Nghiên cứu nhân giống song mật (calamus platyacanthus warb ex beccc) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

i

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khố học Thạc sĩ tại trường Đại học Lâm nghiệp, được sự
đồng ý của Lãnh đạo Nhà trường, Khoa Đào tạo sau Đại học, Khoa Lâm học, Trung
tâm Giống và Công nghệ sinh học đã cho phép tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu kỹ
thuật nhân giống Song mật (Calamus platyacanthus Warb Ex. Becc) bằng phương
pháp nuôi cấy in vitro” dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Hà Văn Huân – Trung
tâm Giống và CNSH, Khoa Lâm học, trường Đại học Lâm nghiệp.
Trong quá trình thực tập làm luận văn tốt nghiệp, tơi nhận được sự giúp
đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi của lãnh đạo Trường Đại học Lâm nghiệp, Khoa Đào
tạo sau Đại học, Khoa Lâm học, Trung tâm Giống và Cơng nghệ sinh học. Đặc biệt, tơi
xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Hà Văn Huân, người đã định hướng nghiên
cứu và tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tơi trong suốt q trình thực hiện và hồn thành
khoá luận.
Xin chân thành cảm ơn ThS. Vũ Thị Huệ, Chủ nhiệm đề tài cấp Bộ “Nghiên
cứu tạo cây con Song mật (Calamus platyacanthus Warb. Ex becc) bằng kỹ thuật
nuôi cấy in vitro”, đã cho phép tôi tham gia trực tiếp vào toàn bộ các nội dung
nghiên cứu thực nghiệm cuả đề tài và được phép sử dụng một phần kết quả của đề
tài để báo cáo trong luận văn tốt nghiệp này. Xin chân thành cảm ơn ThS Hồ Văn
Giảng - Giám đốc Trung tâm Giống và Công nghệ sinh học, ThS Nguyễn Thị Hồng
Gấm đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi và có nhiều đóng góp quý báu cho tơi trong
suốt q trình làm luận văn tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, cán bộ thuộc: Trung tâm Giống và
CNSH, Khoa Lâm học, Khoa Đào tạo sau Đại học đã tận tình truyền đạt những kiến
thức chuyên môn, kinh nghiệm nghiên cứu khoa học và tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho tôi. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp, gia đình và
người thân đã ln ủng hộ, động viên, giúp tơi vượt qua các khó khăn trong suốt
q trình học tập và cơng tác.
Tơi cam đoan, đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ

cơng trình nghiên cứu nào khác.
Hà Nội, tháng 11 năm 2012
Học viên

Trần Thị Thời


ii

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn ........................................................................................................i
Mục lục .............................................................................................................ii
Danh mục các từ viết tắt ...................................................................................v
Danh mục các bảng .........................................................................................vi
Danh mục các hình .........................................................................................vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ....................................... 2
1.1. Đại cương về nuôi cấy mô- tế bào ........ Error! Bookmark not defined.
1.1.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật ................. Error!
Bookmark not defined.
1.1.2. Lịch sử phát triển nuôi cấy mô – tế bào thực vật Error! Bookmark
not defined.
1.1.3. Một số phương thức nhân giống in vitro.......................................... 2
1.1.4.Các giai đoạn chính trong q trình nhân giống in vitro. ................. 5
1.1.5. Những vấn đề trong nhân giống in vitro .......................................... 7
1.1.6. Thành tựu nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy in
vitro............................................................................................................. 8
1.1.7. Ý nghĩa của kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật....................... 10

1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ..................................................... 11
1.2.1. Tổng quan về Song mây ............................................................... 11
1.2.2. Tổng quan về Song mật .................................................................. 12
1.2.3. Một số nghiên cứu nhân giống Song mật. ..................................... 13
Chương 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................. 17
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 17


iii

2.2.1. Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro .................................... 17
2.2.2. Nghiên cứu kỹ thuật tạo cụm chồi in vitro..................................... 17
2.2.3. Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh và kích thích tăng trưởng chồi .. 18
2.2.4. Nghiên cứu kỹ thuật tạo rễ ............................................................. 18
2.2.5. Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây in vitro ở nhà lưới/vườn ươm 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 18
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro ............... 18
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật tạo cụm chồi in vitro ............... 19
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh và kích thích tăng trưởng
chồi............................................................................................................ 22
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật tạo rễ........................................ 24
2.3.5. Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây in vitro ở nhà lưới/vườn ươm 25
2.3.6. Phương pháp thu thập, xử lý số liệu ............................................... 26
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 29
3.1. Kết quả nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro .............................. 29
3.2. Kết quả nghiên cứu tạo cụm chồi ......................................................... 32
3.2.1. Ảnh hưởng của đường kính gốc chồi măng làm vật liệu tạo cụm
chồi ........................................................................................................... 32
3.2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy in vitro đến khả năng tạo cụm

chồi Song mật ........................................................................................... 34
3.2.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo cụm
chồi ........................................................................................................... 35
3.2.4. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo cụm chồi
in vitro....................................................................................................... 36
3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo
cụm chồi Song mật ................................................................................... 39
3.3. Kết quả nghiên cứu nhân nhanh và kích thích tăng trưởng chồi .......... 41


iv

3.3.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh
chồi in vitro. ............................................................................................. 41
3.3.2. Ảnh hưởng của chất điều hồ sinh trưởng đến kích thích tăng
trưởng chồi ............................................................................................... 44
3.4. Kết quả nghiên cứu kỹ thuật tạo cây hoàn chỉnh .................................. 46
3.4.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ in vitro 47
3.5. Kết quả nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây Song mật in vitro trồng ở
vườn ươm. .................................................................................................... 50
3.5.1. Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến tỷ lệ sống và sinh trưởng
của cây Song mật in vitro tại vườn ươm .................................................. 50
KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KHUYẾN NGHỊ ............................................... 57
1. Kết luận .................................................................................................... 57
2. Tồn tại và khuyến nghị ............................................................................ 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt

Nghĩa đẩy đủ

BAP

6- Benzyl amino purine

Cs

Cộng sự

CTNC

Cơng thức nghiên cứu

CTTN

Cơng thức thí nghiệm

CNSH

Cơng nghệ sinh học

ĐC

Đối chứng

ĐHLN

Đại học Lâm nghiệp

ĐHST

Điều hòa sinh trưởng

GA3

Gibberellic acid

HgCl2

Clorua thủy ngân

IAA

Indol-3 acetic acid

IBA

Indolyl butyric acid

Kinetin

6- furfuryl amino purine

MS

Murashige & Skoog 1962 (Môi trường MS 1962)

MS*

Môi trường MS cải tiến

NAA

Naphtyl acetic acid

NaOCl

Natri hypoclorit

TB

Trung bình

TN

Thí nghiệm

% w/v

Phần trăm khối lượng trên thể tích

% v/v

Phần trăm thể tích trên thể tích

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

TT
2.1
2.2
2.3
2.4

Các công thức khử trùng chồi măng
Ảnh hưởng của đường kính gốc chồi măng đến khả năng tạo
cụm chồi
Ảnh hưởng hưởng của chất ĐHST đến khả năng tạo cụm chồi
Ảnh hưởng của loại môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo
cụm chồi

2.5

Ảnh hưởng của thời gian nuôi tối đến khả năng tạo cụm chồi

2.6

Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến khả năng tạo cụm chồi

2.7

2.8

2.9

Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân
nhanh chồi
Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân
nhanh chồi
Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ

2.10 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ .
2.11

2.12
3.1
3.2

3.3

3.4
3.5

Ảnh hưởng của thành phần phối trộn trong ruột bầu đến khả
năng sống và sinh trưởng của cây in vitro tại vườn ươm
Ảnh hưởng của chế độ che sáng trong vườn ươm đến khả năng
sống và sinh trưởng của cây
Kết quả tạo mẫu sạch in vitro từ chồi măng Song mật
Kết quả ảnh hưởng của đường kính gốc chồi măng đến khả năng
tạo cụm chồi
Kết quả ảnh hưởng phối hợp các chất ĐHST đến khả năng tạo
cụm chồi
Kết quả ảnh hưởng của loại môi trường dinh dưỡng đến khả

năng tạo cụm chồi
Kết quả ảnh hưởng của thời gian nuôi tối đến khả năng tạo cụm chồi

Trang


vii

3.6

3.7

3.8

Kết quả ảnh hưởng của cường độ ánh sáng giàn nuôi đến khả
năng tạo cụm chồi.
Kết quả ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng
nhân nhanh chồi Song mật in vitro.
Kết quả ảnh hưởng của chất điều hịa sinh trưởng đến khả năng
kích thích tăng trưởng chồi

3.9

Kết quả ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ của chồi

3.10

Kết quả ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ

3.11

3.12

Kết quả ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống
và sinh trưởng của cây in vitro tại vườn ươm.
Kết quả ảnh hưởng của độ che sáng trong vườn ươm đến khả
năng sống sống sinh trưởng của cây


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
TT

Tên hình

3.1

Biểu đồ ảnh hưởng của cơng thức khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch
và tỷ lệ mẫu sạch nảy mầm
Chồi măng trước khi vào mẫu
Chồi măng nảy mầm
Biểu đồ ảnh hưởng của đường kính gốc chồi măng đến đến khả
năng tạo cụm chồi in vitro
Chồi măng tạo cụm chồi
Biểu đồ ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tạo cụm chồi
Cụm chồi Song mật in vitro trong môi trường Ph8 (A), Ph4 (B)
và Ph9 (C)
Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng
tạo cụm chồi

Cụm chồi trên môi trường MS (A) và 2MS (B)
Cụm chồi trên môi trường MS*
Biểu đồ ảnh của chất điều hòa sinh trưởng đến hệ số nhân nhanh chồi
Chồi sau 4 tuần ở môi trường NC11 (A) và NC6 (B)
Biểu đồ ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng
kích thích tăng trưởng chồi Song mật in vitro
Chồi tăng trưởng ở công thức KT8 (A) và KT 11 (B)
Biểu đồ ảnh hưởng phối hợp của IBA và NAA đến khả năng ra
rễ in vitro.
Chồi Song mật ra rễ trên môi trường R5
Cây con tạo ra trông môi trường MS (A) và 1/2MS* (B)
Biểu đồ ảnh hưởng của giá thể trồng cây đến khả năng sống và
sinh trưởng của cây in vitro tại vườn ươm.
Biểu đồ ảnh hưởng của độ che sáng trong vườn ươm đến tỷ lệ
sống của cây con.
Cây Song mật in vitro sau khi cấy vào bầu đất
Cây Song mật ở vườn ươm sau 04 tuần với độ che sáng 75%
Cây Song mật ở vườn ươm sau 08 tuần
Cây Song mật ở vườn ươm đủ tiêu chuẩn trồng rừng

3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
3.11

3.12
3.13
3.14
3.15
3.16
3.17
3.18
3.19
3.20
3.21
3.22
3.23

Trang


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ở nước ta, lâm sản ngồi gỗ có vai trò đặc biệt quan trọng đối với phát triển
kinh tế - xã hội của đất nước. Song mật là một trong những lồi cây lâm sản ngồi
gỗ có giá trị kinh tế cao. Nghề gây trồng, chế biến và kinh doanh các sản phẩm từ
Song mây, trong đó có Song mật, đã tạo ra nhiều việc làm tăng thu nhập, cải thiện
đời sống cho người dân. Trong những năm gần đây, việc khai thác Song mật tự
nhiên diễn ra quá mức, bất hợp lý làm cho khu phân bố cũng như sản lượng ngày
càng suy giảm, nhiều nơi đã mất giống. Nguồn Song mật ngun liệu tự nhiên
khơng cịn đủ đáp ứng cho các cơ sở sản xuất để tạo thành các sản phẩm phục vụ
cho nhu cầu sử dụng trong nước và xuất khẩu. Vì vậy, hàng năm chúng ta phải nhập
khẩu một lượng lớn nguyên liệu từ nước ngồi.
Hiện nay, nhiều địa phương đang có các chương trình mở rộng diện tích trồng

Song mật ngun liệu, vì vậy nhu cầu thị trường về cây giống chất lượng cao ngày
một lớn. Song mật là lồi cây có giá trị kinh tế cao nên người dân thường khai thác
trước khi cây ra hoa, kết quả. Bên cạnh đó, hạt Song mật có độ ẩm cao, thường bị
giảm khả năng nảy mầm rất nhanh, nên khó bảo quản. Sự thiếu hụt hạt giống là yếu
tố cản trở lớn nhất cho việc mở rộng diện tích gây trồng. Mặt khác, quần thể cây
trồng từ cây con thực sinh có hiện tượng phân li hữu tính, nên khả năng sinh trưởng
và phát triển, cũng như cho số lượng và chất lượng các sản phẩm chun dụng
khơng đồng đều. Điều này đã có ảnh hưởng khơng nhỏ đến việc gây trồng, chăm
sóc, khai thác và chế biến. Việc áp dụng kỹ thuật tạo cây con Song mật bằng
phương pháp nuôi cấy in vitro - phương pháp nhân giống sinh dưỡng tiên tiến nhằm chủ động tạo ra số lượng lớn các cây con có phẩm chất di truyền tốt và đồng
đều, trong thời gian ngắn thực sự là việc làm cần thiết và có nhiều ý nghĩa. Vì vậy,
chúng tơi thực hiện đề tài


2

Chương 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1. Một số phương thức nhân giống in vitro

1.1. Nhân giống từ mô và cơ quan tách rời
Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi cây nho dại, cùng với một số tác giả
khác, ông đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện
thuận lợi. Lon và Ball (1946) với thí nghiệm ni cấy đỉnh chồi măng tây
(Asparagus) đã cho thấy khi nuôi các bộ phận của cây như lá, thân, hoa, thì thân có
khả năng tạo mơ sẹo nhiều hơn [7,12,14,17].
- Nguyên liệu sử dụng của phương thức nhân giống này là những khối mô và cơ
quan tách rời như: mảnh lá, chồi, đoạn thân, rễ, nhánh củ, các bộ phận của
-

hoa,...
Các bước tiến hành nhân giống từ mô và cơ quan tách rời như sau:
+ Chọn cây mẹ để lấy mẫu mô và cơ quan nuôi cấy thích hợp;
+ Chọn mẫu thích hợp: lá bánh tẻ, cành bánh tẻ, đầu rễ non;

+ Khử trùng mẫu với chế độ khử trùng thích hợp đối với từng loại mô và cơ
quan cụ thể;
+ Cấy mẫu sạch đã khử trùng vào mơi trường vào mẫu thích hợp đối với từng
lọai mô, cơ quan của từng loại cây nuôi cấy. Sau một thời gian nhất định từ các mẫu
mô và cơ quan ni cấy sẽ hình thành nên các chồi hoặc cụm chồi;
+ Nhân nhanh các chồi hình thành bằng mơi trường nhân nhanh chồi thích hợp
đối với từng loại cây;
+ Cấy chồi cây vào mơi trường tạo rễ thích hợp để tạo cây hoàn chỉnh;
Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ khác nhau của cây rất khác nhau có thể
thấy một số yêu cầu chung như nguồn các bon dưới dạng đường và các muối của
các nguyên tố đa lượng (nitơ, photpho, kali, canxi và vi lượng (Mg, Fe, Mn, Zn,
Co...). Ngoài ra cần một số chất vô cơ đặc biệt như vitamin (B1, B6, axit nicotinic)
và các chất điều hịa sinh trưởng. Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ
quan nuôi cấy cần thường xuyên chuyển sang môi trường mới [7,12,14,17].
Đối với nuôi cấy mơ, ngồi những thành phần dinh dưỡng như đối với nuôi cấy
cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng axit
amin, đường, rượu và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa


3

sình trưởng có vai trị quan trọng hơn vì các mơ tách rời khơng có khả năng tổng
hợp các chất này.
Nhân giống từ mô và cơ quan tách rời được thực hiện bằng hai cách:
+ Nuôi cấy mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng.

