Nghiên cứu sản xuất cây giống khoai lang hoàng long (ipomoea batatas l lam ) sạch bệnh đốm lông chim bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG
========

LÊ VĂN TÂM

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG KHOAI LANG HỒNG
LONG (IPOMOEA BATATAS L. LAM.) SẠCH BỆNH ĐỐM LƠNG
CHIM BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG

KHĨA LUẬN TƠT NGHIỆP

Đà Nẵng - Năm 2016


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG
========

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG KHOAI LANG HỒNG
LONG (IPOMOEA BATATAS L. LAM.) SẠCH BỆNH ĐỐM LÔNG
CHIM BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG

Ngành: Cơng nghệ sinh học

Người hướng dẫn:
ThS. Trần Quang Dần

Niên khóa: 2012 – 2016

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của
ThS. Trần Quang Dần.
Các kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực và chưa từng được công
bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Sinh viên thực hiện

Lê Văn Tâm


LỜI CẢM ƠN
Đến với Bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Sinh – Môi trường, trường Đại
học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng, chính việc được trực tiếp tiến hành thí nghiệm
trong mơi trường đầy đủ thiết bị hiện đại, tôi đã học hỏi thêm được nhiều kiến thức
bổ sung cho phần kiến thức lý thuyết của mình. Qua đó, bản thân tơi thêm u thích
thế giới sinh học, có tư duy khoa học tốt hơn và cũng đã trưởng thành nhiều hơn.
Để hồn thành khóa học và thực hiện đề tài, ngoài sự nỗ lực của bản thân tơi
cịn nhận được sự giúp đỡ của các thầy cơ giáo, gia đình, các tập thể cá nhân và bạn
bè.
Nhân dịp này cho phép tôi bày tỏ lời cảm ơn tới:
Th.S Trần Quang Dần, thầy giáo hướng dẫn khoa học, đã tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ks Trần Thị Quỳnh Nga – Phịng thí
nghiệm tổng hợp, Viện KHKT Nông nghiệp Bắc Trung Bộ, người đã giúp đỡ tôi rất
nhiều trong việc làm quen và phát triển kĩ năng thực hành thí nghiệm trong suốt q
trình tơi thực hiện đề tài khố luận của mình.
Tập thể các thầy giáo, cô giáo khoa Sinh – Môi trường đã giúp đỡ, tạo mọi
điều kiện để tơi hồn thành chương trình học tập và hồn thành luận văn tốt nghiệp.

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, các anh chị em đã
ln động viên và tạo mọi điều kiện về thời gian, kinh phí và cơng sức để tơi hồn
thành luận văn tốt nghiệp của mình.
Dù đã có nhiều cố gắng nhưng khố luận tốt nghiệp của tơi khơng thể tránh
khỏi những hạn chế thiếu sót. Tơi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các
thầy cơ và bạn bè để khố luận được hồn chỉnh hơn nữa.

Đà Nẵng, tháng 5 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Lê Văn Tâm


DANH MỤC VIẾT TẮT
2,4-D

: 2,4 Diclorophenoxyacetic acid

ABA

: Abscisic acid

ADN

: Acid deoxiribonucleic

BA

: 6-benzyl adenine

CIP

: Trung tâm khoai quốc tế

CMV

: Cucumber mosaic virus

Cs

: Cộng sự

CT

: Công thức

Ctv

: Cộng tác viên

ĐC

: Đối chứng

ĐNB

: Đông Nam Bộ

GA3

: Gibberellin A3

IAA

: Acid β-indol-acetic

KIN

: Kinetin

KT

: Khử trùng

KTST

: Kích thích sinh trưởng

KHKT

: Khoa học Kỹ thuật

MS

: Murashige và Skoog (1962)

NAA

: α-naphthalen acetic acid

NST

: Nhiễm sắc thể

SPCV

: Sweet potato caulimo virus

SPFMV

: Sweet potato feathery mottle virus

SPLV

: Sweet potato latent virus

SPVMV

: Sweet potato vein mosaic virus

TDZ

: Thidiazuron


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1
1.

Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1

2.

Mục tiêu của đề tài .................................................................................................. 2

3.

Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2

4.

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài.................................................... 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 4
1.1. Giới thiệu về cây khoai lang Hoàng Long ............................................................... 4
1.1.1. Đặc điểm sinh học................................................................................................. 4
1.1.2. Phân bố ................................................................................................................. 4
1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển....................................................................... 5
1.1.4. Giá trị của khoai lang Hồng Long ....................................................................... 5
1.2. Tổng quan về ni cấy mô và tế bào thực vật .......................................................... 6
1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật ............................................ 6
1.2.2. Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ................................................ 9
1.2.3. Điề u kiê ̣n nuôi cấy .............................................................................................. 13
1.2.4. Môi trường nuôi cấ y........................................................................................... 14
1.3. Giới thiệu về bệnh vi-rút đốm lông chim ............................................................... 18
1.3.1. Giới thiệu về vi-rút đốm lông chim.................................................................... 18
1.3.2. Nguyên nhân gây bệnh và triệu chứng bệnh ...................................................... 18
1.3.2. Hiện trạng nhiễm bệnh vi-rút ở khoai lang ........................................................ 19
1.3.3. Biện pháp phòng trừ ........................................................................................... 20
1.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam ................................................... 20

1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................................... 20
1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam.................................................................... 23
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................... 25
2.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 25
2.2.1. Chọn vật liệu nuôi cấy........................................................................................ 26
2.2.2. Khử trùng mẫu cấy ............................................................................................. 26


2.2.3. Tái sinh và nhân nhanh chồi từ đỉnh sinh trưởng............................................... 27
2.2.4. Sàng lọc cây sạch bệnh (trước khi chuyể n sang giai đoa ̣n nhân nhanh chồ i) ..... 27
2.2.5. Tạo cây hoàn chỉnh ............................................................................................ 28
2.3. Xử lý thống kê ........................................................................................................ 28
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................... 29
3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng (HgCl2 0,1%) đến mẫu cấy ........................... 29
3.2. Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi .............. 30
3.3. Sàng lọc các dòng khoai lang sạch bệnh .................................................................. 33
3.4. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh ............................ 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 38


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Tên bảng

Bảng
3.1

Trang

Ảnh hưởng của thời gian khử trùng (HgCl2
0,1%) đến mẫu cấy.

