa cho phép thu được cây trên thực tế.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên tôi chọn đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một
số yếu tố đến khả năng phát sinh callus từ bao phấn cây mướp đắng (Momordica
charantia L.) in vitro”

2. Mục tiêu của đề tài
Khảo sát được sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự phát sinh callus từ bao phấn
Mướp đắng in vitro.

3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Đánh giá hiê ̣u quả của kỹ thuâṭ khử trùng nu ̣ hoa bằ ng các hóa chấ t
khác nhau.
Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của yế u tố nô ̣i sinh (kiể u gen, kích thước nu ̣ hoa)
đến khả năng phát sinh callus từ bao phấ n Mướp đắng.
Nội dung 3: Xác đinh
̣ sự ảnh hưởng về thành phần và nồng độ của các chất điều
hòa sinh trưởng (KIN, NAA, 2,4-D, BAP) đến khả năng phát sinh callus từ bao phấ n
Mướp đắ ng.
Nội dung 4: Xác đinh

̣ ảnh hưởng của điề u kiê ̣n nuôi cấ y (tiền xử lý lạnh, nhiê ̣t đô ̣,
ánh sáng) đế n sư ̣ phát sinh callus.

2


4. Ý nghĩa khoa ho ̣c và thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Kế t quả nghiên cứu sẽ góp phầ n bổ sung dẫn liệu khoa ho ̣c về cây Mướp đắ ng
nố i chung, và về sư ̣ ảnh hưởng của điề u kiê ̣n và môi trường nuôi cấ y in vitro đế n viê ̣c
phát sinh callus từ bao phấ n nói riêng.
Kế t quả nghiên cứu là cơ sở khoa ho ̣c cho những nghiên cứu tiế p theo hướng taọ
cây Mướp đắ ng đơn bô ̣i.
Là nguồn tài liệu tham khảo cho công tác giảng dạy, học tập và nghiên cứu
khoa học, trong lĩnh vực công nghệ sinh học, ứng du ̣ng công nghê ̣ sinh ho ̣c trong cho ̣n
giố ng thư ̣c vât.̣

4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Quy trình taọ callus từ bao phấ n Mướp đắ ng in vitro có thể đươ ̣c áp du ̣ng trong
quy trình taọ cây đơn bô ̣i từ cây Mướp đắ ng.
Bao phấ n thu đươ ̣c trong đề tài sẽ là nguồ n nguyên liê ̣u phu ̣c vu ̣ cho quá trình
phát sinh phôi, tái sinh cây đơn bô ̣i.

3


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây mướp đắng (Momordica charantia l.)
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây mướp đắng có tên khoa học là Momordica charantia L. có tên nước ngoài là

Bitter melon, bitter ground (Anh), bitter apple, wild cucumber, bitter cucumber,
ampalaya (Philipines), balsam pear (Mỹ), karela (Ấn Độ)… [18]; tên việt nam là khổ
qua, mướp đắng, lương qua, cẩm lệ chi… [18].
Mướp đắng (momordica charantia L.) thuộc Giới (regnum): Plantae. Ngành
(divisio): Magnoliophyta. Lớp (class): Magnoliopsida. Bộ (ordo): Cucurbitales. Họ
(familia): Cucurbitaceae. Chi (genus): Momordica. [8]
Chi mướp đắng Momordica thuộc họ Cucurbitaceae có khoảng 45 lồi đã biết, chủ
yếu tập trung ở Châu Phi, một số loài ở Mỹ, Châu Á chỉ có khoảng 5-7 lồi. Theo Phạm
Hoàng Hộ (1991) và Nguyễn Hữu Hiến (1994), chi Momordica L. ở Việt Nam có 3 lồi
là: Momordica charantia L. Momordica Cochinchinensis (Louor.) Speng. L.
Momordica subangulata Blume L.
Trong các tài liệu nghiên cứu trên và qua các tiêu bản thu thập ở ác địa phương
trong nước của Viện Dược Liệu, các tác giả thống nhất cây mướp đắng trồng ở Việt
Nam đều thuộc loài Momordica charantia L., họ Cucurbitaceae. [8]
Loài mướp đằng (Momordica Caharantia L.) nhiễm sắc thể 2n=22, được biết đến
như một loại cây trồng đã được thuần hóa từ lâu. Theo M.E.C Reyes, B.H Gildemach
và C.J. Jansen, 1993 thì lồi này tồn tại ở 2 quần thể hoang dại và trồng trọt. Dạng trồng
trọt đã trở nên khá phong phú, đây là dạng cây có hoa đơn tính cùng gốc (monoecious)
và là cây hàng năm. Nếu căn cứ theo hình dạng bên ngồi thì người ta chia mướp đắng
thành hai chủng loại: [16]
- Momordica charantia L. Var. charantia L., quả to (đường kính > 5cm), màu xanh
nhạt, gai tù, ít đắng.
- Momordica charantia L. Var. abbreviata Ser., quả nhỏ (đường kính < 5cm), màu
xanh đậm, gai nhọn, vị rất đắng.

1.1.2. Đặc điểm thực vật
Cũng giống như các cây họ bầu bí, rễ mướp đắng phát triển rộng nhưng ăn nông.
Ở giai đoạn nảy mầm của hạt cây phát triển ngay một rễ cái (rễ cọc), rễ đó ăn sâu trong
4

đất ở độ sâu 90 hoặc 120 tới 180cm. Các rễ con hình thanh sau rất nhiều, phát triển
nhanh theo chiều ngang và lang rộng trong đất, tuy nhiên các nhánh này không ăn sâu
quá 60cm.
Mướp đắng thuộc loại dây leo bằng tua cuốn, thân có cạnh, ở ngọn có mọc lơng
tơ, có đời sống khoảng một năm.
Lá mọc so le, dài 5-10 cm, rộng 4-8 cm, phiến lá chia làm 5-7 thuỳ, hình trứng,
mép khía răng. Mặt dưới lá màu nhạt hơn mặt trên, gân lá có lơng ngắn [22], [16], [3].
Hoa đực và hoa cái mọc riêng ở nách lá, có cuống dài. Hoa đực có đài và ống rất
ngắn, tràng gồm năm cánh mỏng hình bầu dục, nhụy 5 rời nhau. Hoa cái có đài và tràng
hoa giống hoa đực. Tràng hoa màu vàng nhạt, đường kính khoảng 2 cm [22], [16], [3].
Quả hình thoi, dài 8-15 cm, gốc và đầu thn nhọn, mặt vỏ có nhiều u lồi to nhỏ
khơng đều. Quả khi chưa chín có màu xanh hoặc vàng xanh nhạt, khi chín có màu vàng
hồng. Vì thế ở Trung Quốc, mướp đắng cịn có tên là hồng dương, hồng cơ nương. Khi
chín, quả nứt ra dần từ đầu, tách ra làm ba phần để lộ chùm áo hạt màu đỏ bên trong.
[22], [16], [3].
Hạt mướp đắ ng có dang
̣ dẹp, dài 13-15 mm, rộng 7-8 mm, trơng gần giống hạt bí
ngơ. Quanh hạt có màng đỏ bao quanh (giống như màng hạt gấc).