Mô phân sinh thường là những mô đỉnh chồi và đỉnh cành có kích thước
0,1mm - 1 cm. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non,
các chồi mới hình thành hoặc các cành non. Các cơng trình ni cấy mơ phân sinh
của Morel, Martin (1952). Tiếp đó là cơng trình của Murashige (1970), Quack
(1977) và nhiều cơng trình khác. Mơ phân sinh được nuôi cấy trên môi trường
White, Murashige & Skooge, Gambog... có bổ sung đường saccharose hoặc glucose
và vitamin. Đối với việc nuôi cấy mô phân sinh, sự cân bằng giữa các chất điều hòa
sinh trưởng rất quan trọng. Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokynin hoặc tổ
hợp cytokinin với auxin. Muốn tạo rễ thì bổ sung các auxin như NAA, IAA
[7,12,14,17].
+ Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây.
Các bộ phận của cây như: mảnh lá, đoạn thân, mảnh rễ, các bộ phận của
hoa... cũng có thể được sử dụng để ni cấy tạo chồi mới và tạo thành cây hoàn
chỉnh.
Nhân giống từ mơ và cơ quan tách rời có những ưu điểm sau:
Nuôi cấy mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng được sử dụng để loại virus tạo cây
sạch virus và duy trì tính sạch virus, ví dụ: khoai tây, dứa, mía, phong lan, hoa cúc
... [7,12,14,17].
Tạo ra quần thể cây con đồng đều, giữ nguyên đặc tính tốt, ưu trội của cây mẹ đầu
dịng.
Ni cấy mơ phân sinh cịn được sử dụng để nghiên cứu q trình hình thành cơ
quan. Ni cấy mô phân sinh cũng được sử dụng để tạo các cây đa bội thông qua xử
lý colchicin [7,12,14,17].
Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời được sử dụng để nghiên cứu điều kiện dinh
dưỡng đối với các bộ phận và mô khác nhau của cây.
Tuy vậy, phương thức nhân giống từ mơ và cơ quan tách rời lại có những hạn
chế là hệ số nhân giống thấp hơn so với các phương thức nhân giống qua mô sẹo và
tạo phơi soma: chỉ một số lồi cây thực hiện được nhân giống từ mô và cơ quan tách
rời,...
1.2. Nhân giống qua giai đoạn tạo mô sẹo

4

Nhân giống vơ tính in vitro bằng cách tái sinh cây hồn chỉnh trực tiếp từ mẫu
vật ban đầu thì khơng những nhanh chóng thu được các cây mà các cây cũng khá
đồng nhất về mặt di truyền. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không
tái sinh ngay mà phát triển thành khối mơ sẹo, sau đó từ mơ sẹo mới hình thành
chồi và từ đó mới tạo thành cây hoàn chỉnh
Các bước tiến hành nhân giống qua giai đoạn tạo mô sẹo như sau:
- Các bước chọn cây mẹ, chọn bộ phận làm mẫu nuôi cấy và khử trùng mẫu cũng
giống như phương thức nhân giống từ mô và cơ quan tách rời. Ở phương thức nhân
giống qua giai đoạn tạo mơ sẹo thì sau khi cấy mẫu sạch đã khử trùng vào môi
trường nuôi cấy, sau một thời gian các mô và cơ quan nuôi cấy sẽ phát sinh tạo ra
mô sẹo;
- Nhân nhanh để tạo ra khối lượng mơ sẹo bằng mơi trường thích hợp;
- Dưới tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng và các yếu tố của mơi trường
ni cấy thì các cấu trúc hình thái,( chồi, rễ ..) được hình thành từ khối mô sẹo.
Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo có ưu điểm là hệ số nhân nhanh rất cao,
thơng qua giai đoạn tạo mơ sẹo có thể thu được những cá thể sạch virus như thí
nghiệm của Kehr và Schaffer (1976) trên đối tượng tỏi, qua mơ sẹo có thể chọn
dòng tế bào kháng bệnh ở lúa, chịu muối ở thuốc lá, chịu hạn của cây lúa cạn, cây
bông hay ni cấy bảo tồn các cây có giá trị làm thuốc như cây thanh hao hoa vàng,
cây thông đỏ... hoặc nhân nhanh một số cây trồng như giống mía, phong lan
[7,12,14,17].
Hạn chế của phương thức nhân giống này ở chỗ: tế bào mô sẹo khi cấy chuyển
nhiều lần sẽ khơng ổn định về mặt di truyền, vì khi mơ cấy chuyển nhiểu lần thường
hình thành các tế bào đa bội và lệch bội, ngồi ra có thể mất các yếu tố di truyền
[7,12,14,17]. Để khắc phục, người ta sử dụng tế bào mô sẹo sơ cấp (vừa phát sinh)
hy vọng thu được cây tái sinh đồng nhất.

1.3. Nhân giống bằng việc tạo phơi soma
Một số lồi thực vật sự tái sinh cây từ một tế bào xảy ra theo sự phân hóa
phơi. Phân hóa phơi cũng bắt đầu bằng sự tái phân hóa của tế bào đã biệt hóa trong
mơ ni cấy (hình thành mơ sẹo), sau đó xảy ra q trình tạo phơi.
Steward và cộng sự (1958) đã mơ tả sự hình thành cấu trúc phơi trong tế bào
cà rốt nuôi cấy trong môi trường lỏng như sau: Đầu tiên tế bào phân chia mạnh để
tạo thành các cụm tế bào. Trong các cụm này các phần tử của xylem được hình
thành sau đó xảy ra q trình tạo mầm mống rễ. Khi chuyển sang môi trường nuôi


5

tiếp thì quan sát thấy hình thành chồi và sau đó là cây hồn chỉnh. Reinert quan sát
thấy sự phát triển phôi xảy ra với sự thay đổi các pha phát triển (tiền phôi, globula
và torpedo) ở mô mạch của mô nuôi cấy hoặc mô sẹo [7,12,14,17].
Các bước tiến hành nhân giống bằng việc tạo phôi soma như sau:
- Các bước tiến hành chọn mẫu cấy và vô trùng mẫu cấy cũng giống như các
phương thức nhân giống trên;
Ở phương thức nhân giống bằng việc tạo phơi soma thì sau khi cấy mẫu sạch
đã khử trùng vào môi trường nuôi cấy một thời gian các mẫu mô và cơ quan nuôi
cấy sẽ phát sinh ra khối mô sẹo.
- Nhân nhanh để tạo ra khối lượng lớn mô sẹo bằng môi trường thích hợp;
Dưới tác dụng của chất điều hịa sinh trưởng và các yếu tố của môi trường nuôi
cấy từ mơ sẹo hình thành nên phơi soma. Từ phơi soma có thể tạo chồi và cây hồn
chỉnh hoặc sử dụng phôi soma tạo hạt nhân tạo [12,17].
Ưu điểm của phương thức nhân giống này là có hệ số nhân giống rất lớn và có
thể thực hiện trên quy mơ cơng nghiệp với việc sử dụng các thiết bị nuôi cấy được
gọi là bioreactor. Phương thức nhân giống này cịn có ưu điểm là bảo quản được
lượng mẫu lớn trong thời gian dài.
Ngày nay, có nhiều loại cây trồng đã sử dụng phương thức nhân giống bằng việc

