Tổng hợp và tiêu chuẩn hóa tạp chất liên quan 4-Methylbenzensulfonamid (Tạp A) và 2-nitroso-octahydcycpenta[C] pyrrol (tạp B) của Gliclazid

<span class='text_page_counter'>(1)</span><div class='page_container' data-page=1>

Báng 4: Két quả xác định giá trị ấn định của CPDS
' i . I Ì _ i . .* <i>n</i> I <i>. </i> <i>A</i> ! ■ .* <i>Ả</i> I

Sô lân
thay đổi

X* 0 X* 1 X* 2 X* 3

8 = 1,5s* 0,0216 0,0216 0,0216

x * -õ 99,43 99,43 99,43

X* + ỗ 99,47 99,47 99,47

Trung
bình

99,473 99,449 99,449 99,449

Độ lệch s 0,0669 0,0166 0,0166 0,0166
X* mới 99,445 99,450 99,450 99,450
s* mới 0,0144 0,0144 0,0144 0,0144

Sau ba lần thay đồi, s* = 0,0144 khơng thay đối, khỉ
đó X* được chọn là 99,449 % ’ Từ kết qua trên tính z -
score của 12 giá trị đều cỏ |z| < 2,0. Vậy giá trị ấn định
của CPDS: 99,449%. Độ không đảm bảo đo: |J =

<i>Ì , 2 5 s * ỉt Ị p =</i> 1 ,2 5 x 0 ,0144/V Ĩ 2 = 0,0052. Độ không
đảm bảo đo mở rộng u = |i X k = 0,0052 X 2 = 0,0104
(hệ số phủ k = 2 <i>ở</i> aũ,05)

5. Xây dựng qụị trình định lượng CPDS trong
nguyên liệu và chế phầm captoprìi băng HPLC vơi
đau dị PDA

Quy trình xác định hàm lượng CPDS bằng HPLC-
PDA được thẩm định theo hưởng dẫn của !CH[4], bao
gồm khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính chọn
lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng

Bảng 5: Keỉ quả khảo sát khoảng tuyến tính; LOD,
LOQ và độ chính xác

Phương írình hịi qui Y = 33441 X
Khoảng tuyên tính (ụg/ml) 0 ,5 - 4 0

Hệ so tương quan (r*) 0,9992
Giới hạn phát hiện; giới

hạn định lượnq

LOD = 0,17 |jg/ml; LOQ = 0,50
Mg/mỉ

Độ chính
xác

Độ lặp lại (n =6) Đơ chính xác trung gian
(n = 12)
Hàm iượng RSD

% captopril
disulfid TB

Hàm lượng %
captoprii
disuifid TB

RSD

Màu thử nguyên liệu 0,13 0,79% 0,13 0,81%
Mẫu thử thanh phám 0,58 1,47% 0,58 1,97%

Mẫu thử giả lập
nguyên liệu

1,12 1,07% 1,14 1,66%
Mâu thu’ giả lập thành

phẩm

2,03 0,80% 2,02 0,56

Ket quả thong kê cho thay qui trinh xác định độ tinh
khiết CPDS có khoảng tuyến tính rộng với giá trị của

hệ số tương quan cao, đạt yêu cầu về độ chính xác.
Bảng 6: Kết quả định íượng tạp cãptoprii disuifid
trong một số nguyên liệu và chế phẩm càptopril trên íhị
trường ________ _______ _______ _________

Chế phấm Mã hóa Hạn

dùnq

% captopril
dỉsulíid
Nguvên liệu captopril. lơ 1 NL01 03/2016 0,13%
Ngun liệu captopril, lô 2 NL02 09/2016 0,13%

Viên nén captopril 25 mg
(ngoại nhập, công ty A)

CPNNA 05/2016 20,41%

Viên nén captopril 25 mg
(ngoại nhập, cơng íy B)

CPNNB 01/2017 8,49%
Viên nén captopril 25 mg

(trong nước, công ty C)

CPTNC 02/2016 2,82%
Viên nén captopril 25 mg

(trong nước, công ty D)

CPTND 02/2017 0,59%
Viên nén captopri! 25 mg

(trong nước, công ty E)

CPTNE 04/2016 30,60%

Theo quy định của DĐVN IV, BP 2013, USP 36
hàm lượng CPDS trong nguyên liệu không được vượt
quá 1% và trong chế phẩm captopril không được vượt
quá 2%. Bảng 6 cho thấy co 2 chế p h im captoprii
nước ngoài và 3 chế phẫm captoprii trong nước khong
đạỉ yêu cầu theo quy định.

KẾT LUẬN

CPDS đẩ được tổng hợp và tiêu chuầrì hóa thành
công với độ tỉnh khiếỉ trên 99% để làm chất đối chiếu
sử dụng trong kiềm nghiệm íạp chất liên quan cùa
captopril. Qui ỉrình HPLC định iượng tạp CPDS có thể
đữợc ứng dụng để kiểm tra tạp này trong nguyên liệu
và chế phẩm captopril.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bộ V tế (2009), Dược điển Việt Nàm IV, Nhà
xuất bản Y học, Hà Nội, ír. i 24-125, PL-127 -129.

