Nghiên cứu nâng cao chất lượng nhân giống cây hoa chuông (sinningia speciosa) bằng phương pháp vi thủy canh

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG


PHẠM NGỌC HÀ VI

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG NHÂN GIỐNG
CÂY HOA CHUÔNG (SINNINGIA SPECIOSA) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP VI THỦY CANH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đà Nẵng – Năm 2016


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG


PHẠM NGỌC HÀ VI

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG NHÂN GIỐNG
CÂY HOA CHUÔNG (SINNINGIA SPECIOSA) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP VI THỦY CANH

Chuyên ngành: CỬ NHÂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn: ThS. ĐÀM MINH ANH

Đà Nẵng – Năm 2016

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu riêng tơi.
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kì cơng trình nào khác.

Tác giả

Phạm Ngọc Hà Vi


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy
cô bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học sư phạmĐại học Đà Nẵng.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ThS. Đàm Minh Anh thầy giáo đã tận
tình hướng đẫn, giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện đề tài này. Và tôi cũng xin gửi
lời cảm ơn chân thành đến ThS. Trần Quang Dần là người đã giúp đỡ tôi rất nhiều
trong việc trau đồi kiến thức và kĩ năng thực hành thí nghiệm trong suốt q trình
làm khóa luận.
Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã ln sát cánh, động viên khích
lệ tơi về vật chất và tinh thần để tơi có thể đạt được kết quả tốt nhất.
Đà Nẵng, ngày 26 tháng 4 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Phạm Ngọc Hà Vi


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
2,4-D

: Diclorophenoxyacetic acid

AC

: Active carbon (than hoạt tính)

BA

: 6-benzyl adenine

BAP

: 6-benzyl amino purine

B5

: Gamborg (1968)

Cs

: Cộng sự

CW

: Cononut water (nước dừa)

IBA

: Indole 3-butyric acid

KIN

: Kinetin

ĐHST : Điều hòa sinh trưởng
MS

: Murashige và Skoog (1962)

NAA

: α-naphthalen acetic acid

TDZ

: Thidiazuron

VTC

: Hệ thống vi thủy canh in vitro

ĐC

: Hệ thống truyền thống

VTC2

: Hệ thống vi thủy canh ex vitro

DANH MỤC CÁC BẢNG
TÊN BẢNG

BẢNG
3.1

Ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả

TRANG
15

năng tạo rễ in vitro cây hoa chuông sau 2 tuần nuôi cấy.
3.2

Khả năng sinh trưởng hoa chuông trong hệ thống vi thủy

18

canh ex vitro

3.3

Tỉ lệ sống sót của hoa chuông sau một tháng trồng

20

3.4

Khả năng ra hoa của cây hoa chuông

21

3.5

Động thái ra lá của hoa chuông trồng bằng phương pháp

22

thủy canh
3.6

Một số đặc điểm của lá cây hoa chuông trồng bằng thủy

23

canh
3.7

Một số đặc điểm của hoa trồng bằng phương pháp thủy
canh

24


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình
2.1

3.1

3.2

Tên hình
Mơ hình bố trí thí nghiệm
Cây con in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trong môi
trường có hàm lượng đường
Cây hoa chng trong hệ thống vi thủy canh ex vitro.

Trang
13

18

19


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề ...............................................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................2
3.1. Ý nghĩa khoa học ..............................................................................................2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................3
1.1. Giới thiệu về kỹ thuật thủy canh và vi thủy canh ................................................3
1.1.1. Kỹ thuật thủy canh ........................................................................................3
1.1.2. Kỹ thuật vi thủy canh ....................................................................................3
1.1.3. Tình hình nghiên cứu về thủy canh và vi thủy canh trong nhân giống cây
trồng ........................................................................................................................4
1.2. Nghiên cứu nuôi cấy nhân giống in vitro ở thực vật ............................................6

1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro .............................................6
1.2.2. Các nghiên cứu nhân giống hoa bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro ..................7
1.3. Giới thiệu về cây hoa chuông ...............................................................................8
1.3.1. Đặc điểm sinh học.........................................................................................8
1.3.2. Giá trị ............................................................................................................9
1.3.3. Những nghiên cứu về hoa chuông ................................................................9
2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................12
2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................12
2.2.1. Chuẩn cho thí nghiệm .................................................................................12
2.2.2. Các phương pháp theo dõi thí nghiệm ........................................................13
2.3. Xử lí thống kê .....................................................................................................14
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..............................................................15
3.1. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose đến khả năng tạo rễ của cây hoa chuông
trong hệ thồng vi thủy canh in vitro ..........................................................................15


3.2. Khả năng sinh trưởng của hoa chuông trong hệ thống nuôi cấy vi thủy canh ex
vitro ...........................................................................................................................17
3.3. Đánh giá chất lượng cây hoa chuông tại vườn ươm ..........................................20
3.3.1. Tỉ lệ sống sót ...............................................................................................20
3.3.2. Khả năng sinh trưởng và phát triển của cây hoa chuông trồng bằng phương
pháp thủy canh ......................................................................................................21
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................26
KẾT LUẬN ...............................................................................................................26
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................26