1.1.3. Điề u kiê ṇ sinh thái của cây mướp đắng
1.1.3.1. Nhiệt độ
Mướp đắng có thể trồng quanh năm ở vùng nhiệt đới, ở những vùng cận nhiệt nó
có thể trồng hai vụ trong năm, trong khi đó ở những vùng có khí hậu ơn hịa mướp đắng
có thể trồng được trong vụ hè [27].
Cũng như các cây khác thuô ̣c họ bầu bí, mướp đắng rất mẫn cảm với sương giá
đặc biệt là nhiệt độ thấp dưới 0 oC. Vì mướp đắng là cây trồng có nguồn gốc ở vùng nhiệt
đới và á nhiệt đới nên sinh trưởng tốt trong điều kiện khí hậu ấm áp, nhiệt độ thích hợp
(24-27)o C (Desai và Musmade, 1998). Biên độ nhiệt dao động ngày đêm (28-3)oC/(2025)o C là nhiệt độ thích hợp cho quá trình sinh trưởng, nhiệt độ ban đêm dưới 16 oC sẽ
ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây (Peter McLaughlin, 1998). Ở nhiệt độ 5oC

hầu hết các giống mướp đắng ngừng sinh trưởng. Điều kiện nhiệt độ cao sẽ làm cho quả
bi ̣ ngắn, dị hình, nhiệt độ trên 40 oC có thể làm thân bị héo. Nhiệt độ thích hợp cho haṭ
nảy mầm là (30-32)oC [24], [20], nhiệt độ cho năng xuất cao nhất dao động trong khoảng

5


(20-30)o C trong thời kì hình thành quả. Khi nhiệt độ >30 oC cây không đậu quả được
[27]. Khung nhiệt độ tốt nhất cho mướp đắng sinh trưởng và phát triển là từ 25-30o C.

1.1.3.2. Ánh sáng
Mướp đắng là cây ưa ánh sáng, đô ̣ dài này ngày ngắn và trung. Khi ánh sáng thiếu
và yếu cây sinh trưởng phát triển kém, cây ra hoa cái muộn và dễ bị rụng, năng suất
thấp, chất lượng giảm, hương vị kém. Mướp đắng yêu cầu cường độ ánh sáng mạnh để
sinh trưởng, phát triển và tạo năng xuất cao. Do vậy mướp đắng không nên trồng với
mật độ cao, cây thiếu ánh sáng, sinh trưởng chậm và sâu bệnh phát triển. Trong quá trình
sinh trưởng, biện pháp kỹ thuật như tỉa lá gốc, các nhánh mọc sát đất để tạo độ thơng
thống cho giàn mướp đắng là rất cần thiết [19].

1.1.3.3. Đất và dinh dưỡng
Mướp đắng có thể trồng ở nhiều loại đất khác nhau (Cantwell và cs. 1996, Reyes
và cs. 1994), song để có thể sinh trưởng phát triển tốt nhất, cho năng suất cao khi được
trồng trên những chân đất thịt nhẹ, giàu dinh dưỡng có tầng canh tác dày, thốt nước tốt.
Độ pH trung bình 6,0-6,7 (Desai và Musmade 1998) là thích hợp nhất cho sinh trưởng
phát triển của mướp đắng. Song mướp đắng cũng có khả năng sinh trưởng được trên đất
kiềm có độ pH tới 8,0 [24].
Mướp đắng đò i hỏi lượng dinh dưỡng cân đối giữa phân bón hữu cơ và phân vơ
cơ để sinh trưởng phát triển tốt. Song tùy thuộc từng loại đất sẽ có chế đơ dinh dưỡng
thích hợp khuyến cáo dùng cho mướp đắng. Trên thực tế vẫn chưa có nhiều nghiên cứu
về chế độ dinh dưỡng, phân bón cho mướp đắng. Tuy nhiên khi trồng mướp đắ ng trên

những chân đất giàu dinh dưỡng và bón đầy đủ phân hữu cơ hoại mục thì yêu cầu về
dinh dưỡng của mướp đắngtheo khuyến cáo của Robinson cà Decker-Walteer (1996) sử
dụng phân bón với tỷ lệ N:P:K = 100:50:50 kg/ha [20], [19].

1.1.3.4. Đô ̣ ẩm
Mướp đắng có khả năng chịu hạn tốt, nhưng là cây rấ t mẫn cảm với điều kiện ngập
úng (Reyes và cs. 1994), khi ruộng mướp đắng bị ngập 4 ngày, cây sẽ bị thay đổi hình
thái học (Liao và Lin 1994). Để đảm bảo cho cây sinh trưởng, phát triển tốt luôn luôn
phải cung cấ p đủ nước cho cây.
Mướp đắng là cây ưa ẩm, cây sinh trưởng tốt trong điều kiện ẩm độ 70-80%. Thời
kì ra quả rộ và quả phát triển yêu cầu độ ẩm cao 80-90% vì ở giai đoạn này hàm lượng
nước trong thân lá, quả của mướp đắng lên đến trên 90% [20]. Tuy nhiên độ ẩm không
6


khí cao lại là điều kiện thích hợp cho sự phát triển bệnh cũng như sương mai, đốm lá,
thối vi khuẩn gây hại cho mướp đắng.

