Nghiên cứu đánh giá đa dạng vi sinh vật, sàng lọc, thu nhận và xác định tính chất của cellulase suối nước nóng Bình Châu bằng kỹ thuật Metagenomic

viện hàn lâm khoa học và công nghệ việt nam
viện công nghệ sinh học

TRN THANH THY

NGHIÊN CứU đánh giá đa dạng vi sinh vật,
SàNG LọC, THU NHậN Và XáC ĐịNH TíNH CHấT
CủA CELLULASE SUốI NƯớC NóNG bình châu,
VIệT NAM bằng kỹ thuật metagenomicS

luận án tiến sĩ sinh học

Hà nội - 2021


3.2.3. Động thái sinh trưởng và biểu hiện endoglucanase và β-glucosidase của
chủng E. coli C43(DE3) tái tổ hợp ..............................................................82
3.3.

Tinh sạch và xác định tính chất của các cellulase tái tổ hợp ..................83

3.3.1. Tinh sạch enzyme tái tổ hợp .........................................................................83
3.3.2. N g h i ê n c ứ u mộ t s ố đ ặ c t í n h c ủ a e n do g l u c a n a s e _ 1 8 7 3 6 v à
β - g l u c o s i d a s e _ 3 27 6 8 t á i t ổ h ợ p ......................................................85
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................95
4.1.

Đa dạng vi sinh vật và tiềm năng khai thác các gen mới mã hóa cho
cellulase suối nước nóng Bình Châu thơng qua cách tiếp cận không
phụ thuộc vào nuôi cấy. .............................................................................95

4.1.1. Đa dạng vi sinh vật .......................................................................................95
4.1.2. Tiềm năng khai thác các gen mới mã hóa cho cellulase ..............................99
4.2.

Mối liên hệ giữa mơ hình cấu trúc với các đặc điểm của
endoglucanase_18736 và β-glucosidase_32768 ......................................104

4.2.1. Phân tích các do main ch ức năng c ủa endoglucana se_18 736
và β-glucos idase _3 2768 .....................................................................104
4.2.2. Mơ hình cấu trúc 3D của endoglucanase_18736 và β-glucosidase_32768
tái tổ hợp ....................................................................................................104
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................111
NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN
ĐẾN ĐỀ TÀI .........................................................................................................113
TĨM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ......................................................114
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................122
PHỤ LỤC ...................................................................................................................1

vi


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

APS

Ammonium persulfate

Ammonium persulfate

BGI

Beijing Genomics Institute

Viện nghiên cứu hệ gen Bắc Kinh

BLAST

Basic Local Alignment

Cơng cụ tìm kiếm các trình tự tương

Search Tool

đồng trực tuyến của NCBI

Bp

Base pair

Cặp base

BSA

Bovine serum albumin

Albumin huyết thanh bò

CAZy

Carbohydrate – Active

Enzyme thủy phân carbohydrate

enzymes
CBMs hay

Carbohydrate Binding

Module/Vùng liên kết với

CBD

modules/Domains

carbohydrate

CD

Catalytic domain

Vùng xúc tác

CEs

Carbohydrate esterases

Carbohydrate esterases

CMC

Carboxymethyl cellulose

Carboxymethyl cellulose
Cơ sở dữ liệu

CSDL
dH2O

Deionized water

Nước deion

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit Deoxyribonucleic

DNSA

3,5-Dinitrosalicylic acid

Axit 3,5-Dinitrosalicylic

dNTP

2’ – deoxyribonucleoside

2’ – deoxyribonucleoside 5’ -

5’ – triphosphate

triphosphate

1,2-bis

1,2-bis (diphenylphosphino) ethylene

DPPE

(diphenylphosphino)
ethylene
EBI

European Bioinformatics

Viện nghiên cứu tin sinh Châu Âu

Institute
EDTA

Ethylene diamine tetra

Axit ethylene diamine tetra acetic

acetic acid

vii


EMBL

ExPASY

European Molecular

Phịng thí nghiệm sinh học phân tử

Biology Laboratory

Châu Âu

Expert Protein Analysis

Hệ thống chuyên phân tích protein

System
GH

Glycoside hydrolase

Họ enzyme thủy phân glycoside

GTs

Glycosyl transferases

Glycosyl transferases

HTS

High throughput

Giải trình tự thơng lượng cao

Sequencing
IPTG

Kb

Isopropyl β- D-1-

Isopropyl β- D-1-

thiogalactopyranoside

thiogalactopyranoside

Kilo base

Đơn vị đo kích thước của axit
nucleic

KDa

Kilo Dalton

Đơn vị đo kích thước protein

KEGG

Kyoto Encyclopedia of

Cơ sở dữ liệu về gen và hệ gen

Genes and Genomes

Kyoto.

Km

Michaelis constants

Hằng số Michaelis

LB

Luria-Bertani

Mơi trường Luria-Bertani (LB)

MEGAN

MEtaGenomic ANalyser

Phần mềm phân tích trình tự đa hệ gen

NB

Nutrient broth

Môi trường Nutrient broth (NB)

NCBI

National Center for

Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh

Biotechnology Information

học quốc gia (Mỹ)

Next Generation

Giải trình tự gen thế hệ mới

NGS

Sequencing
NR

Non - Redundant

Cơ sở dữ liệu chứa các trình tự

khơng dư thừa của NCBI

ORF

Open Reading Frame

Khung đọc mở

PBS

Phosphate – Buffered

Đệm muối phosphate

saline
PCR

Polymerase Chain Reaction Phản ứng trùng hợp chuỗi

viii


PDB

Protein Data Bank

Ngân hàng dữ liệu protein

PEG

Polyethylen glycol

Polyethylen glycol

PLs

Polysaccharide lyases

Polysaccharide lyases

pNPG

p-nitrophenyl-β-d-

p-nitrophenyl-β-d-glucopyranoside

glucopyranoside
SDS

Sodium dodecyl sulphate

Sodium dodecyl sulphate

SDS -

SDS – Polyacrylamide gel

Điện di trên gel polyacrylamide

PAGE

electrophoresis

Swiss-Prot

Swiss Protein

Cơ sở dữ liệu protein Thụy Sĩ

TB

Terrific Broth

Mơi trường Terrific broth (TB)

TEMED

N,N,N′,N′-Tetramethyl

N,N,N′,N′-Tetramethyl

ethylenediamine

ethylenediamine

Tm

Temperature Melting

Nhiệt độ nóng chảy

Vmax

Maximum Velocity

Vận tốc tối đa

Uniprot

Universal Protein Resource

Nguồn dữ liệu phổ biến về trình tự
và chức năng của protein

ix


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân bố của cellulase vào các họ GH khác nhau ....................................8
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính cellulase của vi sinh vật
ở suối nước nóng ....................................................................................14
Bảng 1.3. Đặc điểm của cellulase bền nhiệt ..........................................................20
Bảng 1.4. Cellulase bền nhiệt từ metagenome của vi sinh vật ở suối nước nóng........31
Bảng 3.1. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA metagenome mẫu nước và mẫu bùn
suối nước nóng Bình Châu .....................................................................54
Bảng 3.2. Kết quả tinh sạch dữ liệu giải trình tự DNA metagenome suối nước nóng
Bình Châu ...............................................................................................54
Bảng 3.3. Kết quả lắp ráp de novo metagenome suối nước nóng Bình Châu .......55
Bảng 3.4. Thống kê phân loại học DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu
đã được chú giải .....................................................................................56