28

Khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi trên các
3.2

mơi trường có bổ sung GA3 ở các nồng độ khác

30

nhau.
3.3

Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ
của chồi in vitro.

34


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình

Tên hình

Trang

2.1.

Khoai lang Hồng Long

25

2.2.

Chồi khoai dùng để vào mẫu

25

2.3.

Sơ đồ thí nghiệm

25

Chồi tái sinh từ đỉnh sinh trưởng trên môi trường MS cơ bản.
3.1.

(A): Đỉnh sinh trưởng mới vào mẫu; Sự tái sinh chồi từ đỉnh

30

sinh trưởng sau 6 tuần (B) và 10 tuần (C).
Chồi tái sinh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy trên các môi
3.2.

trường bổ sung GA3 ở các nồng độ khác nhau. A: không bổ

32

sung GA3; B: 0,5 ppm; C: 1,0 ppm; D:1,5 ppm; E: 2,0 ppm.
Sự nhân chồi từ mẫu đoạn thân chứa các mắt chồi trên môi
3.3.

trường bổ sung GA3 ở các nồng độ khác nhau sau 3 tuần nuôi

33

cấy. CT0: không bổ sung GA3; CT1: 0,5 ppm; CT2: 1,0 ppm;
CT3: 1,5 ppm; CT4: 2,0 ppm.
Sự nhân chồi từ mẫu đoạn thân chứa mắt chồi trên môi trường

3.3.

bổ sung GA3 ở các nồng độ khác nhau sau 6 tuần. CT0: không

33

bổ sung GA3; CT1: 0,5 ppm; CT2: 1,0 ppm; CT3:1,5 ppm;
CT4: 2,0 ppm.
Phát hiện vi-rút SPFMV bằng RT-PCR. (HL1), (HL2) dòng

3.4.

sạch bệnh; (HL3) dòng bị nhiễm vi-rút; (M) Marker; (ĐC-)

34

đối chứng âm; (ĐC+) đối chứng dương.

Chồi khoai lang in vitro được cho ra rễ tạo cây hồn chỉnh trên
3.5.

mơi trường bổ sung IAA ở các nồng độ khác nhau sau 4 tuần.
CT1: không bổ sung IAA; CT2: 0,3 ppm; CT3: 0,5 ppm; CT4:
0,7 ppm; CT5: 1,0 ppm.

36


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Giống khoai lang Hoàng Long (Ipomoea batatas L. Lam.) là giống khoai
lang được trồng phổ biế n ở Việt Nam và được du nhập từ Trung Quố c vào Viê ̣t
Nam năm 1968. Giố ng do trường Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh tuyể n cho ̣n,
giới thiê ̣u và được Bô ̣ Nông nghiê ̣p và Phát triể n Nông thôn công nhâ ̣n giố ng vào
năm 1981 [11]. Khoai lang Hồng Long khơng những là cây lương thực quan trọng
cho người, thức ăn cho gia súc mà còn là sản phẩm của các mặt hàng công nghiệp
thực phẩm, như: chế biến rượu, cồn… Tinh bột khoai lang còn được dùng trong
công nghiệp thực phẩm cũng như là nguồn nguyên liệu tốt cho cơng nghiệp sản xuất
enzyme amylase. Ngồi ra, khoai lang cịn là vị thuốc có tác dụng nhuận tràng, bổ tì
vị [10].
Tuy nhiên, hiện nay sản lượng và chất lượng khoai lang còn thấp và bấp
bênh, do nhiều nguyên nhân, như: sử dụng giống thối hố, ít quan tâm đến các biện
pháp canh tác, điều kiện tự nhiên khắc nghiệt của thời tiết và sự phá hoại của sâu
bệnh hại [9]. Giống khoai lang hiện nay ở nhiều vùng canh tác tại các địa phương
đang đối mặt với nguy cơ nhiễm bệnh do vi-rút kí sinh, làm ảnh hưởng đến nguồn
giống và năng suất cây trồng. Hiện nay các bệnh vi-rút chủ yếu trên khoai lang,

như: đốm lông chim (SPFMV), khảm tĩnh mạch (SPVMV), tiềm ẩn (SPLV) [13].
Theo kết quả điều tra của trường ĐH Nông nghiệp I và Viện KHKT Nông nghiệp
Việt Nam (1994), ở nước ta xuất hiện bệnh vi-rút đốm lông chim (SPFMV), một
loại vi-rút gây bệnh thuộc nhóm Poty-virút [4]. Triệu chứng bệnh thể hiện rõ trên lá,
lá cây bệnh có màu xanh nhạt xen kẽ các vết khảm xanh sẫm, gân lá có màu vàng
sáng, phiến lá co hẹp và mép lá có màu xanh vàng. Bệnh vi-rút đốm lông chim
nhiễm trên các giống khoai Lim, Hoàng Long và Muồng đỏ với tỷ lệ 10-18% [15].
Trong những năm vừa qua, diện tích và sản lượng khoai lang ở Việt Nam có xu
hướng giảm dần, do phần lớn các giống khoai lang nước ta đang bị nhiễm các bệnh
về vi-rút gây ra làm cho năng suất củ khoai lang chưa được cải thiện nhiều [8]. Diện
tích trồng khoai lang trong cả nước liên tục giảm, từ 181.200 ha (năm 2006) đến


