luận văn thạc sĩ sinh học :Tách phòng và xác định trình tự Nucleotit

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
--------------






Nguyễn Ngọc Sơn






TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT
MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG
LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM









LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
-----  -----




NGUYỄN NGỌC SƠN




TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT
MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT
VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC



NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. Nguyễn Trung Nam
Viện Công nghệ sinh học (IBT)






Thái Nguyên - 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1



LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố.

Tác giả


Nguyễn Ngọc Sơn














Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2



LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Trung Nam (Viện Công
nghệ Sinh học) đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành

công trình nghiên cứu này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS. TS Lê Trần Bình, TS.
Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Hữu Cường, KS. Hoàng Thị Thu Hằng và tập thể cán
bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình giúp
đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm đồng thời hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực
nghiệm và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. Nguyễn Như Cường (Viện Bảo
vệ Thực vật) chủ nhiệm đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu đặc tính sinh học của
virut gây bệnh và môi giới truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, các biện pháp quản
lý tổng hợp cây trồng (ICM) trong sản xuất lúa” đã cung cấp mẫu bệnh và cộng
tác trong quá trình tôi thực hiện công trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học sư phạm – Đại học
Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN,
các thày cô giáo, và cán bộ trong Khoa đã truyền đạt kiến thức cũng như tạo điều
kiện cho tôi được thực hiện khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện, động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tác giả luận văn


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ 2
MỤC LỤC .............................................................................................................. 3
DANH MỤC T
Ừ

VIẾ
T T
Ắ
T ................................................................................. 5
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... 7
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 9
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 11
1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .. 11
1.1.1. Thế giới ............................................................................................... 11
1.1.2. Việt Nam ............................................................................................. 12
1.2. TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL ...................................... 13
1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA ..... 14
1.3.1. Virut vàng lùn lúa (RGSV) ............................................................... 14
1.3.2. Các loại virut khác ............................................................................. 16
1.3.2.1. Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV)....................................................... 16
1.3.2.2. Virut tungro hình cầu (RTSV) ..................................................... 17
1.3.2.3. Virut tungro hình nhộng (RTBV) ................................................ 18
1.4. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RẦY NÂU – MÔI GIỚI CHỦ YẾU
TRUYỀN BỆNH VL&LXL .............................................................................. 19
1.4.1. Đặc điểm hình thái ............................................................................ 19
1.4.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và gây hại ............................................ 19
1.5. PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL ................................................................. 20
1.6. MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG
NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUT .......................................................................... 21
1.6.1. Một số enzym sử dụng trong sinh học phân tử ................................. 21
1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR .............................................................................. 22
1.6.3. Kỹ thuật PCR ..................................................................................... 23
1.6.4. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli ................................................ 24
1.6.5. Kỹ thuật tách dòng gen ...................................................................... 24

1.6.6. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) ...................... 25
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 26
2.1. VẬT LIỆU .................................................................................................. 26
2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM .......................................................... 27
2.2.1. Hóa chất .............................................................................................. 27

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
2.2.2. Thiết bị ................................................................................................ 27
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 27
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 27
2.3.1. Thu mẫu thí nghiệm ........................................................................... 27
2.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu ......................................................................... 28
2.3.3. Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa ............................................ 28
2.3.4. Phản ứng RT-PCR ............................................................................. 29
2.3.5. Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) ................. 29
2.3.6. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng
phƣơng pháp sốc nhiệt................................................................................. 30
2.3.7. Colony-PCR........................................................................................ 31
2.3.8. Tách chiết plasmit .............................................................................. 32
2.3.9. Cắt gen bằng enzym giới hạn............................................................. 32
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 34
3.1. THIẾT KẾ MỒI.......................................................................................... 34
3.2. TÁCH DÕNG CÁC ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV ................... 34
3.2.1. RT-PCR .............................................................................................. 34
3.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α ............. 37
3.2.3. Chọn lọc plasmit tái tổ hợp bằng colony-PCR .................................. 37
3.2.4. Tách plasmit và cắt kiểm tra sự có mặt của gen ............................... 39
3.3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG
GENOME CỦA RGSV ..................................................................................... 40

3.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN
VÀ BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TƢƠNG ỨNG TRÊN GENBANK. 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................. 46
CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ ................................................. 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 48
PHỤ LỤC ............................................................................................................. 53

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5

DANH MỤC T
Ừ

VIẾ
T T
Ắ
T

µg microgram
µl microlitre
µm micrometer
bp base pair

cDNA Complementary DNA (DNA bổ sung đƣợc tổng hợp nhờ enzym phiên
mã ngƣợc từ RNA thông tin)
CS Cộng sự
CLRRI Cuulong Delta Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa đồng
bằng sông Cửu Long),
CP/
NCP

Coat protein/
Nucleocapsid Protein (Protein vỏ)
Đ/c Đối chứng
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
DEPC Diethyl pyroCarbonate
DNA Deoxyribonucleic acid
DPV Description of Plant Viruses (Miêu tả các virus thực vật),

EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid
ELISA Enzyme linked immunsorbent assay (kỹ thuật hấp thụ miễm dịch liên
kết với enzym)
g gram
ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses (Ủy ban quốc tế về
phân loại virus).
ICTVdB The Universal Virus Database of the International Committee on
Taxonomy of Viruses (Ngân hàng dữ liệu về virus của ICTV),

IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside

IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu Lúa quốc tế),


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
Kb Kilobase
LB Luria và Bertani
M Nồng độ mol/lit
ml mililitre
mm milimeter
NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia

về thông tin Công nghệ Sinh học),
ng Nanogram
nm Nanometer
PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
PEG Polyethylene glycon
RdRp RNA dependent RNA polymerase (Enzym nhân bản RNA và tạo ra
phân tử RNA)
RGSV Rice grassy stunt virus (Virut vàng lùn lúa)
RNA Ribonucleic acid
RNase Ribonuclease
RRSV Rice ragged stunt virus (Virut lùn xoắn lá lúa)
RSV Rice stripe virus
RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên
mã ngƣợc)
RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virut tungro hình nhộng)
RTSV Rice tungro spherical virus (Virut tungro hình cầu)
RWSV Rice wilted stunt virus (Virut héo lùn lúa)