tạo phôi soma và hạt nhân tạo như: cần tây, rau diếp, linh lăng, hoa ly, cúc, địa lan,
hồng mơn... [11,12]
2.Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống in vitro.
Quá trình nhân giống in vitro được chia ra 5 giai đoạn chính như sau:
- Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ
Cây mẹ là cây cho nguồn mẫu nuôi cấy và giai đoạn này coi như là một bước
thuần hóa vật liệu để ni cấy. Cây mẹ phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở
giai đoạn sinh trưởng mạnh. Thông thường, cây mẹ là cây ưu việt, có những tính
trạng tốt, đạt tiêu chuẩn của các nhà chọn giống hoặc là những đối tượng đang có
nguy cơ bị tuyệt chủng. Cây mẹ được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên của nó rồi
trồng trong điều kiện thích hợp để chăm sóc và phòng bệnh trước khi lấy mẫu. Như
vậy sẽ hạn chế được tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu
cấy, đồng thời chủ động được nguồn mẫu trong công tác nhân giống [7,12,14,17].
- Giai đoạn 2: Tạo vật liệu khởi đầu
Các chồi mới từ các mẫu vật đã được khử trùng và được nuôi cấy trong mơi
trường thích hợp. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ


6

sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào
việc chọn bộ phận nuôi cấy cho nên khi lấy mẫu cấy cần chọn đúng loại mô, đúng
giai đoạn phát triển của cây. Theo Bhatt thì mơ lấy từ cây non có khả năng tái sinh
cao hơn các mô của cây trưởng thành (Bhatt, 1979). Hạt cũng là đối tượng được ưu
tiên trong nuôi cấy in vitro bằng cách phá ngủ nghỉ của hạt và tạo điều kiện cho hạt
nảy mầm ngay trong ống nghiệm. Đối với mẫu dễ bị hóa nâu khi ni cấy có thể bổ
sung vào mơi trường than hoạt tính hay ngâm mẫu trước khi cấy vào axit xitric (25 150 mg/l) [7,12,14,17].
Chọn đúng phương pháp khử trủng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và trong môi
trường dinh dưỡng thích hợp mẫu cấy sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh nhất.
Giai đoạn này thường kéo dài 4 - 6 tuần lễ.

- Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
Toàn bộ q trình nhân giống in vitro nhằm mục đích là tạo ra hệ số nhân cao
nhất. Vì vậy, giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của tồn q trình. Giai
đoạn này sẽ kích thích mơ ni cấy phát sinh thành nhiều chồi mầm cung cấp cho
giai đoạn sau bằng cách cắt nhỏ những bộ phận mới sinh ở giai đoạn trên và cấy
chúng vào môi trường mới theo định kỳ. Hệ số nhân ở giai đoạn này biến động từ 3
đến 50 lần tùy thuộc loài cây và phương pháp nhân nhanh. Quan trọng là phải xác
định được mơi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có thể đạt hiệu quả cao
nhất. Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ quan,
đặc biệt là chồi, nhưng khơng ảnh hưởng đến sức sống và bản chất di truyền của
cây.
Bổ sung tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng mới (tăng hàm lượng cytokinin,
giảm hàm lượng Auxin để kích thích tạo chồi) [7,12,14,17].
Tăng cường chiếu sáng (16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu 1000 lux,
ánh sáng tím) là yếu tố quan trọng kích thích mơ phân hóa tạo chồi mạnh
[7,12,14,17].
Bảo đảm chế độ nhiệt 20 - 300C. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng, mục
đích thí nghiệm cần chế độ nuôi cấy khác nhau.
- Giai đoạn 4: Tạo rễ
Đây là giai đoạn các chồi đã đạt được kích thước nhất định và được chuyển từ
môi trường ở giai đoạn 3 sang mơi trường tạo rễ để hình thành cây hoàn chỉnh.
Thường sau 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây
hồn chỉnh. Ở giai đoạn này mơi trường cần giảm lượng Cytokinin và tăng lượng


7

Auxin để rễ phát triển. Lúc này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt
động của lá và rễ mới sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng
[7,12,14,17].

- Giai đoạn 5: Đưa cây ra trồng ở ngoài tự nhiên
Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngoài
trời để tạo điều kiện cho cây con tự dưỡng hồn tồn và thích nghi dần với mơi
trường tự nhiên. Khi cây con cứng cáp và đủ tiêu chuẩn thì mang trồng. Đây là
bước quyết định khả năng ứng dụng quy trình này trong thực tiễn sản xuất.
Để đưa cây từ ống nghiệm ra môi trường tự nhiên bên ngoài đạt tỷ lệ sống cao
cần đảm bảo một số yêu cầu sau:
+ Cây trong ống nghiệm đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ,
chiều cao cây)
+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể tơi xốp, thốt nước;
+ Phải giữ ẩm cho cây khi mới đưa từ ống nghiệm ra, cần duy trì độ ẩm trên 50%
để cây con khơng mất nước trong 2 - 3 tuần lễ, tránh ánh sáng quá mạnh làm cháy
lá, tránh nhiễm vi khuẩn và nấm gây hiện tượng bị thối nhũn. Điều kiện môi trường
trong giai đoạn này rất quan trọng, cần tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển, cứng cáp
và phòng bệnh cho cây [7,12,14,17].
3. Những vấn đề trong nhân giống in vitro
3.1. Sự nhiễm mẫu
Mẫu cấy được sống trong điều kiện mơi trường tự nhiên nên có rất nhiều mầm
bệnh. Mặc dù trước khi cấy, mẫu cấy được khử trùng nhưng thường chỉ diệt được
các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn trên bề mặt mẫu cấy. Có thể dùng một số chất
kháng sinh để diệt vi khuẩn và nấm, song cũng chính các chất này có thể gây hại
cho mẫu cấy.
3.2. Sản sinh chất độc từ mẫu nuôi cấy
Mẫu mới cấy hay bị hóa nâu, hóa đen rồi chết là hiện tượng thường gặp.
Nguyên nhân của hiện tượng này là do có chứa nhiều tanin hay Hydroxyphenol
trong mẫu cấy đã già. Để khắc phục hiện tượng này người ta thường áp dụng mấy
phương pháp sau:
- Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy (0,1-0,3%) hoặc PolyVinyl
Pyrolidone (PVP). Vài giờ trước khi cấy, ngâm mẫu vào dung dịch chứa các chất có
tác dụng ngăn chặn oxy hóa Phenol như Axit Ascobic, Axit chanh;

8

- Mẫu nuôi cấy trong môi trường lỏng, nồng độ oxy thấp và khơng có ánh sáng
trong 1 - 2 tuần trước khi cấy.
3.3. Hiện tượng thủy tinh hóa
Cây ni cấy mơ có khi trở nên mọng nước, lá và thân trong suốt do đó rất khó
sống, đặc biệt khi ni cấy trên mơi trường lỏng hoặc mơi trường ít thạch, trao đổi
khí thấp. Có thể hạn chế hiện tượng này bằng hai cách:
- Giảm nồng độ chất chứa N trong mơi trường ni cấy;
- Giảm sự hình thành ethylen trong bình mới;
- Xử lý Axit Abxixic hoặc các chất ức chế sinh trưởng;
- Tăng cường độ ánh sáng và giảm nhiệt độ trong phịng ni cấy.
3.4. Tính bất định về di truyền
Trong một số trường hợp nhân giống in vitro có xảy ra đột biến tế bào soma
một cách ngẫu nhiên. Thông thường khi nuôi cấy mô sẹo gặp nhiều đột biến hơn
nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng. Nguyên nhân gây ra hiện tượng này có thể là:
- Kiểu di truyền của mô nuôi cấy;
- Số lần cấy chuyển càng nhiều thì tỷ lệ đột biến càng cao;
- Loại mô cấy