Bảng 3.5. Tỉ lệ các gen đã được phân loại thuộc các Ngành vi khuẩn ở
suối nước nóng Bình Châu ................................................................58
Bảng 3.6. Tỉ lệ các gen đã được phân loại thuộc các Lớp vi khuẩn ở suối nước nóng
Bình Châu ...............................................................................................59
Bảng 3.7. Tóm tắt kết quả chú giải gen dựa vào các cơ sở dữ liệu mở .................61
Bảng 3.8. Phân bố của các ORF mã hóa cho cellulase được dự đốn từ bộ dữ liệu
DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu.................................... 64
Bảng 3.9. Đặc điểm của 5 ORF mã hóa cho endoglucanase và β-glucosidase
thỏa mãn các tiêu chí lựa chọn gen/protein mới....................................68
Bảng 3.10. Kết quả tinh sạch endoglucanase và β-glucosidase tái tổ hợp bằng cột
IMAC-Ni2+.............................................................................................85
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ ion kim loại lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp .....90

x


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1.

Ngun tắc hoạt động của cellulase thủy phân cellulose ........................7

Hình 1.2.

Cấu trúc 3D của endoglucanase thuộc họ GH7 thu nhận từ
nấm Trichoderma reesei ...................................................................10

Hình 1.3.

Cấu trúc cellulosome của A. cellulolyticus ............................................11

Hình 1.4.

Ba dạng tâm hoạt động của các họ GH .................................................11

Hình 1.5.

Hai cơ chế xúc tác của GHsa .................................................................13

Hình 1.6.

Các phương pháp chính để phát hiện gen mới bằng cách sử dụng
Metagenomics........................................................................................22

Hình 1.7.

Các bước chính xây dựng thư viện Metagenomic .................................24

Hình 1.8.

Các bước phân tích tin sinh điển hình cho cơ sở dữ liệu
Metagenomic .........................................................................................26

Hình 2.1.

Quy trình xử lý, phân tích dữ liệu DNA metagenome và sàng lọc gen
mã hóa cho enzyme thủy phân cellulose tiềm năng ..............................38

Hình 3.1.

Các vị trí lấy mẫu nước và mẫu bùn của suối nước nóng Bình Châu ...53

Hình 3.2.

DNA metagenome mẫu nước và bùn suối nước nóng Bình Châu ........53

Hình 3.3.

Phân bố độ dài contig sau khi lắp ráp bằng phần mềm
SOAPdenovo2 .......................................................................................55

Hình 3.4.

Phân bố độ dài các gen được dự đoán từ bộ dữ liệu
D N A m e t a g e n o m e s u ố i n ư ớ c n ó n g B ì n h C h â u ....................56

Hình 3.5.

Biểu đồ biểu thị 8 nhóm chiếm ưu thế cho từng cấp độ phân loại
(Ngành, Lớp, Bộ, Họ, Chi, Lồi) vi sinh vật ở suối nước nóng
Bình Châu .............................................................................................57

Hình 3.6.

Phân bố các họ enzyme được tìm thấy trong bộ dữ liệu DNA metagenome
suối nước nóng Bình Châu khi so sánh với cơ sở dữ liệu CAZy ................62

Hình 3.7.

Phân bố các ORF thuộc họ enzyme GH tham gia chuyển hóa
lignocellulose trong bộ dữ liệu DNA metagenome suối nước nóng

Bình Châu ..............................................................................................63
xi


Hình 3.8.

Cây phát sinh chủng loại Maximum likelihood của trình tự axit amin
mã hóa cho cellulase từ bộ dữ liệu DNA metagenome suối nước nóng
Bình Châu ..............................................................................................66

Hình 3.9.

Dự đốn tính chất của các protein tham gia vào quá trình thủy phân
cellulose được mã hóa bởi các gen trong bộ dữ liệu DNA metagenome
suối nước nóng Bình Châu ......................................................................67

Hình 3.10. Kết quả phân tích vùng bảo thủ trên trình tự axit amin của
endoglucanase_18736............................................................................71
Hình 3.11. Kết quả phân tích vùng bảo thủ trên trình tự axit amin của
β-glucosidase_32768 ...........................................................................71
Hình 3.12. Mơ hình cấu trúc protein 3D được xây dựng bằng phần mềm
Swissmodel của ExPASy. a) Cấu trúc của endoglucanase_18736
dựa theo khuôn mô hình cấu trúc của cellulase Cel6 giả định
(1up3.1.A); b) Cấu trúc khn cellulase Cel6 giả định (1up3.1.A) . .. 72
Hình 3.13. Mơ hình cấu trúc protein 3D được xây dựng bằng phần mềm
Swissmodel của ExPASy. a) Cấu trúc của β-glucosidase_32768 dựa
theo khn mơ hình cấu trúc β-glucosidase (1vff.1.A); b) Cấu trúc
của β-glucosidase khn (1vff.1.A). .....................................................73
Hình 3.14. Điện di đồ sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pET17b mang các đoạn gen
ngoại lai bằng hai enzyme giới hạn HindIII và NdeI ..............................75

Hình 3.15. Hoạt tính endoglucanase_18736 (A) và β-glucosidase_32768 (B)
trong pha tan của các chủng tái tổ hợp ..............................................76
Hình 3.16. Ảnh hưởng của chủng chủ lên quá trình sinh trưởng và biểu hiện
enzyme tái tổ hợp ..................................................................................76
Hình 3.17. Ảnh hưởng của mơi trường ni cấy lên sinh trưởng và sinh hoạt tính
enzyme ở chủng E. coli C43(DE3) tái tổ hợp .......................................77
Hình 3.18. Ảnh hưởng độ thống khí lên sinh trưởng và sinh hoạt tính
endoglucanase của chủng E. coli C43(DE3) tái tổ hợp .........................79
Hình 3.19. Ảnh hưởng độ thống khí lên sinh trưởng và sinh hoạt tính
β-glucosidase của chủng E. coli C43(DE3) tái tổ hợp ............79
xii