TAE Tris - Acetate – EDTA
Taq Thermus aquaticus
v/p vòng/phút
vcRNA viral complementary RNA (đoạn RNA bổ sung của virus)
VL&LXL Vàng lùn, lùn xoắn lá

vRNA viral RNA (đoạn RNA của virus)
X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7

DANH MỤC CÁC BẢNG


Trang


DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi........................................
13
Hình 1.2. RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................................
15
Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV.........................................................
16
Hình 1.4. RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử.............................................
17
Hình 1.5. RTSV và RTBV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................
18
Hình 1.6. Các giai đoạn phát triển của rầy nâu.....................................................
19
Hình 2.1. Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL tại Nam Trung Bộ....
26
Hình 2.2. Sơ đồ vectơ pBT .................................................................................
30
Hình 3.1. Điện di sản phẩm RT-PCR phân đoạn 1 và 4 của RGSV từ mẫu của
tỉnh Bình Thuận bằng 2 cặp mồi RNA1-RGSV và RNA4-RGSV.......................
35
Hình 3.2. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV

36
Hình 3.3. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV
36
Bảng 3.1. Trình tự mồi sử dụng để nhân một số đoạn trong genome RGSV…
34
Bảng 3.2. Mã số đăng ký trên GenBank của các trình tự đã thu đƣợc...............
41
Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit của gen CP-
RGSV tại Bình Thuận, Ninh Thuận với các trình tự tƣơng ứng của các tỉnh
ĐBSCL và thế giới (GenBank).......................................................................... 42

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
Hình 3.4. Khuẩn lạc E.coli DH5α mang vectơ tái tổ hợp của các dòng CP của
RGSV tỉnh Bình Thuận trên môi trƣờng LB đặc.................................................
37
Hình 3.5. Điện di sản phẩm colony-PCR các dòng RGSV bằng cặp mồi pUC 18..
38
Hình 3.6. Điện di sản phẩm colony-PCR từ các dòng của phân đoạn 1 và 4
RGSV bằng cặp mồi pUC 18...............................................................................
38
Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt plasmit mang gen CP của RGSV bằng
BamHI..................................................................................................................
39
Hình 3.8: Điện di sản phẩm cắt plasmit mang phân đoạn 1 và 4 của RGSV tại
Bình Thuận bằng BamHI.....................................................................................
40
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên việc so sánh trình tự 02 gen
CP- RGSV Nam Trung Bộ (NT, BT) với các trình tự tƣơng ứng của ĐBSCL
và thế giới đã đƣợc đăng ký vào GenBank...........................................................

43


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9

MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài
Lúa gạo là nguồn lƣơng thực giàu chất dinh dƣỡng chủ yếu trên thế giới,
đứng thứ ba sau ngô và lúa mì về sản lƣợng, cung cấp trên 20% calo, 15% protein,
các chất khoáng và chất xơ cho con ngƣời. Năm 2009, Việt Nam dự kiến sẽ tiếp tục
đứng thứ hai thế giới về xuất khẩu gạo (khoảng 5,3 triệu tấn/năm) và tổng sản lƣợng
đạt khoảng 36 triệu tấn/năm [62]. Khoảng 52% diện tích lúa đƣợc trồng ở ĐBSCL.
Khi đánh giá về những thành tựu đạt đƣợc trong sự nghiệp đổi mới kinh tế ở Việt
Nam, các nhà kinh tế thế giới đều thống nhất nhận định: Thành công lớn nhất là
nông nghiệp và cây lúa vẫn luôn là cây lƣơng thực quan trọng bậc nhất của Việt
Nam.
Tuy nhiên, sản lƣợng lúa bị giảm sút nghiêm trọng bởi các bệnh virut do rầy
nâu (Nilaparvata lugens Stal) lây truyền, đặc biệt là bệnh VL&LXL xảy ra trong
thời gian gần đây. Bệnh này do sự tổ hợp từ một đến bốn loại virut gây ra, gồm
virut vàng lùn lúa (Rice Grassy Stunt Virus- RGSV), virut lùn xoắn lá lúa (Rice
Ragged Stunt Virus- RRSV), virut tungro hình cầu (Rice Tungro Spherical Virus-
RTSV) và virut tungro hình nhộng (Rice tungro bacilliform virus- RTBV) [8], [43],
[48], [59]. Trong một số trƣờng hợp, cây lúa bị nhiễm cùng một lúc 2 đến 4 loại
virut này. Trong đó, RGSV thƣờng chiếm tỷ lệ cao nhất. Từ năm 2006 đến nay dịch
bệnh lại phát triển rộng ở các tỉnh ĐBSCL với diện tích nhiễm rất lớn. Do ảnh
hƣởng của dịch bệnh này trên cây lúa, năm 2009 Việt Nam có nguy cơ tiếp tục bị
giảm sản lƣợng gạo xuống 1 triệu tấn so với năm 2008 [12].
Rất nhiều thành tựu đã đạt đƣợc trong nghiên cứu các biện pháp phòng