2

150.800 ha (năm 2010) và 129.900 ha (năm 2014) [20]. Năm 2006, Kokkinos và cs
đã sử dụng kỹ thuật Real-time PCR để xác định ngưỡng nồng độ các poly-virút
SPFMV, SPCV, và CMV phát hiện trong cây khoai lang nhiễm bệnh với cặp mồi
CI-F/R [42].
Một trong những kỹ thuật nuôi cấy hiệu quả nhất hiện nay trong việc tạo ra
các giống sạch bệnh vi-rút là nuôi cấy đỉnh chồi, đỉnh sinh trưởng hoặc kết hợp với
xử lý hoá chất, nhiệt độ. Phương pháp này cho phép loại bỏ hầu hết các bệnh vi-rút,
viroid và các tác nhân gây bệnh tương tự vi-rút. Chóp đỉnh sinh trưởng được coi là
sạch bệnh vi-rút. Mẫu mô nuôi cấy càng nhỏ và càng gần đỉnh sinh trưởng thì khả
năng sạch bệnh càng lớn, và có sự tương quan tỷ lệ thuận giữa kích thước mẫu với
khả năng cây tái sinh sạch bệnh [2]. Nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
ni cấy đỉnh sinh trưởng trên các đối tượng cây trồng khác nhau đã thành cơng và
đưa ra được quy trình sản xuất giống sạch bệnh cũng như bảo tồn nguồn gen. Việc
ứng dụng kỹ thuật này vào trong sản xuất khoai lang sẽ tạo nhiều triển vọng mới
trong việc tăng cao năng suất và chất lượng đáp ứng nhu cầu đa dạng của thị trường,

phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng và sản xuất nội địa, xuất khẩu ra thế giới trong thời
gian tới.
Xuất phát từ thực tiễn và các vấn đề nêu trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu sản xuất cây giống khoai lang Hoàng Long (Ipomoea batatas L.
Lam.) sa ̣ch bê ̣nh đốm lông chim bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng”
2. Mục tiêu của đề tài
Tạo nguồn giớ ng khoai lang Hồng Long sa ̣ch bê ̣nh đốm lông chim bằng kỹ
thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
3. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu nghiên cứu, đề tài thực hiện các nội dung sau:
-

Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng thích hợp bằng

dung dịch HgCl2 0,1% đến mẫu ni cấy.
-

Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng GA3

đến khả năng tái sinh chồi cây khoai lang.


3

-

Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng nhân

nhanh chồi cây khoai lang.
-

Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IAA

đến khả năng ra rễ của chồi cây khoai lang.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu, giảng dạy và sản
xuất giống khoai lang sạch bệnh vi-rút.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài góp phần bổ sung quy trình kỹ thuật nhân nhanh giống
khoai lang Hồng Long nhằm giúp bảo tồn nguồn gen, phục tráng giống khoai lang
Hoàng Long từng cho năng suất cao trước đây đang bị thoái hoá.


4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây khoai lang Hoàng Long
1.1.1. Đặc điểm sinh học
Cây khoai lang Hoàng Long (Impomoea batatas L. Lam.) thuộc họ bìm bìm
(Convolvulaceae), lớp thực vật 2 lá mầm. Cây thân thảo to mập, sống quanh năm,
thân dây leo, bò lan rộng, hoa lưỡng tính, quả sóc, lá màu xanh tím, hình tim, có
cuống với sự phân gân hệ hình cung [12].
Các giống khoai lang nói chung và giống Hồng Long nói riêng bộ phận sử
dụng chủ yếu là rễ củ phình to, có thể ăn lá và thân non [10]. Cây sau khi trồng 3 - 4
ngày sẽ mọc rễ mới, trong điều kiện khô hạn hoặc nhiệt độ và ẩm độ thấp thì khoai
mọc rễ non chậm. Rễ mọc đầu tiên ở các đốt thân dưới đất. Mỗi đốt có khả năng ra
15 - 20 rễ, nhưng thường chỉ có 5 - 10 rễ được phân hoá thành rễ dày mới có cơ hội
hình thành củ, củ bắt đầu phát triển theo chiều dài trước, sau đó mới phát triển theo
đường kính và nhanh nhất chỉ khoảng 1 tháng trước khi thu hoạch. Củ khoai lang

nặng khoảng 60 – 70% trọng lượng toàn cây. Thời gian sinh trưởng ngắn 85 - 95
ngày. Năng suất củ tươi trung bình 15 - 27 tấn/ha, tỷ lê ̣ chấ t khô 27-30%, chấ t
lươ ̣ng củ khá, vỏ củ màu hồ ng sẫm, thiṭ củ màu vàng cam, dáng củ đề u đe ̣p [12].
Khoai lang Hoàng Long cũng như các giống khoai lang khác, là lồi khơng
chịu được sương giá. Vì vậy, trong khu vực nhiệt đới khoai lang có thể để ngồi
đồng và thu hoạch khi cần thiết, còn ở khu vực ôn đới thì được thu hoạch sớm trước
khi sương giá bắt đầu [11].
1.1.2. Phân bố
Khoai lang Hoàng Long phân bố ở một số nước châu Á như Mianma, Trung
Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Indonexia [11]. Tại Việt Nam, loài này chủ yếu được trồng
nhiều ở các tỉnh phía bắc và đây là lồi đặc sản của tỉnh Ninh Bình, nơi mà giống
khoai này được nhập nội từ Trung Quốc vào nước ta năm 1968 và do trường Đại
học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh tuyển chọn và trồng thí điểm [10].