1.1.4. Thành phần dinh dưỡng và công dụng dược liệu của cây mướp đắng
(Momordica charantia l.)
Mướp đắng là một trong những cây rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, phần ăn
được của quả mướp đắng chiếm khoảng 95%. Theo tài liệu của viện Đại học Purdue về
các loaị rau quả châu Á nhập vào Mỹ (Willsetal 1984), thành phần dinh dưỡng tính bằng
gam trong 100g mướp đắng như sau: Phần ăn được 84g, nước 93,8g; Protein 0,9g;
Vitamin A 0,04mg; Vitamin B1 0,05mg; Vitamin B2 0,03mg; Niacin 0,4mg, Vitamin C
50,0mg; chất béo 0,1mg; Cacbohydrate 0,2mg; Calcium 22mg; Potassium 26,0mg;
Magnesium 16,0mg; Sắt 0,9mg.
Hợp chất saponin trong vị đắng của cây mướp đắng là vị thuốc có chứa chất
Charantin (như dạng insulin) và Alkaloid. Trong mướp đắng người ta tìm ra nhiều dưỡng
chất có lợi ích cho cơ thể như: Alkaloid, Charantin, Charine, Cryptoxanthin,

Cucurbitins,

Diosgenin,

Galacturonic

acids,

Gentisic

acid,

Goyaglyosides,

Goyasaponins, Gypsogenin, Lanosterol, Lauric acid, Linoleic acid, Momorcharasides,
Momorcharins,

Momordenol,

Momordicins,

Momordicinin,

Momordicosides,

Momordin, Oleanolic acide, Oleic acide, Oxalic acide, Peptides, Petroselinic acide,
Polypeptides, Rubixathin, chất đạm, chất sợi, các sinh tố A, C, Folic acid… Hiện nay
quả mướp đắng được sử dụng như một loại rau cũng như được sử dụng như một loại
dược liệu cho việc điều trị bệnh tiểu đường và làm thuốc tẩy giun.
Thành phần protein trong mướp đắng có cơng năng miễn dịch cao, làm cho tế bào

miễn dịch có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh, do đó có thể coi thực phẩm có thể
dùng để điều trị ung thư. Các nhà khoa học mỹ cịn cho rằng có thể chiết xuất từ trong
mướp đắng ra được 3 loại protein tiêu diệt được virus gây bệnh AIDS [58].
Trong y học truyền thống cổ xưa của Ấn Độ, Trung Quốc, châu Phi và Mỹ Latinh.
Dịch chiết từ mướp đắng chứa loạt các hóa chất thực vật có hoạt tính sinh học, bao gồm
t.riterpenes, pisteins và steroid (Grover và Yadav 2004) có khả năng chống oxy hóa,
kháng khuẩn, kháng virus, gải độc gan và chống viêm vừa có khả năng làm giảm lượng
đường trong máu (Welthinda et al 1986;. Raman và Lan 1996), điều trị nhiề u loaị loét
khác nhau, tiểu đường, và nhiễm trùng (Gurbuz et al 2000;. Scartezzini và Speroni
2000;. Beloin et al 2005). Trong khi nước sắc có tính chất gây sẩy thai, nhưng nước sắc
7


lá và thân cây được sử dụng trong điều trị bệnh lỵ, bệnh thấp khớp, và bệnh gút (Subratty
et al. 2005). Ngoài ra, dịch chiết từ lá, hoa quả và thậm chí tồn bộ cây thường được sử
dụng để điều trị các vết thương, nhiễm trùng, ký sinh trùng (ví dụ, sâu), sởi, viêm gan,
sốt (Behera et al. 2008) [58].

1.2. Vai trò của cây đơn bội trong chọn tạo giống cây trồng
Hầu hết các lồi cây trồng thường có mức bội thể lớn hơn 1, phổ biến là nhị bội
(2n) và tứ bội (4n). Như vậy, mỗi đặc điểm di truyền ở những cá thể này đều bị hai hay
nhiều alen của một gen chi phối. Nếu đó là những cá thể dị hợp tử, tức là các gen trong
mỗi hệ gen nhị bội hay tứ bội khác nhau thì biểu hiện tính trạng của gen đó hồn tồn
tùy thuộc vào tính trạng lặn hay trội của chúng quyết định. Trong công tác cho ̣n giống
người ta không chú ý nhiều tới thể đơn bội (n), bởi lẽ cây trồng ở dạng đơn bội thường
rất khó tồn tại trong tự nhiên. Nó chỉ sống được trong điều kiện nhân tạo của con người.
Cây đơn bội mang bộ NST (n), vì vậy để cho nó sống được người ta phải tiến hành nhân
đôi bô ̣ nhiễm sắ c thể taọ các dòng đồng hợp tử tuyệt đối. Những biểu hiện của cây đơn
bội (kiểu hình) thể hiện chính xác kiểu gen mà nó đang có, kể các gen lặn. Đây sẽ là
nguồn vật liệu di truyền vô cùng quý giá trong công tác chọn giống.

Giá trị của cây đơn bội trong các nghiên cứu di truyền và chọn giống đã được phát
hiện từ lâu. Karpachenco là người đầu tiên ngay từ năm 1929 đã chỉ ra khả năng và triển
vọng của việc sử dụng đơn bội vào mục đích chọn giống, vì lẽ trong bất kỳ một quần
thể nào, một tổ hợp mong muốn của các gen trong giao tử thường là cao hơn so với trong
hợp tử. Do đó, về mặt lý thuyết sẽ thường xuyên và rất nhanh nhận được các dạng đồng
hợp tử có những tổ hợp các dấu hiệu mong muốn bằng cách nhân đôi trực tiếp số lượng
nhiễm sắc thể ở các thể đơn bội [4].
Trong công tác chọn tạo giống ở loài tự thụ phấn trong một thời gian dài người ta
yêu cầu phải có những tái tổ hợp gen mong muốn từ các nguồn đồng hợp tử khác nhau.
Bằng phương pháp truyền thống thường phải mất 8-10 năm để tạo ra con lai đồng hợp
tử ổn định. Ở cây thụ phấn chéo thường gặp nhiều khó khăn hơn để có những dịng tự
phối vì hiện tượng suy giảm sức số ng của con lai sau mỗ i thế hê ̣ tư ̣ thu ̣ phấ n bắ t b ̣c.
Những dịng tự phối đồng hợp tử này sẽ được lai với nhau để tạo con lai F1 ưu thế lai.
Việc nghiên cứu cây đơn bội làm vật liệu nguồn để lưỡng bội hóa chúng thành những
vật liệu đồng hợp tử đã trở nên hữu dụng cho nhà chọn giống. Thời gian cần thiết để tạo

8


ra dòng vật liệu nguồn- dòng đơn bội kép như vậy được rút ngắn rất nhiều, khoảng 3-4
lần, tùy đối tượng cây [1].