chống rầy nâu- môi giới chủ yếu truyền bệnh VL&LXL nhƣ: nghiên cứu đặc tính
sinh học, sinh thái học của rầy nâu, các biện pháp phòng trừ bằng thuốc hóa học,
sinh vật học, kỹ thuật canh tác, giống kháng... Tuy nhiên, hiệu quả của các phƣơng
pháp này vẫn chƣa cao.
Do dịch bệnh VL&LXL đang gây hại nặng nề về sản lƣợng lúa gạo cho các
tỉnh ĐBSCL [7] và có nguy cơ lây lan ra các khu vực lân cận, nên nhiệm vụ cấp
bách là phải kiểm tra sự có mặt của các chủng virus gây bệnh tại khu vực Nam
Trung Bộ, nơi có diện tích trồng lúa khá lớn và tiếp giáp với ĐBSCL. Đồng thời,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
10
đánh giá độ tƣơng đồng di truyền của các chủng virut gây bệnh, góp phần vào việc
đề ra những biện pháp đối phó kịp thời với dịch bệnh tại khu vực miền Trung.
Với những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Tách dòng và xác định
trình tự nucleotit một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV) tại
Việt Nam”.
2. Mục tiêu
Phân lập và so sánh trình tự nucleotit của một số đoạn trong genome của
virut vàng lùn lúa (RGSV).
3. Nội dung nghiên cứu
1> Tách dòng, xác định trình tự một số đoạn trong genome của chủng
RGSV.
2> So sánh các trình tự nucleotit của gen CP- RGSV thu đƣợc với các trình
tự tƣơng ứng trên GenBank để đánh giá độ tƣơng đồng về mặt di truyền giữa các
chủng virut.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
1.1.1. Thế giới
Từ thập kỷ 70 của thế kỷ XX trở lại đây, rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal)
đã nổi lên nhƣ một vấn đề thời sự trong nghề trồng lúa ở Châu Á. Nhiều trận dịch
rầy đã xảy ra trên quy mô rộng lớn chƣa từng thấy ở nhiều nƣớc nhƣ Ấn Độ,
Indonesia, Triều Tiên, Nhật Bản, Philippin, Đài Loan... gây tổn thất nặng nề về kinh
tế [17]. Rầy nâu phá hại làm giảm một phần năng suất, hoặc khi cháy rầy làm mất
trắng. Ngoài tác hại trực tiếp, rầy nâu còn là môi giới truyền bệnh virut nguy hiểm
cho cây lúa nhƣ bệnh VL&LXL, bệnh héo lùn cây lúa ở Trung Quốc và bệnh vàng
lá lúa ở vùng núi phía Bắc Việt Nam. Theo thống kê của Dyck và Thomas (1979)
thiệt hại do rầy nâu và bệnh vàng lụi ở Châu Á trong năm 1966 – 1975 lên tới hơn
300 triệu USD [22].
Năm 1966, RGSV lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Nam và Đông Nam châu Á
[43]. Năm 1977, dạng héo lùn do RWSV xuất hiện ở vụ mùa thứ hai ở Đài Loan,
biểu hiện cây lúa bệnh và hình thái, cấu tạo của RWSV tƣơng tự RGSV [20]. Năm
1974 – 1977, khoảng 1,2 triệu ha lúa ở Indonesia bị nhiễm rầy và virut, gây thiệt hại
03 triệu tấn thóc [40]. Năm 1992 – 1993 cả vụ mùa giống SP60 ở Thái Lan bị mất
do tác hại của rầy nâu [50].
Rầy nâu mang các loại virut gây bệnh trên cây lúa nhƣ RGSV và RRSV, nên
có nguy cơ gây “cháy rầy” làm giảm đáng kể năng suất cây trồng. Hai phƣơng pháp
truyền thống đƣợc sử dụng để bảo vệ cây lúa là phun thuốc trừ sâu và dùng giống
cây kháng rầy. Dùng thuốc trừ sâu hóa học đắt, độc hại và ô nhiễm môi trƣờng, do
đó biện pháp trồng cây lúa mang gen kháng rầy thông qua lai giống đƣợc nghiên
cứu và áp dụng rộng rãi. Tinjuangjun và CS (2000) đã chuyển gen gna thành công
vào hai giống gạo Thái Lan là Khao Dawk Mali 105 (KDML 105) và Supanburi 60
(SP60), 37% số lƣợng rầy giảm đi khi gna biểu hiện bằng promoter RSs1 và 42%
khi gna biểu hiện bằng promoter Ubi-1 [50]. Tuy nhiên, việc trồng lúa mang gen
kháng rầy đang gặp trở ngại do sự thay đổi đặc điểm thích nghi nhanh chóng của

rầy nâu. Tại các Hội nghị quốc tế về rầy nâu họp tại IRRI- Philippin (05/1977), Việt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
12
Nam (11/2001), Trung Quốc (11/2002) và Việt Nam (04/2006), rầy nâu đƣợc coi là
mối đe dọa thƣờng xuyên đối với sản xuất lúa ở Châu Á [41], [61].
1.1.2. Việt Nam
Bệnh VL&LXL trên lúa đƣợc ghi nhận sớm nhất tại Mỹ Tho và Long An
vào năm 1963. Tại miền Bắc, bệnh đƣợc ghi nhận trong những năm 1964, 1966 và
1970 trên giống Mộc Tuyền với diện tích khá lớn (khoảng 50.000 ha) [8]. Bệnh
cũng xuất hiện và gây thiệt hại 20.000 ha vụ Hè Thu 1990 tại vùng ven biển miền
Trung nhƣ Bình Định, Phú Yên và Khánh Hoà. Năm 1999 có 13.120 ha lúa bị
nhiễm ở các tỉnh Bến Tre, TPHCM, Bạc Liêu và Long An, riêng TPHCM có 242 ha
bị bệnh và không trổ bông đƣợc [9].
Đầu vụ Hè Thu 2006 dịch bệnh lại phát triển và lan rộng trên hầu hết các tỉnh
ĐBSCL, với mật số rầy nâu rất cao, diện tích bị nhiễm bệnh vàng lụi riêng tại Đồng
Tháp với thiệt hại dƣới 30% là 613 ha, và trên 30% là 2636 ha trong đó tiêu huỷ
khoảng 500 ha [54]. Cuối năm 2006, dịch bệnh VL&LXL đã đƣợc công bố ở
ĐBSCL và miền Đông Nam bộ. Bệnh VL&LXL lây lan trên lúa vụ Thu Đông và vụ
Đông Xuân ở các tỉnh vùng ĐBSCL, Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ và Tây
Nguyên. Theo báo cáo của các địa phƣơng, đến tháng 10 năm 2006, diện tích lúa vụ
Thu Đông 2006 và vụ Đông Xuân 2006- 2007 bị nhiễm rầy nâu của các tỉnh vùng
ĐBSCL và Đông Nam bộ là 33.323 ha, và diện tích nhiễm bệnh VL&LXL là
51.768 ha, trong đó có 26.283 ha nhiễm bệnh nặng cần phải tiêu huỷ [1]. Cũng
trong năm 2006, Rogelio Cabunagan (IRRI) cùng các chuyên gia Việt Nam đã đi
thực tế đồng lúa ở Trà Vinh, Long An, Bình Chánh (TPHCM), Bình Phƣớc, Đồng
Nai, Tiền Giang quan sát thấy cây lúa có dấu hiệu bị bệnh VL&LXL và xuất hiện
nhiều rầy nâu gây hiện tƣợng “cháy rầy”. Qua xét nghiệm bằng phƣơng pháp
ELISA dƣơng tính với kháng thể đặc hiệu của RGSV và RRSV đã khẳng định tỉ lệ
nhiễm RGSV, RRSV khá cao, đồng thời có sự xuất hiện của RTSV [56]. Năm