1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Cơng nghệ nhân giống vơ tính in vitro bằng nuôi cấy mô thực vật đã trở thành
phương pháp nhân giống hiệu quả với hệ số nhân giống cao, cây sạch bệnh, đồng
đều về chất lượng, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, cơng nghệ
này cịn gặp phải một số hạn chế như việc ni cấy trong bình kín dẫn đến việc rối loạn
chức năng chồi, khí khổng, ảnh hưởng bất lợi của chất điều hòa tăng trưởng… Do nồng
độ CO2 thấp và ẩm độ cao (trên 95%) trong bình ni cấy ảnh hưởng lớn đến sự tăng
trưởng và phát triển của cây con sau khi chuyển ra vườn ươm [20]. Ngoài ra, độ đặc
của agar trong môi trường nuôi cấy cũng ức chế sự phát triển và kéo dài rễ [22].
Những hạn chế trên chính là nguyên nhân làm giảm chất lượng và tăng giá thành sản
phẩm cây giống.
Kĩ thuật vi thủy canh với những đặc tính ưu việt như khơng địi hỏi điều kiện
nuôi cấy, không cần vô trùng và việc điều khiển môi trường nuôi cấy cũng đơn giản
hơn phương pháp quang tự dưỡng, dinh dưỡng trong môi trường lỏng có thể khuyết
tan rộng khắp mơi trường. Đây được xem là giải pháp hỗ trợ hiệu quả nhằm khắc
phục những hạn chế của kỹ thuật nhân giống in vitro và quang tự dưỡng. Kỹ thuật
vi thuỷ canh là sự kết hợp giữa kỹ thuật vi nhân giống và kỹ thuật thủy canh. Bên
cạnh đó, điều kiện mơi trường của hệ thống vi thủy canh tương đồng với điều kiện
ngồi phịng thí nghiệm nên việc thuần dưỡng cây con ngồi vườn ươm rất thuận lợi
và do đó ở giai đoạn sau vườn ươm, cây có thể thích ứng kịp thời với mơi trường
mới. Từ đó sẽ tạo ra cho chúng ta những giống cây chất lượng tốt hơn, rút ngắn thời
gian, chi phí thấp hơn.
Cây hoa chng là một trong những loài hoa ngoại nhập, đang được thị trường
hoa Việt Nam ưa chuộng do có nhiều ưu điểm như hoa nở quanh năm, với nhiều
màu sắc đa dạng: trắng, đỏ, tím viền trắng, đỏ viền trắng…, thời gian tàn rất lâu
khoảng 20 ngày kể từ ngày nở. Việc nhân giống hoa chng bằng kĩ thuật in vitro
bước đầu đã có thành cơng nhất định. Tuy nhiên, để sản xuất lồi hoa này cho sản
phảm chất lượng tốt, giá thành sản xuất thấp, cây giống có tính thích nghi nhanh với

2
mơi trường tự nhiên cần có những biện pháp hỗ trợ, cải tiến về quy trình nhân
giống.
Xuất phát từ những cở sở trên chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu nâng
cao hiệu quả nhân giống cây hoa chuông (Sinningia speciosa) bằng phương
pháp vi thủy canh” nhằm tạo tạo ra cây giống chất lượng tốt, tích kiệm chi phí sản
xuất.
2. Mục tiêu của đề tài
Đánh giá hiệu quả của việc ứng dụng hệ thống vi thủy canh trong nhân giống in
vitro nhằm nâng cao khả năng ra rễ và chất lượng của hoa chuông.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học về phương pháp
vi thủy canh đối với hoa chuông, góp phần làm phong phú hơn cơ sở dữ liệu về kĩ thuật
vi thủy canh.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để chủ động sản xuất nhanh, với chất
lượng giống tốt, giá rẻ, đủ sức cạnh tranh với các giống nuôi cấy mô nước ngoài.


3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về kỹ thuật thủy canh và vi thủy canh
1.1.1. Kỹ thuật thủy canh
Thủy canh là kỹ thuật trồng cây không cần đất mà trồng trực tiếp vào dung
dịch dinh dưỡng cung cấp tất cả các thành phần dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng
trưởng tối thích của thực vật, có sử dụng hoặc không sử dụng giá thể trơ như: cát,
xơ dừa, mùn cưa [9].
Từ nhiều thế kỷ trước ở các vùng Amazon, Babylone, Ai cập, Trung Quốc và
Ấn Độ, người xưa đã biết sử dụng phân bón hồ tan để trồng dưa chuột, dưa hấu và

nhiều loại rau củ khác. Sau đó các nhà sinh lý thực vật bắt đầu trồng cây trên mơi
trường dinh dưỡng đặc biệt để thí nghiệm và họ gọi đó là "ni cấy dinh dưỡng".
Năm 1929, William F. Goricke, Đại học California đã thành công trong việc trồng
cây cà chua đạt kích thước 7,5 m trong dịch dinh dưỡng. Ông gọi hệ thống mới này
là "thủy canh" ("Hydroponic", theo tiếng Hy Lạp, hydros là "nước" và ponic là "làm
việc"). Từ đó, thủy canh được ứng dụng và phát triển rộng rãi, và mở rộng thành
các phương pháp trồng cây trên môi trường rắn trơ sử dụng dung dịch dinh dưỡng.
Đặc điểm chính của kỹ thuật thuỷ canh là khơng cần đất nên đây chính là giải
pháp cho ngành nơng nghiệp ở những đất nước vốn có ít đất canh tác, ở các thành
phố lớn hoặc vùng đất cằn cỗi. Việc trồng cây không cần đất đem lại rất nhiều thuận
lợi, cây trồng sinh trưởng và phát triển nhanh hơn trong mơi trường thủy canh có
đầy đủ các thành phần dinh dưỡng thiết yếu. Mặt khác, kỹ thuật thuỷ canh cho phép
thiết lập hệ thống nuôi trồng tự động và do đó có thể linh hoạt được thời gian chăm
sóc cây trồng. Chính vì thế kỹ thuật thủy canh là một trong những kĩ thuật tiến bộ
của làm vườn hiện đại và được xem là ngành nông nhiệp trong tương lai [22].
1.1.2. Kỹ thuật vi thủy canh
Kỹ thuật vi nhân giống ra đời tạo nên một cuộc cách mạng trong lĩnh vực nhân
giống thực vật, giúp cung cấp nhanh với số lượng lớn các giống cây quý theo yêu
cầu mà vẫn giữ được đặc tính di truyền của thực vật. Tuy nhiên, những giới hạn của
kỹ thuật này về độ ẩm, nhiệt độ, quang hợp, nồng độ CO2, nồng độ chất dinh