Hình 3.20. Ảnh hưởng nồng độ IPTG cảm ứng lên sinh trưởng và biểu hiện
endoglucanase_18736 của chủng tái tổ hợp ..........................................81
Hình 3.21. Ảnh hưởng nồng độ IPTG cảm ứng lên sinh trưởng và biểu hiện
β-glucosidase của chủng E. coli C43(DE3) tái tổ hợp......................81
Hình 3.22. Động thái sinh trưởng và sinh endoglucanase của chủng E. coli C43(DE3)
tái tổ hợp .................................................................................................82
Hình 3.23. Động thái sinh trưởng và sinh β-glucosidase của chủng E. coli C43(DE3)
tái tổ hợp .................................................................................................83
Hình 3.24. Điện di đồ SDS-PAGE (a) và Zymogram (b) của endoglucanase
tái tổ hợp ...............................................................................................84
Hình 3.25. Điện di đồ SDS-PAGE (a) và Zymogram (b) của β-glucosidase
tái tổ hợp ...............................................................................................84
Hình 3.26. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp......................86
Hình 3.27. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính endoglucanase tái tổ hợp ..................87
Hình 3.28. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính β-glucosidase tái tổ hợp ....................87
Hình 3.29. Ảnh hưởng của một số

ion kim loại lên hoạt tính

endoglucanase_18736 ..........................................................................88
Hình 3.30. Ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt tính βglucosidase_32768 ................................................................................88
Hình 3.31. Độ bền nhiệt của endoglucanase_18736 được khảo sát tại giá trị Topt
và pHopt ..................................................................................................91
Hình 3.32. Độ bền nhiệt của β-glucosidase_32768 được khảo sát tại giá trị Topt
và pHopt ..................................................................................................92
Hình 3.33. Khả

năng

thủy

phân

một

số

loại

cơ

chất

của

endoglucanase_18736 và β-glucosidase_32768 ..............................93
Hình 3.34. Động học enzyme tái tổ hợp ..................................................................94

xiii


1

MỞ ĐẦU
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân các liên kết β-1,4-glucoside trong phân tử
cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác. Cellulase
được tổng hợp bởi cổ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, động vật nguyên sinh, thực vật và
động vật. Enzyme này được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, lên men
rượu, thức ăn gia súc, dệt may, giặt ủi, trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy,...
Khi nguồn nguyên liệu hóa thạch dần cạn kiệt thì nhu cầu sử dụng các nguồn năng
lượng thay thế, có thể tái tạo và thân thiện với mơi trường ngày càng tăng. Một trong
những nguồn năng lượng thay thế được quan tâm nhất hiện nay là nhiên liệu sinh học
từ sinh khối lignocellulose. Q trình chuyển hóa lignocellulose thành các sản phẩm
có giá trị như nhiên liệu sinh học, nhựa sinh học, axit hữu cơ và các cụm hóa chất
kiến tạo khác thường được thực hiện ở các điều kiện đặc biệt như ở nhiệt độ cao, tiền
xử lý bằng kiềm hoặc axit hoặc trong dung môi hữu cơ… Do đó địi hỏi các nhà khoa
học phải nghiên cứu tìm kiếm các cellulase mang những đặc tính mới (như bền với
nhiệt độ cao, chịu được áp suất cao, chịu được pH axit/kiềm, dung môi …) để đáp
ứng được các u cầu của q trình chuyển hóa lignocellulose và hạ được giá thành
sản xuất.
Một trong những nguồn địa nhiệt có thể thu nhận cellulase bền nhiệt là nhóm vi
sinh vật ưa nhiệt ở suối nước nóng. Tuy nhiên, sử dụng các phương pháp phân lập,
nuôi cấy vi sinh vật truyền thống không thể khai thác hết được tiềm năng của vật liệu
di truyền trong hệ sinh thái này vì có tới 99% các lồi vi sinh vật sống trong mơi
trường là các lồi khơng ni cấy được. Hơn nữa, do đặc tính riêng của hệ sinh thái
suối nước nóng có mật độ vi sinh vật thấp hơn rất nhiều so với các mơi trường bình
thường khác, vì vậy việc thu nhận được các loài vi sinh vật mới để khai thác nguồn gen

của chúng bằng phương pháp nuôi cấy thông thường gặp nhiều khó khăn.
Ngày nay, nhờ sự tiến bộ của cơng nghệ giải trình tự gen thế hệ mới, việc tách
dịng các gen mới có thể được thực hiện bằng cách tiếp cận cơ sở dữ liệu metagenome
kết hợp với các phần mềm tin sinh để dự đốn tính chất của protein tiềm năng trước
khi biểu hiện và nghiên cứu đặc tính của enzyme tái tổ hợp. Thơng qua cách tiếp cận


2
này, các nhà nghiên cứu không chỉ đánh giá được mức độ đa dạng vi sinh vật ở trong
một hệ sinh thái mà còn bảo tồn và khai thác được các gen mới hoặc các protein có
tính chất đặc biệt từ các vi sinh vật đó.
Với mong muốn có thể đánh giá đa dạng vi sinh vật, đồng thời tiếp cận và khai
thác được nguồn cellulase bền nhiệt mới từ suối nước nóng Bình Châu - suối nước
nóng có nhiệt độ cao thứ hai ở Việt Nam không thông qua nuôi cấy, chúng tôi đã tiến
hành nghiên cứu, thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đánh giá đa dạng vi sinh vật, sàng
lọc, thu nhận và xác định tính chất của cellulase suối nước nóng Bình Châu, Việt
Nam bằng kỹ thuật Metagenomics”.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Thơng qua kết quả giải trình tự DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng
Bình Châu bằng hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới, (i) Đánh giá được nguồn đa
dạng vi sinh vật ưa nhiệt và xây dựng được bộ dữ liệu các gen mã hóa cho cellulase;
ii) Biểu hiện được các cellulase tái tổ hợp đồng thời (iii) Tinh sạch và xác định được
tính chất của các cellulase tái tổ hợp này.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Khai thác bộ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng
Bình Châu, đánh giá đa dạng vi sinh vật và xây dựng bộ dữ liệu các gen mã hóa cho
cellulase.
- Biểu hiện gen mới mã hóa cho cellulase (endoglucanase và β-glucosidase)
chịu nhiệt tiềm năng được lựa chọn từ bộ dữ liệu DNA metagenome.
- Tinh sạch và xác định tính chất của các cellulase tái tổ hợp.

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Đã xây dựng được bộ dữ liệu DNA metagenome của vi khuẩn và cổ khuẩn
suối nước nóng Bình Châu với kích thước 9,4 Gb độ bao phủ trên 60%. Qua phân
tích đã xác định được đa dạng vi sinh vật và gen mã hóa enzyme thủy phân cellulose,
lựa chọn được hai gen mới (có độ tương đồng thấp 50,35% và 53,94%) mã hóa cho
hai enzyme tương ứng là endoglucanase và beta-glucosidase.
- Đã biểu hiện, tinh sạch và nghiên cứu tính chất sinh học của endoglucanase và
beta-glucosidase. Đã xác định được Vmax và Km của hai enzyme này.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Khu hệ vi sinh vật trong suối nước nóng
Suối nước nóng đã được nghiên cứu từ thế kỷ XIX. Các nghiên cứu đầu tiên về

suối nước nóng chỉ tập trung vào nghiên cứu tính chất hóa lý và đặc điểm địa chất,
còn nghiên cứu về vi sinh vật sống trong hệ sinh thái này chỉ mới bắt đầu vào giữa
thế kỷ XX (Marsh và Larsen, 1953). Nhiệt độ trong suối nước nóng thường vượt quá
giới hạn phát triển của sinh vật nhân thật. Do đó, vi sinh vật trong hệ sinh thái này
chủ yếu là nhóm vi khuẩn, cổ khuẩn và virus (López-López và cs., 2013).
Vi sinh vật sống ở nhiệt độ cao được phân vào hai nhóm chính là vi sinh vật ưa
nhiệt - thermophiles (nhiệt độ sinh trưởng tối ưu > 50ºC) và vi sinh vật siêu ưa nhiệt
- hyperthermophiles (nhiệt độ sinh trưởng tối ưu > 80ºC). Các vi sinh vật này đóng
vai trị trung tâm trong chu trình phân hủy các hợp chất hữu cơ và chu trình hóa sinh
địa (Merino và cs., 2019).
Vi sinh vật trong suối nước nóng thường khơng đa dạng và phong phú bằng các

môi trường thủy vực khác. Để nghiên cứu khu hệ vi sinh vật trong suối nước nóng,
các nhà khoa học có thể tiếp cận bằng phương pháp nuôi cấy và/ hoặc không thông
qua nuôi cấy. Sử dụng phương pháp ni cấy, nhiều lồi vi khuẩn và cổ khuẩn đã
được phân lập từ các suối nước nóng khác nhau trên thế giới. Từ các suối nước nóng
nằm trong cơng viên quốc gia Yellowstone (Mỹ), các nhà khoa học đã phân lập được
nhiều loài vi khuẩn và cổ khuẩn: Achnanthes exigua, Archaeoglobus spp, Bacillus
coagulans,