5

1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển
Khoai lang Hoàng Long có bốn thời kỳ sinh trưởng và phát triển: Mọc mầm
và ra rễ; phân cành và tạo củ; phát triển thân lá; sự phát triển của củ.
a. Thời kỳ ra rễ và chồi xanh
Ra rễ và mọc mầm cần 15 - 25 ngày, phụ thuộc vào chất lượng dây giống và
điều kiện sinh thái của các vùng khác nhau [10].
b. Thời kỳ phân cành và hình thành củ
Từ khi trồng đến khi hoàn thành giai đoạn này khoảng 40 - 50 ngày. Các
nhánh trên thân bắt đầu phát triển và bị trải dần trên mặt luống. Củ hình thành
khoảng 1,0 - 1,5 tháng sau khi trồng tùy thuộc điều kiện môi trường. Đây là thời kỳ
quyết định số củ trên cây; trong rễ củ bắt đầu có sự hoạt động của các bó mạch gỗ,
hình thành các loại tượng tầng sơ cấp và tượng tầng thứ cấp để tạo củ [10].
c. Thời kỳ phát triển thân lá

Thời gian từ lúc trồng đến hoàn thành thời kỳ phát triển thân lá khoảng 75 85 ngày. Ở thời kỳ này thân lá phát triển với tốc độ nhanh nhất, bò lan phủ kín mặt
và rãnh luống. Sự hình thành thêm rễ củ mới là không đáng kể. Nhưng những củ đã
được hình thành phát triển theo chiều dài nhanh chóng. Một số củ hình thành sớm
bắt đầu q trình tích lũy chất khô [10].
d. Thời kỳ phát triển củ
Từ khi trồng đến khi hoàn thành giai đoạn này khoảng 90 - 105 ngày đối với
các giống khoai lang hiện trồng phổ biến ở Việt Nam. Điều kiện thuận lợi cho quá
trình phình to của củ là có sự chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm lớn (ban ngày nắng
ấm, ban đêm hơi se lạnh); nên chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm càng lớn trong giai
đoạn cuối thì năng suất củ khoai lang càng cao. Đặc điểm của thời kỳ này là củ lớn
nhanh trong khi sinh trưởng thân lá giảm từ từ rồi ngừng hẳn, lá gốc già vàng và
rụng dần [10].
1.1.4. Giá trị của khoai lang Hoàng Long
Khoai lang không những là cây lương thực quan trọng cho người, thức ăn
cho gia súc mà còn là sản phẩm của các mặt hàng công nghiệp thực phẩm, như: chế
biến rượu, cồn… Giống khoai lang Hồng Long có lớp thịt màu vàng cam sẫm chứa


6

nhiều vitamin A hơn các giống khác có thịt màu nhạt và việc trồng các giống này
được khuyến khích tại châu Phi do thiếu hụt vitamin A là vấn đề nghiêm trọng tại
đây [12].
Tinh bột khoai lang còn được dùng trong công nghiệp thực phẩm, như là
nguồn nguyên liệu tốt cho cơng nghiệp sản xuất enzyme amilase. Ngồi ra, khoai
lang cịn là vị thuốc có tác dụng nhuận tràng, bổ tì vị. Mặc dù có vị ngọt nhưng
khoai lang trên thực tế là thức ăn tốt cho những người bị tiểu đường do các nghiên
cứu sơ bộ trên động vật cho thấy nó hỗ trợ sự ổn định cho nồng độ đường trong máu
và làm giảm sức kháng Insulin [12].
Về thành phần dinh dưỡng, trong 100 g củ khoai lang tươi có 68 g nước, 0,8

g protid; 0,2 g lipid; 28,5 g glucid (24,5 g tinh bột; 4 g glucose) và 1,3 g cellulose,
có thể cung cấp cho cơ thể khoảng 122 calo. Ngồi ra trong khoai lang tươi cịn
nhiều vitamin và muối khoáng (34 mg Canxi; 49,4 mg Photpho; 1 mg Sắt; 0,3 mg
β-Caroten; 0,05 mg vitamin B1; 0,05 mg vitamin B2; 0,6 mg vitamin PP; 23 mg
vitamin C…) [10].
1.2.

Tổng quan về nuôi cấy mô và tế bào thực vật

1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật
a. Tính tồn năng của tế bào
Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mơ và tế
bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào.
Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng
tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy rằng, mỗi tế bào
của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua q trình phân bào ngun
nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di
truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định,
những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh [34].
Miller và Skoog (1956) đã tạo chồi thành công từ mô thuốc lá nuôi cấy,
chứng minh được tính tồn năng của tế bào. Thành cơng trên đã tạo ra công nghệ
mới: Công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vơ tính, tạo giống cây trồng và
dòng chống chịu [46].