4
dưỡng, sự tích lũy khí ethylene và những chất thải khác, vi sinh vật không hiện diện
trong môi trường [30]. … làm giảm sức sống của cây nuôi cấy mô.
Kỹ thuật vi thuỷ canh (microponic) là sự kết hợp giữa kỹ thuật vi nhân giống
(micropropagation) và kỹ thuật thủy canh (hydroponic), đây là hệ thống công nghệ
mới trên thế giới. Mô thực vật được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng phát triển
thành chồi in vitro, sau đó chồi in vitro được cung cấp chất dinh dưỡng dưới dạng
dung dịch để tạo thành cây hoàn chỉnh [26]. Trong kĩ thuật vi thủy canh được chia

làm hai loại: vi thủy canh in vitro và vi thủy canh ex vitro. Vi thủy canh in vitro là
hệ thống ni cấy kín có mơi trường ở dạng lỏng. Vi thủy canh ex vitro là hệ thống
ni cấy thống khí có mơi trường ở dạng lỏng.
1.1.3. Tình hình nghiên cứu về thủy canh và vi thủy canh trong nhân giống cây
trồng
Năm 2005, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã công bố các nghiên cứu ảnh hưởng
của nuôi cấy lỏng trong vi nhân giống cây hoa Hồng Mơn (Anthurium Spp). Kết quả
đã cho thấy thể tích môi trường nuôi cấy ảnh hưởng quang trọng đến sự tái sinh
chồi của cây Hông môn trong in vitro và chỉ số pH cho phép của cây này lớn hơn 4
dưới 3,5 cây sẽ chuyển sang màu vàng và chết dần [8].
Năm 2005, Nguyễn Quốc Thiện và cs đã nghiên cứu nâng cao chất lượng của
cây giống hoa cúc và ni cấy in vitro thơng qua ni cấy thống khí. Kết quả việc
ni cấy thống khí thu được nhiều ưu điểm hơn so với nuôi cây truyền thống hệ rễ
phát triển mạnh trong giai đoạn in vitro tỷ lệ sống cao, sinh trưởng và phát triển tốt
khi vườn [15].
Năm 2005, Dương Tấn Nhựt và cộng sự cũng đã nghiên cứu thành công việc
nhân nhanh in vitro cây hoa chuông bằng phương pháp nuôi cấy đốt và xử lý ra rễ
ex vitro. Thu được kết quả đốt thứ 2 (tính từ ngọn) cho sự tái sinh chồi tốt nhất trên
MS có bổ sung 1,0 mg/BA. Sau đó, các đoạn cắt có mang chồi đỉnh được tiền xử lý
với chất kích thích ra rễ ở IBA 1000 ppm cho kết quả là tốt nhất [9].
Trong năm 2005 này, Dương Tấn Nhựt và cộng sự tiếp tục cơng bố cơng trình
nghiên cứu hệ thống vi thủy canh trong sản xuất giống cúc sạch bệnh. Tất cả chồi
nuôi cấy đều được xử lý NAA nồng độ 500 ppm trong 20 phút rồi đưa vào nuôi vi


5
thủy canh. Kết quả sau 28 ngày, đối với chồi dài 3 cm tách ra từ cụm chồi in vitro,
môi trường dinh dưỡng là nước tỉ lệ sống là 100%, trọng lượng tươi là 0,31 g, chiều
đài chồi 5,99 cm, chiều dài rễ 3,08 cm [7].
Cuối năm 2005, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã nghiên cứu phương pháp thủy