4. Thành tựu nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
Ở nước ta việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô-tế bào thực vật
để nhân nhanh một số giống cây trồng đã được tiến hành từ những năm 1980, đến
nay đã đạt được những kết quả đáng kể. Các đối tượng cây trồng đã được nhân
giống thành công bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, như: (1) Các lồi cây có giá
trị kinh tế phục vụ gây trồng quy mô lớn, như Cây hoa: hoa lan, cúc, đồng tiền, lily,
phăng, cẩm chướng, lay ơn, hoa hồng; Cây lương thực, thực phẩm: khoai tây, cà
chua, súp lơ, khoai sọ, khoai môn, sắn; Cây ăn quả: chuối, dứa, dâu tây, cam, qt,

bưởi; Cây cơng nghiệp: mía, cà phê, thuốc lá; Cây lâm nghiệp: bạch đàn, keo, hơng,
tếch, thơng, tùng, sưa, dó bầu, lõi thọ, Xoan ta, Song mật; (2) Các loài cây dược liệu
quý hiếm như: sâm ngọc linh, trinh nữ hoàng cung, lan kim tuyến, hồn ngọc; (3)
Các lồi cây có khả năng tái sinh sinh tự nhiên thấp (Thông đỏ, Thủy tùng).
Các kết quả nhân giống cây trồng tiêu biểu
Các cán bộ khoa học thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới-Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam, sau nhiều năm nghiên cứu đã thu được nhiều kết quả quan trọng
trong lĩnh vực công nghệ tế bào thực vật, như: Đã hoàn thiện được nhiều quy trình


9

công nghệ nhân nhanh, phục tráng giống, làm sạch vi rút đối với nhiều giống cây
trồng nông- lâm nghiệp, cây dược liệu có giá trị cao, như: Cây khoai lang, khoai
mỡ, măng cụt, chanh không hạt, cây sung Mỹ, hồ tiêu, điều, cây Paulownia, cây tre,
dó bầu, xoan chịu hạn, lõi thọ, keo lai, lát Mêhicô, phong lan, hồng môn, cẩm
chướng, đồng tiền, cây xả, trinh nữ hoàng cung, sâm Ngọc linh. Điển hình là Viện
đã triển khai ứng dụng sản xuất giống khoai tây bằng củ bi và đã cung cấp gần
400.000 củ bi giống cho vùng sản xuất Đà Lạt; Xây dựng thành cơng quy trình kỹ
thuật nhân giống chuối (Cavendish Sp.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro và đã được
đưa vào sản xuất trên quy mô công nghiệp, mỗi năm cung cấp hàng triệu cây giống
chuối ni cấy mơ cho sản xuất; Ngồi ra, Viện cũng đã cung cấp một số lượng lớn
cây giống như hoa phong lan, đồng tiền, hông, nghiến, xoan chịu hạn và một số
giống tre cho thị trường.
Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Hoa, Cây cảnh - Viện Nghiên cứu Rau
quả cũng xây dựng thành cơng hơn 30 quy trình kỹ thuật nhân giống, trồng và
chăm sóc hoa thương phẩm điển hình là: Quy trình kỹ thuật nhân giống hoa lan Hồ
Điệp trên quy mơ cơng nghiệp, quy trình này đã được chuyển giao áp dụng cho 11
tỉnh, thành trong cả nước, góp phần đưa cơng nghệ sản xuất hoa ở Việt Nam tiếp
cận với các nước trong khu vực; Quy trình sản xuất hoa lily áp dụng cho các tỉnh

phía Bắc, giúp cho miền Bắc Việt Nam từ chỗ không sản xuất được hoa lily đến nay
quy mô sản xuất đã đạt trên 10 triệu củ (cây)/năm, chất lượng tương đương các
vùng trồng hoa lớn, có điều kiện tốt như Đà Lạt – Lâm Đồng, Côn Minh (Trung
Quốc); Các Quy trình trên đã và đang được chuyển giao ứng dụng cho hơn 40 tỉnh,
thành trên cả nước, góp phần đáng kể vào sự nghiệp nghiên cứu, phát triển sản xuất
hoa, cây cảnh ở Việt Nam.
Các kết quả nghiên cứu về nhân giống một số loại cây trồng có giá trị kinh tế
ở Viện Di truyền Nơng nghiệp: Đã hồn thiện được quy trình nhân giống in vitro
cho 2 giống hoa cúc (giống CN97 và CN98). Quy trình nhân nhanh in vitro một số
giống hoa Lilium spp và tếch đã được cơng nhận là tiến bộ kỹ thuật và quy trình
nhân nhanh các giống hoa đồng tiền bằng phương pháp nuôi cấy lớp cắt mỏng đã
được công nhận giống tạm thời. Các quy trình này đã được chuyển giao cho các cơ
sở sản xuất.
Đối với nhân giống cây lâm nghiệp cũng đã đạt được nhiều thành quả đáng
kể, chủ yếu tập trung ở một số cơ sở nhân giống cây lâm nghiệp lớn, như: Trung
tâm Khoa học và Sản xuất lâm nông nghiệp Quảng Ninh, Viện Nghiên cứu Cây


10

nguyên liệu giấy Phù Ninh, Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng – Viện Khoa
học Lâm nghiệp Việt Nam, Trường Đại học Lâm nghiệp, Công ty Giống lâm nghiệp
Trung ương,...Nhiều quy trình kỹ thuật nhân giống cây lâm nghiệp đã được xây
dựng, như: Quy trình nhân giống cây Bạch đàn urơ dịng U6, Bạch đàn lai, Keo,
Hơng, Tếch, Dó bầu, Lõi thọ, Song mật. Trong đó, điển hình là Trung tâm Khoa
học và Sản xuất lâm nông nghiệp Quảng Ninh triển khai nhiều đề tài, dự án cấp bộ,
cấp nhà nước về nhân giống cây lâm nghiệp đạt kết quả xuất sắc. Đặc biệt là Dự án
“Hoàn thiện, triển khai công nghệ vi nhân giống trong sản xuất công nghiệp cây
giống bạch đàn U6 và một số dòng bạch đàn Urơ có triển vọng khác tại Quảng
Ninh”, trong 3 năm Trung tâm đã sản xuất được 21 triệu cây, đem lại doanh thu

hàng năm cho Trung tâm từ 2,5-4 tỷ đồng, đồng thời tạo nhiều việc làm cho người
dân trong và ngồi tỉnh.
5. Ý nghĩa của kỹ thuật ni cấy mô - tế bào thực vật
Sự ra đời của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã mang lại ý nghĩa vơ
cùng to lớn. Nó đã chứng minh được tính tồn năng của tế bào thực vật. Kỹ thuật
ni cấy mơ tế bào thực vật góp phần giải quyết vấn đề lý luận và thực tiễn, đặc biệt
là lĩnh vực nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái ở nhiều thực vật từ mức độ tế
bào đến cấu trúc mô.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro được xem là một trong những giải pháp
công nghệ mới có ý nghĩa khoa học trong cơng nghệ sinh học. Trên các môi trường
nhân tạo, từ các mô hay tế bào thực vật sẽ phân chia, phân hóa và phát triển thành
cây hoàn chỉnh. Đây là một kỹ thuật sinh học hiện đại và là một phương pháp nhân
giống hữu hiệu nhất trong các phương pháp nhân giống vơ tính.
Những ưu việt của phương pháp nhân giống này là:
+ Tạo ra quần thể cây con đồng đều, giữ nguyên đặc tính của cây mẹ
+ Có hệ số nhân giống cao (trong một thời gian ngắn có thể tạo ra số lượng lớn
cây giống chất lượng cao);
+ Cây giống có hình thái đồng đều, sạch bệnh;
+ Cây con được tạo ra bằng ni cấy mơ được trẻ hóa cao độ;
+ Sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô-tế bào thực vật khơng cần
nhiều diện tích, khơng phụ thuộc vào mùa vụ, thời tiết;
+ Thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ
nặng 15 kg). Việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi. Các cây giống giữ ở nhiệt độ
40C trong hàng tháng vẫn cho tỷ lệ sống đến 95% [7,12,14,17].