1.3. Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro để tạo cây đơn bội
1.3.1. Giới thiệu chung
Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro bao phấn trong có chứa các tiểu
bào tử hoặc hạt phấn chưa chín trong mơi trường dinh dưỡng tạo ra cây đơn bội, là một
lối thoát kỳ diệu đối với lĩnh vực ứng dụng cây đơn bội vào công tác chọn giống cây
trồng. Thơng qua phương pháp này ta có thể rút ngắn thời gian chọn giống, làm tăng
hiệu quả chọn lọc, tăng tính biến dị cho chọn lọc và giúp giải quyết những khó khăn
trong lai xa. Các dịng thuần có thể nhanh chóng được tạo ra từ ni cấy bao phấn của

con lai F1 hoặc F2 trong thời gian ngắn nhất [51], [30].
Một số ưu điểm của phương pháp này như sau:
- Kỹ thuật khá đơn giản, ở một số loài sự phân chia tế bào có thể xảy ra dễ dàng
ngay cả khi những tế bào hạt phấn chưa thực sự chín. Tỷ lệ hạt phấn có phản ứng tốt với
môi trường nuôi cấy cao (tần suất cảm ứng mơi trường cao) và có thể sản xuất thể đơn
bội với số lượng lớn trong thời gian ngắn giảm từ 3-4 lần [51].
- Nuôi cấy bao phấn là một phương pháp để tạo ra các dòng đồng hợp tử, trong
một quá trình chỉ vài tháng so với yêu cầu nhiều thế hệ khi sử dụng phương pháp truyền
thống [62], [54], [6]. Cây đơn bội kép là sản phẩm cuối cùng của ni cấy bao phấn,
chúng có đặc điểm là đồng hợp tử tuyệt đối và được coi là nguồn vật liệu đa dạng phong
phú cho chọn tạo giống [60], [56], [37]. Thơng qua phương pháp này ta có thể rút ngắn
thời gian chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc, tăng tính biến dị cho chọn lọc và giúp
giải quyết những khó khăn trong lai xa. Các dịng thuần có thể nhanh chóng được tạo ra
từ ni cấy bao phấn của con lai F1 hoặc F2 trong thời gian ngắn nhất.
Như vậy, phương pháp nuôi cấy bao phấn đã góp phần rút ngắn rất nhiều thời gian
chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc và giúp giải quyết vấn đề hiện tại và trong lai.
Chính vì vậy mà phương pháp này đang được áp dụng rộng rãi trong chọn tạo giống cây
trồng trên thế giới cũng như ở Việt Nam.

1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn
Nhiều cơng trình nghiên cứu về ni cấy bao phấn cho chúng ta thấy hiệu quả của
nuôi cấy bao phấn nói chung và bao phấn mướp đắng nói riêng phụ thuộc vào nhiều yếu
tố như: Điều kiện sinh lý của cây mẹ, giai đoạn phát triển của hạt phấn, biện pháp xử lý
9


nhiệt, đặc biệt là kiểu gen của cây cho phấn và thành phần của môi trường dinh dưỡng
[60], [45], [35], [25].

Ảnh hưởng của cây cho bao phấn

Kiểu gen của cây cho bao phấn ni cấy có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả nuôi cấy
không những trong phạm vi một chi mà còn khác nhau giữa các giống trong một lồi.
Bao phấn phản ứng trong mơi trường ni cấy là một đặc điểm có khả năng di truyền
[66], [59].
Zagorska khi nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen cây cà chua đến hiệu quả nuôi
cấy bao phấn cho thấy: trong số 85 kiểu gen của các giống được đưa vào nuôi cấy, callus
chỉ được tạo ra từ bao phấn của 53 giống. Sự tái sinh cây chỉ có được từ callus của 15
giống. Số liệu thu được cho thấy kiểu gen ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả nuôi cấy bao
phấn [64].
Kiểu gen là nguyên nhân chính và là yếu tố quyết định ảnh hưởng đến sự hình
thành callus và tái sinh cây khi nuôi cấy bao phấn. Niizeki (1983) và Haberlebos (1985)
đã chỉ ra tác động có ý nghĩa của kiểu gen và mối tương tác giữa kiểu gen, môi trường
đến sự hình thành callus và tái sinh cây. Ngồi ra theo một số nhà khoa học thì ngồi
kiểu gen ra cịn có các nhân tố tế bào chất cũng ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn
(Heberlebor, 1985) [50]. Tuy nhiên trong thời gian gần đây, Quimio và Zapata cho rằng:
“Sự hình thành callus và tái sinh cây bị điều khiển bởi các gen lặn mà khơng liên can gì
đến các nhân tố tế bào chất” [66].
Điều kiện sinh trưởng và tình trạng sinh lý học của cây cho bao phấn cũng như
mối tương tác giữa yếu tố di truyền và mơi trường bên ngồi đều ảnh hưởng đến phản
ứng của bao phấn trong nuôi cấy in vitro. Chaleff, (1982) cho rằng: “Nhiệt độ tới hạn
của cây cho bao phấn là 18 o C”. Hơn nữa, nếu cây sống trong điều kiện nhà lưới có nhiệt
độ cao thì sự hình thành callus và tái sinh cây giảm, tỷ lệ bạch tạng sẽ tăng [39].

Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của bao phấn.
Các giai đoạn phát triển của bao phấn ni cấy cũng có ảnh hưởng rất quan trọng
đến kết quả ni cấy. Bao phấn càng già thì tỷ lệ tái sinh cây càng thấp, đồng thời tỷ lệ
cây bạch tạng tăng. Tuy nhiên khơng phải bất cứ lồi cây trồng nào cũng có hiệu suất
tối ưu ở giai đoạn trước hoặc sau một nhân, các loại hồ thảo có nhiều điểm khác nhau.
Theo Nizeki và Oono (1968) thì giai đoạn đơn nhân muộn là tốt nhất cho nuôi cấy bao
phấn lúa, còn theo Claphm (1971) lại cho rằng đại mạch có hiệu suất tạo cây cao nhất ở

10


giai đoạn đơn nhân sớm. Một số yếu tố khác hỗ trợ có thể gây nên sự thay đổi về giai
đoạn phản ứng tối ưu, ví dụ đối với lúa giai đoạn phản ứng tối ưu là trước và giữa giai
đoạn hạt phấn một nhân trong điều kiện nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy tăng
từ 6 đến 9% (Chaleff ,1982) [39].
Để đạt được hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn và tạo cây đơn bội, giai đoạn phát
triển của hạt phấn có ý nghĩa quan trọng. Chẳng hạn đối với lúa các nhà khoa học ở Viện
lúa quốc tế (IRRI) đã nghiên cứu 500 bao phấn chọn từ nhiều giống chứa hạt phấn ở các
giai đoạn khác nhau, kết quả cho thấy hạt phấn ở giai đoạn từ đơn nhân giữa đến đơn
nhân muộn là tốt nhất (Guzman, 2000), có nghĩa là cần lấy hoa khi khoảng cách giữa tai
lá cờ và lá đối diện là 2- 4cm (Zapata, 1983) [66]. Trên cây thuốc lá Reed đã xác định
được giai đoạn phát triển của bao phấn tốt nhất khi đài và tràng hoa có chiều dài tương
đương nhau [51].