canh trong việc nâng cao chất lượng cây hoa African Violet phục vụ cho người
trồng hoa. Kết quả sau ba tháng trồng trong đất và thủy canh cho thấy hệ thống thủy
canh cho số lượng hoa (20 - 25) cũng như tuổi thọ hoa (2 - 2,5 tháng) cao hơn so
với trong đất (13 - 15) và (1 - 1,5 tháng) [10].
Năm 2006, Văn Hoàng Long và cộng sự đã nghiên cứu kĩ thuật vi thủy canh
trong sản suất giống cúc sạch bệnh. Chồi cúc dài 3 - 3,5 cm được cát từ chồi nhân
nhanh in vitro xử lý với auxin khác nhau trong khoảng thời gian 10-13 phút. Kết
quả sau 14 ngày IBA nồng độ 500 ppm xử lý trong 20 phút là cho hiệu quả hơn cả
[16].
Năm 2010, Lê Quang Công và cộng sự nghiên cứu hệ thống thủy canh tự tạo
trong việc nâng cao chất lượng cây dâu tây (Fragaria Spp) in vitro ở giai đoạn vườn
ươm. Cây dâu tây in vitro sau khi ra rễ từ 3,8 - 4 cm được đưa ra ngồi thích trên hệ
thống thủy canh. Kết quả thu được sau 30 ngày trồng cho thấy tỷ lệ sống, chiều cao
cây, so với hệ thống truyền thống, chỉ sau 90 ngày cây ra hoa, sau 120 ngày cây có
thể thu hoạch quả [2].
Năm 2010, Nguyễn Thị Xuân Tâm nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật vi thủy canh
(microponic) trong nhân giống cây hoa cúc vàng hoe (chrysanthemun indicum L).
Các chồi cúc in vitro tạo rễ tốt nhất sau 14 ngày nuôi cấy với môi trường là nước cất
(16,00 rễ/mẫu, CDR: 1,58 cm) khi được xử lý trước với IBA nồng độ 250 ppm
trong 10 phút [8].
Năm 2012, Nguyễn Thụy Phương Duyên và cs nghiên cứu các điều kiện thích
hợp cho sự tăng trưởng của cây húng tây (Thymus vulgaris L.) thuộc họ Lamiaceae
nuôi cấy in vitro trong sự tác động của các yếu tố môi trường. Sau 28 ngày nuôi
cấy, đốt thân cây T. vulgaris mang chồi ngủ tạo chồi nhiều nhất (4,3 chồi/mẫu) trên
môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA, 0,5 mg/l IBA, 30 g/l đường sucrose dưới
cường độ ánh sáng 40 µmol m-2 s-1 và thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày. Ở ngày thứ


6
35, sự tăng trưởng của cây từ đốt thân tốt nhất khi được nuôi cấy trong điều kiện

quang tự dưỡng ex vitro (môi trường nuôi cấy không bổ sung đường, vitamin và
chất điều hòa sinh trưởng thực vật) dưới cường độ ánh sáng 95 µmol m-2 s-1, thời
gian chiếu sáng 12 giờ/ngày, trong mơi trường gồm khống MS với thành phần đa
lượng giảm 1/2, có bổ sung thêm 200 mg/L KNO3, 200 mg/L KH2PO4 [3].
Năm 2013, Nguyễn Thị Kim Yến và cs Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của
than hoạt tính và ni cấy thống khí lên khả năng sinh trưởng và phát triển của cây
hoa Đồng tiền. Kết quả cho thấy mơi trường MS có bổ sung 30 g/l sucrose, 9 g/l
agar và 1 g/l than hoạt tính ở điều kiện ni cấy thống khí ex vitro là mơi trường
thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển cây hoa Đồng tiền. Cây hoa Đồng tiền
ni cấy thống khí ex vitro trên mơi trường MS có bổ sung 1 g/l than hoạt tính khi
chuyển ra vườn ươm có tỉ lệ sống sót rất cao (95 %) [17].
1.2. Nghiên cứu nuôi cấy nhân giống in vitro ở thực vật
1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro
1.2.1.1. Môi trường ni cấy
Thành phần hóa học của mơi trường ni cấy ảnh hưởng lớn đến sự sinh
trưởng và phát triển của cây in vitro. Mơi trường ni cấy lí tưởng là mơi trường có
thể cung cấp cho mơ đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết (bao gồm đường là
nguồn cacbon và năng lượng trong nuôi cấy dị dưỡng và quang dị dưỡng). Có
nhiều loại mơi trường cơ bản được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật như
môi trường MS (1962), LS (1965), B5 (1968), NN (1969). Tuy nhiên môi trường
MS (1962) được xem là môi trường có hàm lượng và thành phần các muối khống
phong phú hơn cả, vậy nên hầu hết các thí nghiệm ni cấy mô hiện nay đều sử
dụng môi trường này. Trong các cơng trình nghiên cứu về cây hoa chng đều sử
dụng môi trường nuôi cấy cơ bản là MS (1962) [35, 36].
Ngồi lượng chất dinh dưỡng trong các mơi trường ni cấy cơ bản, có nhiều
lồi cây cần thêm các hợp chất hữu cơ bổ sung từ bên ngoài để kích thích sự tăng
trưởng của mơ. Các chất bổ sung có thể là: nước cam, nước cà chua, dịch chiết
khoai tây… và đặc biệt phổ biến là nước dừa [3]. Trạng thái vật lí của mơi trường
ảnh hưởng đến khả năng lấy chất dinh dưỡng và sự phát triển của mô cấy. Hàm