2008, dịch rầy nâu và các bệnh virut hại lúa tuy có giảm so với năm trƣớc nhƣng
vẫn đang ở mức nghiêm trọng. Lúa Hè Thu ở khu vực ĐBSCL, diện tích bị nhiễm
rầy nâu: 76.795 ha, trong đó có 4.298 ha bị nhiễm nặng. Diện tích bị nhiễm bệnh
VL&LXL trong vụ Hè Thu là 206 ha, tập trung trên lúa hè thu giai đoạn đòng trổ,
trong đó diện tích nhiễm nhẹ là 55 ha (tỉ lệ bệnh từ 5-10%), nhiễm trung bình 13 ha
(tỉ lệ bệnh trên 10-20%), nhiễm nặng 138 ha (tỉ lệ bệnh trên 20-50%) [11].
Năm 2009, dịch rầy nâu và bệnh VL&LXL vẫn xảy ra trên nhiều vùng với
diện tích lớn. Tính đến tháng 08/2009 tại các tỉnh phía Nam diễn tích nhiễm rầy vụ
Hè Thu là 87.246 ha tập trung tại các tỉnh Kiên Giang, Long An, Sóc Trăng, Bạc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
Liêu, Tiền Giang, Trà Vinh, Bình Thuận; Vụ Thu Đông là 18.747 ha tại Vĩnh Long,
Đồng Tháp, Cần Thơ, Bình Phƣớc, Trà Vinh, Hậu Giang, Tây Ninh. Diện tích
nhiễm VL&LXL vụ Hè Thu là 68 ha chủ yếu ở hai tỉnh Đồng Nai và Bình Thuận
[12].
1.2. TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL
Triệu chứng ban đầu chƣa thấy rõ giữa cây bệnh và cây lúa bình thƣờng. Bụi
lúa bệnh chỉ hơi ngã màu xanh nhạt, đôi khi có những lá màu vàng đến cam. Thời
gian sau cây lúa bệnh có vẻ kém phát triển hơn (lúc này rất dễ nhầm lẫn với hiện
tƣợng kém dinh dƣỡng nên nông dân thƣờng bón thêm phân đạm) [8]. Lúa nhiễm
bệnh trong giai đoạn còn non thƣờng rất lùn, mọc nhiều chồi và có lá thẳng đứng.
Các lá bệnh thƣờng ngắn, hẹp, có màu nhạt, và có nhiều đốm nhỏ màu nâu với hình
dạng không cố định [32],[43]. Các lá non mọc sau khi bị nhiễm bệnh thƣờng bị
sọc loang lổ, tuy nhiên lá lúa có thể vẫn xanh bình thƣờng nếu đƣợc cung cấp đủ
phân đạm [32]. Nhìn toàn cảnh thấy lúa hồi xanh không đều sau khi cấy, lá hẹp và
dựng đứng, lá có màu vàng, mềm và hơi rũ hoặc lá có màu xanh đậm có thể có
nhiều đốm màu rỉ sắt (Hình 1.1).

Hình 1.1. Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi
“Nguồn:
Thời kỳ đẻ nhánh, bụi lúa bệnh đẻ quá nhiều nhánh, bụi lúa to hơn, vẫn có
chiều cao tƣơng đƣơng với các bụi khác, chƣa khác biệt lắm [64]. Càng về sau nhìn
toàn cảnh thấy lúa phát triển không đều do bụi lúa bị bệnh không phát triển chiều
cao, cuối cùng các bụi lúa bệnh sẽ khô và lụi dần nhƣ cháy rầy từng chòm. Cây lúa
bệnh có thể không có bông hoặc có rất ít bông nhƣng hạt bị đen và lép. Triệu chứng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
14
tồn tại rất lâu sau khi phát bệnh [26]. Lúa trƣởng thành khi bị nhiễm bệnh có lá bị
vàng, bông bị nâu và hạt lép [43].
1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA
1.3.1. Virut vàng lùn lúa (RGSV)
Virut vàng lùn lúa đƣợc phát hiện chủ yếu trên lúa Oryza sativa [25], [43] và
có tên khoa học là Rice grassy stunt virus (RGSV), thuộc chi Tenuivirus [57]. Virut
phân bố tại nhiều nƣớc vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, và gây thiệt hại kinh tế rất
đáng kể. Các chủng RGSV gây vàng lá, mất mầu và chết cây đƣợc phát hiện năm
1977 tại Đài Loan [19], năm 1982- 1983 tại Philippin và Thái Lan [25], và năm
1984 tại Ấn Độ [33]. Ngoài ra, virut còn phân bố tại các nƣớc châu Á khác nhƣ
Indonesia, Malaysia, Nhật Bản, Sri Lanka, Trung Quốc, và Việt Nam [8], [9], [19],
[51].
RGSV ký sinh chủ yếu trên các loài lúa Oryza spp. và rầy Nilaparvata spp.
Vì vậy có thể nói Nilaparvata spp là vectơ duy nhất truyền bệnh này cho lúa [31].
Thất thu năng suất do RGSV thƣờng khó đƣợc tính toán chính xác vì thiệt hại do