Ảnh hưởng của kỹ thuật tiền xử lý vật liệu trước khi nuôi cấy
Việc xử lý lạnh hay xử lý nhiệt đối với bao phấn hoặc cây cho bao phấn trước khi
ni cấy đều có tác động đối với sự hình thành callus và tái sinh cây, nhiệt độ tối thích
phụ thuộc vào từng giống. Điều kiện lạnh đã kích thích việc tạo callus sớm và khả năng
tái sinh cây cao, callus hình thành từ bao phấn được xử lý lạnh sẽ tạo ra nhiều cây đơn
bội và ít cây lưỡng bội hơn từ bao phấn không xử lý. Các giống khác nhau địi hỏi điều
kiện xử lý có khác nhau, trạng thái sinh lý và giai đoạn phát triển của hạt phấn cũng có
ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý. Phan Hữu Tơn đã khẳng định khả năng hình thành callus
tăng lên gấp đôi khi xử lý lạnh các bao phấn chứa các bào tử ở giai đoạn giữa và cuối
một nhân trong 7 -14 ngày, quá 14 ngày tỷ lệ hình thành cây xanh giảm [17].
Năm 1983 Ying đã nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý lạnh sớm lên hiệu quả nuôi
cấy bao phấn đã cho thấy: Xử lý lạnh làm tăng tỷ lệ tạo mô sẹo được chứng minh ở
nhiều loài như thuốc lá, cà độc dược, lúa mạch và lúa nước. Tapia và cs cũng cho là xử
lý lạnh làm chậm sự lão hoá của hạt phấn, làm tăng sự phân chia của hạt phấn và giúp

giải phóng những chất cần cho sự sinh sản đơn tính đực (Tapia, 2000). Sugimoto lại cho
rằng xử lý lạnh làm tăng lượng axít amin tự do và làm thay đổi tương quan giữa các axit
amin tự do dẫn đến tăng tần số tái sinh cây đơn bội [67], [64].
Yamaguchi và cs (1999) nhận xét: thời gian tối ưu để xử lý lạnh tuỳ từng các giống
cây trồng khác nhau. Nếu xử lý ở thời gian dài thì khả năng tạo mơ sẹo giảm dần, có thể
do hạt phấn bị giảm sức sống do giữ lâu trong tủ lạnh. Đối với lúa, Gooal và cs, (1996)
11


cho biết khi xử lý lạnh ở nhiệt độ ôn hoà 10 oC lên bao phấn trong 11 ngày đã nâng tỷ lệ
tạo mơ sẹo từ 12,5% lên 32,8%. Ngồi ra Tang và cs cũng cho thấy, tỷ lệ tạo mô sẹo, tỷ
lệ tái sinh cây và tỷ lệ cây xanh phụ thuộc nhiều bởi kiểu gen của cây cho phấn [56].
Như vậy việc xử lý lạnh rất có ý nghĩa trong phản ứng của bao phấn. Một số
phương pháp xử lý khác như xử lý ly tâm, chiếu tia gamma, xử lý trong đều kiện yếm
khí tạo ra bởi nitơ phân tử hoặc áp suất nước bão hoà và với khí cacbonic ở 8 oC trong 6
ngày đều có lợi cho sự hình thành callus [41].

Ảnh hưởng của điều kiện sau khi ni cấy
Nhiệt độ trong phịng ni có ảnh hưởng đến khả năng hình thành callus và tái sinh
cây. Nhiệt độ tối thích cho sự hình thành callus là 25 o C với biên độ là 25 – 28 oC và cho
tái sinh cây là 20 – 25o C. Nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối thích chính là nguyên nhân làm
tăng cây bạch tạng. Chen (1983) cho rằng nếu nhiệt độ phịng ni cao hơn 30 oC thì hầu
như chỉ tái sinh cây bạch tạng. Wang và cs (1974) kết luận: việc hình thành cây xanh
hay cây bạch tạng chủ yếu do nhiệt độ tại thời điểm bắt đầu phát triển bào tử chứ không
phải ở pha phân hoá callus, tuy nhiên quan điểm này vẫn cần phải làm sáng tỏ thêm [60].

Ảnh hưởng của thành phần mơi trường ni cấy
Mơi trường ni cấy giữ vị trí quan trọng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của nuôi
cấy bao phấn, nhiều môi trường đã được xây dựng và sử dụng như môi trường White
(1953), môi trường Miashige và Skoog (1962), môi trường Nitsch (1969), môi trường

Gamborg (1968)... Tuỳ theo từng đối tượng nuôi cấy khác nhau những môi trường cơ
bản này sẽ được cải tiến thành nhiều môi trường khác cho phù hợp. Tuy nhiên cũng có
một số quy luật chung: Các cây hoà thảo cần nhiều auxin, đặc biệt là 2,4D ở nồng độ
cao để khởi động sự phân chia đầu tiên. Hàm lượng đường có thay đổi tuỳ đối tượng:
Lúa mì 60120g saccaroza/l, cây họ cà chỉ cần 20- 40g/l. Dịch chiết khoai tây, nấm men,
nước dừa, dịch thuỷ phân tỏ ra có tác dụng tốt trong nhiều môi trường nuôi cấy bao phấn
[51], [9].
Mặc dù trong các bao phấn rất giàu các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như
auxin và giberillin nhưng số lượng và chất lượng của các hooc môn và sự cân bằng giữa
auxin – cytokinin đựơc xem là rất quan trọng để xác định phản ứng giữa bao phấn với
môi trường và thay đổi sự biểu hiện di truyền. Auxin cao và cytokinin thấp sẽ xúc tiến
cho quá trình tăng sinh callus, ngựơc lại sẽ thích hợp cho sự hình thành chồi và cây con.