2. British Pharmacopoeia (2013), pp. 3757-3760.
3. Hellen Karine stulzer, Marcos Antonio Segatto
Silva (2006), “Stability Studies of coated Granules and
Tablets contained Captopril”, Acta Farm. Bonaerense,

25(4), pp. 497-504.

4. ICH Harmonized tripartite guideline (2005),
Validation of analytical procedures: text and
methodology, pp. 1 - 1 3 .

5. <i>ISO guide 34:2009,</i> General requirements for the

competence of reference material producers.

6. USP 36, CD-ROMs: captopril monographs, pp
336-337

<b>TỔNG HỢP VÀ TIÊU CHUẦN HÓA TẠP CHẤT LIÊN QUAN</b>

<b>4-METHYLBENZENSULFONAMID (TẬP </b>

<b>A) </b>

<b>VÀ </b>

<b>2-NITROSO-OCTAHYDROCYCLOPENTA[C]PYRROL (TẠP B) CỦA GLICLAZID</b>

ThS. Mạch Khắc Duy - <i>Bộ m ơn Hóa phân tích-Kiểm nghiệm , Đ ại học Y D ược TP.HCM</i>

<i>Hướng dẫn:</i> PGS.TS.Nguyễn Đ ức Tuẩn - <i>Bộ m ơn Hóa phân tích-Kiểm nghiệm</i>, <i>Đ ại họ c Y D ư ợ c TP.HCM</i>

ĐẶT VẤN ĐÈ VÀ MUC TIÊU <i>với hoạt chất và thành phẩm gliclazid là tạp A </i>

<i>(4-Gliclazid là thuốc điều trị đái tháo đường tỵp 2, có </i> <i>methylbenzensulfonamid) và tạp B (2nitroso </i>

<i>-cơ chế kích thích tể bào beta tuyến tụy giai phóng </i> <i>octahydrocyclopenta[c]pýrrol). Đẩy là 2 tạp phân hủỵ,</i>

<i>insulin và được sử dụng nhiều do tác dụng trị iiệu tot </i> <i>được hình thành trong quá trình bảo quằn gliclazicri</i>

<i>và ít tác dụng phụ. Dược điển Anh BP 2013(1) quy định </i> <i>Trong khi đó, chuần tạp A v à B đang được bán với giá</i>

</div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>

<i>khó khăn cho cơng tác kiểm nghiệm hai tạp chất này.</i>
<i>Trên thế giới, đã có cơng trình nghiên cứu tổng hợp</i>
<i>tạp chất A(6). Đối với tạp chắt B hiện vẫn chưa có cơng</i>
<i>trình nghiên cứu tổng hợp nào được công bố. Gần</i>
<i>đâỵ, Cục Quản lý Dược Việt Nam đã có yêu cầu phải</i>
<i>kiểm tra tạp chất liên quan một cách chặt chẽ trong</i>

<i>nguyên liệu và thành phẩm đắng ký cho sản xuất</i> v-ă

<i>lưu hành. Xuất phât từ những lý do trên, đề tài này</i>
<i>được thực hiện với mục tiêu là tồng hợp tạp A và tạp B</i>
<i>ờ qui mô phòng thỉ nghiệm, thiết lập chắt đối chiếu hai</i>
<i>tạp tổng hợp và kiểm tra tạp Chat liên quan A và B</i>
<i>trong thành phẫm gliclazid, sừ dụng tạp tổng hợp đã</i>
<i>được thiết lập chất đối chiểu.</i>

<i>Từ khóa: Gliclazid, đái tháo đường typ 2</i>

ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHẠP NGHIÊN c ứ u

1. Đ ôl tượng nghiên cứu: Tạp chất gliclazid A: 4-
meihylbenzensulfonamid và tạp chất giiclazid B: 2-
nitroso-octahydrocyciopenta[c]pỳrroỉ.

2. Phương pháp nghiên cứu

<i>2.1. Tổng hợ ẹ tạp A</i>

Tạp A được tong hợp qua 2 giai đoạn

- <i>Giai đoạn 1: Tồng hợp 4-methylbenzensulfonyl</i>

<i>clon'd theo phàn ứng sau:</i>

ĨH, 0

+ 2CISO3H

Cho vào bình cầu toiuen (5,75 mí; 0,05 mo!), íàm
lạnh xuống nhiệt độ 0°c. Sau đó thêm vào từ từ từng
giọt 5,6 ml (0,06 mol) acid ciorosulfonic (CISO

3

H) trong
1 giờ và giữ nhiệí độ dưới 5°c. Tiếp tục khuấy trong 2
giờ ờ nhiệt độ dưới 5°c. Kiểm tra sản phẩm của phản
ứng bằng sắc ký lớp mỏng. Sau đó đề hỗn hợp phàn
ứng ở nhiệt độ 15 °Ò trong 12 giờ. Hỗn hợp được cho
vào nước iạnh, lẳc đều roi cho vào bình lắng gạn, lấy
lớp trên (lớp dầu). Rửa lớp trên với 10 ml nước

iạnh/lần X 3 lần. Làm lạnh lớp trên tới nhiệt độ -10°c

(bằng hỗn hợp đá muối) trong

2

giờ thu được sản
phẩm kết tinh. Lọc sản phẩm kết tinh dưới áp suất
giảm, kết tinh íại trong hỗn hợp methanol - nước (

1

:

2

).