virut thƣờng không thể đƣợc tách biệt rõ ràng với thiệt hại của rầy nâu và của virut
lùn xoắn lá (RRSV- cũng đƣợc truyền bởi rầy nâu) [40]. Trong năm 1974- 1977, có
tổng cộng 1,2 triệu ha lúa ở Indonesia bị nhiễm bởi rầy nâu và virut vàng lùn lúa.
Sự thất thu năng suất do cả hai loài dịch hại này gây nên khoảng 03 triệu tấn lúa
[40].
RGSV không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bệnh hoặc qua phấn hoa [31].
Virut cũng không đƣợc truyền bằng cách tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ mạnh với cây
lúa bệnh, hoặc qua lây bệnh bằng tay. Virut chỉ đƣợc truyền bằng rầy nâu
(Nilaparvata lugens) và một số loài rầy khác (N. bakeri, N. muiri) [28], [43].
Virut đƣợc truyền dạng bền vững qua các tuổi của rầy và nhân mật số trong rầy ký
chủ, nhƣng không đƣợc truyền qua trứng rầy [36]. Rầy nâu một khi nhiễm bệnh sẽ
truyền virut cho đến lúc chết. Kể từ năm 1984, RGSV thƣờng ít xuất hiện và gây
thiệt hại tại châu Á. Mặc dù không đƣợc báo cáo nhiều, sự ít xuất hiện của RGSV
có lẽ là do sự thay đổi trong khả năng truyền bệnh của quần thể rầy nâu. Tại
Philippin, tỉ lệ rầy nâu có thể lấy và truyền RGSV thay đổi từ 3- 5% trƣớc năm
1977 [32] sang 0- 15% trong năm 1984 [26]. Từ đây ta có thể giả thiết là một trong
những khả năng của sự bùng phát của dịch RGSV tại miền Nam Việt Nam hiện nay
là do sự thay đổi về khả năng truyền bệnh của rầy nâu: tỉ lệ rầy có khả năng lấy và
truyền virut có thể đã tăng lên đáng kể trong quần thể rầy nâu tại vùng này trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
những năm vừa qua.
Thể virut bao gồm nhiều đoạn vRNA, vcRNA, protein vỏ virut, và vài phân
tử RdRp [35]. Thể virut khó đƣợc quan sát thấy trong dịch trích thực vật dƣới kính
hiển vi điện tử. Thể virut sau khi đƣợc ly trích có dạng sợi dài 2µm và rộng 6- 8 nm
khi đƣợc quan sát bằng cách nhuộm trong uranyl acetate [16], [29] (Hình 1.2).

Hình 1.2. RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử
Thanh đen dài 100 nm. “Nguồn: DPV”.
Lúa bị nhiễm virut có nhiều bó sợi đƣợc quan sát trong nhân và tế bào chất
hoặc trong các thể có màng bao bọc hiện diện ở phần tế bào chất của các tế bào diệp
lục [20]. Các thể hình ống đi kèm với các hạt có đƣờng kính 25 nm còn đƣợc tìm
thấy trong các tế bào mạch rây của lá lúa bệnh [47]. Các hạt 25 nm tƣơng tự cũng
xuất hiện dƣới dạng các mảng kết tinh trong các thể béo và khí quản của rầy nâu
nhiễm virut [43].
RGSV có 6 đoạn RNA khác nhau, với tổng chiều dài bộ gen của RGSV là
khoảng 25 kb (Hình 1.3) [21], [32]. Cả 6 đoạn RNA đều lƣỡng tính (ambisense, mã
hoá protein theo cả 2 chiều dƣơng và chiều bổ sung của phân tử RNA) và đều mang
đoạn mã kết thúc dài 17 nucleotit tƣơng tự nhau. Các đoạn mã kết thúc này có khả
năng tự cuốn lại và tạo nên cấu trúc hình cán chảo. Đoạn mã theo chiều bổ sung của
đoạn RNA dài nhất (RNA1) chứa một ORF mã hoá cho một RdRp tƣơng tự nhƣ
RdRp của RSV, loài chuẩn của chi Tenuivirus [35], [38] và có cùng 37 ± 9% axit
amin giống nhau trong tổng số 2140 axit amin. Tuy nhiên, khác với các Tenuivirus
khác, RNA1 của RGSV còn có thêm một ORF ngắn có chiều dƣơng ở gần đầu 5’.
Hai protein dự đoán đƣợc mã hoá bởi RNA2 chỉ tƣơng tự chút ít với các protein
đƣợc mã hoá bởi RNA2 của các Tenuivirus khác. Các protein dự đoán đƣợc mã hoá
bởi RNA3 và RNA4 rất khác biệt so với các protein đƣợc biết. Sự khác biệt giữa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
16
các protein đƣợc mã hoá bởi các chuỗi RNA2, 3, 4 5 và 6 cho thấy RGSV rất khác
biệt so với các Tenuivirus khác [51]. Các đoạn RNA1, 2, 5, 6 của RGSV theo thứ tự
tƣơng đƣơng với RNA1, 2, 3, 4 của RSV. Protein vỏ của RGSV đƣợc mã hoá bởi

đoạn mã theo chiều bổ sung với RNA5 [21].









Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV
Các thanh đen hình sợi chỉ tƣợng trƣng cho các RNA với chiều dài đã đƣợc xác
định. Các mũi tên đen tƣợng trƣng cho các sản phẩm protein. Chiều mũi tên là chiều của
quá trình dịch mã để tạo ra chuỗi polypeptide. “Nguồn: Hồ Xuân Thiện, 2006”
1.3.2. Các loại virut khác
1.3.2.1. Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV)
Bệnh lùn xoắn lá lúa đƣợc miêu tả đầu tiên năm 1977 [48]. Bệnh xuất hiện
chủ yếu trên các loài lúa Oryza spp. và đƣợc gây ra bởi virut có tên khoa học là
Rice ragged stunt virus (RRSV), thuộc chi Oryzavirus, họ Reoviridae [58].
RRSV xuất hiện tại nhiều nƣớc trồng lúa châu Á nhƣ Ấn Độ, Bangladesh,
Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Nhật Bản, Philippin, Sri Lanka, Thái Lan, Trung
Quốc [60], và Việt Nam. RRSV là một virut quan trọng gây thiệt hại kinh tế đáng
kể. Virut không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bệnh [20]. Virut không đƣợc
truyền qua phấn hoa, qua chủng bệnh bằng tay, hoặc qua tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ
mạnh với cây lúa bệnh [60]. Rầy nâu Nilaparvata lugens là tác nhân truyền bệnh
duy nhất đƣợc biết [18], [48].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
17
Thể virut của RRSV có dạng hình cầu, bao gồm một vỏ, một phần trung tâm,

và một phức hợp nucleoprotein. Vỏ virut không có màng bao và mang nhiều thành
phần nhỏ tạo thành các gai (Hình 1.4). Vỏ virut có 12 gai dạng “B” dài 8 – 10 nm,
rộng 23- 26 nm ở phần chân đế và 14- 17 nm ở phần trên [36]. Thể virut có rất
nhiều ở tế bào chất của các tế bào nhu mô của mạch rây và thƣờng liên kết với nhau
tạo thành các sợi dài. Virut không đƣợc phát hiện ở các mô khác [48]. Khi bị nhiễm
virut, các tế bào nhu mô của mạch rây nhân lên và phình ra, tạo thành các u sần trên
lá và bẹ lá [26]. RRSV có 10 đoạn RNA sợi đôi khác nhau [59].






Hình 1.4. RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử
(A): Thể virut với các protein gai dạng B “nguồn ”.;
(B): Các thể virut liên kết lại tạo thành sợi dài, xem trong uranyl acetate, thanh đen
dài 50 nm. “Nguồn: DPV”.
1.3.2.2. Virut tungro hình cầu (RTSV)
Virut tungro hình cầu có tên khoa học là Rice tungro spherical virus
(RTSV), chi Waikavirus, thuộc họ Sequiviridae [27]. RTSV phân bố trên các loài
lúa Oryza spp. ở hầu hết các nƣớc trồng lúa tại vùng Nam và Đông Nam Á. RTSV
còn có thể phân bố ở những quốc gia khác nhƣng không đƣợc phát hiện bởi vì virut
này thƣờng không gây ra triệu chứng bệnh. Sự phân bố của RTSV có lẽ liên quan
lớn đến sự phân bố của côn trùng truyền bệnh [59].
RTSV kết hợp với RTBV gây nên bệnh Tungro [14]. Đây là bệnh hại lúa gây
thiệt hại kinh tế rất lớn với thiệt hại ƣớc tính hàng năm tại vùng Đông Nam Á lên
đến hơn 1,5 tỉ USD [24]. RTSV không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bị bệnh.
Virut không đƣợc truyền qua chủng bệnh bằng tay hoặc tiếp xúc giữa cây lúa lành
với cây lúa bị bệnh. RTSV có tác dụng nhƣ là một loài giúp đỡ cho RTBV trong
việc truyền bằng côn trùng [42]. RTSV đƣợc truyền dƣới dạng bán bền bởi một số

loài rầy xanh. Loài rầy truyền bệnh chủ yếu của RTSV tại vùng Đông Nam Á là rầy
xanh đuôi đen Nephotettix virescens (tên khác là N. impicticeps) [47], [59].
A B

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18








Hình 1.5. RTSV và RTBV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử
Xem trong dung dịch uranyl acetate. “Nguồn: Hull R., 1996”
RTSV có thể virut hình cầu, đƣờng kính 30 nm (Hình 1.5), chứa một phân tử
RNA sợi đơn có chiều dƣơng và dài khoảng 12 kb [37], và ba protein cấu tạo vỏ
virut là CP1 (kích thƣớc 22.900 kDa), CP2 (22.300 kDa) và CP3 (33.000 kDa)
[23],[46], [49], [52], [53].
1.3.2.3. Virut tungro hình nhộng (RTBV)
Virus tungro hình nhộng có tên khoa học là Rice tungro bacilliform virus
(RTBV), thuộc chi Tungrovirus, họ Caulimoviridae [27], [34]. RTBV đƣợc tìm
thấy tại hầu hết các nƣớc trồng lúa tại Nam và Đông Nam Á. Sự phân bố của virut
có lẽ có mối quan hệ chặt chẽ với sự phân bố của rầy xanh (côn trùng truyền bệnh
tungro) [59].
Giống nhƣ RTSV, RTBV không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bị bệnh.
Virut không đƣợc truyền qua chủng bệnh bằng tay hoặc tiếp xúc giữa cây lúa lành
với cây lúa bị bệnh. Virut chỉ đƣợc truyền bằng rầy xanh (Nephotettix virescens) khi
có sự giúp đỡ của RTSV. RTBV chỉ đƣợc truyền khi rầy xanh hút RTSV trƣớc hoặc