12


Trong một vài trường hợp lại không cần thiết đến sự có mặt của auxin (Evan, 1981)
[47].
Những auxin được sử dụng rộng rãi trong môi trường nuôi cấy bao phấn là
αNAA(naphthalene acetic acid), IAA (indone acetic acid), 2,4-D (2,4dichlorophenoxy
acetic acid) và CPA (p-chlorophenoxy acetic acid), 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxy
acetic acid). Trong đó, αNAA ở nồng độ 1 – 2 mg/l được coi là có hiệu quả hơn so với
các auxin đơn lẻ hay kết hợp khác [42], [39].
Theo Phan Hữu Tôn (2004) để tạo mơ sẹo đối với cây lúa thì auxin 2,4D ở nồng
độ 2mg/l là thích hợp nhất [17]. Nhưng Nguyễn Văn Uyển lại cho rằng phối hợp cả
2,4D, αNAA và Kinetin sẽ cho hiệu quả cao nhất, tỷ lệ và các loại chấ t ĐHST còn phụ
thuộc vào từng kiểu gen [15].
Sự kết hợp khác nhau của auxin và cytokinin trên các môi trường đã được nghiên
cứu rất nhiều nhưng sự kết hợp tối thích cần phải được thiết lập cho từng kiểu gen bởi
vì khơng có mơi trường đơn lẻ nào biểu hiện tốt nhất cho nhiều kiểu gen (Karim, 1987)

[55].
Các chất chuyển hoá và các chất sinh trưởng khác nhau như DDT, ActinomicynD và 2- deoxyglucose cũng được nghiên cứu, ABA và DDT được coi là ngăn cản sự
phân chia tế bào và kích thích sự hình thành chồi xanh trong nuôi cấy bao phấn lúa.
Trong khi đó, Actinomicyn-D và 2- deoxyglucose lại tăng cường sự hình thành callus ở
lúa mì và lúa nước. ABA làm tăng sự tái sinh cây xanh nhưng mức tối thích lại tuỳ theo
kiểu gen [57].

1.3.3. Nghiên cứu về kĩ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội in vitro trên
thế giới và trong nước
Các nghiên cứu ngồi nước
Trong ni cấy đơn bội, Các bao phấn dùng để nuôi cấy thường được lấy từ các
cây của quần thể F1 hoặc F2 nhằm tạo ra sự đa dạng di truyền tối đa trong quần thể
những cây đơn bội được tạo thành. Nhiễm sắc thể của cây đơn bội thông qua nuôi cấy
hạt phấn F1, sau khi lưỡng bội hoá sẽ trở thành cây lưỡng bội thuần chủng, từ các cây
này sẽ tạo thành quần thể các dòng thuần, qua đánh giá chọn lọc và cho ra giống mới
[53].
Các tác giả Juhasz, Venczel, Balogh đã tạo cây đơn bội thơng qua q trình ni
cấy nỗn chưa thụ tinh của cây dưa chuột và cây bí xanh. Hoa cái được thu từ cây mẹ
13


trồng trong nhà lưới có chiều dài 2–3 cm đối với cây bí xanh và 0,5 – 1 cm đối với cây
dưa chuột. Cắt thành từng lát cấy vào môi trường có bổ sung 0,02 mg/1 TDZ, mơi trường
phát si nh phơi có chứa NAA và BA đều có kết quả đối với cả dưa chuột và bí xanh [48].
Năm 1974 Eun và cộng sự khi nuôi cấy bao phấn dưa chuột đã phát hiện calus phát
triển từ bao phấn sau khi ni cấy 7 ngày trên mơi trường có bổ sung 2,4 D. Sau 30
ngày rễ và chồi sẽ xuất hiện [54]. Theo Lazarte, và Sasser, (1982) bao phấn dưa chuột
được trên nuôi cấy môi trường Nitsch và Nitsch cải tiến sau đó tạo callus trên mơi trường
cơ bản MS. Phôi phát triển thành cây con trên môi trường Nitsch and Nitsch đặc có chứa
20 g/lit raffinos [57].

Với cây dưa hấu tác giả Xue và cs (1989) cho rằng tiến hành lấy hoa khi bao phấn
ở giai đoạn một nhân, có kích thước 5 mm và nụ hoa có tràng hoa nhìn rõ sẽ cho hiệu
quả ni cấy tốt nhất. Callus phát sinh trên mơi trường khống MS có bổ sung 2mg/l
BA + 2mg/l Ki + 3 saccarose + 6-7% agar ở pH 5,8. Sự phát sinh cơ quan thu được bằng
nuôi cấy callus trên môi trường MS muối có bổ sung agar + 5-10 mg/l GA3 + 4mg/l BA
+ 30-40 mg/l adenine + 500mg/l lactalbumin hydrolysate. Sự phát sinh cơ quan chuyên
hoá và sự phát triển chồi thu được trên môi trường nuôi cấy MS + 2mg/l Triaconital. Rễ
phát sinh trên mơi trường agar + ½ MS + 0,2mg/l IBA + 1mg/l IAA + 1,5% succarose
+ pH 5,7. Mặc dù tần suất rất thấp nhưng họ vẫn thu được cây đơn bội và đơn bơi kép
qua q trình ni cấy [62].
Các nghiên cứu khác trên cây bí ngơ Metwall cho thấy rằng khi nuôi cấy bao phấn
cây ở giai đoạn giữa và cuối của giai đoạn hạt phấn đơn nhân được thu vào buổi sáng và
xử lý ở nhiệt độ 4oC trong 4 ngày, khử trùng nụ hoa bằng ethanol 70% trong 2 phút và
trong Clorox 20% (5,2% sodium hypochlorite) trong 20 phút cấy trên môi trường MS +
150g succarose + 5mg/l 2,4D cho tỷ lệ tạo cây cao nhất. Rễ của 20 cây tạo ra được soi
ở dưới kính hiển vi cho thấy 50% số cây là lưỡng bội và 50% số cây là đơn bội [46].
Đối với họ bầu bí thì dịng đơn bội kép được tạo ra thơng qua ni cấy bao phấn
cịn nhiều hạn chế [48], [43], [33]. Những yếu tố như đặc tính di truyền, điều kiện trồng
của cây mẹ, giai đoạn phát triển của tiểu bào tử, xử lý nụ hoa trước khi ni cấy, mơi
trường và điều kiện ni cấy có ảnh hưởng đến kết quả của q trình ni cấy bao phấn
[36]. Năm 1996, E.I. Metwally và cộng sự đã nghiên cứu thành cơng tạo đơn bội cây bí
( Eskandarani). Ông tiến hành lấy bao phấn trước một ngày nở, tiếp xúc với nhiệt độ

14


lạnh ( 4 o C) trong 2, 4, 8 ngày. Sau đó ni cấy trên trên mơi trường MS với 30g đường
sucrose, 8g agar, bổ sung nồng độ 2,4-D: 0,1 0,5 1 và 10 mg/l [35].
Năm 2010, T. Yang, J. Liu, B. Liu, X. M. Li và H. X. Li qua nghiên cứu đã tạo
được callus từ bao phấn cây mướp đắng, sau khi xử lý lạnh ở 4oC trong 1 ngày trên mơi

trường MS có bổ sung 2,4-D 0,5mg/l [63]. Sau đó, năm 2015 M. Usman và cs cũng đã
nghiên cứu thành công tạo callus từ bao phấn cây mướp đắng trên mơi trường MS có bổ
sung NAA kết hợp với BAP ( 3,22+0,88 µm/l). Bao phấn trước khi nuôi cấy tạo callus
phải qua 48 giờ xử lý lạnh ở 4o C [44].