Clostridium

thermoautotrophicum,

Sulfolobus

acidocaldarius,

Thermoleophilum album, Thiobacillus thiooxidans (Resources, 1997). Đây là các lồi
có nhiệt độ sinh trưởng cao hoặc cực cao. Sử dụng phương pháp này, nhiều loài vi
khuẩn và cổ khuẩn mới cũng đã được phát hiện như Caldivirga maquilingensis gen.
nov., sp. nov đã được phân lập từ suối nước nóng ở Phillipines (Itoh và cs., 1999);
Vulcanisaeta distribute gen. nov., sp. nov. và Vulcanisaeta souniana sp. nov. đã được
tìm thấy trong suối nước nóng ở Nhật Bản (Itoh và cs., 2002); Fervidicoccus fontis
gen. nov., sp. nov. đã được thu nhận ở suối nước nóng tại vùng Kamchatka Peninsula,
Nga (Perevalova và cs., 2010).


4
Mặc dù nhiều chủng, loài vi sinh vật khác nhau từ các suối nước nóng trên Thế
giới đã được phân lập và phân loại, nhưng số lượng những loài chưa thể phân lập
được vẫn cịn rất lớn, do đó khơng thể tiếp cận được các vi sinh vật bản địa, nắm bắt

được vai trị của chúng trong các chu trình chuyển hóa vật chất cũng như thu nhận
được các chất có hoạt tính sinh học từ hệ sinh thái này. Sự ra đời của máy giải trình
tự gen thế hệ mới được đánh giá là một công nghệ tiên tiến của ngành công nghệ sinh
học, khi kết hợp với các công cụ tin sinh sẽ tạo thành kỹ thuật Metagenomic (kỹ thuật
phân tích hệ gen mơi trường), cho phép các nhà khoa học có điều kiện tiếp cận, bảo
tồn và khai thác nguồn vi sinh vật một cách đầy đủ và toàn diện hơn. Hiệu quả của
phương pháp này đã được chứng minh rõ rệt khi phân tích về số lượng, thành phần
chủng loại của quần xã vi khuẩn trong suối nước nóng Comano Terme (Ý) so với
phương pháp ni cấy thông thường (Pedron và cs., 2019). Kết quả đánh giá đa dạng
khơng thơng qua ni cấy có thể bao phủ toàn bộ số liệu về chủng loại vi khuẩn phân
lập được, do vậy bức tranh về quần xã vi sinh vật trong các hệ sinh thái suối nước
nóng trở lên phong phú và đa dạng hơn. Trong các nghiên cứu trước đây, hầu hết các
vi khuẩn phân lập được từ suối nước nóng Ma'in và Afra ở Jordanian thuộc chi
Bacillus, Geobacillus và Anoxybacillus (Malkawi và Al-Omari, 2010; Al-Batayneh
và cs., 2011), tuy nhiên sử dụng kỹ thuật Metagenomics cho thấy vi sinh vật trong
hai suối nước nóng này đa dạng hơn rất nhiều với sự có mặt của các lồi thuộc ngành
Proteobacteria,

Bacteroidetes,

Firmicutes,

Deinococcus,

Verrucomicrobia,

Planctomycetes và Chloroflexi (Hussein và cs., 2017).
Sự phân bố và thành phần vi sinh vật trong mỗi suối nước nóng mang các đặc
trưng riêng biệt, thường bị tác động bởi các yếu tố như nhiệt độ, thành phần hóa học
và pH của suối nước nóng (López-López và cs., 2013). Nhiệt độ được coi là yếu tố

chính ảnh hưởng đến số lượng và thành phần của quần xã vi sinh vật ở các vị trí khác
nhau trong suối nước nóng. Nhiệt độ trong suối nước nóng giới hạn sự sống sót của
các sinh vật nhân thật (nhiệt độ giới hạn của chúng thường < 60ºC) và các sinh vật
quang hợp (70°C). Ví dụ quần thể vi sinh vật ở suối nước nóng ven biển Iceland chịu
tác động mạnh mẽ của sự thay đổi nhiệt độ và độ mặn do ảnh hưởng của thủy triều
cao định kỳ. Nhóm vi khuẩn siêu ưa nhiệt chiếm ưu thế tại các vị trí có thời gian nóng


5
kéo dài nhất, trong khi nhóm vi sinh vật ưa nhiệt vừa phải, các vi sinh vật biển, các
Proteobacteria ưa ấm được tìm thấy ở các khu vực có thời gian nóng ngắn nhất (Hobel
và cs., 2005). Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phân bố vi sinh vật dọc theo dịng chảy
của suối nước nóng Octopus (suối nước nóng kiềm với pH=8,5, có nồng độ sulfide
thấp) nằm trong cơng viên quốc gia Yellowstone cũng được nghiên cứu. Ở vị trí cách
miệng giếng phun 2 m có nhiệt độ khoảng 88°C chỉ tìm thấy các lồi vi khuẩn thuộc
chi Aquifex - tế bào có màu tím hồng, hóa tự dưỡng vơ cơ. Dọc theo dịng chảy, càng
ra xa miệng giếng phun, nhiệt độ càng giảm. Ở nhiệt độ khoảng 45-72oC, các loài vi
khuẩn lam Cyanobacteria phát triển tạo thành các đám trên mặt nước. Trong số các
chi vi khuẩn lam, Synechococcus có khả năng chịu nhiệt cao nhất (~ 72oC) tạo thành
quần thể bên trên che phủ cho tầng dưới là quần thể của chi Chloroflexus - một loại
vi khuẩn lam màu xanh lá cây, quang hợp khơng thải khí oxy. Ngoài ra, các chi vi
khuẩn lam khác như Phormidium và Calothrix cũng được tìm thấy trong dịng chảy
của suối nước nóng Octopus ở các vị trí có nhiệt độ thấp hơn (Rothschild và
Mancinelli, 2001). Ngoài yếu tố nhiệt độ, cấu trúc các quần xã vi sinh vật suối nước
nóng có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác như đặc điểm địa hóa, hoặc sự kết hợp
giữa hai yếu tố nhiệt độ và pH. Ngoài các yếu tố nhiệt độ, thành phần hóa học, pH,
quần xã vi sinh vật trong suối nước nóng cịn có thể chịu sự tác động của khoảng cách
địa lý. Một số loài vi sinh vật có thể có mặt ở tất cả các suối nước nóng. Tuy nhiên,
bên cạnh đó cũng có những loài được cho là đặc hữu của một khu vực suối nước
nóng. Vai trị của khoảng cách địa lý cịn gây tranh cãi, nhưng có thể là một yếu tố