11

2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
2.1. Tổng quan về Song mây

Song mây là thuật ngữ gọi chung cho khoảng 600 loài thuộc chi Calamus và
Daemonorops. Song mây là một trong những loại lâm sản ngồi gỗ có giá trị kinh tế
cao, có vai trị đặc biệt quan trọng đối với việc phát triển kinh tế- xã hội vùng nơng
thơn miền núi.
Do thân Song mây có đặc tính dẻo dai, dễ uốn, màu sắc đẹp (có thể dùng sơn
để tạo thân Song mây có vân giống như vân gỗ), nên có thể dùng được nhiều chủng
loại đồ dùng bằng Song mây với nhiều kiểu dáng và màu sắc khác nhau. Đã từ lâu
Song mây được sử dụng nhiều trong đời sống hàng ngày của người dân (làm hàng
thủ công mỹ nghệ, đan lát, bàn ghế,…). Ngoài ra lá Song mây được người dân miền
núi dùng để lợp nhà, quả dùng để ăn và là vị thuốc tốt [10,11,15,16]. Đây chính là
một lồi cây trồng có nhiều triển vọng phát triển ở vùng nông thôn và miền núi ở
nước ta.
Song mây là một trong những chi có sự đa dạng nhất về lồi (khoảng 600 lồi
thuộc 13 nhóm lồi (Rao et al.,1997)), có phạm vi phân bố rộng ở nhiều vùng địa lý
khác nhau, thích hợp với vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, như: vùng Xích
đạo châu Phi, vùng phía Tây Thái Bình Dương, Australia, khu vực Đơng Nam Á,
phía Nam Trung Quốc (Dransfield và Manokaran, 1993). Các sản phẩm từ Song
mây đem lại lợi ích cho người dân nhiều nước, ở khu vực Đông Nam Á có gần một
triệu người dân sinh sống liên quan đến nghề gây trồng và chế biến Song mây
(Menon, 1980). Theo thống kê năm 1979, giá trị thương mại của Song mây nguyên
liệu đạt 50 triệu USD, sản phẩm được chế từ Song mây nguyên liệu đạt 1,2 tỷ USD
và giá trị thương mại của các sản phẩm từ Song mây đạt trên 2 tỷ USD (Rao et al.,
1997).
Hiện nay, trên thế giới có khoảng trên 700 triệu người bn bán và sử dụng
song mây với rất nhiều mục đích khác nhau. Thương mại toàn cầu và giá trị sử dụng
của Song mây cũng như giá trị của chúng được dự báo vào khoảng 7.000 triệu USD
trong một năm. Tại Việt Nam, con số thống kê cho thấy sản lượng của Song mây
giao động trong khoảng 20.000 – 80.000 ngàn tấn và sử dụng ít nhất 2-3 triệu lao
động trên khắp đất nước (FAO, 2003).
Trung Quốc có 40 lồi và 21 dưới lồi thuộc 3 nhóm lồi, chủ yếu tập trung ở

vùng phía Nam, trong đó có 19 lồi có giá trị thương mại quan trọng và 18 loài khác
được người dân sử dụng tại địa phương. Các loài Song mây có giá trị thương mại


12

cao tập trung chủ yếu ở đảo Hải Nam và tỉnh Vân Nam. Ngay từ đầu những năm
1980, hàng năm Trung Quốc thu được khoảng 4.000 – 7.000 tấn Song mây nguyên
liệu tự nhiên, trong đó có khoảng 4.000 tấn từ đảo Hải Nam và khoảng 2.000 tấn từ
tỉnh Vân Nam (chiếm 90% sản lượng của cả nước). Do tốc độ phát triển kinh tế xã
hội nhanh, nhu cầu của dân về các sản phẩm làm từ Song mây ngày càng tăng, dẫn
đến việc khai thác quá mức. Đến nay nguồn Song mây tự nhiên ở Trung Quốc hầu
như đã bị cạn kiệt.
Indonesia có khoảng 300 lồi, trong đó những loài quan trọng dùng cho xuất khẩu
là C. manna, C. trachycoleus, C. caesius, C. inops và C.scopionum. Từ những năm
1985, nước này đã sản xuất được 575.000 tấn Song mây nguyên liệu. Indonesia là nước
cung cấp Song mây nguyên liệu lớn nhất (khoảng 90%) trên thị trường thế giới.
Ngoài ra, Song mây còn tập trung ở một số quốc gia khác, như: Thái Lan
(khoảng 50 loài), Philippines (khoảng 60 loài) và Ấn Độ (khoảng 46 loài).
Trong những năm gần đây sản lượng Song mây bị giảm sút đáng kể do rừng
nhiệt đới bị tàn phá nặng nề. Hiện nay, vấn đề gây trồng Song mây thương mại
không chỉ ảnh hưởng trực tiếp đến việc làm và mức sống của người dân vùng trồng
Song mây mà có khuynh hướng ảnh hưởng tới các nước khác có liên quan trong
khu vực. Thực vậy, việc trồng Song mây thương mại ở các nước thuộc khu vực
Đông Nam Á đã trở thành một trong những yếu tố làm tăng sự phụ thuộc lẫn nhau
giữa các quốc gia. Ví dụ như Indonesia là nước có sản lượng Song mây nguyên liệu
lớn nhất thế giới đã đưa ra chính sách cấm xuất khẩu Song mây nguyên liệu, chỉ
xuất khẩu những sản phẩm đã qua chế biến. Chính sách này nhằm mục đích tăng
việc làm cho người dân và tăng giá trị của sản phẩm. Mặt khác, nó cũng giúp cho
việc bảo tồn nguồn Song mây khỏi bị khai thác quá mức. Song chính sách này đã

ảnh hưởng đến nguồn Song mây nguyên liệu của Thái Lan, Trung Quốc và
Philippine vì các nước này chủ yếu nhập Song mây nguyên liệu từ Indonesia.
1.2.2. Tổng quan về Song mật
Song mật (Calamus platyacanthus Warb.Ex Becc) là một trong những lồi lâm
sản ngồi gỗ có giá trị kinh tế rất cao. Do thân Song mật có kích thước lớn, dài, bền,
dẻo, dễ uốn và chịu lực tốt, nên từ lâu Song mật đã được sử dụng nhiều trong đời
sống hàng ngày (làm hàng mỹ nghệ cao cấp, bàn ghế, thay thế dây cáp cầu nhỏ ở
vùng núi, cuốn bè mảnh) (Lê Mộng Chân, 2002). Song mật là loài cây ưa sáng và
ẩm, luôn vươn lên tầng cao nhất của tán rừng. Cũng gặp Song mật mọc xen kẽ lẫn
rừng Tre, Vầu ở độ cao 700 m. Trên thế giới, Song mật tập trung chủ yếu ở Trung