Các nghiên cứu trong nước
Ở nước ta, công nghệ đơn bội được ứng dụng với hai mục đích chính:
- Cố định ưu thế lai thơng qua việc rút ngắn thời gian tạo giống thuần chủng bằng phương
pháp ni cấy bao phấn con lai F1.
- Tạo dịng thuần có những đặc tính thích nghi với thụ phấn chéo và mang gen kết hợp
rộng.
Sau năm 1975, nuôi cấy tế bào được phát triển, phương pháp nuôi cấy bao phấn
cũng được nghiên cứu. Các kết quả đầu tiên nuôi cấy thành công bao phấn lúa được Lê
Thị Muội công bố năm 1978 [11].
Nghiên cứu vật liệu ban đầu cho nuôi cấy tạo cây đơn bội, tác giả Nguyễn Đức
Thành (2000) cho thấy vật liệu ban đầu cho ni cấy có thể là bao phấn hoặc hạt phấn
tách rời. Sử dụng bao phấn để nuôi cấy đơn giản hơn về mặt kỹ thuật và môi trường nuôi
cấy nhưng mô và cây có thể tạo thành từ mơ soma của thành bao phấn và như vậy rất
khó phân biệt với cây tự lưỡng bội bắt nguồn từ hạt phấn. Tuy nhiên thành bao phấn lại
có vai trị quan trọng trong sự phát triển của hạt phấn. Hạt phấn được khởi đầu phân chia
trong bao phấn và chỉ những hạt phấn được khởi đầu phân chia mới tiếp tục phát triển.
Thành bao phấn cung cấp một số chất dinh dưỡng chủ yếu cho tế bào hạt phấn và đóng
vai trị như bể chứa chất trao đổi cho hạt phấn hấp thu, dự trữ và biến đổi các chất từ
môi trường nuôi cấy. Đối với hạt phấn tách rời sẽ rất khó khăn để nuôi cấy và môi trường
nuôi cấy cần giàu dinh dưỡng hơn. Sự ổn định pH là yếu tố duy trì trao đổi các chất
trong tế bào vì vậy pH mơi trường cũng cần được quan tâm. Sự bền vững và hấp thu
nhiều chất phụ thuộc vào pH môi trường như αNAA, giberelin, vitamin, sắt, pH thường
là 5,5 - 5,8 trước khi khử trùng, pH mức cao hơn làm hầu hết các muối trong mơi trường
có khuynh hướng kết tủa [11].
15

Trên cây dưa hấu Nguyễn Thị Thanh Dung khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng
đến kết quả nuôi cấy bao phấn của các giống dưa hấu (Hắc Mỹ Nhân, Siêu Nhân 0110,
SG 221) cho biết xử lý nụ hoa ở nhiệt độ 7oC trong 1 ngày và cấy trên mơi trường B5
có bổ sung 1mg/l Ki + 1mg/l 2,4D + 3% Saccarose cho tỷ lệ tái sinh callus cao nhất
[14].
Năm 2007 Nguyễn Thị Hiệp cho rằng các giống lúa thuộc lồi phụ Japonica có tỷ
lệ tạo callus cao hơn các giống lúa thuộc lồi phụ Indica. Xử lý địng ở nhịêt độ 7oC
trong 7 ngày cho hiệu quả tạo callus cao nhất và mơi trường tái sinh cây thích hợp cho
nhiều kiểu gen là MS + 1mg/l Kinetin + 1mg/l αNAA + 1mg/l BAP [12]. Khi nuôi cấy
bao phấn của các dòng bất dục đực di truyền nhân cảm ứng với môi trường tác giả
Nguyễn Thị Hồng Hạnh kết luận điều kiện ngoại cảnh của cây cho bao phấn (ánh sáng,
nhiệt độ, chế độ dinh dưỡng....) và đặc biệt là yếu tố mùa vụ có ảnh hưởng rất lớn đến
tỷ lệ tạo callus và tái sinh cây của các dịng EGMS. Ni cấy các dịng lúa EGMS khi
hạt phấn ở trạng thái hữu dục sẽ đem lại hiệu quả cao hơn nhiều so với nuôi cấy ở thời
điểm hạt phấn bất dục [13].
Trong chọn tạo giống mướp đắng bằng phương pháp truyền thống, để tạo được
dòng thuần cho việc thử khả năng kết hợp chung và kết hợp riêng phải mất từ 7- 8 thế
hệ (3- 4 năm), mất rất nhiều thời gian và kinh phí, đồng thời kéo dài thời gian cho công
tác chọn tạo giống. Bằng phương pháp nuôi cấy hạt phấn mướp đắng sẽ khắc phục nhược
điểm của phương pháp chọn tạo giống truyền thống. Cây đơn bội kép tạo ra từ ni cấy
hạt phấn có độ đồng hợp tử tuyệt đối, hồn tồn khơng phân ly trong các thế hệ sau và
có thể tạo ra được trong một thời gian ngắn (1 thế hệ), tiết kiệm được rất nhiều kinh phí
và đặc biệt rút ngắn thời gian cho công tác chọn tạo giống mướp đắng.
Tuy nhiên, việc ứng dụng kỹ thuật đơn bội phục vụ cơng tác tạo dịng thuần trong
chọn tạo giống cây trồng vẫn còn nhiều hạn chế. Hiện nay, kỹ thuật này mới chỉ ứng
dụng được một phần rất nhỏ trong chọn tạo lúa, ngơ cịn các đối tượng cây trồng khác
chưa được nghiên cứu nhiều. Vì vậy, việc nghiên cứu ni cây bao phấn đối với nhiều
loại cây trồng nhằm rút ngắn thời gian tạo giống là rất cần thiết. Đặc biệt là trong công

cuộc chuyển đổi cơ cấu cây trồng, để phát triển ngành nông nghiệp cần phát triển ngành
công nghiệp chế biến, đẩy mạnh xuất khẩu, vấn đề rút ngắn thời gian tạo dịng thuần
phục vụ cơng tác chọn tạo giống cần được quan tâm nhiều hơn nữa.

16


CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu.
Vật liệu nghiên cứu là các bao phấn thu từ các giống cây mướp đắ ng đươ ̣c trồng
tại thơn Bầu Trịn xã Đại An huyện Đại Lơc tỉnh Quảng Nam.