quan trọng ảnh hưởng đến quần thể xạ khuẩn và vi khuẩn lam theo một số nghiên cứu
nhưng không đại diện cho các quần thể vi sinh vật khác (Valverde và cs., 2012;
López-López và cs., 2013).
Mỗi suối nước nóng thường đặc trưng bởi một vài nhóm vi sinh vật chiếm ưu
thế. Các nghiên cứu từ trước cho đến nay đều thấy Proteobacteria là ngành chiếm ưu
thế trong các suối nước nóng ở Châu Phi (Tekere và cs., 2011), trong khi đó nhóm cổ
khuẩn thuộc bộ Thermoplasmatales (chiếm 39%) thuộc ngành Euryarchaeota, và một
nhóm cổ khuẩn khác (chiếm 33%) thuộc ngành Crenarchaeota lại là các nhóm ưu thế
trong hệ sinh thái nước ngầm ở những vùng địa nhiệt ở Nga. Cả hai ngành này đều là


6
những ngành có mặt trong các suối nước nóng trên tồn thế giới. Tuy nhiên, nhóm vi
khuẩn chiếm ưu thế trong hệ sinh thái này chủ yếu lại là vi khuẩn chuyển hóa
methane, ưa axit, ưa nhiệt và vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh. Đây là các vi khuẩn có thể
sử dụng các hợp chất vơ cơ có nguồn gốc từ núi lửa để sinh trưởng (Mardanov và cs.,
2011). Phân tích các đặc điểm phân loại của quần xã vi sinh vật trong suối nước nóng
có tính axit ở Colombia cho thấy chỉ một tỷ lệ nhỏ các trình tự nucleotide trong DNA
metagenome có thể được phân loại đến lồi dựa vào các cơ sở dữ liệu hiện có, hầu
hết vi sinh vật trong suối nước nóng là các lồi mới, chưa được phân lập và phân loại.
Những vi sinh vật được phân loại có tiềm năng tham gia vào các chu trình chuyển
hóa nitơ và lưu huỳnh trong mơi trường (Jimenez và cs., 2012). Nghiên cứu suối nước
nóng Sungai Klah (SK) là suối nước nóng kiềm (pH 7,0 - 9,0), có nhiệt độ cao thứ
hai ở Malaysia (50 - 110°C) cho thấy ngành Proteobacteria và Firmicutes là hai ngành
chiếm ưu thế (Chan và cs., 2015). Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu
về vi sinh vật ở suối nước nóng Kenya - suối nước nóng kiềm (pH 9,2 - 9,8), nhiệt độ
45,1 - 83,6ºC (Kambura và cs., 2016). Ngược lại, ngành Proteobacteria và Thermi
chiếm ưu thế ở suối nước nóng axit nhẹ (pH 5 - 7), có nhiệt độ 45 - 90ºC (Paul và cs.,
2016). Điều đó chứng tỏ, mức độ đa dạng và phân bố của vi sinh vật trong suối nước
nóng cũng bị ảnh hưởng rất nhiều bởi pH hệ sinh thái.

1.2.

Cellulase

1.2.1.

Phân loại

Dựa vào cơ chế hoạt động của các domain xúc tác và tính đặc hiệu cơ chất,
cellulase được chia thành 3 dạng chính: β-1,4-endoglucanase (EC 3.2.1.4),
exoglucanase [cellobiohydrolase phân giải cơ chất từ đầu không khử (EC 3.2.1.91),
cellobiohydrolase phân giải cơ chất từ đầu khử (EC 3.2.1.176) và cellodextrinase (EC
3.2.1.74)] và β-glucosidase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase phân cắt ngẫu nhiên các
liên kết glycoside nội mạch của chuỗi cellulose, giải phóng ra các oligosaccharide có
chiều dài khác nhau (như cellobiose và cellotriose). Cellobiohydrolase hoạt động
phân cắt trên các đầu khử và không khử của cellulose, giải phóng cellobiose là chủ
yếu, ngồi ra cịn giải phóng ra các oligosaccharide mạch ngắn khác. Cellodextrinase
hoạt động trên các cellooligosaccharide hịa tan và nó cũng giải phóng ra cellobiose.


7
Cuối cùng, β-glucosidases thủy phân cellodextrin và cellobiose để tạo thành glucose,
kích hoạt cả endoglucanase và exoglucanase bằng cách làm giảm sự ức chế của sản
phẩm cuối cùng (Hình 1.1).

Hình 1.1. Nguyên tắc hoạt động của cellulase thủy phân cellulose.
Chú thích: Cellulose tinh thể (màu đỏ), cellulose vơ định hình (màu đen).

(Nguồn: Juturu và Wu (2014)).
Do polysaccharide rất đa dạng trong tự nhiên và thực tế cho thấy không phải lúc

nào cũng dễ dàng phân loại cellulase thành endo- hoặc exoglucanase (Poidevin và
cs., 2013) nên dựa trên mức độ tương đồng về trình tự axit amin và cấu trúc tinh thể,
cellulase được xếp vào họ enzyme thủy phân glycoside (glycoside hydrolase - GH).
Cách phân loại này không chỉ phản ánh mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng, cơ
chế nhận biết cơ chất và phản ứng enzyme mà nó cịn phản ánh mối quan hệ tiến hóa
giữa các enzyme. Các enzyme thuộc các họ GH khác nhau được tập hợp trong cơ sở
dữ liệu enzyme có hoạt tính carbohydrate (Carbohydrate-Active Enzymes Database)
(). Số lượng các enzyme mới liên tục được cập nhật ở cơ sở dữ
liệu này, trung bình mỗi năm có thêm khoảng 5 họ GH mới (Helbert và cs., 2019).
Tính đến thời điểm tháng 9 năm 2019 số lượng họ GH trong cơ sở dữ liệu CAZy là
165 họ GH, trong đó endoglucanase chủ yếu hiện diện ở 15 họ GH, bao gồm GH510, GH12, GH26, GH44, GH45, GH48, GH51, GH74, GH124 và GH148;


8
cellobiohydrolase hoạt động trên các đầu không khử hiện diện ở 3 họ GH5, GH6 và
GH9; cellobiohydrolase hoạt động trên các đầu khử hiện diện ở 3 họ GH7, GH9 và
GH48; cellodextrinase hiện diện ở 4 họ GH1, GH3, GH5 và GH9; và cuối cùng, βglucosidase hiện diện ở 9 họ GH1-3, GH5, GH9, GH16, GH30, GH39 và GH116
().
Bảng 1.1. Phân bố của cellulase vào các họ GH khác nhau.
Họ
GH

Loại Enzyme

Cơ
chế

Nhóm
lớn
(Clan)