13

Quốc, Việt Nam và một số nước khác. Ở Trung Quốc, Song mật tập trung chủ yếu ở
tỉnh Vân Nam, mọc trên núi cao hơn 900 m, thành từng cụm lớn, đường kính thân
khoảng 20 - 50 mm, lóng dài hơn 50 cm, lá dài 2 - 6 cm, quả hình trứng kích thước
17 x 11 mm, được bao bọc bởi 20 vẩy màu sáng (Rao et al., 1997). Ở Việt Nam,
Song mật là loài cây tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền Bắc như: Bắc Giang, Hịa
Bình, Tun Quang, … Từ những năm 1985, Song mật đã bị khai thác mạnh để sản
xuất hàng xuất khẩu, làm cho nhiều nơi đã mất giống làm cho khu phân bố bị thu
hẹp dần và có nguy cơ bị tiêu diệt, vì vậy cần xây dựng một số khu rừng giống và
khoanh một số khu vực còn tương đối nhiều cá thể để khai thác hợp lý, đảm bảo sản
lượng ổn định lâu dài. Sớm đưa Song mật vào gây trồng trong các rừng đặc dụng và
rừng đầu nguồn.
1.2.3. Một số nghiên cứu nhân giống Song mật.
1.2.3.1. Các nghiên cứu ngoài nước
Nhận thức rõ vai trị quan trọng của lồi cây có giá trị kinh tế cao này, ngay từ
những năm đầu của thập kỷ 80, các nước trên thế giới, đặc biệt các nước trong khu
vực Đông Nam Á đã tiến hành nghiên cứu về phân loại, kỹ thuật gây trồng, phân

tích lợi ích kinh tế của việc gây trồng Song mây (Yin Guangtian et al., 1993). Các
nghiên cứu về nguồn tài ngun di truyền xác định những lồi có giá trị thương mại
đã được tiến hành ở nhiếu quốc gia như: Bangladesh, Trung Quốc, Ấn Độ,
Indonesia, Lào, Malaysia, Myanma, Nepal, Philippine và Thái Lan (Ramanatha
Rao., 1999) nhằm mục đích xác định số lượng, khu vực phân bố, vùng gây trồng
phù hợp. Ngồi ra cịn có một số nghiên cứu ở Thái Lan về phân tích đa dạng di
truyền bằng các phương pháp phân tích phân tử (isozyme, RAPD, RFLP, AFLP…)
(Hong et al., 2002).
Do nguồn Song mây nguyên liệu tự nhiên ngày càng suy kiệt, nguồn hạt giống
khan hiếm, nên việc áp dụng kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in
vitro đang được xem là một giải pháp hữu hiệu để giải quyết vấn đề tồn tại trên.
Các nghiên cứu về nhân giống Song mây in vitro đã được tiến hành từ rất sớm,
tiêu biểu là các nghiên cứu của các tác giả: Patena (1984), Umali- Garcia (1985),
Barb (1985), Yusoff (1985), Gunawan (1989) và Dekkers (1989).
Kết quả các nghiên cứu trên đã chỉ ra rằng trong nuôi cấy in vitro các lồi
Song mây, vật liệu dùng để ni cấy là nhân tố quan trọng quyết định đến sự thành
công. Vật liệu dùng để nuôi cấy rất đa dạng như: phôi hạt, vùng cổ chồi, đỉnh chồi,
mảnh lá, cuống lá, bẹ cây con, chóp rễ, … Tùy từng lồi mà lựa chọn vật liệu nuôi


14

cấy thích hợp. Cụ thể: đối với lồi C. tetradactylus dùng phơi và đỉnh chồi, lồi C.
obvoideus dùng vùng cổ của cây con, cịn đối với lồi C. egregious dùng phơi hạt
để ni cấy là phù hợp nhất. Nhìn chung, phôi hạt và vùng cổ rễ của cây non là vật
liệu tốt nhất cho nhân giống in vitro của nhiều loài Song mây (Zeng el al., 1999).
Năm 1985, Umali - Garcia đã lấy đỉnh chồi của 3 loài mây thuộc chi Calamus
làm vật liệu nuôi cấy. Đỉnh chồi được cấy vào môi trường cảm ứng tạo mô sẹo, cho
mô phát triển thành cụm chồi, sau đó tách chồi cấy vào mơi trường thúc rễ để tạo
cây con hồn chỉnh. Năm 1989, Yuoff và Manokaran đã tạo được mô sẹo từ phơi

hạt của lồi C. manna, sau đó cho mơ sẹo phát triển thành chồi, thúc chồi ra rễ để
tạo thành cây con hoàn chỉnh. Các tác giả trên cũng đã thành công trong nghiên cứu
tạo đa chồi bằng cách dùng vùng cổ chồi cây con nuôi cấy trên môi trường MS bổ
sung BAP hoặc Kinetin, (10-6 đến 10-4 M), sau đó tách chồi để cấy vào mơi trường
hàm lượng Cytokinin thấp để tạo cây hoàn chỉnh và chuyển ra trồng ngồi tự nhiên.
Năm 1986, Gunawan và Yani đã ni cấy phơi hạt chưa chín của lồi C.
manna trên mơi trường MS (Marashige và Skoog, 1962) và Y3 (Eewens, 1976)
cũng đã tạo được cây in vitro hoàn chỉnh.
Năm 1989, Dekkers và Rao lấy phơi hạt của lồi C. trachycoleus cấy vào mơi
trường MS có bổ sung 2.4D hoặc NAA với hàm lượng 5 mg/l. Sau khoảng 2- 4 tuần
thấy xuất hiện mô sẹo. Mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường có hàm lượng
2.4D thấp để cảm ứng tạo chồi.
Các cơng trình nghiên cứu về nhân giống Song mây in vitro của Trung Quốc
được tiến hành chủ yếu ở Viện nghiên cứu lâm nghiệp nhiệt đới Quảng Châu (tỉnh
Quảng Đông) và Viện thực vật học Côn Minh. Năm 1987, Zhuang Chengji đã thông
báo thành công bước đầu của việc nghiên cứu tạo cụm chồi ở hai loài C.
yunnanensis và C.obovoideu trong điều kiện ni cấy in vitro. Nhìn chung các điều
kiện về nuôi cấy in vitro Song mây mới chỉ tập trung cho những lồi quan trọng,
đặc biệt những lồi có giá trị kinh tế cao. Năm 1993, Zhuang Chengji đã cơng bố
kết quả nghiên cứu ở 3 lồi C. tetradactylus, C. simplicifolius và D. margaritae.
Cheng Zhiying đã tiến hành nghiên cứu với các loài C. gracilis và C. nambariensis.
Zeng Bingshan (1991- 1997) đã tiến hành nghiên cứu với các loài: C. egregious, D.
Jenkisiana, C. dioicus, C. rhabdocladus, C. egregious và D. margaritae đã được tạo
ra với số lượng lớn bằng nuôi cấy in vitro và đã được trồng thành rừng vơ tính ở
tỉnh Quảng Tây và Quảng Đơng.