cùng thời gian [16].
RTBV có thể virut dạng hình nhộng, chứa 01 DNA sợi đôi và có dạng vòng.
Sợi DNA đôi này có một điểm đứt ở các vị trí nhất định trên mỗi sợi đơn [15],
[13]. Bộ gen của RTBV đƣợc dịch sang một RNA dài hơn chiều dài của bộ gen ban
đầu và RNA này đƣợc dịch ngƣợc sang DNA để tái tạo lại bộ gen của virut. RNA
này còn đƣợc dùng để dịch mã protein của các ORF 1, 2, 3. Ngoài ra, RNA này còn
đƣợc cắt nhỏ để dịch mã và tạo ra ORF 4 [27].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
1.4. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RẦY NÂU – MÔI GIỚI CHỦ YẾU TRUYỀN
BỆNH VL&LXL
1.4.1. Đặc điểm hình thái
- Rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal), thuộc họ Delphacidae, bộ Homoptera
[65].
- Trứng rầy nâu có dạng “quả chuối tiêu”, mới đẻ trong suốt, gần nở chuyển
màu vàng và có hai điểm mắt đỏ. Trứng rầy nâu đẻ thành từng ổ từ 5-12 quả nằm
sát nhau theo kiểu “úp thìa”, đầu nhỏ quay vào trong, đầu to quay ra ngoài biểu bì
ngoài của bẹ lá (Hình 1.10.A).
- Rầy non rất linh hoạt, mới nở có màu xám trắng, tuổi 2-3 trở lên có màu
nâu vàng, trong điều kiện mật độ cao có màu nâu sẫm (Hình 1.10.B).
- Con trƣởng thành có màu nâu tối, con đực nhỏ hơn con cái. Có 2 dạng rầy
trƣởng thành: loại cánh ngắn (Hình 1.10.C) và loại cánh dài (Hình 1.10.D).






Hình 1.6 . Các giai đoạn phát triển của rầy nâu

A. Trứng rầy; B. Rầy con (ấu trùng);
C. Rầy nâu trƣởng thành cánh ngắn; D. Rầy nâu trƣởng thành cánh dài
“Nguồn:

1.4.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và gây hại
Vòng đời của sâu gai từ 25- 30 ngày và thay đổi theo mùa
+ Thời gian trứng: 5- 14 ngày
+ Thời gian rầy non: 12- 32 ngày
+ Thời gian rầy trƣởng thành: 3- 20 ngày
A
B
C D

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20
Rầy cái trƣởng thành có thể đẻ 150- 250 trứng và có tính hƣớng sáng mạnh.
Con trƣởng thành và rầy non đều hút nhựa cây từ dảnh và lá lúa. Rầy nâu xâm nhập
vào ruộng lúa ngay từ khi mới cấy và hại cả trên mạ. Rầy nâu phát sinh với mật độ
cao và gây hại nặng vào giai đoạn trƣớc lúc lúa trỗ bông, ngậm sữa và bắt đầu chín
[65]. Nếu chỉ đơn thuần rầy gây hại không là môi giới truyền bệnh thì đánh giá mức
gây hại của rầy nâu là không lớn nhƣng cách phòng trừ loại rầy này lại tƣơng đối
khó. Rầy nâu có phản ứng kháng, nhiễm với các giống lúa rất rõ, nó có khả năng
hình thành các nòi sinh học mới khi có sức ép chọn lọc của môi trƣờng đủ lớn. Rầy
có khả năng di cƣ đám đông rất xa và kháng thuốc cao. Rầy nâu còn có tác hại chủ
yếu là truyền lan các loại virut [10]. Nguy hiểm hơn cả là bệnh VL&LXL lúa khi
truyền các loại virut là RGSV và RRSV. Rầy nâu thích hợp với điều kiện khí hậu
ấm nóng, độ ẩm cao, mƣa nắng xen kẽ. Ở Miền Nam rầy có thể gây hại liên tục các
vụ lúa, còn ở phía Bắc cháy rầy thƣờng xảy ra vào tháng 5 (vụ xuân) và cuối tháng
9 đầu tháng 10 (vụ mùa) [54].
Tỉ lệ rầy nâu N. lugens có thể truyền bệnh khác nhau theo từng vùng trên

ruộng lúa, và biến động từ 5- 60 % [22], [28], [29]. Tỷ lệ rầy truyền bệnh có thể
đƣợc tăng lên bằng cách chọn lọc và nhân mật số các cá thể rầy có khả năng truyền
virut, nhƣng lại giảm đi khi không còn áp lực chọn lọc [28]. Với rầy nâu N. lugens,
tỉ lệ truyền bệnh không khác biệt rõ ràng giữa rầy đực và cái, giữa rầy đen đậm và
đen nhạt, giữa rầy cánh dài và cánh ngắn [28]. Tuy nhiên, rầy non có khả năng
truyền bệnh cao hơn và có giai đoạn ủ virut ngắn hơn rầy trƣởng thành [22].
1.5. PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL
Bệnh VL&LXL cho đến nay chƣa có thuốc đặc trị. Vì vậy, biện pháp an toàn
và hữu hiệu nhất vẫn là phòng bệnh thông qua việc ngăn chặn, tiêu diệt rầy nâu
(môi giới truyền bệnh trực tiếp). Sự phát triển và lây truyền bệnh virut tùy thuộc vào
số lƣợng cây mang nguồn bệnh, số lƣợng và sự hoạt động của côn trùng truyền
bệnh, sự mẫn cảm của giống lúa với virut, với côn trùng truyền bệnh và thời tiết.
Nhiều biện pháp phòng trừ bệnh VL&LXL đã đƣợc tiến hành nhƣ canh tác lúa theo
tinh thần 3G, 3T, trong đó không bón thừa N, giảm mật độ xạ cấy, giảm sử dụng
thuốc hóa học, bón phân cân đối tạo sức đề kháng cho cây lúa, phun thuốc diệt trừ
rầy [5]. Thuốc hóa học có thể làm giảm mật số rầy nhƣng vẫn không thể giải quyết
đƣợc bệnh vàng lùn lúa, vì sự truyền bệnh có thể xảy ra giữa rầy và cây lúa trong
khoảng thời gian rất ngắn [2],[5].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
21
Từ năm 2003 đến nay tại Sóc Trăng đã áp dụng chế phẩm sinh học trên đồng
ruộng, và đã cho kết quả khả quan. Chế phẩm sinh học dựa trên nuôi cấy các loại
nấm kháng rầy trong tự nhiên, rồi đƣa loại nấm này ra đồng ruộng, rầy nâu gặp nấm
sẽ mang bệnh rồi truyền bệnh sang rầy khác, bằng phƣơng pháp này có thể diệt trừ
rầy nâu một cách hiệu quả mà không gây ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời [55].
Hiện nay, phƣơng pháp này cũng gặp nhiều hạn chế: về mặt qui mô (mỗi lần áp
dụng chỉ trên diện tích vài chục ha đất), về công nghệ chế biến, mƣa sau khi phun sẽ
làm trôi thuốc, phun thuốc phải trúng rầy, mƣa nhiều, nắng nhiều cũng làm ảnh
hƣởng tới chất lƣợng chế phẩm và hạn chế về mặt thời gian (rầy nâu không bị tiêu