Cấu trúc
3D

Nucleophile/
Bazơ xúc tác

Chất cho
proton xúc tác

1

β-Glucosidase; exo-β1,4-glucanase

Giữ lại

GH-A

(β/α)8

Glu

Glu

3

β-Glucosidase; glucan1,4-β-glucosidase

Giữ lại

-

-

Asp

Glu

5

Endo-β-1,4-Glucanase;
β-Glucosidase;
exo-β-1,4-glucanase;
β-1,4-cellobiosidase

Giữ lại

GH-A

(β/α)8

Glu

Glu

6

Endo-β-1,4-Glucanase;
cellobiohydrolase

Đảo
ngược

-

-

Asp

Asp

7

Endo-β-1,4-Glucanase

Giữ lại

-

β-jelly roll

Glu

Glu

8

Endo-β-1,4-Glucanase

Đảo

ngược

GH-M

(α/α)6

Asp

Glu

9

Endo-β-1,4-Glucanase;
β-Glucosidase;
exo-β-1,4-glucanase;
cellobiohydrolase

Đảo
ngược

-

(α/α)6

Asp

Glu

12

Endo-β-1,4-Glucanase

Giữ lại

GH-C

β-jelly roll

Glu

Glu

30

β-Glucosidase

Giữ lại

GH-A

(β/α)8

Glu

Glu

44

Endo-β-1,4-Glucanase

Giữ lại

-

(β/α)8

Glu

Glu

45

Endo-β-1,4-Glucanase

Đảo
ngược

-

-

Asp

Asp

48

Endo-β-1,4-Glucanase

Đảo

ngược

GH-M

(α/α)6

-

Glu

51

Endo-β-1,4-Glucanase

Giữ lại

GH-A

(β/α)8

Glu

Glu

74

Endo-β-1,4-Glucanase

Đảo
ngược

-

Seven fold
β-propeller

Asp

Asp

116

β-Glucosidase

Giữ lại

-

Glu

Glu

124

Endo-β-1,4-Glucanase

Đảo
ngược

-

-

-

-

(Nguồn: Sharma và Yazdani (2016)).


9
Mặc dù được phân loại vào cùng một họ GH nhưng các enzyme riêng biệt vẫn
có thể khác nhau về tính đặc hiệu cơ chất và nguồn gốc tiến hóa như trong trường
hợp họ GH5 bao gồm cả cellulase, xylanase và mannase. Điều này cho thấy sự tiến
hóa từ tâm hoạt động của enzyme để có thể phù hợp với các cơ chất khác nhau. Mặt
khác, do sự tiến hóa tập trung của các kiểu cuộn gấp khác nhau trong tâm hoạt
động mà các enzyme thuộc các họ GH khác nhau vẫn có thể thủy phân cùng một
cơ chất (Duan và Feng, 2010; Lopez-Mondejar và cs., 2016; Tiwari và cs., 2018).
Nghiên cứu cơ sở dữ liệu CAZy cũng cho thấy một số họ như họ GH1 và GH5 là
họ cellulase của vi khuẩn, nấm mốc và cổ khuẩn; họ GH30 và GH48 là họ enzyme thủy
phân của nấm mốc; họ GH8 và GH44 là họ enzyme thủy phân của vi khuẩn (Bảng 1.1).
Mặt khác, một chủng vi sinh vật có thể sinh tổng hợp nhiều loại cellulase thuộc một
số họ với các kiểu cuộn gấp và cơ chế xúc tác khác nhau. Do đó, có thể khẳng định
rằng cellulase là một nhóm phức hợp các enzyme dường như đã phát triển từ cùng
một kiểu cuộn gấp cơ bản. Sự đa dạng phổ biến trong các họ cellulase phản ánh tính
khơng đồng nhất của cơ chất, bao gồm cellulose và các polysaccharide liên quan cấu
thành sinh khối thực vật và cũng là đa dạng nơi sống của vi sinh vật – nơi mà quá
trình thủy phân diễn ra (Sharma và Yazdani, 2016).
1.2.2.

Đặc điểm hóa sinh

1.2.2.1. Cấu trúc
Cellulase có cấu trúc gồm các module xúc tác và module không xúc tác. Các
module xúc tác của cellulase được phân loại thành nhiều họ dựa vào trình tự axit amin
và cấu trúc tinh thể của chúng. Các module liên kết carbohydrate - không xúc tác
(CBM) và/ hoặc các module đã biết hoặc chưa biết chức năng khác có thể nằm ở đầu
N hoặc đầu C của module xúc tác. Cellulase của nấm và vi khuẩn thường có hai hoặc
nhiều domain cấu trúc và chức năng.
Dựa vào thành phần enzyme có thể chia cellulase này thành hai loại cấu trúc:
(i) không tạo thành phức hợp hoặc (ii) tạo thành phức hợp đa enzyme (cellulosome).
Dạng cellulase không tạo thành phức hợp thường được sinh tổng hợp bởi vi sinh vật hiếu
khí phân giải cellulose, có cấu tạo gồm một vùng xúc tác (Catalytic domain – CD) gắn kết


10
với vùng liên kết cellulose (cellulose-binding domain – CBD) qua cầu nối peptide linh
hoạt (Hình 1.2). Ngược lại, hầu hết các vi sinh vật kỵ khí tạo ra một phức hợp cellulase
đa enzyme gọi là cellulosome. Cellulosome là một thể thống nhất, cấu tạo gồm có
vùng xúc tác (CD) gắn kết với vùng dockerin. Phức hợp cellulosome gồm nhiều
protein gắn lên trên bề mặt màng tế bào để thực hiện chức năng giống như các
cellulase dạng không tạo thành phức hợp (Hình 1.3). Ngồi hai domain chính, trong
cấu trúc cellulosome cịn có một số domain khác như domain tương đồng lớp bề mặt
(Surface layer homology (SLH) domain), domain 111 dạng fibronectin, domain giống
NodB và các vùng chưa biết chức năng khác. Các domain này thường liên kết với nhau
qua chuỗi liên kết giàu axit amin Pro, Thr và Ser. Trong số tất cả các domain này, CD và
CBD là hai domain quan trọng nhất bởi vì chúng là thành viên chính tham gia vào cơ chế
thủy phân của enzyme (Jayasekara và Ratnayake, 2019).
Trong enzyme, tâm hoạt động thường nằm ở vùng xúc tác CD và có cấu trúc
thuộc một trong ba dạng: dạng túi (pocket), dạng đường hầm (tunnel) và dạng

khe/rãnh (cleft) (Hình 1.4). Hầu hết endoglucanase có tâm hoạt động dạng khe/rãnh,
exoglucanase có tâm hoạt động dạng đường hầm, cịn β-glucosidase có tâm hoạt động
dạng túi (Davies và Henrissat, 1995).

Hình 1.2. Cấu trúc 3D của endoglucanase thuộc họ GH7 thu nhận từ nấm
Trichoderma reesei.
Chú thích: Enzyme có mang vùng CBM (xanh nhạt) được nối với vùng xúc tác lớn bởi cầu
nối linh hoạt (màu vàng); chuỗi cellulose (màu xanh lá cây).

(Nguồn: Sanchez Hernandez (2019)).