7

Tính tồn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của
phương pháp ni cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay, con người đã hoàn toàn
chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào

riêng rẽ [2].
b. Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tấ t
cả các loa ̣i tế bào đó đề u bắ t nguồ n từ mô ̣t tế bào đầ u tiên (tế bào hơ ̣p tử). Ở giai
đoa ̣n đầ u, tế bào hơ ̣p tử tiế p tu ̣c phân chia hình thành nhiề u tế bào phôi sinh chưa
mang chức năng riêng biê ̣t (chuyên hóa). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng
tiế p tu ̣c đươ ̣c biế n đổ i thành các tế bào chuyên hóa đă ̣c hiê ̣u cho các mô, cơ quan có
chức năng khác nhau [2].
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phơi sinh thành các tế bào của mơ
chuyển hố, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá trình phân hố
của tế bào có thể biểu thị như sau:
Tế bào phơi sinh

Tế bào giãn

Tế bào chun hóa
chức năng riêng

Mặc dù các tế bào đã chuyển hoá thành các mô chức năng nhưng chúng vẫn
giữ nguyên khả năng phân chia. Trong điều kiện thích hợp, các tế bào lại có thể trở
về dạng tế bào phơi sinh và phân chia mạnh mẽ. Q trình đó được gọi là phản phân
hố tế bào, (ngược lại với q trình phân hố tế bào). Tuy nhiên, khi tế bào đã phân
hoá thành các tế bào có chức năng chun biệt, chúng khơng hồn tồn mất khả
năng biến đổi của mình. Trong điều kiện cần thiết ở điều kiện thích hợp, chúng lại
có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Q trình đó gọi là phản
phân hố tế bào, ngược lại với q trình phân hố tế bào [2]. Quá trình phân hóa và
phản phân hóa tế bào có thể hiể n thi ̣như sau:
Phân hóa tế bào
Tế bào phôi sinh

Tế bào dan
̃
Phản phân hóa tế bào

Tế bào chuyên hóa


8

Q trình phát sinh hình thái trong ni cấy mơ, tế bào thực vật thực chất là
kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế
bào thực vật xét cho cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào
thực vật một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào
trên cơ sở tính tồn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái
của mơ ni cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy 2 nhóm chất
điều hồ sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp
thì sự phát sinh hình thái theo hướng tạo chồi; nếu tỷ lệ này cao thì tạo thành rễ, cịn
khi tỷ lệ này cân bằng thì sẽ phát sinh theo hướng tạo mơ sẹo [2].
c. Cơ chế di truyền thông qua các hệ tế bào
Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào bao gồm các cơng đoạn:
Trong q trình ngun phân, từ một tế bào mẹ sẽ nhân đôi, tạo ra 2 tế bào
con giống nhau và giống tế bào mẹ ban đầu. Như vậy qua nguyên phân bộ NST
trong nội bộ từng cơ thể được diễn ra theo cơ chế nguyên phân, đây là cơ chế phân
bào mà từ một tế bào ban đầu sẽ phân chia thành hai tế bào con có bộ NST giống bộ
NST của tế bào mẹ đã truyền nguyên vẹn sang tế bào con. Sở dĩ có hiện tượng này
là do trước mỗi lần giảm phân, mỗi phân tử ADN đã thực hiện quá trình tái sinh để
từ mỗi phân tử ADN hình thành 2 phân tử ADN giống nhau và giống ADN ban đầu.
Quá trình này được thực hiện ở kỳ trung gian và thông qua cơ chế phân ly đều của
NST ở kỳ sau, là cơ sở cho sự truyền nguyên vẹn thông tin di truyền trong nội bộ cơ

thể [24].
Giữa 2 thế hệ cơ thể được hình thành thơng qua cơ chế giảm phân đã làm cho
ở thế hệ đời sau có hiện tượng phân ly tính trạng, do bộ NST của thế hệ sau không
giống nhau và không giống bố mẹ. Vì vậy việc duy trì các tính trạng mong muốn ở
bố mẹ sang thế hệ sau bằng sinh sản hữu tính sẽ khơng thể đảm bảo hồn tồn chắc
chắn. Đây là một trở ngại lớn trong sinh sản hữu tính. Ngày nay bằng phương pháp
sinh sản vơ tính, người ta đã khắc phục được nhược điểm này. Đặc biệt là nhân
giống vơ tính in vitro [24].
Dựa trên cơ chế nguyên phân, trong nhân giống in vitro khi lấy các bộ phận
sinh dưỡng trong một cây đem nhân giống thì các bộ phận đó có thơng tin di truyền


9

giống nhau và tạo nên các cơ thể mới có thông tin di truyền giống nhau và giống cơ
thể mẹ. Như vậy nếu cơ thể mẹ có các tính trạng di truyền tốt thì các tính trạng đó
sẽ được thể hiện ở mọi cơ thể con [2].
1.2.2. Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
a. Khái niệm
Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thực chất là nuôi cấy in vitro với bộ phận
nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng có chứa 1 – 2 lá non. Những cây được tạo ra từ ni
cấy đỉnh sinh trưởng có độ đồng đều cao vì chúng được sinh ra từ tế bào ít hoặc
chưa bị phân hóa như những tế bào ở nơi khác [2].
Kỹ thuật này dùng các phần rất nhỏ của đỉnh chồi (shoot-tip) bao gồm mô
phân sinh đỉnh riêng rẽ (single apical meristem) và mầm lá non (young leaf
primordia) để kéo dài chồi (shoot elongation) ngay sau đó. Đây cũng là kỹ thuật đầu
tiên được dùng để làm sạch vi-rút (virus - free) ở thực vật. Việc tạo ra các giống
sạch vi-rút là biện pháp bắt buộc phải tiến hành cho tất cả các cây nhân giống vơ
tính và cũng là biện pháp phục tráng cho các giống đã bị thối hóa do vi-rút và các
hình thức thâm canh khác. Các giả thiết giải thích tế bào sinh trưởng sạch vi-rút,