7
lượng agar thường được sử dụng từ 6 – 10 g/L, nồng độ tốt nhất là 8 g/L [5]. Nồng
độ pH quyết định đến trạng thái vật lí của mơi trường, pH dưới 5,5 làm cho agar
khó chuyển sang trạng thái gel, pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng [16]. Nồng độ pH
phù hợp nhất thường được sử dụng là 5,8 [14].
1.2.1.2.Điều kiện nuôi cấy
Cùng với môi trường ni cấy, các điều kiện vật lí trong q trình nuôi cấy
cũng ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây in vitro.
Ánh sáng: Ánh sáng tác động lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật do
ảnh hưởng của quang kì, sự quang hợp và quang phát sinh hình thái. Nhu cầu ánh
sáng của mỗi loại thực vật không giống nhau, một số cây phát triển tốt trong điều
kiện tối, một số cần ánh sáng liên tục và những cây khác dưới điều kiện trung gian.
Ánh sáng là một trong những yếu tố kiểm sốt sự nảy mầm của hạt, vừa có hoạt
động cảm ứng ngủ vừa tháo gỡ sự ngủ của hạt [6]. Thông thường điều kiện tốt nhất
cho sự sinh trưởng của hầu hết cây từ 16 – 18 giờ chiếu sáng mỗi ngày [38].
Nhiệt độ: Nhiệt độ có tác động vào sự phát sinh hình thái in vitro, do đó nó
cũng kiểm soát sự sinh trưởng và phát triển in vitro của cây [6]. Cây hoa chng
sinh trưởng thích hợp trong khoảng nhiệt độ 18 – 24°C [39].
1.2.2. Các nghiên cứu nhân giống hoa bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro
Hiện nay nhiều nhà khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã và đang
nghiên cứu công nghệ nuôi cấy mơ với mục đích nhân nhanh nhiều giống hoa đẹp,
quý nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường cũng như bảo vệ nguồn
các nguồn gen quý.
Năm 1980, Hosoki và cs nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây hoa thủy tiên
(Narcissus poeticus). So sánh hiệu quả tái sinh chồi từ các nguồn mẫu khác nhau:
cuống hoa, bầu nhụy, búp hoa và lá trên môi trường MS cơ bản. Kết quả chỉ ra rằng
cuống hoa cho tỉ lệ tái sinh cồi cao nhất với 21 chồi/mẫu trên môi trường MS bổ
sung 5,0 mg/L BA + 1,0 mg/L NAA sau 2 tháng. Bầu nhụy, búp hoa và lá cho tỉ lệ
tái sinh chồi thấp hơn. Chồi được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L

NAA cho hiệu quả ra rễ tốt nhất [27].


8
Zuzartea và cs (2010) nghiên cứu khả năng lưu giữ tinh dầu qua nhiều lần
nhân nhanh trong ống nghiệm ở cây hoa oải hương Lavandula pedunculata. Kết quả
cho thấy, trên môi trường MS bổ sung 0,25 mg/L BA cho hiệu quả nhân nhanh chồi
tốt nhất và môi trường MS không bổ sung auxin thích hợp để ra rễ. Các cây con có
chất lượng tinh dầu tốt và khơng bị giảm sút qua nhiều thế hệ [46].
Năm 2012, Mahendran và cs đã nuôi cấy in vitro thành công cây Cymbidium
bicolor. Hạt giống sau khi nảy mầm trên môi trường MS sau 8-9 tuần. Protocorm
phát triển tốt nhất khi được cấy vào mơi trường MS có bổ sung 5 mg/l BA và 2,5
mg/l NAA. Môi trường tạo rễ là MS bổ sung 0,1 mg/l IBA. Cây con được chuyển
sang trồng với giá thể than, rơm, phân bị (1:1:1), tỷ lệ sống sót 88% [31].
Ở nước ta, những năm trở lại đây việc nhân giống các loại cây đặc biệt là các
loài hoa bằng công nghệ nhân giống in vitro đang ngày được chú trọng.
Nguyễn Thị Phương Thảo và cs (2011) đã nghiên cứu nhân nhanh cây hoa
loa kèn (Lilium poilanei Gapnep) sử dụng nguyên liệu là mô vẩy. Kết quả đã xác
định được mơi trường tái sinh chồi thích hợp cho mơ nuôi cấy là MS + 0,5 mg/L
BA + 0,5 mg/L NAA + 30g/L sucrose, trên môi trường này tỷ lệ chồi tái sinh
83,33%, 2,67 chồi/mẫu sau 8 tuần. Hệ số nhân chồi đạt cao nhất 4,13 lần, chiều cao
trung bình cụm chồi đạt 2,64 cm trên môi trường MS chứa 1,0 mg/l BA và 0,25
mg/L NAA. Các chồi có chiều cao 4 - 5 cm được sử dụng tạo rễ in vitro. Tỷ lệ chồi
ra rễ đạt được cao nhất (93,33%) trên môi trường MS chứa 1,0 g/L than hoạt tính
sau 4 tuần [14].
1.3. Giới thiệu về cây hoa chng
Hoa chuông (Sinningia speciosa) thuộc họ Tai voi (Gesneriacea). Đây là cây
thân thảo, có nguồn gốc từ Đơng Nam Brazil nên cịn gọi là hoa chng Brazil [1].
Cây được trồng rộng rãi nhiều nơi trên thế giới như Brazil, Ấn Độ, Nhật Bản, Thái
Lan, Philippin…[23].