11

Hình 1.3. Cấu trúc cellulosome của A. cellulolyticus.
Chú thích: Cellulosome A bao gồm ScaA, ScaB và ScaC, liên kết với nhau thông qua các
tương tác cohesin-dockerin đặc biệt. ScaA chứa một cohesin dạng I cho phép enzym chứa
bảy dockerin gắn vào cellulosome. ScaA cũng chứa module liên kết với cellulose (CBM) và
module xúc tác thuộc họ GH9. ScaB hoạt động như một cầu nối giữa ScaA và ScaC, đồng
thời ScaB cho phép bốn protein ScaA liên kết với cohesin dạng II của nó. Mặt khác scaffoldin
dạng I, ScaC, có thể liên kết một cách chọn lọc với ba protein ScaB và gắn tồn bộ
cellulosome lên bề mặt tế bào thơng qua các vùng tương đồng trên lớp bề mặt (SLH) của nó.
Cellulosome B chứa hai scaffoldin, ScaA và ScaD. ScaD cũng cố định cellulosome vào bề
mặt tế bào thông qua các vùng tương đồng trên lớp bề mặt và có thể liên kết hai protein ScaA
bằng hai cohesin dạng II của nó. ScaD cũng có thể liên kết với enzyme chứa dockerin dạng
I thơng qua cohesin dạng I của nó.

(Nguồn: Hamberg và cs. (2014)).

Hình 1.4. Ba dạng tâm hoạt động của các họ GH.

Chú thích: a) Dạng túi; b) dạng khe/rãnh; c) dạng đường hầm. Axit amin xúc tác có màu đỏ.

(Nguồn: Davies và Henrissat (1995)).


12
1.2.2.2. Cơ chế xúc tác
Cellulase xúc tác cho quá trình phân hủy mạch polysaccharide của cellulose
bằng cách phá vỡ các liên kết β-1,4-glycoside. Ba loại enzyme chính tham gia vào
quá trình thủy phân các vi sợi cellulose trong thành tế bào thực vật gồm:
endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Quá trình thủy phân hồn tồn
cellulose hình thành nên một loạt các chất trung gian dưới sự xúc tác đồng thời của
cả ba loại enzyme chính này. Endoglucanase thường tấn cơng vào các vùng vơ định
hình của cellulose. Enzyme này thuỷ phân các liên kết lỏng lẻo nội phân tử ở vùng
vô định hình của cellulose để tạo ra các chuỗi mới. Những chuỗi mới này sau đó dễ
dàng bị tấn cơng bởi các loại enzyme khác. Hoạt tính enzyme cao nhất thường đạt
được trên cơ chất cellulose dạng hòa tan hoặc cellulose vơ định hình đã được xử lý
bằng axit. Exoglucanase có chức năng thủy phân đầu khử và không khử của cellulose
để tạo ra glucose hoặc cellobiose. Exoglucanase khác với endoglucanase ở chỗ có
khả năng thủy phân cơ chất cellulose tinh thể như avicel hoặc cellooligosaccharide.
Cuối cùng, β-glucosidase có thể thủy phân cellobiose thành glucose từ các đầu không
khử và β-glucosidase bị bất hoạt khi phản ứng với cellulose vô định hình hoặc
cellulose tinh thể. Mặc dù cơ chế chính xác vẫn chưa được hoàn thiện, tuy nhiên đã
quan sát thấy sự phân mảnh của cellulose thành các sợi ngắn trước khi phát hiện thấy
đường khử trong quá trình thủy phân (Jayasekara và Ratnayake, 2019).
Cellulase có hai cơ chế xúc tác: giữ lại và đảo ngược. Cellulase cắt các liên kết
glucoside bằng cách sử dụng nhóm xúc tác axit – bazơ. Q trình thủy phân được
thực hiện bởi hai nhóm xúc tác của enzyme, trong đó một nhóm là axit (đóng vai trị
là chất cho proton) và một nhóm là nucleophile/bazơ. Cơ chế xúc tác xảy ra phụ thuộc
vào vị trí khơng gian của nhóm xúc tác. Duy trì và đảo ngược cấu hình dị thường của

cellulase là hai cơ chế thủy phân cellulose. Trong cơ chế đảo ngược, cấu hình C dị
thường của cellulase đã bị đảo ngược sau khi thủy phân dịch chuyển nucleophilic đơn
(Hình 1.5A). Cịn trong cơ chế giữ lại, cellulase giữ nguyên cấu hình C dị thường
mang liên kết glucoside đích ngay cả khi đã có sự dịch chuyển kép của hai axit amin
glycosyl hóa hoặc khử glycosyl hóa chìa khóa trong q trình thủy phân (Hình 1.5B)
(Vocadlo và Davies, 2008).


13

Hình 1.5. Hai cơ chế xúc tác của GHsa.
Chú thích: (A) Cơ chế đảo ngược; (B) Cơ chế giữ lại.

(Nguồn: Payne và cs. (2015)).
1.2.2.3. Cơ chế gắn kết và tính đặc hiệu cơ chất
Cơ chế gắn kết và tính đặc hiệu cơ chất là một trong những đặc tính hóa sinh
của enzyme. Ngồi cellulose, cellulase cịn có thể thủy phân xylan, lichenan và
mannan. Cellulase Cel5E của Pseudomonas fluorescens có khả năng thủy phân CMC,
lichenan, avicel và cellulose trương nở bởi axit nhưng lại bị bất hoạt hoàn toàn trên
cơ chất xylan (Hall và cs., 1995). Trong khi cũng thuộc họ GH5, cellulase CelG của
Fibrobacter succinogenes S85 lại có khả năng thủy phân hoàn toàn CMC và xylan
nhưng lại bị bất hoạt hoàn toàn trên cơ chất avicel và lichenan (Iyo và Forsberg,
1996). Ngược lại, một số cellulase chỉ hoạt động trên các dẫn xuất của cellulose.
Chẳng hạn, cellulase cel5B thuộc họ GH5 sinh tổng hợp bởi Thermobifida fusca, chỉ
có thể thủy phân các cơ chất chứa cellulose như CMC, avicel và MN300 (sợi cellulose
tự nhiên) nhưng lại bị bất hoạt hoàn toàn trên các cơ chất khác (Posta và cs., 2004).
Do đó, CMC được sử dụng như là cơ chất đặc hiệu chung để phát hiện cellulase. Tuy


14

nhiên, các cơ chế gắn kết và tính đặc hiệu cơ chất của cellulase trên các cơ chất khác
ngoài CMC cịn rất ít thơng tin (Sukharnikov và cs., 2011).
1.2.2.4. Các chất ức chế và cofactors
 Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính cellulase
Các ion kim loại có thể liên kết với protein và cũng có thể tạo thành phức chất
với các phân tử khác khi liên kết với enzyme. Các ion này đóng vai trị là chất cho
hoặc nhận điện tử hoặc chất điều chỉnh cấu trúc. Các ion kim loại có thể làm tăng
hoặc ức chế hoạt tính enzyme bằng cách tương tác với các nhóm amine hoặc nhóm
axit carboxylic của các axit amin. Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính của
enzyme thủy phân lignocellulose nói chung và của cellulase nói riêng đã được Pereira
và cs. (2017) đề cập. Ngồi ra, hoạt tính cellulase của vi sinh vật ở suối nước nóng
cũng bị ảnh hưởng bởi một số ion kim loại như trong tóm tắt ở Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính cellulase của vi sinh vật
ở suối nước nóng.
Enzyme

Nguồn gốc

Kim loại làm tăng hoạt

Kim loại làm

tính enzyme

mất hoạt tính

TLTK

enzyme
Ca2+, K+

Endoglucanase Bacillus licheniformis

Cu2+, Zn2+

KBFB3

cs. (2018)
Ca2+, Mn2+, Mg2+

Endoglucanase

K+, Zn2+, Li+,
Na+,

Endoglucanase

Bacillus sp. PW1
và Bacillus sp.