như: Vi-rút vận chuyển trong cây nhờ hệ thống mơ dẫn nhưng hệ thống này chưa có
ở mơ phân sinh do đó vi-rút khơng thể vào được tế bào mơ phân sinh; tại mơ phân
sinh đỉnh tế bào có tốc độ phân chia cao không đồng nhất với tốc độ nhân bản vật
chất di truyền của tế bào vi-rút và khi tế bào mô phân sinh phân chia không sao
chép thông tin di truyền của vi-rút; mô phân sinh đỉnh là nơi tổng hợp auxin nên
thường có hàm lượng cao, có tác dụng ngăn cản và ức chế sự sao chép vật chất di
truyền của vi-rút [2]. Nếu dùng đỉnh phân sinh khơng thể sống sót và tạo rễ một
cách độc lập, thì có thể thay thế bằng phương thức vi ghép (micrografting) [13].
Đỉnh sinh trưởng (mô phân sinh ngọn) là một đỉnh tròn gồm các tế bào phân
chia tích cực, có đường kính khoảng 0,1 mm và dài khoảng 0,25 mm. Ngồi “ni
cấy mơ phân sinh“ (meristem culture), các thuật ngữ khác như “nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng“ (meristem-tip culture), “nuôi cấy đỉnh“ (tip culture) hay “nuôi cấy chồi
đỉnh“ (shoot tip culture) cũng được sử dụng, trong chừng mực nào đó phụ thuộc vào
kích thước khối mơ tách ra. Thơng thường mơ phân sinh của thân chính và các chồi


10

nách được cắt theo các kích thước trên. Tuy nhiên, do khả năng tăng trưởng của mô
phân sinh rất thấp nên người ta cắt khối mô bao gồm cả đỉnh sinh trưởng và một
hoặc hai sơ khởi lá. Những đỉnh như vậy dài khoảng 1 mm và có nhiều khả năng để
phát triển hơn nhưng lại giảm mức độ sạch vi-rút [18].
b. Vật liệu khởi đầu dùng trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Kết quả nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phụ thuộc vào vật liệu khởi đầu; nguồn
gốc và kích thước của mẫu. Để đạt được hiệu quả cao, cần lấy mẫu nuôi cấy từ chồi
đang sinh trưởng mạnh hoặc chồi của cây mới ghép [39], [41]. Nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng cây non dễ dàng hơn cây trưởng thành, tỷ lệ ra rễ trong trường hợp này đạt
83%, trong khi với cây trưởng thành chỉ đạt 63% (52). Điều kiện nuôi cấy, thời
điểm lấy mẫu cũng ảnh hưởng rất lớn đến kết quả tái sinh cây từ đỉnh sinh trưởng.
Một số lồi có ưu thế chồi đỉnh mạnh, ni cấy đỉnh sinh trưởng từ chồi đỉnh dễ

dàng hơn từ chồi nách, đối với một số loài khác lại thu được kết quả ngược lại [25].
Kích thước mẫu ni cấy càng lớn, tỷ lệ tái sinh và sống sót của mẫu càng
cao, tuy nhiên mẫu càng nhỏ thì khả năng sạch bệnh vi-rút lại cao hơn. Do vậy, kích
thước mẫu ni cấy cần phải xác định bằng thực nghiệm đối với mỗi lồi. Mẫu ni
cấy nhỏ nhất chỉ có chóp sinh trưởng và 2 - 3 mầm lá sẽ là lý tưởng để tạo giống
sạch bệnh do mô phân sinh đỉnh nằm ở chóp đỉnh chồi, là trung tâm hoạt động sinh
trưởng, phân hoá và phát triển của thực vật. Ngay dưới mơ phân sinh này là các
mầm lá. Đơi khi kích thước mẫu lớn hơn vẫn đảm bảo sạch bệnh vi-rút, song một số
trường hợp khác lại đòi hỏi mẫu nhỏ hơn [41].
Tương quan giữa độ lớn của chồi nuôi cấy, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về
mặt di truyền của chồi được biểu hiện như sau: Nếu độ lớn tăng thì tỷ lệ sống và
tính ổn định tăng, nếu độ lớn giảm thì tỷ lệ sống và tính ổn định giảm. Nhưng xét về
hiệu quả kinh tế nuôi cấy (thể tích bình ni, lượng dung dịch mơi trường dinh
dưỡng): Nếu độ lớn tăng thì hiệu quả kinh tế giảm, nếu độ lớn giảm thì hiệu quả
kinh tế tăng. Do đó, phải kết hợp hài hịa được các yếu tố trên để tìm ra phương
thức lấy mẫu tối ưu.


11

Một đỉnh sinh trưởng ni cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo một hay nhiều
chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh. Xét về nguồn gốc của các
cây đó có ba khả năng:
- Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn).
- Cây phát triển từ chồi nách phát ngủ.
- Cây phát triển từ chồi mới phát sinh.
c. Kỹ thuật tách đỉnh sinh trưởng
Mô phân sinh chồi ngọn hoặc chồi bên đuợc bảo vệ triệt để bởi các lá đang
phát triển và các vảy bắc đến mức việc khử nhiễm gần như là không cần thiết. Để
khử trùng nhẹ bề mặt, các chồi và các đoạn thân đã cắt bỏ lá được rửa khoảng vài