1.3.1. Đặc điểm sinh học
Cây hoa chuông có chất lượng tốt nhất khi nảy mầm từ hạt. Hạt hoa chng
rất nhỏ, mỗi hạt chỉ nặng khoảng 3,5×10-5 gam [29]. Cây thường nở hoa sau 4-5
tháng gieo trồng từ hạt [19]. Hoa chuông cũng thường được trồng bằng củ, vào


9
tháng 12 – 3 là thời điểm thích hợp để các chồi mới nảy mầm từ củ [40]. Hoa
chuông là cây thân thảo, cao khoảng 10 – 30 cm, đường kính tán 22 – 33 cm, thân
thấp, lá rộng mọc sát đất, lá có hình oval màu xanh lá cây đậm, có lơng nhung mềm
mượt, mặt dưới của lá thường hơi đỏ. Cuống lá thn, gân lá hình xương cá, có
nhiều lơng tơ mịn, lá mọc đối xứng từng cặp xen kẽ nhau. Hoa có hình chng khá
to, rất khoe sắc do có ít lá, nhiều hoa nở cùng lúc, mỗi đợt hoa nở kéo dài khoảng
20 ngày. Hoa có hình chng, đường kính khoảng 6 – 9 cm mọc đơn lẻ hay mọc
thành từng cụm nhiều bơng. Chúng có thể có hai màu với màu trắng ở giữa hoặc
màu trắng ở ngồi mép cánh hoa. Hoa có nhiều màu: trắng, hồng, hồng da cam,
cam, đỏ, xanh, tím, cho đến tím sẫm. Hoa có thể cánh đơn hoặc cánh kép, cánh hoa
mềm mại, rìa cánh hoa trơn mịn hoặc gợn sóng, có phủ lớp lơng mịn như nhung.
Các cánh hoa xếp xen kẽ nhau. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự tăng trưởng của cây
hoa chuông là 18 – 24°C [29]. Cây hoa chuông cần nhiều ánh sáng nhưng không
phải là ánh sáng mặt trời trực tiếp, ánh sáng trực tiếp sẽ làm cháy là. Độ ẩm thích
hợp nhất cho sự sinh trưởng của cây là 70 – 75% [40].
1.3.2. Giá trị
Hoa chuông sinh trưởng trong điều kiện tránh ánh sáng trực tiếp nên phù hợp
với nhiều mục đích khác nhau như: trang trí trong nhà, ban cơng, cơng viên, công
sở…
1.3.3. Những nghiên cứu về hoa chuông
Năm 1999 Scaramuzzi và cs đã nghiên cứu sự tái sinh chồi bất định từ từ
mẫu lá của cây hoa chuông trong ống nghiệm đồng thời theo dõi sự ổn định của bộ
nhiễm sắc thể lồi qua các chồi tái sinh. Trên mơi trường MS bổ sung IAA và KIN,

kết quả tạo 80% mô sẹo có màu xanh lá cây và phát sinh 25-30 chồi/ mẫu, có sự
phát sinh chồi trên tất cả các mẫu cấy. Khi cấy các mẫu lá lên môi trường MS bổ
sung IAA và BA cũng cho kết quả 80% mẫu cấy tạo mô sẹo mày xanh lá cây, môi
trường này tỏ ra vượt trội hơn khi kích thích tái tạo chồi cao hơn hẳn mơi trường
trước đó 40 chồi/mẫu, tuy nhiên khơng có tự phát sinh rễ trên tất cả các mẫu cấy.
Khi so sánh bộ nhiễm sắc thể từ các tế bào của chồi phát sinh với tế bào gốc của cây


10
hoa chng cho thấy bộ nhiễm sắc thể của lồi khơng đổi qua các lần tái sinh vơ
tính (2n = 26) [35].
Năm 2001, Shagufta N và cs đã nhân giống thành công cây hoa chuông và
chỉ ra rằng chồi phát sinh từ lá tốt nhất trên mơi trường MS có bổ sung 3,0 mg/L
BA, các đoạn chồi được cấy trên môi trường MS bổ sung 2,0 mg/L BA để nhân
nhanh cụm chồi. Những đoạn chồi cao 2 - 2,5 cm được cấy trên mơi trường MS có
bổ sung 1,0 mg/L NAA sau 4 - 5 tuần 100% ra rễ tạo cây hoàn chỉnh [36].
Xu và cs (2009) đã nghiên cứu về những biến thể cây hoa chuông phát sinh
trong quá trình tái sinh chồi in vitro. Nhóm tác giả sử dụng 2 phương thức nhân
chồi từ lá: phương pháp đầu tiên kích thích sự tạo thành mơ sẹo và chồi, sau đó là
hình thành rễ, với phương pháp này, các mẫu lá được cấy lên môi trường MS bổ
sung 2,0 mg/L BA và 0,2 mg/L NAA và cho hiệu quả tái sinh chồi 99%. Phương
pháp thứ 2, mơi trường thí nghiệm được sử dụng là MS bổ sung 1,0 – 5,0 mg/L
NAA, các mẫu lá cấy trên môi trường này hình thành mơ sẹo và phát sinh rễ trước
sau đó mới phát sinh chồi, hiệu quả tái sinh chồi là 90,4 % [43].
Nhóm tác giả Lã Thị Thu Hằng và cs (2012) đã nghiên cứu khả năng sinh
trưởng, phát triển và sâu bệnh của giống hoa chuông màu đỏ trên các loại giá thể
khác nhau trên địa bàn thành phố Huế, tỉnh Thừa Thiên Huế vụ Đông Xuân năm
2009 – 2010. Kết quả nghiên cứu cho thấy giống hoa chuông sinh trưởng phát triển
tốt trong điều kiện thời tiết khí hậu vụ Đông-Xuân ở tỉnh Thừa Thiên Huế và giá thể
phù hợp cho cây hoa chuông sinh trưởng và phát triển tốt nhất là giá thể được phối

trộn giữa đất phù sa, phân chuồng hoai mục và trấu hun với tỉ lệ 1:1:1. Các loại sâu
bệnh hại chủ yếu là sâu khoang, sâu xám và bệnh thối thân do nấm Pythium sp,
Collectotrichum sp gây nên [4].
Năm 2012, Nguyễn Quang Thạch và cs tiến hành nghiên cứu nhân nhanh in
vitro cây hoa chuông, sử dụng nguyên liệu là mô lá và đoạn thân mang mắt ngủ.
Khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong vòng 10 phút cho hiệu quả khử trùng tốt
nhất. Sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA và 0,2 mg/L
NAA cho tỉ lệ phát sinh chồi tối ưu. Mơi trường ½ MS cho kết quả ra rễ tốt hơn các
môi trường MS và MS bổ sung NAA. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng phân bón có tác