- <i>Giai đoạn 2: Tổng hợp 4-methylbenzensulfonamid</i>

<i>theo phản ứng sau:</i>

h3c h3c _\ _{/>— | - N H}₂_{+ h 20 + C0}₂_{+ NH}₄_CI

4,2 g (0,022 mol) 4-mhbenzensuỉfon clorid
được phản ứng với 1,96 g (0,022 mol) (NH

4

)

2

C 0

3

ở
nhiệt độ 80°c trong 15 phút. Sau đỏ hỗn hợp này
được đổ vào

100

m ĩ nước lạnh và khuếy đều trong

10

phút. Lọc thu chất rắn, hòá tan chầt rắn trong rỈLPỚc
nóng vả lọc. Kết tinh lại trong hỗn hợp methanol -
nước (

1

:

2

). Sản phẩm sau khi kết tinh được lọc dưới
áp suất giam.

<i>2.2. Tổng hợ p tạp B</i>

Tạp B được tổng hợp bằng phản ứng nitroso hóa,
chuần bị

2

dung dịch:

- Dung dịch 1: cho vào binh cầu 2 g
octahỵdrocyclopenta[c]pyrrol (0,015 moi), thêm vào

2,8

ml HCIđđ, khuấy trong 1 giờ ờ nhiệt độ 5 °c.

- Dung dịch 2: cho vào cốc có mỏ 1 g (0,015 moi)
NaN02, thêm vào

2

ml nước cất, khuấy trong

1

giờ <i>ở</i>

nhiệt độ 5 °c.

Nhố từ từ từng giọt dung dịch 2 vào dung dịch 1,
giữ nhiệt độ

<b>5°c, </b>

chiết ngay bằng dĩclorometan (3 X 5

ml), cô quay dịch chiết đến cắn khô. Tinh chề sản
phẩm thô bằng sắc ký cột.

Sản phẩm sau khi tồng hợp sẽ được kiểm tra sơ
bộ độ tỉnh khiết bằng sắc ký lớp mỏng vả nhiệt độ
nóng chảy, được xác định cấu trúc bằng các kỹ thuật
phổ nghiẹm như !R, MS và NMR, được xác định độ
tinh khiết bằng phương pháp HPLC qui về 100% diện
tích pic và được thiết lập Chat đối chiếu. Sau cùng, tạp
A và B írong chế phẩm gliclazid sẽ được kiểm tra bằng
phương pháp HPLC, sư dụng chuẩn tạp đã được thiết
iập.

KÉT QUẢ

1. Tổng hợp tạp A và tạp B

Hỉnh 1 và 2 minh họa sắc ký đồ kiểm tra độ tinh
khiết cùa sản phẩm kết tỉnh A và B với 3 hệ duna mơi
có íỷ lệ khác nhau. Kết quồ cho thấy sản phẩm kết tinh
A và B đều cho 1 vết duy nhất, vếí sản phẩm kết tinh A
khác với vết sản phẩm tổng hợp A và vểí sản phẩm
kết tinh B có vị trí và màu sac tương đương với chuẩn
tạp B. Bảng 1 trình bày kết quả xác định nhiệt độ nóng
chảy của sản phẩm kết tinh A và nhiệt độ SÔI cùa sản
phẩm kết tinh B. Khoảng nhiệt độ từ trạng thái rắn bắt
đầu tan chảy đến khi tan chay hoàn toàn chênh lệch
khoảng

1

° c và phù hợp với nhiệt độ nóng chảy của
tạp A(;. Trong khi đó, khoảng nhiệt độ íừ trạng thái
lỏng bắí đầu bay hơi đến khi bay hơi hoàn toàn chênh

lệch khoảng

<b>1°c </b>

và phù hợp với nhiệt độ sôi của tạp
B(5> Như vạy, sơ bộ cho ỉhẩỳ cả 2 sản phầm kết tinh A
và B đều tinh khiết.