Bacillus

Cu2+

,

Fe3+

Ca2+, Ni2+, Co2+, Cu2+ ,
Fe2+,

Zn2+,

PW2
CMCase

Thankappan và

và

Mg2+

,

Zarafeta và cs.
(2016)
Sharma và cs.

Mn2+

(2019)

Hg2+

Mg2+và Cu2+

sonorensis HSC7

K+, Zn2+, Co2+,

Azadian và cs.

Mn2+,

(2017)

Fe2+,Ca2+, Hg2+
β-Glucosidase

DNA metagenome

Ở nồng độ 1mM gồm:
Al3+, Ca2+, Co2+, Cr3+,
Fe2+,

Fe3+,

K+,

Mg2+,

Rb+; ở nồng độ 5mM
gồm: Mg2+, Rb+

Mn2+, Ni2+, Sr2+ Schroder và cs.
(2014)


15
Các ion kim loại hóa trị I, II và III như Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Co2+,

Cu2+, Ni2+, Zn2+, Hg2+ và Fe3+ thường được nghiên cứu trong quá trình phân tích đặc
tính của cellulase. Bên cạnh đặc điểm về điện tích, kích thước bán kính ion cũng có
ảnh hưởng lớn đến hoạt tính và độ bền của enzyme. Một số nghiên cứu đã cho thấy
những ion có bán kính lớn hơn ít ảnh hưởng đến các axit amin xúc tác, trong khi
những ion có bán kính nhỏ hơn có thể hấp dẫn các axit amin tích điện mạnh hơn
làm thay đổi cấu trúc tổng thể của enzyme bằng việc phá hủy vị trí xúc tác (Zeng và
cs., 2014).
Tác dụng ức chế của Fe2+ và Cu2+ lên hoạt tính cellulase cũng đã được nghiên
cứu. Tuy nhiên, ảnh hưởng của các ion khác nhau có hóa trị II lên hoạt tính của
cellulase được sinh tổng hợp bởi các vi sinh vật khác nhau là khác nhau (Bảng 1.2).
Tác dụng của các ion hóa trị II lên cellulase khơng tn theo quy luật rõ ràng và mức
độ ảnh hưởng khác nhau có thể do tác dụng của q trình oxy hóa khử lên các axit
amin, làm tăng hoặc giảm hoạt tính của enzyme (Tejirian và Xu, 2010).
Ion Hg2+ ức chế cellulase do tương tác với các gốc axit amin xúc tác có chứa
lưu huỳnh dẫn đến q trình oxy hóa và hình thành các liên kết disulfide bất thường
(Tejirian và Xu, 2010). Ion Fe2+ có thể tạo phức với D/L-Lys và L-Met (Vassilev và
cs., 2013), Cu2+ tạo phức với His và Ba2+ tạo phức với Arg, Glu, Pro, Ser và Val (Bush
và cs., 2008).
Sajadi (2010) đã đánh giá sự tương tác của các axit amin như Asp và Glu với
các ion kim loại và thiết lập thứ tự mức độ tương tác như sau: Ca2+ < Mg2+ < Mn2+ <
Zn2+ < Co2+ < Cu2+ (đối với aspartate); Ca2+ < Mg2+ < Mn2+ < Co2+ < Zn2+ < Cu2+ (đối
với glutamine).
 Ảnh hưởng của các tác nhân hóa học và các hợp chất hữu cơ lên hoạt tính
cellulase
Hoạt tính của cellulase có thể bị ảnh hưởng bởi các loại dược phẩm (ví dụ 2,3dichloride-1,4-nafthoquinone), thuốc diệt nấm (như phenylmercury acetate và
ethylen-bis-dithiocarbamate), các chất kháng sinh và chất khử trùng (như
Phenylmercury nitrate, 8-hydroxiquinoline và một số loại khác), đường (ức chế sản
phẩm cuối cùng), protein (các chất được tiết ra từ thực vật như cơ chế bảo vệ), các
hợp chất hữu cơ gắn với CBM, các sản phẩm từ phân hủy đường và lignin (như hợp

16
chất phenol), phụ gia thực phẩm (như Octyl gallate), hormone thực vật (auxin,
chẳng hạn như axit indoleacetic) và ion của chất rắn (Sodium azide – NaN3) (Pereira
và cs., 2017).
Các sản phẩm của quá trình thủy phân cellulose như cello-oligosaccharide và
cellobiose có thể ức chế hoạt tính tương ứng của endo- và exoglucanase. Q trình
endoglucanase thủy phân xyloglucan và xylan có thể bị ức chế bởi chính sản phẩm
xylooligomer được giải phóng ra của phản ứng. Bổ sung xylanase vào mơi trường
phản ứng là một cách thay thế để loại bỏ xylooligomer. β-Glucosidase bị ức chế bởi
glucose. Còn exoglucanase bị ức chế bởi các disaccharide (như cellobiose và
xylobiose) và monosaccharide (như mannose và galactose) (Pereira và cs., 2017).
Beta-glucosidase có thể bị ức chế bởi gluconolactone - sản phẩm của quá trình
oxy hóa cellulose bởi lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO). Cellobiose và
các cơ chất khác của β-glucosidase cạnh tranh với gluconolactone và các sản phẩm
phân hủy bởi LPMO khác. Mặt khác, β-glucosidase có thể được kích hoạt bởi
soforose và lactose (Dhillon và cs., 2012; Pereira và cs., 2017).
Các loại đường được giải phóng ra khi thủy phân lignocellulose bằng enzyme
có thể bị phân hủy và chuyển hóa thành các hợp chất ức chế enzyme. Trong điều kiện
axit, glucose, mannose và galactose có thể được chuyển hóa thành các furan aldehyde
như hydroxymethylfurfurals (HMF). Ngược lại, HMF có thể được chuyển hóa thành
axit levulinic và axit formic (Jönsson và cs., 2013).
Tiền xử lý lignocellulose bằng kiềm hoặc axit, hoặc bằng các cách khác trong quá
trình thủy phân lignin bằng enzyme (có sự tham gia của laccase) có thể giải phóng các hợp
chất phenol như vanillin, syringaldehyde, axit trans-cinnamic và axit hydroxybenzoic. Các
hợp chất này là chất ức chế hoạt tính endo/exoglucanase và β-glucosidase do sự hiện diện
của các nhóm hydroxyl, carbonyl và methoxyl (Qin và cs., 2016).
Như đã đề cập ở trên, cellulase còn bị ức chế bởi một nhóm các chất có nguồn
gốc protein. Các protein ức chế xyloglucan endo-β-glucanase đặc hiệu (XEGIPs) có
mặt trong thành tế bào của một số loại rau như cà chua, thuốc lá và lúa mì. Đồng thời

các chất ức chế này cũng ức chế endoglucanase thủy phân xyloglucan. Những protein