11
dụng rõ rệt trong việc tăng trưởng của cây hoa chuông nuôi cấy mô. Cây hoa
chuông cấy mô khi được bón phân hữu cơ vi sinh và phân bón lá cho tăng trưởng
gấp 1,5 đến 1,9 lần so với không sử dụng phân bón. Ở giai đoạn thương phẩm (cây
lấy hoa), nên sử dụng giá thể đất + trấu hun + EM Bokashi 5 (tỉ lệ 4:8:1) và phun
NPK (21:21:21) 1 g/L/tuần cho cây hoa chuông phát triển tốt, tăng năng suất hoa
[12].
Eui và cs (2012) đã thực hiện nghiên cứu về việc sử dụng bạc nitrate và xử lý
putresxin nhằm cải thiện sự phát sinh cơ quan chồi ở Gloxinia. Nhóm tác giả sử
dụng mơ lá cây hoa chng để ni cấy trong mơi trường MS có bổ sung BAP và
NAA. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng với mơi trường MS có bổ sung 2 mg BAP/l
và 0,1 mg NAA/l cho kết quả cao nhất về tỷ lệ tạo chồi/mẫu cấy (12,3 ± 0,8) và
chiều cao chồi là (1,2 ± 0,1 cm) sau 6 tuần theo dõi. Khi bổ sung bạc nitrat là 7 mg/l
đã làm tăng hệ số nhân chồi và sự phát triển của chồi lần lượt là (23,9 ± 1,6) và (1,7
± 0,2 cm) sau 6 tuần theo dõi. Tương tự, khi bổ sung putresxin với nồng độ 50 mg/l
đã làm tăng số chồi (19,2 ± 1,6) và chiều cao chồi là (1,7 ± 0,2 cm). Sau khi chuyển
sang môi trường tạo rễ, cây nuôi cấy mô được đưa ra vườn ươm với tỷ lệ sống đạt
90% [23].
Sharma (2013) đã nghiên cứu nâng cao khả năng tạo chồi của cây hoa

chuông từ lá. Mẫu lá được khử trùng bề mặt bằng dung dịch HgCl2 0,1% và
Bavistin 2%. Môi trường nuôi cấy tạo chồi là môi trường MS bổ sung 2 mg BAP/l
và 0,5 mg NAA/l trong thời gian 2 tuần số lượng trung bình chồi là 7,3 chồi/mẫu
cấy. Chồi sau đó được ni cấy trong mơi trường tạo rễ MS có bổ sung NAA và
IBA. Cây hoa chuông in vitro được chuyển ra vườn ươm trên giá thể gồm đất sạch
và cát với tỷ lệ 1:1 [37].
Nhân xét: ứng dụng kỹ thuật nuôi cây mô tế bào thực vật để nhân giống vơ
tính in vitro cây hoa chuông, đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà
khoa học trên thế giới và trong nước. Tuy nhiên, ở Đà Nẵng chưa có một nghiên
cứu cụ thể nào về việc ứng dụng phương pháp vi thủy canh trong nhân giống cây
hoa chuông để tạo ra cây giống có chất lượng tốt, phù hợp với điều kiện sinh thái,
phục vụ nhu cầu sản xuất trên quy mô lớn tại địa phương


12

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là cây hoa chuông (Sinningia speciosa) thuộc: bộ
Lamiales và họ Gesneriaceae.
Đề tài tiến hành nghiên cứu tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học thực vật,
khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng từ tháng
1/2015 – 05/2016.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn cho thí nghiệm
2.2.2.1. Thiết kế giá thể
Được làm từ nylon chịu nhiệt (kích thước 20 × 30 cm2) được quấn quanh ống
nghiệm (đường kính 1 cm) và được hàn bằng que kim loại nóng. Các ống được rút
khỏi ống nghiệm và các phần không cần thiết được cắt đi. Sau cùng các ồng dài

được cắt thành những ống nhỏ có chiều cao 2 cm [7].
2.2.2.2. Chuẩn bị hệ thống nuôi cấy
Hệ thống truyền thống (ĐC) Hệ thống truyền thống được sử dụng làm đối chứng.
Môi trường được rót vào các bình thủy tinh ở thể tích 25 ml/bình 250 ml. Các bình được
bịt kín bằng bao nylon trước khi hấp khử trùng ở 121ºC, 1 atm trong 20 phút.
Hệ thống vi thủy canh in vitro (VTC) các ống nhỏ được xếp thẳng đứng
trong các bình nuôi cấy (250 ml) bằng thủy tinh với mật độ là 25 ống/bình. Mơi
trường được đổ vào mỗi bình với thể tích 25 ml. Các bình ni cấy được đậy kín
bằng bao nylon và khử trùng ở 121oC, 1 atm trong thời gian 30 phút.
Hệ thống vi thủy canh ex vitro (VTC2) Các ống nylon được xếp thẳng đứng với
mật độ 30 ống/ hộp vào hộp nhựa tròn cao 12 cm với đường kính miệng và đáy lần lượt là
8,5 và 5 cm được đục 30 lỗ trên nắp. Mỗi hộp chứa 30 ml thể tích mơi trường.