Hình 2.1. Nụ hoa mướp đắng và bao phấn hoa mướp đắng. (A) Nụ hoa
mướp đắng. (B) Bao phấn hoa mướp đắng.

Đặc điểm của giống được sử dụng:
Bảng 2.1. Đặc điểm giống sử dụng để thu hái nụ hoa.
STT

1

Tên giống
Khổ qua mỡ
F1 TN 187

Đặc điểm
Có dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn.
Thời vụ gieo trồng: quanh năm
Thời gian bắt đầu thu hoạch: 35-38 ngày sau khi gieo
Có dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn.

Cây sinh trưởng rất khỏe chống chịu virus rất tốt.
Thời vụ mùa mưa.

2

Khổ qua lai

Thời gian bắt đầu thu hoạch: 35-38 ngày sau khi gieo, thu

F1 Diago 26

hoạch rộ và rất bền.
Trái dài 20-23 cm, có màu xanh bóng cơm dày, gai nở to,
khơng bị nức trái vào mùa mưa, vận chuyển đi xa tốt.
Năng xuất trung bình 4,5-5kg/cây.

3

Khổ qua lai
F1 Diago 25

Có dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn.
Cây sinh trưởng rất khỏe chống chịu virus rất tốt.
Thời vụ mùa khô.

17


Thời gian bắt đầu thu hoạch: 35-38 ngày sau khi gieo, thu
hoạch rộ và rất bền.

Trái dài 20-23 cm, có màu xanh bóng cơm dày, gai nở to,
khơng bị nức trái vào mùa mưa, vận chuyển đi xa tốt.
Năng xuất trung bình 4,5-5kg/cây.
Có dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn.
Đại địa

4

Thời vụ: vụ chính đơng xn. Trồng vụ mưa đất phải thoát
nước tốt.
Thời gian bắt đầu thu hoạch: 40-45 ngày sau khi gieo.

2.2 Phương pháp nghiên cứu
Đề tài tiến hành nghiên cứu tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học thực vật, Khoa
Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng từ tháng 7/2016 –
3/2017.
Nụ hoa mướp đắng
Tiền xử lý, khử trùng
Tách bao phấn, cấy vào môi trường nuôi cấy
Callus phát sinh từ bao phấn hoa mướp đắng
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm

2.2.1. Phương pháp xử lý mẫu
Thu hái nụ hoa giống khổ qua lai F1 Diago 25 tại huyện Đại Lộc-Quảng Nam vào
buổi sáng từ 6h đến 7h sáng. Theo M.Usman và cộng sự đã nghiên cứu thành công việc
tạo callus từ bao phấn hoa mướp đắng với kích thước 13-15mm (kích thước trung bình
của giống Faisalabad long), qua tiền xử ý 2 ngày (2015) [44]. Vì mướp đắng giống khổ
qua lai F1 Diago 25 có kích thước lớn nhất là 10mm nên ta hái nụ hoa có khích thước
trung bình 4-6mm để nghiên cứu. Nụ hoa được đặt trong đĩa pestri hay túi polyethylene.
Khử trùng nụ hoa mướp đắng theo cơng thức thí nghiệm sau:

- Công thức 1: Nụ hoa được ngâm, lắc trong cồn 70% trong 3 phút, rửa lại 3 lần
18


bằng nước cất vơ trùng, sau đó thấm khơ nụ hoa trên giấy thấm vô trùng, tách lấy bao
phấn đưa vào môi trường nuôi cấy.
- Công thức 2: Nụ hoa được ngâm, lắc trong cồn 70% 30 giây, rửa lại bằng nước
cất vô trùng, tiến hành khử trùng bằng NaOCl nồng độ 5% trong 8 phút, rửa lại bằng
nước cất vô trùng 5 lần. Nụ hoa được thấm khô trên giấy thấm vô trùng, tách lấy bao
phấn đưa vào môi trường nuôi cấy.
- Công thức 3: Nụ hoa được ngâm, lắc trong cồn 70% 30 giây, rửa lại bằng nước
cất vô trùng, tiến hành khử trùng bằng NaOCl nồng độ 5% trong 8 phút, rửa lại bằng
nước cất vô trùng 5 lần. Nụ hoa được thấm khô trên giấy thấm vô trùng, tách lấy bao
phấn đưa vào môi trường nuôi cấy.
- Công thức 4: Nụ hoa được ngâm, lắc trong cồn 70% trong 30 giây, rửa lại bằng
nước cất vô trùng. Tiếp tục ngâm, lắc trong dung dịch HgCl2 0,1 % trong thời gian 5
phút, sau đó rửa 3 lần với nước cất khử trùng. Rồi thấm khô nụ hoa trên giấy thấm vô
trùng, tách lấy bao phấn đưa vào môi trường nuôi cấy.
- Công thức 5: Nụ hoa được ngâm, lắc trong cồn 70% trong 30 giây, rửa lại bằng
nước cất vô trùng, tiến hành khử trùng bằng NaOCl nồng độ 0,1% trong 3 phút, rửa lại
bằng nước cất vô trùng 3 lần. Tiếp tục ngâm, lắc trong dung dịch HgCl2 0,1 % trong thời
gian 3 phút, sau đó rửa 3 lần với nước cất khử trùng. Tiếp tục ngâm, lắc trong dung dịch
HgCl2 0,1 % trong thời gian 5 phút, sau đó rửa 3 lần với nước cất khử trùng.
Thu nụ hoa vô trùng tách lấy bao phấn cấy trên mơi trường MS có bổ sung 3%
sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 0.2mg/l BA và 0.6mg/l NAA theo như M.Usman và cộng
sự đã nghiên cứu thành công (2015) [44]. Đánh giá khả năng phát sinh callus sau 1,2,3
tuần nuôi cấy thông qua các chỉ tiêu đánh giá sau:
Tỷ lệ phát sinh callus (%) =
Số callus/mẫu (%) =

mẫu phát sinh𝑐𝑎𝑙𝑙𝑢𝑠
tổng số mẫu

mẫu phát sinh 𝑐𝑎𝑙𝑙𝑢𝑠
bình mẫu

x 100

x 100

Tỷ lệ sống của hạt phấn (khoanh 3 vùng khác nhau, mỗi vùng đếm 100 hạt phấn
dưới kính hiển vi) [37].
Tỷ lệ hạt phấn sống (%) =

số hạt phấn sống
100

x 100

Bao phấn sau 1 tuần nuôi cấy nhuộm bằng acetocarmine 0.1% trong 30 phút rồi
quan sát dưới kính hiển vi quang học HSX Pro.Way-BK 5000 – Trung Quốc với độ

19