Bảng 1. Kết quả xác định nhiệt độ nóng chảy của
sàn phẩm kếí tinh A và nhiệị độ sôi của sản phẩm kết
tinh B

Lần
đo

Kết tinh A Kết tinh B

Bâí đâu tan
chảy (°C)

Tan chảy
hồn tồn

? C )

Bắt đầu
sơi (°C)

Sơi hồn
tồn (°C)

137 138 273 274

2 136 137 274 275

3 137 138 274 275

<i>.ssẩk</i>

‘Off-(a) (b) (a) (b> (a) (b)

</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3>

<i>w</i> (b) (a) (b) (a) (b)
H-hexan- etliyl acciat (7 :i) H-hexan - ethyl acctat (7:3) fi-liexan - ethyl acetai (4:6)

Hình 2. Săc ký đồ kiềm tra độ íinh khiết của sản
phẩm kết tinh B. 6: dung địch chuẩn ỉạp B 0,1% pha
trong n-hexan; SP: dung dịch sàn phẩm kết tinh B
0,1% pha trong n-hexan

<i>Xác định cấu trúc sản phẩm kết tinh A</i>

Phổ ỈR (KBr): vmax (cm 1) 3327 - 3242 (-NH2); 1648 -
1595 (-S02-).

Phổ khối ESi-MS (-) có m/z = 170,0226 [M-H]'- M
phù hợp với khối lượng phân tư của tạp A
(CH3C6H4S 0 2NH2l M= 171,04).

Pho 1H-NMR [(500 MHz, MeOD), ỖH (ppm)]: 2,41
(s 3H, CH3), 7,35 <i>(d,</i> 2H, J = 8,5 Hz, H3l Hs), 7,80 <i>(d,</i>

2H, J = 8,5 Hz, H2l He); Phổ ^ 13C-NMR [(125 MHz, <i></i>

'*aW-MeOD) 8c (ppm)Ị: 21,37 (CH3), 127,05 (C2l

<b>c6),</b>

130,44 (Cạ,

<b>c 5), </b>

141,84 (C Ạ ■144,09

<b>(Cl). </b>

(Phụ lục 1)

Phân tích dữ liệu phổ ÍR, phổ khối, phổ 13Ò-NMR
và H-NMR cho thấy sản phẩm kết tinh Ả phù hợp với
công thức cấu tạo của 4-methylbenzensuIfonamid (tạp
A)

<i>Xốc định cấu trúc sản phầm kết tinh B</i>

Phổ IR (KBr): vmax (cm 1) 1435 (-N-N=0).

Phổ khối ES1-MS (+) có m/z = 163,0865 [M+Na]+và
m/z = 141,1409 [M+H]+; M. phù hợp vớí khối lượng
phân tử của tạp B (C7HÍ2N2O, M= 140 09).

So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR và H-NMR của sản
phẩm kết íinh B với chuẩn íạp B cho thấy có sự phù
hợp về số lượng và vị trí của proton, carbon . Như vậy
sản phầm kết tỉnh B chính là 2-nitroso-
octahydrocyc!openỉa[c]pyrroi (íạp B) (Phụ lục 2).

2 3
HoN

6 5

4-methyibenzensulfonamid (tạp A)

2-niíroso-ocỉahydrocyclopenta[c]pyrroi (tạp B)

<i>Hiệu suẩt tồn quy trình</i>

Tạp A

- Lượng lý thuyết: 4,7750 g
- Sản

phẩm

kết tinh A: 3,3683 g
-H iệu suấí tồn qui trinh: 70,54%
Tạp B

- Lượng lý thuyết: 2,1027 g
- Sản phẩm kết tinh A: 1,3642 g
- Hiệu suất tốn qui trình: 64,874%

<i>3.2. </i> <i>Xác đ ịnh độ tin h k h iế t tạp A và B bằng</i>

<i>HPLC - Đánh giá và th iế t lậ p chất đ ó i chiếu</i>

Bảng 2 trình bày điều kiện sắc ký thích hợp xác
định độ tinh khiết tạp A và tạp B bằng HPLC. Hình 3 và
hình 4 minh họa sac ký đồ tạp A và tạp B. Kết quả
thẩm định qui trình xác định đọ tinh khiet theo hương
dẫn cùa ICH<3) cho thấy ca 2 qui trình đạí tính phù hợp
hệ thống, có tính chọn lọc, độ chính xác cao và
khoảng tuyến tính rộng. Độ tinh khiết tạp A và tạp B
được tính theo phương pháp phần trăm diện tích pic
đều trên 99%. Tạp A và B sau đó được íiến hành đánh

<i>r%</i>Ỉ4 IkíẮt ÍArt #9ẨỈ I /nUt I 1.. o . HL.. J . . _ <i>A\</i>

Két quá thiêt ỉập châí đơi chiêu cho thắy tạp A và B đủ
điều kiện đề đẳng ký chuẩn quốc gia vởi hàm iượng
được xác định lần lượt là 99,89% và 99,97% tính theo
hiện trạng, độ không đảm bào đo là 0, độ lệch chuẩn
lần lượt la 0,0137 va 0,0067 (n = 11). Tiến hanh lập hồ
sơ chất chuần, dán nhãn lọ chuẩn và kèm theo phiếu
kiểm nghiệm. Bảo quản cắc lọ chuẩn ở nhiệt đọ 2 -

<b>8°c, </b>

íránh ánh sáng.