15

Đến nay, Viện nghiên cứu Lâm nghiệp nhiệt đới đã cho 16 năm kinh nghiệm

nghiên cứu về nhân giống Song mây bằng phương pháp ni cấy in vitro, đã hồn
thiện được quy trình nhân giống cho 3 lồi C. simlicifolius, D. margaritae và D.
jenkinsiana. Các quy trình cơng nghệ nhân giống này hoàn toàn đáp ứng được yêu
cầu của sản xuất ở quy mô công nghiệp.
1.2.3.2. Các nghiên cứu trong nước
Ở nước ta trong những năm gần đây việc ứng dụng công nghệ nhân giống in
vitro đã thành công ở một số loài cây trồng rừng phổ biến như: Bạch đàn cao sản,
Keo lai, Dó trầm, Tếch, Hơng,… Nhiều cơ sở nghiên cứu và sản xuất đã áp dụng
công nghệ này để sản xuất cây con ở quy mô công nghiệp nhằm chủ động cung cấp
nguồn cây con chất lượng cao phục vụ trồng rừng sản xuất đang có nhu cầu rất lớn.
Tuy nhiên, đối với những loài cây bản địa và cây đặc sản rừng có giá trị kinh
tế cao nói chung, đặc biệt cho Song mật nói riêng, vẫn chưa nghiên cứu đầy đủ.
Việc ứng dụng kỹ thuật nhân giống in vitro đối với các loài cây này còn rất mới mẻ
và nhiều hạn chế, mới chỉ được tiến hành một cách đơn lẻ ở một số cơ sở nghiên
cứu trong phạm vi phịng thí nghiệm và mang tính thăm dị là chính.
Thí nghiệm về khả năng nảy mầm của hạt với các biện pháp tác động khác
nhau như: hoá chất, nhiệt độ, cơ học đã được tiến hành (Trần Quang Việt, 1994; Vũ
Văn Dũng và Lê Huy Cường, 1996; Nguyễn Quang Khải, 1998), trong đó việc xử
lý bằng cạy nắp rốn hạt của tác giả Nguyễn Quang Khải đã rút ngắn đáng kể thời
gian bắt đầu nẩy mầm của hạt Song mật.
Một số thí nghiệm về chăm sóc cây con, phịng trừ sâu bệnh ở giai đoạn vườn
ươm đã được thực hiện (Trần Quang Việt, 1994). Tác giả cũng tìm được phương
pháp bảo quản hạt giống bằng cách làm sạch hạt và ngâm vào dung dịch benlat
nồng độ 0,5% sau đó phơi khơ rồi bảo quản trong tủ lạnh, sau 1 năm tỷ lệ nảy mầm
vẫn đạt 70%.
Mơ hình trồng rừng thí nghiệm đã được tiến hành ở Cầu Hai (Phú Thọ), Lương
Sơn (Hồ Bình), Bà Rền (Quảng Bình) (Trần Quang Việt, 1995) với độ tàn che
khác nhau cho thấy cây sinh trưởng tốt với độ tàn che 0,5 - 0,7 trong giai đoạn đầu
kể cả vườn ươm và rừng trồng đạt chiều cao 30,91cm, trong khi ở độ tàn che 0,3 0,4 chỉ đạt 26,08 cm. Nhưng sau 15 tháng sau khi trồng cây ở độ tàn che thấp lại
sinh trưởng tốt hơn và xu thế này càng ngày càng thể hiện rõ. Kết quả cũng chỉ ra

rằng sau 6 tháng trồng, khi trồng bằng cây con 2,5 tuổi đạt tỷ lệ sống cao và phát
triển nhanh hơn so với cây 1 tuổi. Lê Thu Hiền và cộng sự cũng đã xây dựng mô


16

hình trồng rừng dưới tán rừng phục hồi, tác giả cũng đưa ra tiêu chuẩn cây con cho
trồng rừng là từ 18-24 tháng tuổi. Ngồi ra cịn có một số mơ hình khác được trồng
thử trên quy mơ rất lớn như ở Trạm thí nghiệm Bình Thành (Hồ Bình), Viện điều
tra quy hoạch rừng, Vườn Quốc Gia Xuân Sơn (Phú Thọ).
Gây trồng Song mật chủ yếu phụ thuộc vào cây hạt, do đặc tính sinh trưởng
chậm nên việc tạo cây con đủ tiêu chuẩn cũng mất nhiều thời gian. Một số tác giả
đã đưa ra hướng dẫn kỹ thuật trồng Song mật, trong đó tiêu chuẩn cây con đem
trồng là 15 - 18 tháng tuổi (Vũ Văn Dũng và Nguyễn Huy Cường, 1996; Triệu Văn
Hùng, 2007), từ 18 - 24 tháng tuổi (Lê Thu Hiền và cộng sự, 2005), cây cao khoảng
20 cm đạt từ 3 - 4 lá.
Nhân giống sinh dưỡng cho cây Song mật được tiến hành (Nguyễn Ngọc Tân và
Trần Hồ Quang, 1995) bằng lá non và phơi hạt. Kết quả cho thấy có sự hình thành mô
sẹo từ lá non nhưng không tái sinh chồi và chết dần khi mơi trường có nồng độ
Cytokinin cao. Các tác giả thành công trong việc nhân giống từ phôi, các phôi được
nuôi cấy trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung Cytokinin và
Auxin để tạo cây hồn chỉnh. Tuy nhiên nghiên cứu này cịn hạn chế ở chu kỳ cấy
chuyển dài từ 6 – 8 tuần, không thấy đề cập hệ số nhân chồi hữu hiệu, thời gian và tỷ
lệ ra rễ của cây con cũng như biện pháp huấn luyện cây con ở vườn ươm.
Tóm lại, nhiều cơng trình nghiên cứu đã đi sâu vào giải quyết các nội dung cơ
bản trồng, chăm sóc, hiệu quả kinh tế...mà chưa có cơng trình nghiên cứu nào công
bố chi tiết về phương thức nhân giống in vitro Song mật. Mặc dù các nghiên cứu trên
thế giới đã giải quyết nhiều vấn đề liên quan tới việc nuôi cấy in vitro Song mật
nhưng có ít tác giả nghiên cứu đầy đủ và xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho
loài Song mật.

Năm 2008 Trung tâm Giống & CNSH trường Đại học Lâm nghiệp mới thực
hiện đề tài cấp bộ nhân giống tạo cây con Song mật bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro do
Ths. Vũ Thị Huệ chủ trì. cùng tơi là cộng tác viên tham gia nghiên cứu chính trong đề
tài này. Trong q trình thực hiện đề tài chúng tơi có nghiên cứu thêm về môi trường
dinh dưỡng ảnh hưởng đến khả năng tạo cụm chồi trong đó mơi trường MS* thích
hợp cao với các giai đoạn tạo cụm chồi, nhân nhanh và kích thích tăng trưởng chồi
cho luận văn thạc sỹ của mình. Tiếp theo, đến giai đoạn tạo rễ chúng tôi lại nghiên
cứu tiếp và thấy rằng mơi trường 1/2MS* rất thích hợp cho khả năng tạo rễ, môi
trường dinh dưỡng giảm một nửa khả năng ra rễ mạnh hơn, thời gian ra rễ cũng sớm


17

hơn. Đặc biệt là sẽ giảm được giá thành sản xuất khi đưa quy trình vào sản xuất trên
quy mơ công nghiệp.
Nghiên cứu tạo cây con Song mật bằng kỹ thuật ni cấy in vitro cịn đang là
vấn đề rất mới ở Việt Nam. Do vậy, nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống Song
mật bằng kỹ thuật ni cấy in vitro là việc làm cần thiết và có ý nghĩa để sớm đưa
quy trình ra sản xuất trên quy mô lớn đủ đáp ứng cây giống phục vụ cho công tác
trồng rừng Song mật chất lượng cao

Chương 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu chung
Xây dựng được quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro Song mật từ vật liệu
chồi măng, nhằm góp phần chủ động cung cấp nguồn giống chất lượng cao để phát
triển Song mật làm nguyên liệu phục vụ sản xuất.
Mục tiêu cụ thể:
- Xác định được kỹ thuật khử trùng vật liệu nhân giống đạt hiệu quả cao;

- Xác định được loại vật liệu nuôi cấy và công thức môi trường cảm ứng tạo cụm
chồi tốt nhất;
- Xác định được công thức môi trường nhân nhanh chồi và kích thích tăng trưởng
chồi thích hợp;
- Xác định được cơng thức mơi trường ni cấy kích thích chồi ra rễ tốt nhất;
- Xác định được kỹ thuật trồng và chăm sóc cây con ở vườn ươm phù hợp nhất.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro
Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hóa chất khử trùng và thời gian khử trùng đến
khả năng tạo mẫu sạch in vitro;
2.2.2. Nghiên cứu kỹ thuật tạo cụm chồi in vitro
- Ảnh hưởng đường kính gốc chồi măng đến khả năng tạo cụm chồi in vitro;
- Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo cụm chồi in vitro;
+ Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo cụm chồi;
+ Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo cụm chồi.
- Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo cụm chồi in vitro.