giây trong cồn 96%, sau đó ngâm trong dung dịch Ca(ClO)2 50 g/l đã được lọc
trong 10 – 20 phút và rửa nhẹ vài lần bằng nước vơ trùng. Ngồi ra, cần có một kính
hiển vi với độ phóng đại 20 – 40 lần. Sau mỗi lần tách mơ phân sinh, kính hiển vi
cần được lau sạch [18].
Đặt một hộp 6 – 10 tấm giấy lọc vô trùng ( đã hấp vô trùng) và hai cốc 100
ml ở một bên kính hiển vi. Một cốc chứa cồn và cốc còn lại chứa nước vô trùng để
nhúng rửa các dụng cụ cắt trước khi lau khô bằng giấy thấm. Để tránh nhiễm vi-rút,
vi khuẩn và nấm, cần thường xuyên khử trùng (bằng cồn) phần đầu kim và các lưỡi
dao cắt. Một tay dùng panh giữ chồi dưới kính hiển vi, một tay cầm kim/dao ấn nhẹ
để cắt bỏ các lá non và sơ khởi lá. Sau đó dùng dao để cắt rời phần đỉnh sinh trưởng
lộ ra có hình đỉnh trịn sáng bóng. Đỉnh sinh trưởng được chuyển sang môi trường
dinh dưỡng trong các ống nghiệm nuôi cấy bằng cách chạm lưỡi dao lên bề mặt
thạch và nhấn lên nhẹ nhàng. Trong môi trường lỏng, mô phân sinh được đặt trên
miếng giấy thấm để một phần được ngập trong dung dịch [37].
Nhiều loại ống nghiệm ni cấy với các kích thước khác nhau đã được sử
dụng và các nhà nghiên cứu đề nghị dùng loại ống nhỏ có đưởng kính khoảng 10
mm bằng thuỷ tinh boronsilicate (Pyrex). Ống nghiệm nuôi cấy được đậy bằng nắp
làm bằng nhựa hoặc nhơm. Các nút bơng có thể được hơ khử trùng trên ngọn đèn
cồn, sau đó được ấn xuống dưới thành miệng ống và dán bên ngoài miệng một lớp


12

parafin. Đối với việc khử trùng nút bông cẩn thận khơng gây cháy nút, khói có thể
đi vào trong gây độc cho mô phân sinh [18].
d. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng sau khi xử lý nhiệt
Mặc dù được nuôi cấy trong môi trường được xem là thuận lợi cho sự phát
triển của mô phân sinh, nhưng không nhiều trong số đó phát triển và sạch vi-rút. Vì
vậy, một số nhà nghiên cứu đã tiến hành xử lý nhiệt các cây vật liệu trước khi tách
đỉnh sinh trưởng lớn hơn và nuôi cấy chúng [18].

Những đỉnh sinh trưởng này được cắt với chiều dài khoảng 1 mm và mang
hai hay ba sơ khởi lá. Người ta cho rằng sự nhân lên của vi-rút bị ức chế trong quá
trình xử lý nhiệt. Do nhiệt độ có thể ngăn cản q trình biến dưỡng và làm giảm sự
sinh trưởng của mô phân sinh, vì vậy cần tiến hành các thử nghiệm để xác định mơ
phân sinh có thể được giữ ở nhiệt độ cao trong bao lâu mà vẫn phát triển với số
lượng chấp nhận được, nhờ đó ta có thể thu được một tỉ lệ cao nhất các cây còn
sống và sạch vi-rút [15]. Khi nghiên cứu giống hoa Cúc Blanche, Portevine
Supréme, Hakkaart và Quak (1964) nhận thấy những nguyên liệu được xử lý nhiệt
trong 10, 20, hay 30 ngày tạo tỉ lệ cây sạch vi-rút tăng dần từ 9 đến khoảng 90%.
Tuy nhiên, việc xử lý nhiệt trong 40, 50, hay 60 ngày không làm thay đổi tỉ lệ này,
nhưng lại làm giảm đáng kể số lượng mô phân sinh phát triển thành cây. Tác động
rõ ràng này lên mô phân sinh thay đổi tuỳ theo các giống được nghiên cứu: trong
điều kiện tương đồng, giống Migoli tạo ra rất ít cây sau 20 và 30 ngày xử lý nhiệt,
nhưng dù sao những cây này cũng sạch vi-rút với tỉ lệ 100% (sau 20 ngày) và 70%
(sau 30 ngày) trong khi chỉ có 9% cây sạch bệnh được tạo ra ở những ngun liệu
khơng được xử lý nhiệt [53].
Một số lồi vi-rút cây khoai tây rất khó bị loại bỏ bằng phương pháp nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng, nhưng xử lý nhiệt có thể giúp giải quyết vấn đề này. MacDonald
(1973) đã làm sạch vi-rút X và S khỏi các giống khoai tây “Duke of York“ và
“Royal Kidney“ bằng cách nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tách ra từ chồi trên các củ đã
được xử lý nhiệt. Các đỉnh sinh trưởng của dâu tây được giữ ở nhiệt độ 35oC trong
một tuần hoặc hơn sẽ sinh trưởng nhanh và đạt đến giai đoạn trưởng thành với tỉ lệ
cao hơn so với những đỉnh sinh trưởng tách từ những cây không được xử lý. Những


13

cây này cũng đồng thời loại bỏ bệnh nhăn và vàng lá (pallidosis) [15]. Việc xử lý
nhiệt trước khi nuôi cấy chồi đỉnh đã giúp loại bỏ thành công một số chứng bệnh virút ở cây Khoai lang (Ipomoea batatas) [49].
Chúng ta có thể kết luận rằng trong những trường hợp mà vi-rút không thể bị

loại trừ bằng cách nuôi cấy ni cấy đỉnh sinh trưởng như vậy thì có thể cân nhắc
áp dụng các biện pháp xử lý nhiệt trước khi tiến hành tách đỉnh sinh trưởng. Quy
trình kết hợp này có ích với những cây trồng mà chỉ một tỉ lệ thấp những mẫu cấy
nhỏ phát triển một cách chậm chạp thành cây sạch vi-rút như cây hoa Cẩm chướng.
Đối với những cây này, việc tiền xử lý nhiệt tạo điều kiện cho các mẫu cấy đỉnh
sinh trưởng có kích thước lớn (1 – 2 mm) sinh trưởng và phát triển tạo cây con sạch
vi-rút dễ dàng hơn so vỡi những mẫu có kích thước nhỏ (0,1 – 0,3 mm) [15].
1.2.3. Điều kiêṇ nuôi cấy
a. Điều kiện vô trùng
Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo điều
kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm. Điều kiện vơ
trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro [21].
Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hố học,
đèn tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Riêng với kỹ thuật ni cấy đỉnh sinh
trưởng cịn sử dụng thêm buồng sinh trưởng để xử lý nhiệt vật liệu nuôi cấy.
Vơ trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định.
Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng thích hợp sẽ
mang lại hiệu quả vơ trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao. Thông thường hay sử dụng một số hoá
chất như: HgCl2 0,1%, nước Clolox, cồn 70o, Ca(ClO)2… để khử trùng [21].
Phương tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vơ trùng,
phịng ni cấ y [21].
b. Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ
Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính có ảnh hưởng cơ bản đến q trình
sinh trưởng của mô nuôi cấy [21]:


14

-

Ánh sáng:
Sự phát sinh hình thái của mơ ni cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như:

thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu
sáng tác động đến quá trình phát triển của mơ ni cấy. Thời gian chiếu sáng thích
hợp với đa số các loài cây là 12 – 18 h/ngày.
Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.
Theo Ammirato (1986): cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mơ
sẹo; ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn chung cường độ
ánh sáng thích hợp cho mơ ni cấy là 1000 - 7000 lux (Morein, 1974), ngồi ra
chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mơ thực vật in
vitro: ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu
mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt
tới sự sinh trưởng của mô sẹo.
Hiện nay trong các phịng thí nghiệm ni cấy mơ để cung cấp nguồn ánh
sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt
cách bình ni cấy từ 35 – 40 cm.
-

Nhiệt độ
Trong ni cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng

tới sự phân chia tế bào và các q trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào xuất xứ
của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích
hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 250C (White, 1973) [21].
1.2.4. Môi trường nuôi cấ y
Môi trường ni cấy là điều kiện vơ cùng quan trọng, có tính chất quyết định
sự phân hố tế bào và cơ quan trong nuôi cấy.
Môi trường nuôi cấy và môi trường xung quanh là những nhân tố quyết định
sự thành công hoặc thất bại của q trình ni cấy in vitro. Môi trường nuôi cấy là

nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự phân chia và phân hố của mơ tế bào trong
suốt q trình ni cấy. Vì vậy, những môi trường này phải đầy đủ chất dinh dưỡng,
các chất cần thiết.


15

Đối với hầu hết các lồi thực vật, mơi trường nuôi cấy bao gồm các nguyên
tố đa lượng, vi lượng, nguồn các bon, các axit amin, các chất kích thích sinh trưởng
và một số chất phụ gia. Thành phần dinh dưỡng, hàm lượng các chất cần thiết cho tế
bào sinh trưởng tốt nhất thay đổi tuỳ theo từng loài, giống, nguồn gốc mẫu cấy hay
từng cơ quan khác nhau trên cùng một cơ thể.
Từ những năm 1933, Turkey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực
vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại mơi trường khác nhau được sử dụng cho mục
đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS,
LS, WPM [4].
Tuy có nhiều loại mơi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một
số thành phần cơ bản sau:
+ Các muối khoáng đa lượng và vi lượng.
+ Nguồn cacbon.
+ Các vitamin và amino acid.
+ Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái mơi trường.
+ Các chất kích thích sinh trưởng.
a. Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
Đối với cây trồng, các chất khống đa lượng và vi lượng đóng vai trị rất
quan trọng. Ví dụ: Mg2+ là một phần của phân tử diệp lục, Ca2+ cấu tạo nên màng tế
bào, nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino acid và protein. Ngoài ra, các
nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzyme cần thiết
cho hoạt động sống của tế bào.
Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy tế

bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzyme.
Các ion của các muối hoà tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường
trong tế bào, duy trì điện thể hố của thực vật. Các yếu tố như: K+, Ca2+ rất quan
trọng trong điều hồ tính thấm lọc của tế bào.


16

b. Nguồn cacbon
Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường khơng có khả năng quang
hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của
tế bào.
Nguồn cacbon được ưa chuộng hiện nay trong nuôi cấy là đường saccarose,
một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccarose nhưng chúng
thường nghèo cacbon hydrat so với nhu cầu của thực vật.
Ngồi ra, khi khử trùng mơi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian
để tránh xảy ra hiện tượng caramen hố, làm cho mơi trường chuyển màu vàng dẫn
đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào [4].
c. Các vitamin
Trong q trình ni cấy, cây in vitro có thể tự tổng hợp được một số vitamin
cần thiết nhưng chưa đáp ứng được nhu cầu sinh trưởng. Việc sử dụng các vitamin
khác nhau thường làm thuận lợi cho sự phát triển của cây nuôi cấy in vitro .[19]
Các vitamin vẫn thường được sử dụng trong quá trình ni cấy mơ tế bào
thực vật thuộc nhóm B như:
-

B1 hoặc Thiamin: Phân hủy trong nồi hấp vô trùng (Autoclave), nhưng

các chất bị phân hủy này cũng có tác động lên sinh trưởng của mô như chưa phân
hủy.

-

B6 hoặc Pyridoxine .

-

Biotin.

-

Pantotheate Canxi.

-

Myo – inositol.

d. Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường
- Agar: Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để
làm rắn hố mơi trường. Hàm lượng agar sử dụng thường là 0,6 – 1% đây là loại
tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mơ chìm trong mơi trường hoặc bị
chết vì thiếu O2 như ni trong môi trường lỏng và tĩnh [2].
- pH môi trường: Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác
nhau nhưng pH của môi trường thường là 5,6 – 6,0 [19]. Nếu pH của môi trường