Bảng 2. Điều kiện sắc ký xác định độ tinh khiết tạp

<b>A WÒ D k Ầ n n u m r*</b>

Điếu kiện sằc ký Tạp A I Tap B
Cột sâc ký Phenomenex Gemini NX (150 X

4,6 mm; 3 M m )

Nhiệí độ cột 25 <i>° c</i>

Pha động: nước-
acetoniíri!

50:5 0 55:45

Tốc độ dịnq 0,8 mi/phút

Thế tích tiêm mẳu 10 Ml
Đầu dị PDA, bước

sóng phát hiên

225 nm 235 nm

</div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>

-3 0 Plo t

lí A
í i<

Auld Throihoif

Purity Plot

/ ... ... _ .

T^-rrTTT^n-,rTTTTT-i-T-i"v~-|' r r

<i>ĨỈD</i> ? « 3ca 3 » 040 3S0

<i>ĩh</i>

'ii

<i>y</i>

Ị

r ’

<i>' '</i>
<i>: </i>

<i>.</i>

.it

ị nfl

co

0»

Purtty Plot

-SJC0

-fB.cn

S)
--10.C0 £
-».a)

■■OS)
<i>3iC</i>

<i>U inta</i>

<i>PA:</i> 0.030 TH: 0.277

u

<oco j

ãMOO

-0ô
Wimnts

PA: 0.040 TH: 0.255

<b>Hình 3. Sắc ký đồ mẫu thử tạp Ạ (a), mẫu trắng </b> <b>Hinh 4. sắc ký đồ mẫu thử tạp B (a), mẫu trắng</b>
<b>(b), pha động (c); sắc kỷ đồ 3 chiều và sắc ký đô </b> <b>(b), pha động (c); sắc ký đồ 3 chiều và sắc ký đô</b>
<b>minh họa độ tính khiết pic tạp A </b> <b>minh họa độ tinh khiết pic tạp B</b>

<b>3. Xây dựng qui trình định lượng đồng thời tạp A và tạp B ỉrong chế phẩm gliclazid bằng kỹ thuật</b>
<b>HPLC-PDA</b>

Dựa theo điều kiện sắc ký xác định độ tinh khiết tạp A, tạp B và tài liệu tham khảo(1), tiến hành khảo sáí hệ
dung môi H20 - ACN - TFA - TEA với tỳ lẹ thay đổi. Điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng đồng thời tạp A và
tạp B trong chế phẩm gliclazid ià: cột Phenomenex Gemini NX C18 (150 X 4,6 mm; 3 fjm), pha động H20 - ACN -
TFA - TEA (40 : 60 : 0,1 : 0,1), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, đầu dò PDA với bước sóng phát hiện 232 nm, thể tích
tiêm mẫu 5 |J1, nhiệt độ cột 25 c . Để chứng minh qui trinh định lượng đồng thời tạp Ả và tạp B trong chế phẩm
gliclazid có tính đặc hiẹu trong trường hợp giiclazid bị phân huy íhành tạp A, tạp B và tạp khác (nếu co), các <i>mẫu</i>

<i>khảo sàt thành phẩm</i> ơ điều kiện khắc nghiệt đã được chuẩn bị: đặt trong tủ sầy 60 °c trong 24 giờ, cách thủy 60

° c trong 24 gỉờ, thủy phân bằng HCÍ 0,1 N; NaOH 0,1 N trong 24 giờ và oxy hóa bằng H20 2 3% trong 24 giờ. Kết
quả thầm định theo hướng dẫn của ICH cho tháy qui trình định iượng đồng thời 2 tạp A và B đạt tính phù hợp hệ
thống, có tính đặc hiệu, co khoảng tuyển tính rộng với hệ sổ tương quan cao, giới hạn phát hiện và giới hạn định
lượng thấp, độ chính xác và độ đung cao. Do đỏ, qui trình có thể được áp dụng để định lượng ỉạp A và B trong
ỉhẩnh phẩm giiclazid. Tạp A và tạp B đã được kiếm tra trong 1 chế phẩm ngoại nhập và 4 chể phầm trong nước
được mã hóa. Mỗi mẫu được tiến hành 4 lần. Kết quả được trình bày <i>ở</i> bảng 3.

p . > A l y X ể •» I I J <i>A </i> <i>\ r-* t</i>... í . _ t _ j £ ____________________ iT í -1 1 ' i ...» ___ __ Í L_ 4 V / n i ____1_____<i>I -</i> V

Chê phám Mã hóa Hạn dùng Số iơ % tap A % tap B

Viên nén gliclazid 60 mg (ngoại nhập, công ty A) GLINNA 31/01/2018 965523 0,40 < LOD
Viên nén gliclazid 80 mg {trong nước, công ty B) GLiTNB 06/06/2017 010614 < LOD < LOD

Viên nén gliclazid 80 mq (tronq nước, công ty C) GLITNC 15/09/2017 040914 0,78 < LOD
Viên nén qliclẫd 80 mq (trong nước, cơng ty D) GUTND 01/10/2017 011014 0,33 < LOD
Viên nén giiclazid 80 mg (trong nước, công ty E) GLITNE 03/11/2017 211114 < LOD < LOD
Nhận xét: Trong các mẫu định lượng, có 2 mẫu

chế phẩm trong nưởc không phát hiện tạp A, trong khi
đó mẫu chế phầm ngoại nhập và 2 mau chế phẩm
trong nước còn iai có hàm lượng tạp A cao hơn mức
cho phép (0,1%){1}. Tát cả các mẩu đều không phát
hiện tạp B.