13

Hình 2.1: Mơ hình bố trí thí nghiệm
(a): Hệ thống đối chứng (ĐC); (b): Hệ thống vi thủy canh in vitro (VTC)
(c): Hệ thống vi thủy canh ex vitro (VTC2)
2.2.2. Các phương pháp theo dõi thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên khả năng ra rễ của đoạn
chồi cây hoa chuông trong hệ thồng vi thủy canh in vitro
Các chồi in vitro (dài 2 cm) nuôi cấy trên các mơi trường ra rễ: mơi trường chỉ
có ¼ MS có bổ sung lượng đường theo tỷ lệ 15-25 g/l. Đánh giá khả năng ra rễ của
chồi in vitro trong cả ba hệ thống sau 2 tuần nuôi cấy thông qua: số rễ, chiều dài rễ
(cm), tỉ lệ phát sinh rễ (%), tỷ lệ phát sinh rễ.
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy vi thủy canh ex vitro
lên khả năng sinh trưởng hoa chuông
Các chồi in vitro (dài 2 cm) nuôi cấy trên các mơi trường có nồng độ 1/2 MS, ¼
MS,

1/

5

MS,

1/
10

MS và mơi trường đối chứng nước máy trong hệ thống thống khí


14
ex vitro. Đánh giá khả năng sinh trưởng của chồi in vitro sau 2 tuần nuôi cấy thông
qua: số rễ, chiều dài rễ (cm), chiều cao cây (cm).
Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của hoa chuông
tai vườn ươm
Cây con (2 tuần tuổi) được làm thích nghi trong điều kiện nhiệt độ phịng
khoảng 1 tuần, sau đó các cây trong hệ thống đối chứng (ĐC) sẽ được trồng trên
loại giá thể cát + xơ dừa + trấu hun (1:1:1). Những cây con trong hệ thống vi thủy
canh in vitro (VTC) và ex vitro (VTC2) sẽ được trồng trong hệ thống bán thủy canh
với thành phần dung dịch thủy canh cơ bản (Hogland) khơng pha lỗng và pha
lỗng 50% với tên gọi lần lược là cơng thức 1 và công thức 2. Theo dõi và đánh giá
khả năng sống sót và sinh trưởng của cây hoa chng in vitro sau 3 tuần chăm sóc
trong điều kiện nhà lưới có độ ẩm khoảng 75%, nhiệt độ 30 - 320C thông qua: chất
lượng lá và chất lượng hoa.
2.3. Xử lí thống kê
Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lí thống kê theo
chương trình SPSS 16.0.

15
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose đến khả năng tạo rễ của cây hoa
chuông trong hệ thồng vi thủy canh in vitro
Chồi in vitro sau khi sinh trưởng 6 tuần (dài 2-2,5 cm) được ni cấy trên
mơi trường MS có nồng độ đường saccharose thay đổi (15-25 g/l) trong hệ thống
truyền thống (đối chứng) và hệ thống vi thủy canh in vitro. Sau 2 tuần ni cấy, kết
quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng tạo
rễ in vitro cây hoa chuông sau 2 tuần nuôi cấy.
Số rễ

Chiều dài rễ

Tỉ lệ phát

(rễ/chồi)

(cm)

sinh rễ (%)

ĐC

5,66f ± 1,15

0,22f ± 0,09

70

VTC1

16,47a ± 1,47

3,21a ± 0,14

100

ĐC

8,00e ± 0,92

0,55e ± 0,09

85

VTC1

11,67b ± 1,68

2,52b ± 0,20

100

ĐC

9,02d ± 1,56

1,23d ± 0,15

100

VTC1

11,38c ± 0,86

2,02c ± 0,16

90

Saccharose (g/l)

15

20

25

Chú ý: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa
thống kê với p<0,05.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, đối với hệ thống vi thủy canh khi giảm lượng
đường saccharose (15-25 g/l) cho chất lượng rễ tốt hơn so với hệ thống truyền
thống. Cụ thể, ở nồng độ đường 25 g/l hệ thống vi thủy canh in vitro cho kết quả số
rễ 11,38, chiều dài rễ 2,02 cm, tỉ lệ phát sinh rễ 90% trong khi đó ở mẫu đối chứng
số rễ đạt 9,02, chiều dài rễ 1,23 cm và tỉ lệ phát sinh rễ 100%. Trong đó, tại môi
trường MS bổ sung nồng độ đường thấp nhất 15 g/l hệ thống vi thủy canh in vitro
cho kết quả có chất lượng rễ tốt nhất cụ thể số rễ 16,47, chiều dài rễ 3,21 cm, tỉ lệ
phát sinh rễ 100% trong khi đó ở mẫu đối chứng cho kết quả kém hơn số rễ 5,66,

chiều dài rễ 0,22 cm, tỉ lệ phát sinh rễ 70%.


16

Hình 3.1 Cây con in vitro sau 2 tuần ni cấy trong hệ thống đối chứng và
vi thủy canh in vitro của môi trường hàm lượng đường lần lược là: a,a’: 15 g/l
đường b,b’: 20 g/l đường; c,c’: 25 g/l đường.