diệt ngay sau khi phun thuốc) [6].
Nhiều kết luận cho rằng không một biện pháp đơn lẻ nào có thể phòng trừ
rầy nâu một cách hoàn hảo. Vấn đề chỉ có thể giải quyết bằng cách thực hiện một
chƣơng trình phòng trừ tổng hợp, trong đó giống kháng, biện pháp sinh học, biện
pháp canh tác và dùng thuốc hóa học phải đƣợc kết hợp với nhau một cách hợp lý
[9], [44]. Vì vậy, đòi hỏi phải có những nghiên cứu chi tiết về các chủng virut gây
bệnh và môi giới truyền bệnh VL&LXL trên qui mô rộng lớn.
1.6. MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN
CỨU BỆNH VIRUT
1.6.1. Một số enzym sử dụng trong sinh học phân tử
Trong sinh học phân tử, có nhiều loại enzym quan trọng, trong đó phải kể
đến những loại sau:
Enzym phiên mã ngƣợc có vai trò quyết định trong quá trình hình thành
ngành sinh học phân tử Eucaryot. Enzym này do các retrovirut sản sinh nhằm sao
chép bộ gen RNA của chúng trong tế bào vật chủ. Enzym phiên mã ngƣợc tổng hợp
nên một mạch DNA bổ sung (cDNA- complementary DNA) từ RNA khuôn theo
chiều 5’-3’, khi có mặt của mồi. Các ứng dụng chủ yếu là: Thiết lập ngân hàng
cDNA, tiến hành phản ứng PCR trên mRNA, và xác định trình tự của các axit
nucleic bằng phƣơng pháp sử dụng các dideoxynucleotit.
DNA ligase là enzym xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn DNA hay
RNA (RNA ligase). Enzym này đƣợc tách chiết từ E.coli và xúc tác cho phản ứng
nối hai trình tự DNA có đầu so le. T
4
DNA ligase có nguồn gốc từ phage T
4
xâm
nhiễm E.coli. Enzym này có cùng chức năng với ligase tách chiết từ E.coli nhƣng
đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng nên T
4
DNA ligase đƣợc

dùng phổ biến nhất trong kỹ thuật tạo dòng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22
Enzym DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5’-3’. phần
lớn các DNA polymerase dùng một bản mẫu là DNA đề làm khuôn cho sự tổng hợp
(DNA polymerase I, T
4
DNA polymerase, Taq polymerase). Một DNA polymerase
đặc biệt là enzym phiên mã ngƣợc (Reverse Transciptase) sử dụng khuôn là RNA
để tổng hợp DNA. Ngoài ra, còn có Terminal transferrase là một DNA polymerase
không tổng hợp mạch mới từ mạch khuôn mà chỉ thêm các nucleotit vào đầu của
một phân tử DNA có sẵn. Các DNA mồi, là một đoạn DNA hay RNA ngắn bắt cặp
bổ sung với phần đầu của mạch khuôn (đầu 3’), để từ đó các polymerase mới nối
dài tạo mạch bổ sung.
Enzym cắt giới hạn (RE) là các endonuclease có khả năng cắt DNA mạch đôi
một cách lặp lại ở những vị trí (trình tự) xác định. Do đặc tính cơ bản của các RE là
khả năng nhận biết và cắt một trình tự xác định trên phân tử DNA, dựa vào khả
năng này, ngƣời ta chia chúng làm ba loại: (1) Khi enzym nhận biết đƣợc trình tự,
nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000 – 5000 nucleotit và
giải phóng độ vài chục nucleotit; (2) Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí
đó; (3) Enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20
nucleotit. Trình tự nhận biết của RE loại 2: Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotit
đặc trƣng. Các trình tự này thƣờng bao gồm 4-8 nucleotit (thƣờng là 4 hoặc 6). Đối
với một số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số
nucleotit của trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotit khác. Đặc trƣng quan trọng
nhất của các trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palindromic, nghĩa là hai mạch
của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng đƣợc đọc theo cùng chiều 5’-3’. Nhƣ
vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch.
1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR

Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR) là sự kết hợp của hai phản
ứng phiên mã ngƣợc (Reverse Transcriptase) và PCR để nhân lên đƣợc đoạn gen
quan tâm từ RNA [3]. Kỹ thuật này gồm hai giai đoạn:
- Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất: Nguyên lý của phƣơng pháp này là sử dụng
enzym phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase) để tổng hợp sợi cDNA thứ nhất từ
RNA. Tùy theo mục đích của thí nghiệm mà các loại RNA đƣợc sử dụng là khác
nhau. Nếu muốn nhân một đoạn gen của sinh vật nhân chuẩn mà không muốn có
intron thì ngƣời ta thƣờng tổng hợp cDNA từ mRNA với mồi oligo(dT)s. Nếu là
sinh vật nhân sơ hoặc virrut ngƣời ta có thể tổng hợp cDNA từ RNA tổng số với
mồi ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu cho gen cần nhân. Khi mồi gắn bổ sung với sợi
RNA khuôn, enzym phiên mã ngƣợc sẽ xúc tác cho quá trình tổng hợp cDNA từ các