<b>BẦN LUẬN</b>

<b>1. Tổng hợp và tinh chế tạp A</b>

ở giai đoạn 1 của qui trình tổng hợp, phản ứng
được thực hiẹn dựa vào sự thế trên nhân thơm cho ra
hỗn hợp đồng phân ortho và para. Sau đó sử dụng
ỉính chai khác biệt của 2 đồng phân về độ tan theo
nhiệt độ nên đã tách được 2 đong phân vị trí này một
cách dễ dàng, ở giai đoạn 2, phản ứng được thực

hiện írong điều kiện nỏng chảy do nguyên iiệu có nhiệt
đọ nóng chảy không quá cao, sản phẩm tạp A tạo
thành không tan trong nước, tạo điều kiện thuận lợi
cho quá trình tinh chế sau này. Đối với phương pháp
kết tinh, kết tinh nguội đã được lựa chọn do có hiệu
suất kết tinh cao, tinh thể hình thành ổẹp và có độ tinh
khiết cao.

<b>2. Tổng hợp và tinh chế tạp B</b>

Cho đen náy, chưa có cơrig trình nào cơng bố về
qui trình tổng hợp tạp B. Qui trinh tồng hợp tạp B lần
đầu tiên đã được thực hiện trong đề tai. Qui trinh nảy
đơn giản, có thể thực hiện ở các phịng thí nghiệm và
cho hiệu suất cao. Phàn ứng tổng hợp tạp B là phản
ứng niíroso hóa, xảy ra ở nhiệt đọ thấp 2 - 5 °c, sản

</div>
<span class='text_page_counter'>(5)</span><div class='page_container' data-page=5>

-phẩm tạo thành không bền trong nước nên cần chiếỉ
ngay bằng một dung mơi hữu cơ. Sau đó cần tinh chế
sản phẩm tổng hợp bằng sắc ký cột với thời gian rửa
giải nhanh, hiệu suat sạu tinh che đạt được sẽ cao.

3. Thiết lập ch ấ ỉ đố i chiếu tạp Ả và tạp B

Việc kiểm soát các tạp chất liên quan trong nguyên
liệu và đặc biệt là trong thành phầm tương ưng chưa
được quan tâm nhiều tại Việt Nam vì nhiều iý do như
một sổ tạp chấỉ chuẩn vẫn chưa có hoặc nếu có
thường rất đắt tiền và phải mua từ nước ngoài. Tuy
nhiên, phần lớn các chuyên luận trong được điển
nước ngoài (USP, EP, BP) cũng như dược điển Việỉ
Nam IV đều bắt buộc phải kiểm soát tạp chất liên
quan. Hiện nay hệ thống kiểm nghiệm thuoc quốc gia
chưa cung cấp được tạp chuẩn A và B nên gây khó
khăn cho công tác kiểm nghiệm tạp chất này tại các xí
nghiệp dược trong nước cỏ sản xuất thành phẩm
gliclazid. Việc đặt mua các tạp chuẩn này từ nước
ngoài phải mất 1 - 2 tháng với giá thành rat đắt. Kết

quả đánh giá và thiết lập chất đổi chiếu tạp A và B cho
thấy chất này đủ điều kiện để đăng kỷ chuẩn quốc gia
với độ ỉinh khiết lần lượt là 99,89% và 99,97%. Với
hiệu suất toàn qui trình (tổng hợp và tinh chế) cao,
khối lượng tạp Á thu được khoẩng 3 g cho mỗi iần
tổng hợp và tạp B là 1,5 g cho mỗj lần íổng hợp, thời
gian tổng hợp và tinh che không quá 5 giơ nen chất
đối chiếu tạp A và B có thể cung cấp đủ cho các xí
nghiệp dược trong nước có nhu cầu, góp phần làm
tăng nguồn tạp chuần trong công tác kiếm tra chất
lượng tạp chất liên quan.

_ 4. Qui trình xác định độ tin h kh iế t tạp A và tạp B
bằng HPLC

Việc sử dụng hệ pha động ACN - nước (không sử
dụng dung dịch đệm) đã tạo điều kiện thuận lợi cho
việc phân tích sau này, đảm bảọ tuổi thọ cột được kéo
dài hơn, thời gian phân tích ngắn, các thơng số sắc ký
đạt theo quy định.

5. Quỳ trình định lượng đồng th ờ i tạp A và B
ỉro n g chê phẩm gliclazid

Sử dụng hệ pha động ACN - nước có thêm TEA và
TFA ià do trong cáu írúc của gliclazid, tạp A và tạp B
tồn tại đồng thời cả nhóm chức có tính acid và nhóm
chức có tính base, Vai ỉrò của TEA và TFA là làm giảm
tương tác lần lượt của các nhóm base và acid có trong
phân tử chất cần phân tích với nhóm siianol tự đo cịn

lại của pha tĩnh với chất nền íà silica, điều này làm
giảm giảm hệ số bất đối, tăng độ nhạy và cải thiện
được độ phân giải.

Một khó khăn trong cơng tác kiểm nghiệm íạp chất
liên quan là giới hạn cho phép thường rất nhỏ so với
dược chấỉ nên để phát hiện được tạp chất liên quan
phải chuần bị mẫu thử có nồng độ dược chất rất cao

(thường íừ 1000 ppm trờ lên). Điều này đòi hòi điều
kiện sắc ký phải được lựa chọn sao cho độ phân giải
giữa pic dược chất và pic tạp chất phải lớn hơn rất
nhiều so vớj giá trị qui định !a 1,5. Ngoài ra tải ỉượng
cột sắc ký cũng ià một thông số cần !ưu ý. Nếu nồng
độ chất phân tích quá cao sẽ làm cột phân tích bị quá
tải, dẫn đến hiệu năng cột giảm nhanh chóng chỉ sau
vài lần sắc ký.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận: Đề tài đã hoàn thành mục tiêu đề ra,
với các kết quả như sau:

- Đã tổng hợp được tạp A và B với khối íưựng lần
lượt là 3,4 g và 1,4 g; đạt độ tinh khiết trên 99%, có thể
dùng làm chất đối chiếu quốc gia trong kiểm nghiệm
tạp chấí liên quan của glidazid.

- Đã xây dựng và ỉhẩm định đạt yêu cầu qui trình
xác định độ tỉnh khiết tạp A và B và qui trình định

lượng đồng thời 2 tạp chấỉ này trong thành phẩm
gliclazid bằng phương pháp HPLC với đau dò PDA.

- Đã ứng dụna qui trình định lượng tạp A và B để
kiểm tra tạp Chat này trong một so thành phảm
gliclazid có trên thị trường.

2. Kiến nghị: Từ những kết quả trên, đề tài nên
được tiếp íục thực hiện các nội dung sau:

- ứng dụng qui trinh định lượng tạp chất A và B
trên nhiều thánh phẩm giiclazid khac

- Nghiên cứu íheo dõi độ ổn định của chất đối
chiếu íạp A và B để có thể tính ỉốn chu kỳ đánh giá lại
chất chuẩn.

- Nghiên cứu tổng hợp và thiết iập chất đối chiểu
các iạp chất liên quan khác cũng nhứ xâỵ dựng qui
ỉrinh định lượng đồng thời tất cả cac tạp chất lỉển quan
của gliclazid.

TAI LIỆU THAM KHẢO

1. British Pharmacopoeia (2013), CD-ROM,

<i>monograph gliclazide.</i>

2. Daqing Che, Xiaohua Du (2011), <i>Method for</i>

<i>preparing gliclazide and its intermediate,</i> patent w o

2011054312 A1.

3. I.C.H. (2005), <i>Harmonized tripartite guideline,</i>
<i>Validation of analytical procedures: test and methodology,</i>

pp. 1-13.

4. LCGC standards (2011), <i>Safety datasheet </i>

<i>p-toluensulfonamide,</i> Axcentive SARL, 1-3.

5. LCGC standards (2013), <i>Safety datasheet</i>

<i>according to 1907/2006/EC, Article 3 1 ,</i>1-7.

6. Satish Kumar. K.v (2005), “Study of impurity
profile and forced degradation of buik drugs: Gliclazide
and Dimetindene maieate”, <i>Master of Pharmacy Thesis,</i>

Krupanidhi college of Pharmacy Bangalore, India, pp. 25-
38.

PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Dữ liệu phổ NMR của sản phầm kết tinh A_____

!H-NMR {500 MHz, MeOD) lbC-NMR (125 MHz, MeOD)

<i>ÕH ( p p m )</i> <i>S Ố H</i> <i>H ì n h d ạ n g đ n h</i> <i>V Ị t r í H</i> <i>õ c ( p p m )</i> <i>V i <b>trí c</b></i>

7,80 <i><b>2</b></i> <i>d (</i> J = 8,5Hz) H2, Hs 144,09 Ci

7,35 2 đ(J = 8,5Hz) H3, Hõ 141,84 c4

2,41 3 s -c h3 130,44 C3IC5

127,05 C2. Cs

21,37 -c h3

</div>
<span class='text_page_counter'>(6)</span><div class='page_container' data-page=6>

-Phụ lục 2. Dữjiậu phổ NMR sản phẳm kếttinh B so với chuẳn tạp B

Sản phấm kết tinh B Chuấn tap B

<i>H-NMR (500 MHz, CDCh) '</i> <i>UC-NMR</i>

<i>(125 MHz,</i>
<i>CDCh): Sc</i>

<i>(ppm)</i>

<i>1H-NMR (500 MHz, CDCh)</i> <i>IJC-NMR</i>

<i>(125 MHz,</i>
<i>CDCI</i>

<i>3</i>

<i>): Sũ</i>

<i>(ppm)</i>

<i>5 (ppm)</i> <i>SỐH</i> <i>Hình dạng đnh</i> <i>Vị trí H</i> <i>õ (ppm)</i> <i>SỐH Hình dạng đnh</i> <i>Vị trí H</i>

4,43 <i>dd(</i> J = 8Hz,

12,5 Hz) H2a 55,51 (C2) 4,42 <i>dd</i> (J = 8,5 Hz, 12,5 Hz)

H2a 55,41 (Ca)
4,10 1 <i>dd</i> (J =4,5 Hz,

12,5 Hz) Híb 50,81 (C4) 4,09 <i>dd{</i>12,5 Hz) J = 5Hz, H2b 50,75 (C4)

3,79 <i>ơd(</i> J = 9Hz,

15,5 Hz)

H4a 41,42 (Ca) 3,78 ơơ (J = 9 Hz,

15,5 Hz) H4a 41,49 (Cs)
3,42 1 đc/(J = 5Hz,

15,5 Hz)

H4b 40,75 (C*) 3,41 <i>dd</i> (J = 5,5 Hz,

15,5 Hz) H4b 40,82 (Ce)

2,81-2,72 2 <i>m</i> Hs 32,43 (C i) 2,80-2,73 2 <i>m</i> Ha 32,39 (C

1

)

2,00-1,87 2 <i>m</i> He 31,45 ÍCs) 2,01-1,86 2 <i>m</i> He 31,41 (C5)

1,80-1,72 1 <i>m</i> Hi 25,57 (C7) 1,81-1,70 <i>m</i> Hi 25,56 (C7)

1,71-1,63 1 <i>m</i> h5 1,69-1,61 <i>m</i> Hs

1,54-1,45 2 <i>m</i> ■ H? 1,50-1,43 2 <i>m</i> h7

Phụ lục 3: Két quả đánh giá tạp A

Chỉ tiêu Phương pháp u cầu

Tính chát <i>Cảm quan</i> Tỉnh thê trằnq, khơnq mùi

<i>Độ tan</i> Dễ tan trong methanol, ethanol, cloroform, aceíon, ethyl

acetat; không tan ỉronq nước, /7-bútanoỉ

Điêm chảy <i>DSC</i> 136- 138°c

Định tỉnh <i>Phổ hổng ngoại</i> <i>_{IR (KBr):}</i>_{vmax (cm'1) 3327 - 3242 (-NH}

₂

_{); 1648 - 1595 (-SO}

₂

_-)

<i>Phố khối</i> ESl-MS (-) có m

/2

= 170,0226 [M-HT

<i>Phố cộng hưởng từ hạt nhàn</i> Bảnq dữ liệu phố 'H-NMR và 13C-NMR (Phụ lục 1)

Độ tinh khiết sắc ký <i>HPLC</i> ằ 99,0% tính trên chê phấm nquyên íranq

Phụ lục 4: Két quả đánh giá tạp B

Chỉ tiêu Phương pháp Yêu cầu

Tính chất <i>Cảm quan</i> Chầt lỏng màu vànq nhat

<i>Độ tan</i> Dế tan trong methanol, acetonitril, cloroform, aceton, ethyl

acetat, n-hexan; khơnq tan tronq nước, n-butanóỉ

Điếm sơi <i>Chưnq cât</i> 273 - 275°c

Định tính <i>Phơ hống ngoại</i> <i>IR (KBr}:</i>V m a x (cm'1) 1435 í-N~N=0)

<i>Phố khơi</i> ESI-MS (+) có m/z = 141,1409 [M+Hf

ESI-MS (+) có m/z = 163,0865 fM+Naf

<i>Phố cộnq hườnq từ hạt nhân</i> Bảng dữ liệu phô 'H-NMR và 13C-NMR (Phu luc <i>2)</i>

Độ ílnh khiết sắc ký <i>HPLC</i> s 99,0% tính trên chê phấm nquyên iranq

Phụ lục 5. sắc ký đồ các mẫu định lượng đồng thời tạp A và B trong một số mẫu thành phầm giiciazid có trên
thị trường đã được mã hóa

<i>m</i>
5

visslĩầ': iv-i'S

vMaiiGiSiTND;

<i>lĩ.ụ</i>v; í Ị*/.” wS<i>. %</i> fo'r* T:' ! ô < < ã f ô3'ÊT

</div>

<!--links-->